Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, University of Orléans and INSERM

Summary

Vi karakteriserade ett nytt Kinas protein med hjälp av robusta biokemiska metoder: Western blot analys med en dedikerad specifik anti kropp på olika cellinjer och vävnader, interaktioner genom coimmunoprecipiten experiment, Kinas aktivitet detekteras av västerländska Blot med hjälp av en phospho-specifik anti kropp och γ [32P] ATP märkning.

Abstract

Omfattande sekvensering av hela genomet har identifierat många öppna Läs ramar (ORFs) som ger många potentiella proteiner. Dessa proteiner kan ha viktiga roller för cellen och kan nysta upp nya cellulära processer. Bland proteiner, kinaser är stora aktörer som de tillhör cell signalering vägar och har förmågan att slå på eller av många processer som är avgörande för ödet för cellen, såsom cell tillväxt, uppdelning, differentiering, motilitet, och död.

I denna studie fokuserade vi på ett nytt potentiellt Kinas protein, LIMK2-1. Vi visade dess existens genom Western blot med hjälp av en specifik anti kropp. Vi utvärderade dess interaktion med ett uppströms reglerande protein med hjälp av coimmunoprecipitionexperiment. Coimmunonederbörd är en mycket kraftfull teknik som kan detektera samspelet mellan två mål proteiner. Det kan också användas för att upptäcka nya partners av ett bete protein. Bete proteinet kan renas antingen via en tagg konstruerad till dess sekvens eller via en anti kropp som specifikt riktar sig mot den. Dessa protein komplex kan sedan separeras av SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel) och identifieras med hjälp av masspektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 användes också för att testa dess Kinas aktivitet in vitro-av γ [32P] ATP märkning. Denna väletablerade analys kan använda många olika substrat, och muterade versioner av betet kan användas för att bedöma den roll som specifika rester. Effekterna av farmakologiska agens kan också utvärderas eftersom denna teknik är både mycket känslig och kvantitativ. Radio aktivitets hanteringen kräver dock särskild försiktighet. Kinas aktivitet kan också bedömas med specifika anti kroppar riktade mot fosfogruppen av den modifierade aminosyran. Dessa typer av anti kroppar är inte kommersiellt tillgängliga för alla fosfimodifierade rester.

Introduction

Under många decennier har många signal vägar klarlagts och deras medverkan i viktiga cellulära processer såsom cell delning, differentiering, motilitet, programmerad celldöd, immunitet och neurobiologi, har visats. Kinases spelar en viktig roll i dessa signal vägar eftersom de ofta fint reglerar deras aktivering eller inaktive ring och är en del av övergående mångsidiga komplex som reagerar på yttre stimuli1,2,3. Mutation och Dysreglering av kinaser leder ofta till sjukdomar hos människor, och de har därför blivit en av de viktigaste drogen mål under de senaste 40 år4.

I detta sammanhang är det viktigt att kunna upptäcka Kinas interaktion med deras uppströms regulatorer eller nedströms substrat och att identifiera nya partners. Affinitet rening och immunutfällning är mycket kraftfulla tekniker för isolering av protein komplex5. Betet protein eller Kinas kan märkas med en specifik peptid sekvens gör det möjligt att använda kommersiella pärlor kovalent kombination med anti kroppar inriktade på peptiden. Detta material möjliggör en hög reproducerbarhet i experiment6,7,8. Endogena proteiner kan även vara immunutfällda med anti kroppar riktade direkt mot bete proteinet. Anti kropparna kan vara tvär bunden till protein A eller protein G AGA ros pärlor eller helt enkelt inkuberas med dessa pärlor innan du lägger lysate. Lysbuffertar måste optimeras för att möjliggöra proteinlösbilisering utan att förlora interaktion och för att undvika protein nedbrytning. En stor nackdel med detta tillvägagångs sätt är att interaktionen upptäcks vid celllys; Därför kan övergående eller svaga interaktioner, tillsammans med de som kräver subcellulär kontext, missas. Andra tekniker kan användas för att arbeta direkt i cellen som närhet ligation assay (PLA)9, in vivo tvär bindning-assisterad affinitet rening (XAP)10, bioluminescence resonans energi överföring (Bret) eller Förster resonans energi Överföring (fret)11,12. Dessutom är immunutfällning inte lämplig för bestämning av de termodynamiska konstanterna hos bindningen, för vilka fysikaliska tekniker såsom Ytplasmon-resonans, Isotermisk titrering Calorimetri eller Microscale Thermophoresis krävs 13,14.

Kinas aktivitet kan bedömas med hjälp av flera tekniker. Häri fokuserade vi på fosfospecifika anti kroppar och in vitro γ [32P] ATP (adenosintrifosfat) märkning. Fosfospecifika anti kroppar inriktar sig på fosfatmodifiering av en viss rest i ett protein. De kan användas i Western blot eller ELISA (enzymkopplad ImmunoSorbent assay) efter cell lysis, för immunhistokemi, och även på intakta celler med flödescytometri eller immunofluorescens. Deras nack delar kan omfatta deras brist på specificitet, som kan utvärderas med hjälp av en muterad version av mål proteinet, och att de inte är kommersiellt tillgängliga för alla proteiner. In vitro γ [32P] ATP märkning är en mycket robust, väletablerad och mycket känslig metod15. Immunoprecipiterade eller rekombinanta proteiner kan användas, och olika substrat kan testas. Effekterna av droger kan också bedömas eftersom denna metod är kvantitativ. Dess största nackdel är att radio aktiviteten i samband med metoden kräver hantering med försiktighet. Alternativa metoder är också möjligt baserat på mätning av fluorescerande eller självlysande peptid substrat och dra nytta av förändrade fluorescerande/självlysande egenskaper vid fosforylering. Sådana metoder möjliggör också hög genom strömning, vilket krävs, till exempel vid screening av molekyler som kan vara potentiella hämmare av mål Kinas. Faktum är att kinaser utgör en av de största klasserna av narkotika mål som eftersträvas av läkemedels företag16.

I denna studie fokuserade vi på LIMK2-1-proteinet (LIMK2-1 står för Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). LIMK2 Kinas protein beskrevs först i 1995-17. Tre ISO former av LIMK2 framställs genom alternativ skarvning: LIMK2a, LIMK2b och LIMK2-1. För närvarande har LIMK2-1 endast beskrivits på mRNA-nivå i en enda studie18. Häri karakteriserar vi detta potentiella nya Kinas protein på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder. För det första visar vi att LIMK2-1 är verkligen syntetiseras. Liknar dess två motsvarigheter, LIMK2a och LIMK2b, det interagerar med uppströms Kinas ROCK (Rho-associerade protein Kinas). Vi visar LIMK2-1 har en Kinas aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men inte på cofilin, den kanoniska substrat av LIM kinaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell förberedelse för transfektion

Varning: alla steg i cell kulturen måste utföras i ett särskilt laboratorium, och celler manipuleras inom ett klass 2 mikrobiologiskt skåp.

  1. Frö HEK-293 (Human embryonal njure) celler i Ø 10 cm plattor i 10 mL DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles medium) kompletteras med 10% Foster kalv serum. Kultur för 3 till 5 dagar under 5% CO2, vid 37 ° c, tills cellerna når ~ 90% confluence.
  2. Behandla Ø 10 cm plattor med kollagen R att öka cellernas vidhäftning till plast plattorna.
    1. Tillsätt 5 mL av en lösning av kollagen R, 200-faldig utspädd i fosfatbuffert (PBS) i en Ø 10 cm plåt. Överlägg vätskan över hela plattans yta.
    2. Inkubera vid rums temperatur i minst 1 h inom biosäkerhets skåpet.
    3. Ta bort kollagen lösningen och kassera den. Tillsätt 5 mL PBS, Sprid ut den över plattans yta, ta bort den och kassera den. Upprepa denna tvätt en gång.
    4. Tillsätt 8 mL DMEM kompletterat med 10% Foster kalv serum. Förvara de beredda plattorna i biosäkerhets skåpet.
  3. Ta HEK-293 plattor från steg 1,1 inom biosäkerhets skåpet. Ta bort mediet från plattorna och kassera det i en dedikerad blek medel skräp. Tillsätt 2 mL kompletterad DMEM, och spola cellerna för att lossa dem med hjälp av flödet av en 1 mL mikropipett, var noga med att undvika att göra skum.
  4. Samla in cellerna i ett 15 mL-rör och tillsätt 4 mL kompletterad DMEM. Homogenisera med en 10 mL pipett genom att Pipettera upp och ner 3 gånger.
  5. Ta 2 mL av denna cell lösning och tillsätt dem till kollagen-behandlade plattor som innehåller kompletterade DMEM från steg 1.2.4.
  6. Växa i 24 timmar i inkubator på 5% CO2 och 37 ° c. Cellerna bör vara 50-80% konflytande vid tidpunkten för transfektion.

2. övergående transfektioner

  1. Ta bort mediet från plattorna, kassera det i en dedikerad blek medel skräp, och tillsätt 10 mL av ny kompletterad DMEM. Sätt tillbaka plattorna i inkubator vid 37 ° c under förberedelserna av transfektionsmblandningen.
  2. Tillsätt i ett 15 mL-rör 450 μL 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA (tris står för tris (hydroxymetyl) aminmetan, och EDTA för etylenedinitrilotetraättiksyra) lösning och 50 μL av en 2,5 M CaCl2 lösning. Blanda genom inversion.
  3. Tillsätt 10 μg plasmidiskt DNA (Deoxyribonukleinsyra) som framställts från en MIDI-beredning på en flytande bakterie odling som transformeras med den dedikerade plasmid. Blanda genom inversion.
  4. Under smidig agitation på en virvel, tillsätt 500 μL av BES buffrade saltlösning 2x koncentrat (sammansättning: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na2HPO4, 0,27 g/l; BES står för N, N-bis (2-hydroxyeyl) -2-aminoetylsulfonsyra, N, N-bis (2-hydroxyeyl) taurin) droppe långsamt.
  5. Inkubera i minst 15 min (upp till 45 min) vid rums temperatur inom biosäkerhets skåpet. Inte virvel, blanda inte! Flytta rören mycket noga för att inte störa den komplexa bildningen mellan DNA och kalcium fosfat.
  6. Ta plattorna från steg 2,1 till säkerhets skåpet. Tillsätt DNA-komplex mycket noggrant, droppe för droppe, på cellerna över ytan av plattan.
  7. Inkubera i 24 till 72 timmar i inkubator vid 37 ° c. Vanligt vis uppnås maximalt protein uttryck inom 48 timmar.

3. Lys

Obs: arbete på is, och med kalla buffertar för att förhindra protein nedbrytning.

  1. Förbered lyseringsbuffert: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM natriumpyrofosfat, 1 mM na3VO4, 20 mm p-nitrofenylfosfat, 20 mm β-glycerofosat, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidinsyra , 1 μg/mL leupeptin och 1 mM PMSF (Fenylmetylsulfonylfluorid). Cirka 4 ml lyseringsbuffert krävs för varje transfekterade plåt.
  2. Ta bort plattorna med transfekterade celler från inkubator. Lägg dem på is.
    Obs: från detta steg är det möjligt att arbeta på en "normal" bänk.
  3. Ta bort mediet och kassera det i en dedikerad blek medel skräp.
  4. Tvätta två gånger med 3 ml kallt PBS: tillsätt 3 ml PBS på sidan av plattan droppe för droppe för att undvika att lossa transfekterade celler, spridda över ytan av plattan, ta bort PBS och kassera den; upprepa det här steget en gång till. I slutet, ta försiktigt bort resten av PBS genom att luta plattan för att förhindra lyseringsbuffert utspädning för nästa steg.
  5. Tillsätt 500 μl kalllyseringsbuffert på de transfekterade tvättade cellerna. Sprid den över ytan av plattan.
  6. Inkubera i 10 min på is. Från tid till annan (minst två gånger), Sprid igen bufferten över hela ytan av plattan.
  7. Skrota cellerna och samla dem i ett mikrocentrifugerör.
  8. Centrifugera i 10 min vid 10 000 x g vid 4 ° c.
  9. Samla supernatanten i ett nytt mikrocentrifugerör. Denna fraktion motsvarar det lysat (hela cell extrakt). Kassera pelleten som motsvarar cell membranets skräp.
  10. Samla en alikvot av denna fraktion till ett nytt mikrocentrifugerör (ca 50 μL). Denna fraktion motsvarar "total fraktion" eller "celllysat" eller "helcellsextrakt" som möjliggör analys av huruvida transfekterade proteiner uttrycks av Western blot.
    Obs: vid denna punkt, prover kan användas direkt för Western blot analyser. Laemmli-bufferten skall läggas till i provet, som sedan värms upp till 95 ° c i 5 min, centrifugeras vid 10 000 x g i 5 min och lastas på lämplig SDS-sida. Proverna kan också förvaras vid-80 ° c.

4. immunutfällning

  1. Försiktigt omsuspendera AGA ros pärlor i kombination med lämplig anti kropp: ha (Human influensa hemagglutinin), Flag, eller GFP (grön fluorescerande protein) genom smidig inversion.
  2. Skär änden av en 200 μL spets från en mikropipett så att pärlor kan komma in i spetsen. Pipettera pärlorna upp och ner flera gånger för att mätta spetsen för att säkerställa att ta rätt volym av pärlor.
  3. Ta 40 μL pärlor i ett mikrocentrifugerör.
  4. Tillsätt 500 μL TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) buffert. Blanda genom inversion. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g vid 4 ° c. Ta försiktigt av supernatanten och kassera den. Tillsätt 500 μL TENET. Inkubera i minst 1 timme vid 4 ° c på ett roterande hjul.
    Anmärkning: detta pre-inkubations steg i TENET gör det möjligt att minska icke-specifika interaktioner och så att minska bakgrunds signalen.
  5. Tvätta pärlorna två gånger med 500 μL lyseringsbuffert.
    1. Centrifugera 2 min vid 1 000 x g vid 4 ° c.
    2. Ta försiktigt bort supernatanten buffert och kassera den.
      Obs: var noga med att inte aspirera pärlor under dessa tvätt steg.
    3. Tillsätt 500 μL lyseringsbuffert. Homogenisera genom att Invertera röret.
    4. Upprepa steg 4.5.1-4.5.3.
  6. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g vid 4 ° c. Ta försiktigt bort supernatanten buffert och kassera den.
  7. Inkubera pärlor med lysat från steg 3,9 för 2 till 4 timmar vid 4 ° c på ett roterande hjul.
  8. Tvätta immunoprecipiterade pärlor.
    Obs: vid denna punkt, de immunutfällda pärlor kan tvättas fem gånger med lyseringsbuffert, och sedan elueras med Laemmli buffert. Eluatet kan användas för Western blot-analyser eller förvaras vid-80 ° c. Alternativt kan pärlor tvättas två gånger med lyseringsbuffert och sedan tre gånger med Kinas buffert för att utföra γ [32P] ATP märkning.

5. coimmunoprecipidationsanalyser

  1. Tvätta immunoprecipiterade pärlor från steg 4,7 med lyseringsbufferten.
    1. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g i en kyld centrifug vid 4 ° c.
    2. Ta försiktigt bort supernatanten och kassera den.
    3. Tillsätt 500 μL lyseringsbuffert. Homogenisera genom att Invertera röret.
    4. Upprepa steg 5.1.1-5.1.3 fyra gånger.
  2. Eluering
    1. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g i en kyld centrifug vid 4 ° c.
    2. Ta försiktigt bort supernatanten och kassera den. Ta bort de sista dropparna av supernatanten med en Hamilton spruta för att undvika aspiration av pärlorna, och Kassera supernatanten.
    3. Tillsätt 40 μL 4x Laemmli-buffert (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glycerol, 0,5 M β-merkaptoetanol, 0,02% Bromophenolblått). Homogenisera genom att försiktigt knacka röret.
    4. Inkubera i 5 minuter i rums temperatur.
    5. Centrifugera i 5 min vid 10 000 x g vid rums temperatur.
    6. Med en Hamilton spruta, ta bort supernatanten och samla in den i ett nytt mikrocentrifugerör. Denna fraktion motsvarar "eluatet", som kan lagras vid-80 ° c, eller direkt analyseras av Western blot.

6. Kinas analys

  1. Förbered Kinas buffert: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES står för 4-(2-hydroxyeyl) -1-piperazineetylsulfonsyra), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2,5mm mncl2, 50 mm NAF, 1 mm na3VO4, 20 mm β-Glycerofosat, 1 μg/ml leupeptin och 1 mM PMSF. Runt 2 mL av Kinas buffert krävs för varje immunutfällning tillstånd.
  2. Tvätta immunoprecipiterade pärlor från steg 4,7 två gånger med 500 μL lyseringsbuffert.
    1. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g i en kyld centrifug vid 4 ° c.
    2. Ta försiktigt bort supernatanten och kassera den. Tillsätt 500 μL lyseringsbuffert. Homogenisera genom inversion.
    3. Upprepa steg 6.2.1 och 6.2.2.
  3. Tvätta immunoprecipiterade pärlor tre gånger med 500 μL Kinas buffert.
    1. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g i en kyld centrifug vid 4 ° c.
    2. Ta försiktigt bort supernatanten och kassera den. Tillsätt 500 μL Kinas buffert. Homogenisera genom inversion.
    3. Upprepa steg 6.3.1 och 6.3.2 två gånger.
  4. Centrifugera i 2 min vid 1 000 x g i en kyld centrifug vid 4 ° c.
  5. Ta försiktigt bort supernatanten och kassera den. Ta bort de sista dropparna av supernatanten med en Hamilton spruta för att undvika aspiration av pärlorna, och Kassera supernatanten.
  6. Tillsätt 40 μL av Kinas buffert till de immunutfällda pärlorna. Omsuspendera pärlorna genom att Knacka försiktigt på röret.
  7. Förbered blandningen för γ [32P] ATP märkning (slutlig volym är 22,5 μl, komplett med Kinas buffert) i en säker lås-röret.
    1. Tillsätt den erforderliga volymen av Kinas buffert för att nå en slutlig volym på 22,5 μL.
    2. Skär änden av en 20 μL spetsen av en mikropipett. Omsuspendera de immunoprecipiterade pärlorna från steg 6,6 genom att Pipettera upp och ner flera gånger. Samla in 10 μL av dessa pärlor i Safe-lock-röret.
    3. Lägg till ATP från en 10 μM stam lösning för att nå 50 mM av finalen koncentration. Enligt antalet behandlade prover, föreslås en utspädning av stam lösningen av ATP i Kinas buffert för att Pipettera 1 till 2 μL, för att vara säker på att volymen är korrekt.
    4. Tillsätt 2,5 μg substrat (cofilin eller myelin Basic protein, MBP i det aktuella studie fallet).
  8. Tillsätt 5 μCi γ [32P] ATP (3 000 CI/mmol) för att initiera reaktionen. Blanda genom att Pipettera upp och ner långsamt.
    Varning: från denna punkt måste arbetet utföras på en säkerhets plats avsedd för radio aktivitet manipulationer med försiktiga försiktighets åtgärder, särskilda skydd och lämpliga kontroller (radioaktiva sköldar, Geigerräknare, särskilda avfall samla in, personliga bröst och finger märken för att upptäcka radioaktiv exponering, filter tips).
  9. Inkubera i 20 min vid 30 ° c.
  10. Stoppa reaktionen med 6 μL av 5x Laemmli buffert.
  11. Värm vid 95 ° C i 5 min.
  12. Centrifugera vid 10 000 x g i 5 min vid rums temperatur.
  13. Ladda på en SDS-PAGE. Fortsätt till migreringen.
    Obs: var noga med att den främre raden av fri γ [32P] ATP inte lämnar gelen för att undvika kontaminering av flyttnings tanken.
  14. Färga gelen vid rums temperatur.
    1. Ta bort gelen från glas plattorna.
    2. Fortsätt med tre bad i vatten vid rums temperatur.
    3. Färga gelen över natten med Coomassie Blue vid rums temperatur.
    4. Destain gelen med flera tvättbad med vatten i rums temperatur.
  15. Linda in gelen med plastfolie.
  16. Exponera för en natt eller mer på en fosformager skärm.
  17. Läs skärmen på en fosformager att upptäcka märkta band.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LIMK2-1 protein syntetiseras
LIMK2-1 nämns i databanks, men hittills har bara ett papper visat förekomsten av dess mRNA18. Jämfört med dess två homologs, LIMK2a och LIMK2b, LIMK2-1 har en extra C-Terminal domän identifierats som en protein fosfatas 1 hämmande domän (PP1i). Vi designade en anti kropp som inriktar sig på en peptid av denna domän, aminosyror 671-684 (figur 1a).
BLAST forskning mot mänskliga protein databaser visade att endast ett protein, PHI-1 (fosfatas holoenzymhämmare 1), har en stark sekvens likhet med denna 12 aminosyran sekvens. Men, PHI-1 migrerar vid 23 kDa på SDS-PAGE gels, långt borta från LIMK2-1, som förväntas migrera runt 75 kDa (dvs, de två bör inte störa). Vi validerade denna anti kropp först för hek-293 celler transfekterade antingen med LIMK2-1, LIMK2a, eller LIMK2b och visade att anti-PP1i anti kroppen kunde känna igen transfekterade LIMK2-1 (pcmv-LIMK2-1) och ha-märkt LIMK2-1, men inte korsreagera med HA-Tagged LIMK2a eller LIMK2b (figur 1b). Vi observerade ett band av endogena LIMK2-1 i hek celler transfekterade med ha-Tagged versioner av LIMK2 ISO former (indikeras av en pil i anti-PP1i blot; Figur 1b). För det andra kontrollerade vi om den signal som inducerats av anti-PP1i-antikroppen var specifik för LIMK2-1 med hjälp av siRNA med inriktning på de tre skarvas varianterna av LIMK2 (figur 1c). I närvaro av LIMK2 siRNA observerades en reproducerbar och signifikant minskning av intresse gruppen (indikeras av en pil i figur 1c) jämfört med kontroll förhållanden, vilket tyder på att anti kroppen är specifik för LIMK2-1. Efter detta använde vi anti-PP1i anti kropp för att upptäcka LIMK2-1 i olika cell linje extrakt: HEK-293 (mänskliga embryonala njure celler), HeLa (Human epitelial cervix celler), och C6 (Rat Brain Gliala celler). Dessa celler störs i lyseringsbufferten som innehåller 1% Triton X-100. Med hjälp av silico-analys visades LIMK2-1 vara Hominidae primater-specifika19. Western blot-analys med anti-PP1i-antikroppen visade att LIMK2-1 verkade uttryckas i HEK-293 och HeLa men inte i C6-celllinjer som förväntat från i silico-studier (figur 1d). Dessa experiment upprepades med olika mänskliga vävnader, visar att nivåerna av LIMK2-1 protein varierade beroende på vävnaden: de högsta nivåerna hittades i levern, lägre nivåer i bukspottkörteln, och den lägsta i testiklarna och lunga. LIMK2-1 kunde inte upptäckas i hjärn vävnaden (figur 1e). Vi observerade lägre molekyl vikt band i alla vävnadsprover utom levern, vilket tyder på nedbrytning av hela proteinet förmodligen på grund av Lys villkoren för dessa kommersiella prover (denna lysis buffert innehåller en cocktail av hämmare som inte anges på Data blad, som kan vara mindre effektiva än de många proteashämmare och fosfatashämmare vi använder i vår hemgjord buffert). Dessa data visar att humant LIMK2-1-protein syntetiseras och uttrycks annorlunda i de testade vävnaderna.

LIMK2-1 interagerar med dess uppströms Kinas ROCK
LIMK2-1 homologs, LIMK2a och LIMK2b, har beskrivits som regleras av uppströms Kinas ROCK. Vi bedömde samspelet mellan LIMK2-1 och ROCK med hjälp av coimmunoprecipitionexperiment. HEK celler var co-transfected med vektorer kodning cMyc-Tagged ROCK1 och antingen en av HA-märkt version av LIMK2 isoforms, eller orelaterade HA-märkt protein Larp6. Larp6 fungerar som en negativ kontroll, vilket möjliggör upptäckt av icke-specifika interaktioner. Celler lyserat och anti-ha immunonederbörd utfördes. Lysates (helcellsextrakt) och immunprecipitater analyserades av Western blot, med anti-HA-och anti-cMyc-antikroppar. Som skildras i figur 2 (vänster paneler; Lysates), var och en av de olika proteiner kodade av transfekterade vektorer är väl uttryckta. De tre ISO formerna av LIMK2, samt Larp6, är effektivt immunoprecipiterade (figur 2, nedre högra panelen; Eluates). I eluaterna upptäcks ROCK och därmed medimmunoprecipiterade med de tre ISO formerna av LIMK2, men inte med Larp6 (figur 2, övre högra panelen; Eluates). Detta visar att ROCK interagerar med de tre ISO formerna av LIMK2, särskilt med den nypräglade isoformen LIMK2-1. Denna interaktion är specifik eftersom den negativa kontrollen (Larp6) inte interagerar med ROCK.

Häri presenterar vi data för immunnederbörden som utförs med anti-HA-antikroppar; interaktionen kan dock testas i motsatt riktning genom immunprecipiterande ROCK med pärlor konjugerade med cMyc-antikroppar och analysera eluater med HA-antikroppar för att detektera LIMK-coimmunutfällning.

Kinas aktivitet
Fosho-cofilin i intakta celler
Homostockarna i LIMK2-1, LIMK2a och LIMK2b har visats fosforylera cofilin, en aktin depolymerisationsfaktor, på dess Serine3. Med hjälp av en anti kropp specifikt inriktad på phospho-Serine3 av cofilin, vi studerade LIMK2 Kinas aktivitet genom att mäta nivån av endogena fosfocofilin i HEK celler överuttrycker en av de LIMK2 ISO formerna. Hek celler var transfekterade med vektorer kodning antingen en av ha-Tagged LIMK2 ISO former, eller motsvarande Tom vektor som en negativ kontroll. Cellerna lyserades och de olika lysaterna analyserades av Western blotting med anti-phospho-Serine3 cofilin-antikroppen. Överuttrycket av LIMK2a och LIMK2b inducerade en signifikant och reproducerbar ökning av fosfilinnivåerna i förhållande till kontroll förhållandena, medan förekomsten av LIMK2-1 inte hade någon detekterbar effekt (figur 3, vänster panel).

Vi upprepade samma experiment med en C-Terminal YFP-Tagged (gul fluorescerande protein) version av de tre LIMK2 ISO former och en otaggad version av LIMK2-1 för att utesluta eventuella störningar av N-terminalen HA tagg. Resultaten var identiska med de som erhållits med hjälp av HA-Tagged versioner av de tre ISO formerna (figur 3, höger panel som visar yfp Tagged version). Transfection effektivitet bedömdes för yfp-Tagged versionen av limk ISO former använder flödescytometri att utesluta att detta resultat kan ha varit på grund av skillnaden i protein uttryck. De tre ISO formerna visade liknande transfection effektivitet: 54% för LIMK2-1, 49% för LIMK2b och 43% för LIMK2b.

Tester av in vitro- Kinas
Vi studerade sedan Kinas aktivitet av LIMK2 isoformer genom in vitro-märkning med γ [32P] ATP. Figur 4a visar det allmänna schemat för denna in vitro-märkning. HEK-cellerna transfekterades med antingen en av de HA-märkta versionerna av LIMK2-isoformerna eller det orelaterade proteinet, Larp6, som användes som en negativ kontroll. Kinas aktivitet i anti-HA-immunprecipitater mättes med rekombinant GST-cofilin som substrat i närvaro av γ [32P] ATP. HA-immunoprecipitated Larp6 visade ingen Kinas aktivitet på cofilin. HA-immunoprecipitated LIMK2a och LIMK2b fosforylerade cofilin, medan LIMK2-1 inte (figur 4b). Vi fick liknande resultat med hjälp av YFP-märkta versioner av de tre isoformerna immunoprecipitated med GFP-trap pärlor i närvaro av rekombinant cofilin och γ [32P] ATP (figur 4D).

Vi testade sedan om LIMK2-1 hade ingen Kinas aktivitet eller om dess aktivitet på cofilin var nedsatt. Vi upprepade in vitro-märkning experiment med myelin Basic protein (MBP), ett effektivt substrat för många Proteinkinaser, i stället för cofilin. Det fanns en hög bakgrunds signal i kontroll tillståndet när analysen utfördes i närvaro av HA-Tagged versioner: den negativa kontrollen, HA-immunoprecipitated Larp6, producerade en stark signal av fosforyleras MBP, även om det inte är en Kinas ( Figur 4C). Vi övervann detta problem med hjälp av YFP-Tagged version av dessa proteiner. Under dessa förhållanden var bakgrunden i kontrollen (enbart YFP) låg, vilket möjliggjorde att mer specifika studier genomfördes. GFP-fångade YFP-LIMK2a, LIMK2b och LIMK2-1 visade Kinas aktivitet mot MBP, även om aktiviteten av LIMK2-1 var lägre (figur 4D). Emellertid, LIMK2-1 var också mindre effektivt immunoprecipitated under dessa förhållanden (se Coomassie Brilliant Blue (CBB) färgning och Western blotting). Således visade de tre ISO formerna jämförbar aktivitet på MBP när fosho-MBP normaliserades till immunutfällda LIMK2 nivåer av CBB-färgning (figur 4D, undre panelen). Immunprecipitater analyserades också av Western blot med anti-ROCK anti kroppar för att kontrol lera om aktiviteten på MBP kan bero på närvaron av ROCK, som skulle ha varit coimmunoprecipitated med LIMK2s. Vi kunde inte upptäcka någon ROCK signal i LIMK2 immunprecipitates. Så MBP fosforylering är inte på grund av ROCK utan att LIMK2s per se.

Sammantaget visar dessa data att LIMK2a och LIMK2b har liknande aktiviteter på cofilin och MBP. Även om LIMK2-1 visar Kinas aktivitet mot MBP jämförbar med de andra två isoformer, cofilin är inte ett bra substrat för det.

Figure 1
Figur 1: bevis för förekomsten av LIMK2-1-proteinet. ASchematiskt diagram över de tre ISO formerna av mänsklig LIMK2. LIMK2 ISO former beskrivs i Entrez Gene: LIMK2-1 (np_ 001026971.1), LIMK2a (np_ 005560.1), LIMK2b (np_ 057952.1). De olika domänerna i LIMK2 visas: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM (kortare LIM domän), PDZ (PSD95, Dlg1, zo-1), S/P (serine ProLine rik), Kinas (kortare Kinas domän), och PP1i (protein fosfatas 1 hämmande). Sekvensen som valts för anti-PP1i anti kropps design visas i rött. (B och C) Validering av anti-LIMK2-1-antikroppen. (B) hek-293-celler transfekterades med OTAGGADE LIMK2-1 (PCMV-LIMK2-1) eller en av de ha-märkta ISO formerna av LIMK2. Lysates analyserades av Western blotting med hjälp av de indikerade anti kropparna. Chek-293-celler transfekterades antingen med LIMK2 siRNA eller med kontroll siRNA. Lysates analyserades av Western blot. LIMK2-1 uttrycks i olika humana cellinjer (D) och vävnader (E). HEK-293, HeLa och C6-celler stördes i 1% Triton-X100 lyseringsbuffert. Vävnads extrakt köptes och prover därav analyserades av Western blotting. Denna siffra ändrades från Vallee et al., den biokemiska tid skriften, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: De tre ISO formerna av LIMK2 interagerar med ROCK1. Hek-293 celler var co-transfected med cmyc-Tagged ROCK1 och antingen en av de tre ha-märkta LIMK2 ISO former (2-1, 2a, 2b) eller orelaterat protein, Larp6. Lysates och anti-HA immunoprecipitates utsattes för Western blotting. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: LIMK2-1 har ingen Kinas aktivitet mot cofilin i intakta celler. Hek-293 celler var transfekterade med endera en av de tre ha-märkt LIMK2 ISO former (1, 2a, 2b) eller den tomma föräldra-vektorn, pcDNA3 (vänster panel), eller med endera en av de tre yfp-taggade LIMK2 ISO former eller yfp ensam (höger panel). Lysates utsattes för Western blotting. Kvantifiering av förhållandet mellan fosfor-cofilin och cofilin visas i grafen till höger. Den fosho-cofilin kontra cofilin förhållandet av mock transfekterade celler normaliserades till 100. Varje värde representerar medelvärdet ± SE av tre oberoende experiment. Denna siffra ändrades från Vallee et al., den biokemiska tid skriften 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: LIMK2-1 har ingen in vitro-Kinas aktivitet mot cofilin, även om det fosforylerar MBP. (A) generell systematik för γ [32P] ATP in vitro-märkning. B) LIMK2-1 inte fosforylerar cofilin in vitro. HEK-293-celler transfekterades med antingen en av de tre HA-märkta LIMK2-isoformerna (2-1, 2a, 2b) eller ett orelaterat HA-märkt protein, Larp6, som en negativ kontroll. Anti-HA immunoprecipiterade proteiner och GST-cofilin användes i Kinas analysen. Anti-HA immunoprecipitates utsattes också för anti-HA Immunoblotting och Coomassie blå färgning. (C) ha-Taggad immunnederbörd har en stark bakgrunds signal när MBP används som substrat. HEK-293-celler transfekterades med antingen en av de tre HA-märkta LIMK2-isoformerna (2-1, 2a, 2b) eller ett orelaterat HA-märkt protein, Larp6, som en negativ kontroll. Anti-HA immunoprecipiterade proteiner och MBP användes i Kinas analysen. Anti-HA immunoprecipitates utsattes också för anti-HA Immunoblotting och Coomassie blå färgning. (D) de tre LIMK2 isoformerna har Kinas aktivitet mot myelin bas protein (MBP). Hek-293 celler transfekterade med antingen en av de tre yfp-taggade LIMK2 ISO former (2-1, 2a, 2b) eller yfp ensam. Anti-GFP immunoprecipitated LIMK2 isoformer och cofilin eller MBP användes i Kinas analysen. Den anti-GFP immunoprecipitates utsattes också för anti-GFP Immunoblotting och Coomassie blå färgning. Kvantifiering av phospho-cofilin och fosho-MBP visas i den nedre grafen. Phospho-cofilin nivåer som erhölls med anti-GFP immunoprecipitated LIMK2a var normaliserade till 100. Varje värde representerar medelvärdet ± SE av tre oberoende experiment. Denna siffra ändrades från Vallee et al., den biokemiska tid skriften, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Häri har vi använt robusta biokemiska verktyg för att karakterisera på molekylär nivå ett nytt protein, LIMK2-1, tros vara en Kinas baserat på dess sekvens och på dess homologs, LIMK2a och LIMK2b20.

För det första demonstrerade vi förekomsten av LIMK2-1 på protein nivå med hjälp av Western blot-analys med en specifik anti kropp. Efter detta utvärderade vi dess interaktion med uppströms Kinas ROCK1, som är känd för att reglera LIMK2a och LIMK2b, homologer av LIMK2-1. Slutligen bedömde vi potentiell Kinas aktivitet av LIMK2-1 genom in vitro γ [32P] ATP märkning och i cellulo av Western blot med hjälp av en specifik fosfoantikropp.

Lyseringsbuffertsammansättning
Vid studier av proteiner för att analysera dem med Western blot krävs särskild försiktighet när det gäller lyseringsbuffertsammansättningen. Flera parametrar måste beaktas: (i) rengörings medels typ och koncentration21och (II) proteashämmare.

Lyseringsbuffertens sammansättning måste anpassas till mål proteinet för att under lätta dess nära kompletta solubilisering för att extrahera den så mycket som möjligt och för att tillåta att den upptäcks av Western blot. För lösliga proteiner räcker det ofta med milda tillstånd (t. ex. ett milt rengörings medel vid låg koncentration) för att uppnå detta. För membran proteiner krävs ofta starkare förhållanden. Det finns olika kategorier av rengörings medel: (i) jonisk, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB), (II) icke-joniska såsom polyetylenglykolhexadecyl (BRIJ), Triton, Octylglukosid (OG), Dodekylentosid (DDM) III) zwitterionic såsom 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) eller zwittergents. Starka rengörings medel kan störa interaktioner och komplex kan gå förlorade. För immunprecipitationexperiment kan anti kroppar dessutom vara känsliga för svåra förhållanden. På samma sätt kan enzym aktivitet störas av närvaron av rengörings medel som kan utvecklas eller denaturera det studerade proteinet. Både typ och mängd av det använda disk medlet kan påverka egenskaperna och aktiviteten hos ett protein. För vissa proteiner, tolereras ett mycket begränsat antal av koncentrationen av tvätt medel för att bevara aktiviteten av proteinet. Under detta spänner proteinet återstår olösligt, eftersom över denna spänner av koncentration, proteinet är inte längre aktivet.

Proteashämmare måste tillsättas till lyseringsbufferten för att förhindra nedbrytning av mål proteinet genom endogena proteaser. Proteashämmare cocktails är kommersiellt tillgängliga. De kan användas som utgångs punkt för en studie. Om problem påträffas, kan man överväga att använda en blandning av hämmare extillfälligt beredd från lager lösningar lagrade vid-20 ° c. Dessa hämmare måste rikta serin och Cystein proteaser. PMSF (Fenylmetylsulfonylfluorid) används ofta, men det är mycket instabilt i vatten lösning och måste läggas strax före utvinning. Metalloproteaser bör också hämmas: metallkelaterande reagenser, såsom EDTA (etylenglytrilotetraättiksyra) eller EGTA (etenglykol-bis (2-aminoetylether)-tetraättiksyra), som binder till mg2 +, används i detta syfte. För att hålla proteinet i deras fosforylerade och därmed aktive rad form, rekommenderas det också att lägga till fosfatashämmare till lyseringsbufferten. Dessa hämmare måste inriktas på alkaliska, syra, serin, treonin och tyrosinfosfataser. Att arbeta vid låg temperatur (4 ° c) rekommenderas också för att bromsa graden av proteolys.

Mål proteiner
Häri fokuserade vi på Epitope-taggade proteiner. Taggar (flagga, HA, cMyc, GFP, etc.) är mycket användbara för att upptäcka och rena proteiner, eftersom anti kroppar och anti kroppar kopplade pärlor är kommersiellt tillgängliga och är lätt reproducerbara material. Dock måste storleken och positionen för taggen beaktas eftersom detta kan påverka aktiviteten, lokalisering eller funktion av mål proteinet6,7,8. Det är också möjligt att arbeta med endogena proteiner. I detta fall måste anti kroppar som riktas mot just detta protein användas. De kan kopplas till pärlor (protein A eller protein G) kovalent (Cross-Link) eller inkuberas med lysat och sedan med pärlorna. När man arbetar med taggade proteiner, vars gen uttrycks på en Plasmid, är det lätt att byta till en muterad version av detta protein genom mutesis av genen. Det är då möjligt att arbeta med olika mutanter för att bedöma biologiska funktioner.

Immunoprecipitation
Immunutfällning är en mycket kraftfull teknik för att isolera partner av mål proteinet5. Sammansättningen av lyseringsbufferten (särskilt tvätt medel) måste noggrant fastställas för att bevara interaktionen (se ovan). Det är möjligt att detektera interaktionen mellan två identifierade proteiner. Det kan vara endogena proteiner eller överuttryckta proteiner. När proteiner uttrycks vid lågt överflöd, kan det vara nödvändigt att överuttrycka dem för att få starkare signaler. Omfattande tvättar av immunutfällda pärlor krävs för att avlägsna icke-specifikt samverkande proteiner eller föroreningar. Innan bestämning av immunoprecipitationseffektivitet eller co-immunutfälld partner närvaro, är det viktigt att kontrol lera att de olika partnerna är väl uttryckta och närvarande i lysat genom att analysera hela cellen lysate eller den ingående fraktionen av västerländska Blot. Dessutom är det möjligt att identifiera nya partner till ett mål protein och isolera nya komplex med hjälp av immunutfällning experiment. Dessa nya partners kan identifieras genom masspektrometri.

Sådana partner kan spela en viktig roll som aktivatorer av mål proteinet så att dess fulla aktivitet för ytterligare biologiska tester. Å andra sidan, coreNAS oönskade proteiner kan användas som ett argument att det inte finns en direkt interaktion mellan två identifierade partner, utan i stället att den upptäckta interaktionen genom co-immunonederbörd beror på en annan okänd partner. I detta specifika fall, för att vara säker på en direkt interaktion, behövs en annan experimentell anordning, såsom att arbeta på däggdjurs proteiner renas från bakterier.

Kinas aktivitet
Kinas aktivitet kan bedömas med olika tekniker. Häri fokuserade vi på in vitro-analys med γ [32P] ATP märkning och på hela cell extrakt analys av Western blot med hjälp av en specifik fosho-antikropp. γ [32P] ATP märkning är en mycket känslig och kvantitativ teknik som gör det möjligt att upptäcka svaga Kinas aktivitet15. Radio aktivitet inkorporering från ATP till mål substraten tillåter ett direkt mått på enzym aktivitet som skall göras. Det är möjligt att arbeta med olika substrat för att bedöma Kinas aktivitet av det studerade proteinet på olika mål. Det är också möjligt att identifiera aminosyror avgörande för Kinas aktivitet genom att mutera dem när proteinet är överuttryckt. Kinas aktivitet kräver en divalenta Cation såsom mg2 +, som måste finnas i Kinas buffert.

Den största nack delen med detta tillvägagångs sätt är hanteringen av radio aktivitet, som kräver särskilda anläggningar för experiment och för insamling av avfall. Alternativa metoder finns, såsom fluorescerande eller självlysande kit som detekterar biprodukter av reaktionen, såsom ADP (adenosindifosfat)16. Proteinfosforylering kan också studeras med masspektrometri, men en större mängd material krävs för dessa analyser. I vårt fall, vi försökte bedöma LIMK2 Kinas aktivitet med hjälp av kapillär elektrofores att öka vår effektivitet, men detta var tyvärr Miss lyckas.

Fosfospecifika anti kroppar är ytterligare ett verktyg för att studera fosforyleringen av ett protein. Breda allmänna anti-phospho Serine och tyrosin anti kroppar finns, kompetent att känna igen phospho-ser eller phospho-Tyr av några proteiner. Under de senaste åren, anti kroppar som riktar sig till en specifik fosho-plats av ett mål protein har varit allmänt utvecklad och oftast de erkänner både fosfor gruppen och de omgivande aminosyrorna. Särskild försiktighet krävs när man börjar arbeta med sådana anti kroppar, eftersom deras specificitet måste kontrol leras till exempel med en negativ kontroll, till exempel mål proteinet muterat på fosfor platsen. Vid sondering av en blot med en anti-phospho anti kropp, den blockerande lösningen får inte vara mjölk, eftersom detta innehåller fosfoproteiner som kan interagera med anti kroppen. Bovint serum albumin (BSA) rekommenderas, och fosfatashämmare kan tillsättas i den blockerande lösningen för att förhindra att fosfat släpps ut. Proverna får inte frysas och tinas, utan bereds som Ali kvoter som hålls vid-80 ° c. Faktum är att fosfor modifieringar är labila.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av La Ligue contre le cancer, L' Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, och la Région Centre Val de Loire. Ett stort tack till Aurélie Cosson och Déborah Casas för flödescytometri data, och till Keyron Hickman-Lewis för grundlig korrektur läsning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for γ[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for γ[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 		 Biochain

 		 P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis		 for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Tags

Biokemi cell linje kultur övergående transfektion immunnederbörd Western blot Kinas aktivitet γ [32P] ATP märkning fosfospecifik anti kropp
Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vallée, B., Doudeau, M., Godin, … More

Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter