Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, University of Orléans and INSERM

Summary

Vi karakteriserede en ny kinase protein ved hjælp af robuste biokemiske tilgange: Western blot analyse med et dedikeret specifikt antistof på forskellige cellelinjer og væv, interaktioner ved coimmunoprecipitation eksperimenter, kinaseaktivitet detekteret af vestlige Blot ved hjælp af et phospho-specifikt antistof og ved γ [32P] ATP-mærkning.

Abstract

Omfattende hele genomsekvensering har identificeret mange åbne læse rammer (Orf'er), der giver mange potentielle proteiner. Disse proteiner kan have vigtige roller for cellen og kan opklare nye cellulære processer. Blandt proteiner er kinaser store aktører, da de hører til celle signalering veje og har evnen til at tænde eller slukke mange processer afgørende for skæbnen for cellen, såsom cellevækst, division, differentiering, motilitet, og død.

I denne undersøgelse fokuserede vi på et nyt potentielt kinaseprotein, LIMK2-1. Vi demonstrerede sin eksistens af Western blot ved hjælp af et bestemt antistof. Vi evaluerede samspillet med et opstrømsregulerende protein ved hjælp af coimmunoprecipitation-eksperimenter. Coimmunoprecipitation er en meget kraftfuld teknik i stand til at detektere samspillet mellem to målproteiner. Det kan også bruges til at opdage nye partnere af en agn protein. Agn protein kan renses enten via et tag konstrueret til sin sekvens eller via et antistof specifikt rettet mod det. Disse protein komplekser kan derefter adskilles af SDS-PAGE (Natriumdodecyl sulfat Polyacrylamidgel) og identificeres ved hjælp af massespektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 blev også brugt til at teste sin kinase aktivitet in vitro af γ [32P] ATP mærkning. Denne veletablerede analyse kan bruge mange forskellige substrater, og muterede versioner af agn kan anvendes til at vurdere den rolle, specifikke rester. Virkningerne af farmakologiske agenser kan også evalueres, da denne teknik både er meget følsom og kvantitativ. Ikke desto mindre kræver håndtering af radioaktivitet særlig forsigtighed. Kinaseaktiviteten kan også vurderes med specifikke antistoffer rettet mod fosfo-gruppen af den modificerede aminosyre. Disse former for antistoffer er ikke kommercielt tilgængelige for alle fosfo modificerede rester.

Introduction

I mange årtier er talrige signalerings veje blevet belyst, og deres involvering i afgørende cellulære processer såsom celledeling, differentiering, motilitet, programmeret celledød, immunitet og Neurobiologi, er blevet vist. Kinaser spiller en væsentlig rolle i disse signalerings veje, da de ofte finregulerer deres aktivering eller inaktivering og er en del af forbigående alsidige komplekser, der reagerer på eksterne stimuli1,2,3. Mutation og dysregulering af kinaser ofte fører til sygdomme hos mennesker, og de er derfor blevet et af de vigtigste Drug mål i løbet af de seneste 40 år4.

I denne sammenhæng er det vigtigt at kunne påvise kinase interaktion med deres upstream regulerende myndigheder eller downstream-substrater og at identificere nye partnere. Affinity rensning og immunopræcipitation er meget kraftfulde teknikker til isolering af protein komplekser5. Agn protein eller kinase kan mærkes med en specifik peptid sekvens tillader brug af kommercielle perler kovalent kombineret med antistoffer rettet mod peptid. Dette materiale muliggør en høj reproducerbarhed i forsøg6,7,8. Endogene proteiner kan også være immunoprecipitated ved hjælp af antistoffer rettet direkte agn protein. Antistofferne kan være kryds forbundne med protein A eller protein G agopstået perler eller blot inkuperet med disse perler før tilsætning af lysatet. Lysis buffere skal optimeres for at tillade protein solubilisering uden at miste interaktion og for at undgå proteinnedbrydning. En væsentlig ulempe ved denne fremgangsmåde er, at interaktionen opdages ved celle lysis; Derfor kan forbigående eller svage interaktioner sammen med dem, der kræver subcellulær kontekst, gå glip af. Andre teknikker kan anvendes til at arbejde direkte i cellen såsom nærheds ligation assay (PLA)9, in vivo Cross-Linking-assisteret Affinity rensning (xap)10, bioluminescens resonans energi Transfer (BRET) eller Förster resonans energi Transfer (fret)11,12. Desuden er immunopcipitation ikke egnet til at bestemme de termodynamiske konstanter for bindingen, for hvilke der kræves fysiske teknikker såsom overflade Plasmon resonans, isotermisk titrering Calorimetri eller Microscale Thermophorese 13,14.

Kinaseaktiviteten kan vurderes ved hjælp af flere teknikker. Heri fokuserede vi på fosho-specifikke antistoffer og in vitro γ [32P] ATP (adenosin TriPhosphate) mærkning. Phospho-specifikke antistoffer er rettet mod fosfat modifikationen af en bestemt rest i et protein. De kan anvendes i Western blot eller ELISA (enzym-linked ImmunoSorbent assay) efter celle lysis, til Immunohistokemi, og også på intakte celler ved hjælp af flow cytometri eller immunofluorescens. Deres ulemper kan omfatte deres manglende specificitet, som kan evalueres ved hjælp af en muteret version af målproteinet, og deres ikke er kommercielt tilgængelige for alle proteiner. In vitro γ [32P] ATP mærkning er en meget robust, veletableret og meget følsom metode15. Immunoprecipiterede eller rekombinante proteiner kan anvendes, og forskellige substrater kan testes. Virkningerne af narkotika kan også vurderes som denne metode er kvantitativ. Dens største ulempe er, at radioaktiviteten i forbindelse med tilgangen kræver håndtering med forsigtighed. Alternative metoder er også mulige baseret på måling af fluorescerende eller luminescerende peptidsubstrater og drage fordel af ændrede fluorescerende/luminescerende egenskaber ved fosforylering. Sådanne metoder giver også mulighed for høj gennemløb, som er nødvendig, for eksempel i screening af molekyler, der kan være potentielle hæmmere af målkinase. Kinaser udgør faktisk en af de største grupper af narkotika-mål, der forfølges af medicinalvirksomhederne16.

I denne undersøgelse fokuserede vi på LIMK2-protein (LIMK2-1 står for Lin11, Isle1, Mec3 kinase isoformen 2-1). LIMK2 kinaseproteinet blev først beskrevet i 199517. Tre isoformer af LIMK2 er produceret af alternative splejsning: LIMK2a, LIMK2b og LIMK2-1. På nuværende tidspunkt er LIMK2-1 kun blevet beskrevet på mRNA-niveau i en enkelt undersøgelse18. Heri, vi karakteriserer dette potentielle nye kinase protein på det molekylære niveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange. For det første viser vi, at LIMK2-1 faktisk er syntetiseret. I lighed med de to modparter, LIMK2a og LIMK2b, interagerer det med upstream kinase ROCK (Rho-associeret protein kinase). Vi viser LIMK2-1 har en kinase aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men ikke på cofilin, det kanoniske substrat af LIM kinaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle forberedelse til transfektering

Forsigtig: alle trin i cellekulturen skal udføres i et dedikeret laboratorium, og cellerne manipuleres i et mikrobiologisk kabinet i klasse 2.

  1. Seed HEK-293 (humane embryonale nyrer) celler i Ø 10 cm plader i 10 mL DMEM (Dulbecco's modificerede Eagles medium) suppleret med 10% føtalt kalv serum. Kultur for 3 til 5 dage under 5% CO2, ved 37 °c, indtil cellerne når ~ 90% Confluence.
  2. Behandl Ø 10 cm plader med collagen R for at øge celle vedhæftningen til plastik pladerne.
    1. Der tilsættes 5 mL af en opløsning af kollagen R, 200-fold fortyndet i fosfat salt buffer (PBS) i en Ø 10 cm plade. Læg væsken over hele pladens overflade.
    2. Der inkubieres ved stuetemperatur i mindst 1 time inden for biosikkerhedskabinettet.
    3. Fjern kollagenopløsningen, og kassér den. Tilsæt 5 mL PBS, Spred det over overfladen af pladen, Fjern det og kassér det. Gentag denne vask én gang.
    4. Der tilsættes 8 mL DMEM suppleret med 10% føtalt kalv serum. Opbevar de forberedte plader i biosikkerhedskabinettet.
  3. Tag HEK-293 plader fra trin 1,1 i biosikkerhedskabinettet. Fjern mediet fra pladerne og kassér det i en dedikeret blege Papirkurv. Tilsæt 2 mL suppleret DMEM, og skyl cellerne for at løsne dem ved hjælp af en 1 mL mikropipette, idet du sørger for at undgå skumdannelse.
  4. Cellerne opsamles i et 15 mL rør, og der tilsættes 4 mL suppleret DMEM. Homogeniseres med en 10 mL pipette ved at pipettere op og ned 3 gange.
  5. Tag 2 mL af denne celle opløsning og tilsæt dem til kollagenbehandlede plader indeholdende suppleret DMEM fra trin 1.2.4.
  6. Vokse i 24 timer i inkubator ved 5% CO2 og 37 °c. Cellerne skal være 50-80% konflydende på tidspunktet for transfection.

2. forbigående transfections

  1. Fjern mediet fra pladerne, kassér det i en dedikeret blege Papirkurv, og tilsæt 10 mL frisk suppleret DMEM. Læg pladerne tilbage i inkubatoren ved 37 °c, mens transfektering-blandingen forberedes.
  2. I et 15 mL rør tilsættes 450 μL af en 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris står for tris (hydroxymethyl) aminomethan og EDTA for ethylenedinitrilotetraeddikesyre) opløsning og 50 μL af en 2,5 M CaCl2 opløsning. Bland efter inversion.
  3. Tilsæt 10 μg plasmidic DNA (deoxyribonukleinsyre) fremstillet af en MIDI-præparat på en flydende bakteriekultur, der omdannes med den dedikerede plasmid. Bland efter inversion.
  4. Under glat omrøring på en hvirvel, tilsættes 500 μL af BES-bufferet saltvand 2x koncentrat (sammensætning: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na2HPO4, 0,27 g/l; BES står for N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethansulfonsyre, N, N-bis (2-hydroxyethyl) taurin) langsomt dråbe for dråbe.
  5. Der inkubieres i mindst 15 min (op til 45 min) ved stuetemperatur i biosikkerheds kabinettet. Må ikke vortex, Bland ikke! Bevæg rørene meget forsigtigt for ikke at forstyrre den komplekse formation mellem DNA og calciumphosphat.
  6. Tag pladerne fra trin 2,1 til sikkerheds kabinettet. Tilsæt DNA-komplekser meget omhyggeligt, dråbe for dråbe, på cellerne over hele pladens overflade.
  7. Inkuberes i 24 til 72 timer i inkubatoren ved 37 °C. Normalt maksimale protein udtryk er nået inden for 48 timer.

3. lysis af

Bemærk: Arbejd på is, og med kolde buffere for at forhindre proteinnedbrydning.

  1. Klargøring af lysisbuffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM natrium pyrophosphat, 1 mM na3VO4, 20 mm p-nitrophenylphosphat, 20 mm β-glycerophosphat, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidic syre , 1 μg/mL leupeptin og 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid). Der kræves ca. 4 ml lysis-buffer for hver transficeret plade.
  2. Fjern plader med transferede celler fra inkubatoren. Læg dem på is.
    Bemærk: fra dette trin, er det muligt at arbejde på en "normal" bænk.
  3. Fjern mediet, og kassér det i en dedikeret blege Papirkurv.
  4. Vask to gange med 3 mL kold PBS: Tilsæt 3 mL PBS på siden af pladen dråbe for dråbe for at undgå at løsne transferede celler, sprede sig over hele pladens overflade, fjerne PBS og kassere den; Gentag dette trin en gang til. I slutningen, fjerne forsigtigt resten af PBS ved at vippe pladen for at forhindre lysis buffer fortynding til næste trin.
  5. Der tilsættes 500 μl kold lyse buffer på de transficeret vaskede celler. Spred det over overfladen af pladen.
  6. Inkubeter i 10 minutter på is. Fra tid til anden (mindst to gange), spredes igen bufferen over overfladen af pladen.
  7. Skrot cellerne og saml dem i et mikrocentrifuge glas.
  8. Der centrifugeres i 10 min ved 10.000 x g ved 4 °c.
  9. Saml supernatanten i et nyt mikrocentrifuge glas. Denne fraktion svarer til lysatet (hele celle ekstrakt). Kassér den pellet, der svarer til celle membran rester.
  10. Der opsamles en alikvot af denne fraktion til et nyt mikrocentrifugerør (ca. 50 μL). Denne fraktion svarer til "TOTAL fraktion" eller "Cell Lysate" eller "hele celle ekstrakt", der gør det muligt at analysere, om transferede proteiner udtrykkes af Western blot.
    Bemærk: på dette tidspunkt kan prøverne anvendes direkte til Western blot-analyser. Der skal tilsættes laemmli-buffer til prøven, som derefter opvarmes ved 95 °C i 5 min., centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter og indlæses på den relevante SDS-side. Prøverne kan også opbevares ved-80 °C.

4. immunoprecipitation

  1. Forsigtigt resuspension agopstået perler kombineret med det relevante antistof: HA (human influenza hemagglutinin), flag, eller GFP (grøn fluorescerende protein) ved glat inversion.
  2. Skær enden af en 200 μL spids fra en mikropipette for at tillade perler at komme ind i spidsen. Pipette perler op og ned flere gange for at mægle spidsen for at sikre, at tage den korrekte mængde af perler.
  3. Der tages 40 μL perler i et mikrocentrifugerings glas.
  4. Der tilsættes 500 μL TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) buffer. Bland efter inversion. Der centrifugeres i 2 min ved 1.000 x g ved 4 °c. Fjern forsigtigt supernatanten og kassér den. Der tilsættes 500 μL TENET. Der inkueres i mindst 1 time ved 4 °C på et roterende hjul.
    Bemærk: dette præ-inkubations trin i TENET gør det muligt at reducere ikke-specifikke interaktioner og dermed mindske baggrunds signalet.
  5. Perlerne vaskes to gange med 500 μL lysis buffer.
    1. Der centrifugeres 2 min ved 1.000 x g ved 4 °c.
    2. Fjern forsigtigt supernatanten buffer, og kassér den.
      Bemærk: pas på ikke at Aspirer perler under disse vaske trin.
    3. Der tilsættes 500 μL lysis buffer. Homogenisering ved at invertere røret.
    4. Gentag trin 4.5.1-4.5.3.
  6. Der centrifugeres i 2 min ved 1.000 x g ved 4 °c. Fjern forsigtigt supernatanten bufferen, og kassér den.
  7. Der inkupereres perler med lysatet fra trin 3,9 i 2 til 4 timer ved 4 °C på et roterende hjul.
  8. Vask immunoprecipiterede perler.
    Bemærk: på dette tidspunkt kan de immunoprecipiterede perler vaskes fem gange med lysis buffer, og derefter elueres med Laemmli buffer. Eluatet kan anvendes til Western blot-analyser eller opbevares ved-80 °C. Alternativt kan perler vaskes to gange med lysis buffer og derefter tre gange med kinase buffer til at udføre γ [32P] ATP mærkning.

5. coimmunoprecipitation-analyser

  1. Vask immunoprecipiterede perler fra trin 4,7 med lysis buffer.
    1. Der centrifugeres i 2 min ved 1.000 x g i en kølet centrifuge ved 4 °c.
    2. Fjern forsigtigt supernatanten, og kassér den.
    3. Der tilsættes 500 μL lysis buffer. Homogenisering ved at invertere røret.
    4. Gentag trin 5.1.1-5.1.3 fire gange.
  2. Eluering
    1. Der centrifugeres i 2 min ved 1.000 x g i en kølet centrifuge ved 4 °c.
    2. Fjern forsigtigt supernatanten, og kassér den. Fjern de sidste dråber supernatanten med en Hamilton sprøjte for at undgå aspiration af perlerne, og kassér supernatanten.
    3. Der tilsættes 40 μl 4X laemmli buffer (200 mm Tris/HCL pH 6,8, 4% SDS, 40% glycerol, 0,5 M β-mercaptoethanol, 0,02% bromphenolblåt blå). Homogenisering ved forsigtigt at tappe røret.
    4. Inkubeter i 5 minutter ved stuetemperatur.
    5. Der centrifugeres i 5 minutter ved 10.000 x g ved stuetemperatur.
    6. Tag supernatanten ud med en Hamilton-sprøjte, og Saml den i et nyt mikrocentrifuge glas. Denne fraktion svarer til "eluat", som kan opbevares ved-80 °C, eller analyseres direkte af Western blot.

6. kinaseassay

  1. Klargør kinasebufferen: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES står for 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonsyre) 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2,5mm mncl2, 50 mm NAF, 1 mm na3VO4, 20 mm β-Glycerophosphat, 1 μg/ml leupeptin og 1 mM PMSF. Der kræves ca. 2 ml kinasebuffer for hver immunopræcipitation-tilstand.
  2. Der vaskes immunoprecipiterede perler fra trin 4,7 to gange med 500 μL lysis buffer.
    1. Der centrifugeres i 2 min ved 1.000 x g i en kølet centrifuge ved 4 °c.
    2. Fjern forsigtigt supernatanten, og kassér den. Der tilsættes 500 μL lysis buffer. Homogenisering ved inversion.
    3. Gentag trin 6.2.1 og 6.2.2.
  3. Der vaskes immunoprecipiterede perler tre gange med 500 μL kinasebuffer.
    1. Der centrifugeres i 2 min ved 1.000 x g i en kølet centrifuge ved 4 °c.
    2. Fjern forsigtigt supernatanten, og kassér den. Der tilsættes 500 μL kinasebuffer. Homogenisering ved inversion.
    3. Gentag trin 6.3.1 og 6.3.2 to gange.
  4. Der centrifugeres i 2 min ved 1.000 x g i en kølet centrifuge ved 4 °c.
  5. Fjern forsigtigt supernatanten, og kassér den. Fjern de sidste dråber supernatanten med en Hamilton sprøjte for at undgå aspiration af perlerne, og kassér supernatanten.
  6. Der tilsættes 40 μL kinasebuffer til de immunoprecipiterede perler. Resuspender perlerne ved forsigtigt at tappe røret.
  7. Forbered blandingen til γ [32P] ATP-mærkning (slutvolumen er 22,5 μl, komplet med kinasebuffer) i et sikkert låse-rør.
    1. Tilsæt den nødvendige mængde kinasebuffer for at nå et endeligt volumen på 22,5 μL.
    2. Skær enden af en 20 μL spids af en mikropipette. Resuspender de immunopcipiterede perler fra trin 6,6 ved at pipette op og ned flere gange. 10 μL af disse perler opsamles i det sikre låse rør.
    3. Tilsæt ATP fra en 10 μM stamopløsning for at nå 50 mM finale koncentrationen. Ifølge antallet af behandlede prøver foreslås en fortynding af stamopløsningen af ATP i kinasebufferen for at give mulighed for at afpipettere 1 til 2 μL for at sikre, at volumenet er korrekt.
    4. Tilsæt 2,5 μg substrat (cofilin eller myelin Basic protein, MBP i dette studie tilfælde).
  8. Tilsæt 5 μCi af γ [32P] ATP (3.000 CI/mmol) for at initiere reaktionen. Blandes ved at pipette op og ned langsomt.
    Forsigtig: fra dette punkt skal arbejdet udføres på et sikkerheds sted, der er dedikeret til radioaktivitet manipulationer med forsigtig forsigtighed, dedikeret beskyttelse og passende kontrol (radioaktive skjolde, Geiger-tæller, specifikt affald indsamle, personlige bryst og finger Emblemer for at detektere radioaktiv eksponering, filter tips).
  9. Inkubeter i 20 min ved 30 °C.
  10. Stop reaktionen med 6 μL 5x Laemmli buffer.
  11. Opvarmes ved 95 ° C i 5 min.
  12. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  13. Indlæs på en SDS-PAGE. Fortsæt til overflytning.
    Bemærk: pas på, at den forreste linje af fri γ [32P] ATP ikke forlader gelen for at undgå kontaminering af migrations tanken.
  14. Pletter gelen ved stuetemperatur.
    1. Tag gelen ud af glaspladerne.
    2. Fortsæt med tre bade i vand ved stuetemperatur.
    3. Pletter gelen natten over med Coomassie Blue ved stuetemperatur.
    4. Deplette gelen med flere vaske bade med vand ved stuetemperatur.
  15. Pak gelen med plastikfolie.
  16. Udsæt for en nat eller mere på en skærm med phosphorimager.
  17. Læs skærmen på en phosphorimager for at registrere mærkede bånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LIMK2-1 protein er syntetiseret
LIMK2-1 er nævnt i databanker, men hidtil har kun ét papir vist eksistensen af mRNA18. Sammenlignet med de to homologs, LIMK2a og LIMK2b, har LIMK2-1 en ekstra C-Terminal domæne identificeret som en protein fosfatase 1 hæmmende domæne (PP1i). Vi designede et antistof, der er målrettet mod et peptid af dette domæne, aminosyrer 671-684 (figur 1a).
BLAST Research mod humane protein databaser viste, at kun ét protein, PHI-1 (Fosfataseholoenzym-hæmmer 1), har en stærk sekvens lighed med denne 12 aminosyresekvens. Men, PHI-1 migrerer på 23 kDa på SDS-PAGE gels, langt væk fra LIMK2-1, som forventes at migrere omkring 75 kDa (dvs., de to bør ikke blande sig). Vi validerede dette antistof først for hek-293 celler transficeret enten med LIMK2-1, LIMK2a, eller LIMK2b og viste, at anti-PP1i-antistof var i stand til at genkende transficeret LIMK2-1 (pcmv-LIMK2-1) og ha-mærkede LIMK2-1, men ikke krydsreagerer med transficeret ha-mærket LIMK2a eller LIMK2b (figur 1b). Vi observerede en gruppe endogene LIMK2-1 i HEK-celler transficeret med HA-mærkede versioner af de LIMK2 isoformer (angivet med en pil i anti-PP1i blot; Figur 1b). For det andet undersøgte vi, om signalet induceret af anti-PP1i antistof var specifikt for LIMK2-1 ved hjælp af siRNA rettet mod de tre splejsede varianter af LIMK2 (figur 1c). I nærværelse af LIMK2 siRNA blev der observeret et reproducerbart og signifikant fald i interessegruppen (indikeret med en pil i figur 1c) sammenlignet med kontrolbetingelser, hvilket tyder på, at antistoffet er specifikt for LIMK2-1. Efter dette brugte vi anti-PP1i antistof til at detektere LIMK2-1 i forskellige cellelinje ekstrakter: HEK-293 (humane embryonale nyreceller), HeLa (humant epithelial cervix-celler), og C6 (rat Brain glial celler). Disse celler afbrydes i lysis-bufferen, der indeholder 1% Triton X-100. Ved hjælp af in silicium-analyse blev LIMK2-1 vist at være Hominidae primat-specifik19. Western blot-analyse ved hjælp af anti-PP1i-antistoffet viste, at LIMK2-1 syntes at være udtrykt i hek-293 og Hela, men ikke i C6-cellelinjer som forventet fra in silicium-undersøgelser (figur 1d). Disse eksperimenter blev gentaget med forskellige humane væv, viser, at niveauet af LIMK2-1 protein varierede afhængigt af vævet: de højeste niveauer blev fundet i leveren, mindre niveauer i bugspytkirtlen, og den laveste i testiklerne og lunge. LIMK2-1 kunne ikke påvises i hjernevæv (figur 1E). Vi observerede lavere molekylvægt bands i alle vævsprøver undtagen lever, hvilket tyder på nedbrydning af det fulde protein sandsynligvis på grund af lyse betingelserne for disse kommercielle prøver (denne lysis buffer indeholder en cocktail af inhibitorer ikke specificeret på databladet, som kan være mindre effektivt end de talrige proteasehæmmere og fosfataseinhibitorer, vi bruger i vores hjemmel satte buffer). Disse data viser, at humant LIMK2-1 protein syntetiseres og udtrykkes forskelligt i det testede væv.

LIMK2-1 interagerer med sin upstream kinase ROCK
LIMK2-1 homologs, LIMK2a og LIMK2b, er blevet beskrevet som reguleret af upstream kinase ROCK. Vi vurderede samspillet mellem LIMK2-1 og ROCK ved hjælp af coimmunoprecipitation-eksperimenter. HEK-celler blev co-transficeret med vektorer kodning cMyc-Tagged ROCK1 og enten en af de HA-mærkede version af LIMK2 isoforms, eller det ikke-forbundne HA-mærkede protein Larp6. Larp6 fungerer som en negativ kontrol, der gør det muligt at afsløre ikke-specifikke interaktioner. Cellerne blev lyseret og anti-ha immunopræcipitation blev udført. Lysates (hel celleekstrakter) og immunoprecipitater blev analyseret af Western blot, ved hjælp af anti-HA og anti-cMyc antistoffer. Som afbildet i figur 2 (venstre paneler; Lysates), hver af de forskellige proteiner kodet af de transficeret vektorer er godt udtrykt. De tre isoformer af LIMK2, samt Larp6, er effektivt immunoprecipitated (figur 2, nederste højre panel; Eluater). I eluaterne detekteres ROCK og dermed coimmunoprecipitated med de tre isoformer af LIMK2, men ikke med Larp6 (figur 2, øverste højre panel; Eluater). Dette viser, at ROCK interagerer med de tre isoformer af LIMK2, især med den nyligt karakteriserede isoformen LIMK2-1. Denne interaktion er specifik, da den negative kontrol (Larp6) ikke interagerer med ROCK.

Heri præsenterer vi data for immunopræcipitation udført med anti-ha antistoffer; interaktionen kan dog testes i modsat retning af immunoprecipiterende klippe med perler konjugeret med cMyc antistoffer og analysere eluater med HA antistoffer til at detektere LIMK coimmunoprecipitation.

Kinaseaktivitet
Phospho-cofilin i intakte celler
Homologgene af LIMK2-1, LIMK2a og LIMK2b har vist sig at fosforylere cofilin, en aktiv depolymeriserings faktor, på dets Serine3. Ved hjælp af et antistof specifikt rettet mod fosho-Serine3 af cofilin, studerede vi LIMK2 kinaseaktivitet ved at måle niveauet af endogene fosho-cofilin i HEK celler, der overudtrykker en af de LIMK2 isoformer. Hek-celler blev transficeret med vektorer kodning enten en af ha-mærkede LIMK2 isoformer, eller den tilsvarende tomme vektor som en negativ kontrol. Cellerne blev lysed, og de forskellige lysater blev analyseret af Western blotting ved hjælp af anti-fosho-Serine3 cofilin antistof. Overekspression af LIMK2a og LIMK2b inducerede en signifikant og reproducerbar stigning i fosho-cofilin-niveauerne i forhold til kontrolbetingelserne, hvorimod tilstedeværelsen af LIMK2-1 ikke havde nogen påviselige virkninger (figur 3, venstre panel).

Vi gentog det samme eksperiment med en C-Terminal yfp-Tagged (Yellow fluorescerende protein) version af de tre LIMK2 isoformer og en ukodet version af LIMK2-1 for at udelukke eventuel interferens af N-terminal ha tag. Resultaterne var identiske med dem, der blev opnået ved hjælp af HA-mærkede versioner af de tre isoformer (figur 3, højre panel, der viser yfp-mærket version). Transfection effektivitet blev vurderet for YFP-mærkede version af LIMK isoformer ved hjælp af flow cytometri at udelukke, at dette resultat kan have været på grund af forskelle i protein udtryk. De tre isoformer viste lignende transfektering effektivitet: 54% for LIMK2-49% for LIMK2b og 43% for LIMK2b.

In vitro- kinasetests
Vi studerede derefter kinaseaktiviteten af LIMK2 isoformer ved in vitro-mærkning med γ [32P] ATP. Figur 4a viser den generelle opbygning af denne in vitro mærkning. HEK-cellerne blev transficeret med enten en af de HA-mærkede versioner af LIMK2 isoformer eller det ikke-relaterede protein, Larp6, som blev brugt som en negativ kontrol. Den kinase aktivitet af anti-HA immunoprecipitater blev målt ved hjælp af rekombinant GST-cofilin som substrat ved tilstedeværelse af γ [32P] ATP. HA-immunoprecipiteret Larp6 viste ingen kinaseaktivitet på cofilin. HA-immunoprecipiteret LIMK2a og LIMK2b fosforyleret cofilin, hvorimod LIMK2-1 ikke (figur 4b). Vi opnåede lignende resultater ved hjælp af YFP-mærkede versioner af de tre isoformer immunoprecipitated med GFP-Trap perler i tilstedeværelse af rekombinant cofilin og γ [32P] ATP (figur 4d).

Vi testede derefter, om LIMK2-1 ikke havde nogen kinaseaktivitet, eller om dets aktivitet på cofilin var svækket. Vi gentog in vitro mærkning eksperiment ved hjælp af myelin Basic protein (MBP), et effektivt substrat for talrige protein kinaser, i stedet for cofilin. Der var et højt baggrunds signal i kontroltilstanden, når analysen blev udført i nærværelse af HA-mærkede versioner: den negative kontrol, HA-immunoprecipitated Larp6, producerede et stærkt signal af phosphoryleret MBP, selv om det ikke er en kinase ( Figur 4C). Vi overvandt dette problem ved hjælp af den YFP-mærkede version af disse proteiner. Under disse omstændigheder var baggrunden i kontrol (YFP alene) lav, hvilket gjorde det muligt at gennemføre mere specifikke undersøgelser. GFP-fanget YFP-LIMK2a, LIMK2b og LIMK2-1 viste kinaseaktivitet mod MBP, selv om aktiviteten af LIMK2-1 var lavere (figur 4d). Men, LIMK2-1 var også mindre effektivt immunoprecipitated under disse betingelser (Se Coomassie Brilliant Blue (CBB) farvning og Western blotting). Således viste de tre isoformer sammenlignelig aktivitet på MBP, når fosho-MBP blev normaliseret til immunopcipiterede LIMK2 niveauer ved CBB farvning (figur 4d, nedre panel). Immunoprecipitates blev også analyseret af Western blot ved hjælp af anti-ROCK antistoffer for at kontrollere, om aktiviteten på MBP kunne skyldes tilstedeværelsen af ROCK, som ville have været coimmunoprecipitated med LIMK2s. Vi kunne ikke detektere nogen ROCK signal i LIMK2 immunoprecipitates. Så MBP fosforylering skyldes ikke ROCK, men at LIMK2s per se.

Samlet set viser disse data, at LIMK2a og LIMK2b har lignende aktiviteter på cofilin og MBP. Selv om LIMK2-1 viser kinaseaktivitet mod MBP, der kan sammenlignes med de to andre isoformer, er cofilin ikke et godt substrat for det.

Figure 1
Figur 1: bevis for eksistensen af LIMK2-1-proteinet. (A) skematisk diagram over de tre isoformer af human LIMK2. LIMK2 isoformer er beskrevet i Entrez gene: LIMK2-1 (NP_ 001026971.1), LIMK2a (NP_ 005560.1), LIMK2b (NP_ 057952.1). De forskellige domæner i LIMK2 er vist: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM ' (kortere LIM domæne), PDZ (PSD95, Dlg1, zo-1), S/P (Serine ProLine rige), kinase ' (kortere kinase domæne), og PP1i (protein fosfatase 1 hæmmende). Den sekvens, der er valgt til anti-PP1i-antistof design, vises med rødt. (B og C) Validering af anti-LIMK2-1-antistoffet. (B) hek-293-cellerne blev transficeret med UKODET LIMK2-1 (PCMV-LIMK2-1) eller en af de ha-mærkede ISOFORMER af LIMK2. Lysates blev analyseret af Western blotting ved hjælp af de indikerede antistoffer. C) hek-293-cellerne blev transficeret enten med LIMK2 siRNA eller kontrol siRNA. Lysates blev analyseret af Western blot. LIMK2-1 udtrykkes i forskellige humane cellelinjer (D) og væv (E). HEK-293, HeLa-og C6-cellerne blev forstyrret i 1% Triton-X100 lysis-buffer. Vævs ekstrakter blev købt og prøver heraf blev analyseret af Western blotting. Dette tal blev ændret fra Vallee et al., Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: De tre isoformer af LIMK2 interagere med ROCK1. HEK-293 celler blev co-transficeret med cMyc-Tagged ROCK1 og enten en af de tre HA-mærkede LIMK2 isoformer (2-1, 2a, 2b) eller det ikke-forretningsmæssigt forbundne protein, Larp6. Lysates og anti-HA immunoprecipitater blev udsat for Western blotting. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: LIMK2-1 har ingen kinaseaktivitet mod cofilin i intakte celler. HEK-293 celler blev transficeret med enten en af de tre HA-mærkede LIMK2 isoformer (1, 2a, 2b) eller den tomme forældre vektor, pcDNA3 (venstre panel), eller med enten en af de tre YFP-mærkede LIMK2 isoformer eller YFP alene (højre panel). Lysates blev udsat for Western blotting. Kvantificeringen af forholdet mellem phospho-cofilin versus cofilin er vist i grafen til højre. Phospho-cofilin versus cofilin ratio af mock transficeret celler blev normaliseret til 100. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE af tre uafhængige eksperimenter. Dette tal blev ændret fra Vallee et al., Biochemical Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: LIMK2-1 har ingen in vitro-kinaseaktivitet mod cofilin, selv om det fosforylerer MBP. (A) generel ordning af γ [32P] ATP in vitro mærkning. B) LIMK2-1 ikke fosforylerer cofilin in vitro. HEK-293-celler blev transficeret med enten en af de tre HA-mærkede LIMK2-isoformer (2-1, 2a, 2b) eller et ikke-relateret HA-mærket protein, Larp6, som en negativ kontrol. Anti-HA immunoprecipiterede proteiner og GST-cofilin blev anvendt i kinaseanalysen. De anti-ha immunoprecipitater blev også udsat for anti-ha immunblotting og coomassie blå farvning. C) ha-mærket immunopræcipitation har et stærkt baggrunds signal, når MBP anvendes som substrat. HEK-293-celler blev transficeret med enten en af de tre HA-mærkede LIMK2-isoformer (2-1, 2a, 2b) eller et ikke-relateret HA-mærket protein, Larp6, som en negativ kontrol. Anti-HA immunoprecipiterede proteiner og MBP blev anvendt i kinaseanalysen. De anti-ha immunoprecipitater blev også udsat for anti-ha immunblotting og coomassie blå farvning. D) de tre LIMK2 isoformer har kinaseaktivitet mod myelin Basic protein (MBP). HEK-293-celler blev transficeret med enten en af de tre YFP-mærkede LIMK2-isoformer (2-1, 2a, 2b) eller YFP alene. Anti-GFP immunoprecipiteret LIMK2 isoformer og cofilin eller MBP blev anvendt i kinaseanalysen. Anti-gfp immunoprecipitater blev også udsat for anti-gfp immunblotting og coomassie blå farvning. Kvantificeringen af phospho-cofilin og fosho-MBP er vist i den nederste graf. Fosho-cofilin-niveauer opnået med anti-GFP immunoprecipiteret LIMK2a blev normaliseret til 100. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE af tre uafhængige eksperimenter. Dette tal blev ændret fra Vallee et al., Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri har vi brugt robuste biokemiske værktøjer til at karakterisere på molekylært niveau et nyt protein, LIMK2-1, menes at være en kinase baseret på dens sekvens og på dens homologs, LIMK2a og LIMK2b20.

For det første demonstrerede vi eksistensen af LIMK2-1 på Proteinniveau ved hjælp af Western blot analyse med et bestemt antistof. Efter dette, vi evalueret sin interaktion med upstream kinase ROCK1, som er kendt for at regulere LIMK2a og LIMK2b, homologer af LIMK2-1. Endelig vurderede vi den potentielle kinaseaktivitet af LIMK2-1 gennem in vitro γ [32P] ATP-mærkning og i Cellulo af Western blot ved hjælp af et specifikt phospho-antistof.

Lysis buffer sammensætning
Når man studerer proteiner for at analysere dem af Western blot, er der behov for særlig omhu med hensyn til lysis buffer sammensætning. Der skal tages hensyn til flere parametre: i) vaskemiddel type og koncentration21og II) proteasehæmmere.

Lysis buffer sammensætning skal tilpasses til målet protein for at lette sin nær fuldstændig solubilisering for at udtrække det så meget som muligt og at tillade dens påvisning af Western blot. For opløselige proteiner er milde tilstande (f. eks. et mildt rengøringsmiddel ved lav koncentration) ofte tilstrækkelige til at opnå dette. For membran proteiner, er stærkere betingelser typisk ofte påkrævet. Forskellige kategorier af vaske-og rengøringsmidler findes: i) ionisk, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), (II) ikke-ionisk såsom polyethylenglycol hexadecyl ether (BRIJ), Triton, octylGlucoside (OG), Dodecylmaltosid (DDM) og ( III) zwitterionic såsom 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS) eller zwittergents. Stærke rengøringsmidler kan forstyrre interaktioner og komplekser kan gå tabt. For immunopræcipitation-eksperimenter kan antistoffer desuden være følsomme over for svære tilstande. Tilsvarende kan enzymaktivitet forstyrres af tilstedeværelsen af rengøringsmidler, der kan udfolde eller denaturerer det undersøgt protein. Både typen og mængden af det anvendte vaskemiddel kan påvirke et proteins egenskaber og aktivitet. For nogle proteiner tolereres en meget begrænset koncentration af vaskemiddel for at bevare proteinets aktivitet. Under dette interval forbliver proteinet uopløseligt, hvorimod proteinet over dette koncentrationsområde ikke længere er aktivt.

Proteasehæmmere skal tilsættes til lysis-bufferen for at forhindre nedbrydning af målproteinet ved endogene proteaser. Proteasehæmmere cocktails er kommercielt tilgængelige. De kan bruges som udgangspunkt for en undersøgelse. Hvis der opstår problemer, kan man overveje at anvende en blanding af inhibitorer, der er fremstillet midlertidigt fra stamopløsninger opbevaret ved-20 °C. Disse inhibitorer skal være rettet mod Serin-og cystein-proteaser. PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) er almindeligt anvendt, men det er meget ustabilt i vandig opløsning og skal tilsættes lige før ekstraktion. Metalloproteaser bør også hæmmes: metal chelerende reagenser, såsom EDTA (Ethylenedinitrilotetraeddikesyre) eller EGTA (ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-tetraeddikesyre), som binder til mg2 +, anvendes i dette øjemed. For at holde proteinet i fosforyleret og dermed aktiveret form anbefales det også at tilføje fosfatasehæmmere til lysis-bufferen. Disse hæmmere skal målrette alkalisk, syre, Serin, threonin, og tyrosin fosfataser. Det anbefales også at arbejde ved lav temperatur (4 °C) for at sænke hastigheden af proteolyse.

Target proteiner
Heri fokuserede vi på epitope-mærkede proteiner. Tags (flag, HA, cMyc, GFP, etc.) er meget nyttige for at detektere og rense proteiner, som antistoffer og antistof koblede perler er kommercielt tilgængelige og er let reproducerbare materialer. Mærkets størrelse og placering skal dog tages i betragtning, da dette kan påvirke målprotein6,7,8's aktivitet, lokalisering eller funktion. Det er også muligt at arbejde med endogene proteiner. I dette tilfælde skal der anvendes antistoffer mod dette særlige protein. De kan være koblet til perler (protein A eller protein G) kovalent (Cross-link) eller blive inkueret med lysatet og derefter med perlerne. Når man arbejder med mærkede proteiner, hvis gen udtrykkes på en plasmid, er det let at skifte til en muteret version af dette protein ved mutagenese af genet. Det er derefter muligt at arbejde på forskellige mutanter til at vurdere biologiske funktioner.

Immunopræcipitation
Immunoprecipitation er en meget kraftfuld teknik til at isolere partnere af målet protein5. Sammensætningen af lysis buffer (især vaskemiddel) skal nøje fastlægges for at bevare interaktioner (se ovenfor). Det er muligt at detektere samspillet mellem to identificerede proteiner. Det kan være endogene proteiner eller over udtrykte proteiner. Når proteiner udtrykkes ved lav forekomst, kan det være nødvendigt at over udtrykke dem for at få stærkere signaler. Omfattende skyller af immunoprecipitated perler er forpligtet til at fjerne ikke-specifikt interagere proteiner eller forurenende stoffer. Forud for bestemmelse af immunopræcipitation effektivitet eller co-immunoprecipitated partner tilstedeværelse, er det vigtigt at kontrollere, at de forskellige partnere er godt udtrykt og til stede i lysatet ved at analysere hele celle lyat eller input fraktion af vestlige Skamplet. Ved hjælp af immunopræcipitation-eksperimenter er det desuden muligt at identificere nye partnere i et målprotein og isolere nye komplekser. Disse nye partnere kan identificeres ved massespektrometri.

Sådanne partnere kan spille en vigtig rolle som aktivatorer af målproteinet, så dens fulde aktivitet for yderligere biologiske tests. På den anden side kan copurificerede uønskede proteiner anvendes som argument for, at der ikke er en direkte interaktion mellem to identificerede partnere, men i stedet, at den detekterede interaktion ved co-immunoprecipitation skyldes en anden ukendt partner. I dette særlige tilfælde, for at være sikker på en direkte interaktion, en anden eksperimentel anordning er nødvendig, såsom at arbejde på pattedyr proteiner renset fra bakterier.

Kinaseaktivitet
Kinaseaktiviteten kan vurderes ved forskellige teknikker. Heri fokuserede vi på in vitro analyse af γ [32P] ATP mærkning og på hele celle ekstrakt analyse af Western blot ved hjælp af en specifik fosho-antistof. γ [32P] ATP mærkning er en meget følsom og kvantitativ teknik tillader påvisning af svage kinase aktivitet15. Radioaktivitet iblanding fra ATP til målsubstratet giver mulighed for en direkte måling af enzymaktivitet, der skal foretages. Det er muligt at arbejde med forskellige substrater til at vurdere kinaseaktiviteten af det undersøgt protein på forskellige mål. Det er også muligt at identificere aminosyrer afgørende for kinase aktivitet ved at Muere dem, når proteinet er overudtrykt. Kinaseaktiviteten kræver en divalent kation, såsom mg2 +, som skal være til stede i kinasebufferen.

Den største ulempe ved denne fremgangsmåde er håndteringen af radioaktivitet, som kræver dedikerede faciliteter til eksperimenter og indsamling af affald. Alternative metoder findes, såsom fluorescerende eller luminescerende kits, der detekterer biprodukter af reaktionen, såsom ADP (adenosindiphosphat)16. Proteinfosforylering kan også undersøges ved massespektrometri, men der kræves en større mængde materiale til disse analyser. I vores tilfælde, vi forsøgte at vurdere LIMK2 kinase aktivitet ved hjælp af kapillar elektroforese at øge vores effektivitet, men det var desværre forgæves.

Fosfospecifikke antistoffer er et yderligere værktøj til at studere fosforylering af et protein. Brede generelle anti-fosho Serin og tyrosin antistoffer findes, i stand til at genkende fosho-ser eller fosho-tyr af nogen proteiner. I de seneste år er antistoffer rettet mod en specifik fosfo-lokalitet af et målprotein blevet bredt udviklet, og de genkender normalt både fosfo-gruppen og de omgivende aminosyrer. Særlig omhu er nødvendig, når de begynder at arbejde med sådanne antistoffer, da deres specificitet skal kontrolleres for eksempel med en negativ kontrol, såsom målproteinet muteret på fosho stedet. Ved sondering af en skamplet med et anti-fosho-antistof må blokerings opløsningen ikke være mælk, da den indeholder foshoproteiner, der kan interagere med antistoffet. Bovint serum albumin (BSA) anbefales, og fosfatasehæmmere kan tilsættes i blokerende løsning for at forhindre fosfat frigivelse. Prøverne må ikke fryses og optøet, men fremstilles som aliquoter, der holdes ved-80 °C. Faktisk fosho modifikationer er labile.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af La Ligue contre Le cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen og La Région Centre Val de Loire. Mange tak til Aurélie Cosson og Déborah Casas for flow cytometri data, og til Keyron Hickman-Lewis for grundig korrekturlæsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 		 Biochain

 		 P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis		 for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Tags

Biokemi cellelinje kultur forbigående transfection immunoprecipitation Western blot kinaseaktivitet γ [32P] ATP-mærkning phospho-specifikt antistof
Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vallée, B., Doudeau, M., Godin, … More

Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter