Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.
Abstract
Der Darm ist die Heimat der größten Anzahl von Immunzellen im Körper. Die kleinen und großen Darm-Immunsysteme Polizei Exposition gegenüber exogenen Antigenen und modulieren Reaktionen auf potente mikrobiell abgeleitete Immunreize. Aus diesem Grund ist der Darm ein wichtiger Zielort für Immundysregulation und Entzündungen bei vielen Krankheiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) nach Knochen Knochenmarktransplantation (BMT) und viele allergische und infektiöse Erkrankungen. Murine Modelle von Magen-Darm-Entzündung und Kolitis werden stark verwendet, um GI-Komplikationen zu studieren und vorklinisch zu optimieren Strategien für Prävention und Behandlung. Daten, die aus diesen Modellen über Isolation und phänotypische Analyse von Immunzellen aus dem Darm gewonnen werden, sind entscheidend für ein weiteres Immunverständnis, das zur Linderung gastrointestinaler und systemischer entzündlicher Erkrankungen angewendet werden kann. Dieser Bericht beschreibt ein hochwirksames Protokoll zur Isolierung mononuklearer Zellen (MNC) aus dem Doppelpunkt unter Verwendung einer gemischten, auf Kieselsäure basierenden Dichtegradientenschnittstelle. Diese Methode isoliert reproduzierbar eine signifikante Anzahl lebensfähiger Leukozyten und minimiert dabei die Kontamination von Schmutz und ermöglicht eine nachträgliche Immun-Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder andere Methoden.
Introduction
Obwohl der Magen-Darm-Trakt (GI) in erster Linie der Verarbeitung und Resorption von Nährstoffen aus Der Nahrung gewidmet ist, behält der GI-Trakt auch zentrale Rollen in der Integrität des Gefäß-, Lymph- und Nervensystems und zahlreicher anderer Organe durch schleimhaut- und submukosalenImmunsystems 1. Das GI-Immunsystem hat eine einflussreiche Rolle sowohl in der gastrointestinalen als auch in der systemischen Gesundheit aufgrund seiner konstanten Exposition gegenüber fremden Antigenen aus Lebensmitteln, kommensalen Bakterien oder eindringenden Krankheitserregern1,2. So muss das GI-Immunsystem ein empfindliches Gleichgewicht aufrechterhalten, in dem es nicht pathogene Antigene toleriert und gleichzeitig angemessen auf pathogene Antigene1,2reagiert. Wenn das Gleichgewicht von Toleranz und Verteidigung gestört ist, können lokalisierte oder systemische Immundysregulation und Entzündungen auftreten, was zu einer Vielzahl von Krankheiten1,2,3führt.
Der Darm beherbergt mindestens 70% aller Lymphzellen im Körper4. Die meisten primären immunologischen Wechselwirkungen umfassen mindestens eine von drei Immunstationen im Darm: 1) Peyer es Patches, 2) Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) und 3) Lamina propria Lymphozyten (LPL). Jeder von ihnen besteht aus einem komplexen vernetzten Netzwerk von Immunzellen, die schnell auf normale Immunherausforderungen im Darm reagieren5. Beschränkt auf die Stroma über der Muskulatur, ist die lose strukturierte Lamina propria das Bindegewebe der Darmschleimhaut und umfasst Gerüste für den Villus, die Vaskulatur, Lymphdrainage und das Mukosalnervensystem sowie viele angeborene und adaptive Immun-Teilmengen6,7,8,9. LPL bestehen aus CD4+ und CD8+ T-Zellen in einem ungefähren Verhältnis von 2:1, Plasmazellen und myeloischen Abstammungszellen einschließlich, dendritischen Zellen, Mastzellen, Eosinophilen und Makrophagen6.
Es gibt ein wachsendes Interesse am Verständnis der Immundysregulation und Entzündung des Darms, wie es zu verschiedenen Krankheitszuständen betrifft. Solche Bedingungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa manifestieren alle unterschiedliche Konzentrationsniveaus der Darmentzündung10,11,12. Darüber hinaus können Patienten mit bösartigen oder nicht-bösartigen Erkrankungen des Markoder Immunsystems, die sich einer allogenen Knochenmarktransplantation (allo-BMT) unterziehen, verschiedene Formen der Kolitis entwickeln, einschließlich 1) direkte Toxizität durch Konditionierungsschemas vor BMT, 2) Infektionen, die durch Immunsuppression nach BMT und 3) Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) verursacht werden, die von Spender-Typ-T-Zellen angetrieben werden, die auf Spender-Allo-Antigene im Gewebe nach BMT13,14,15reagieren. Alle diese Post-BMT-Komplikationen führen zu signifikanten Veränderungen im Immunmilieu des Darms16,17,18. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Immunzellakkumulation im Mausdoppel und ermöglicht, wenn sie auf murine Empfänger nach BMT angewendet wird, einen effizienten Test sowohl der Spender- als auch der Empfängerimmunzellen, die an der Transplantationstoleranz beteiligt sind19 ,20. Weitere Ursachen für Darmentzündungen sind Bösartige Erkrankungen, Lebensmittelallergien oder Störungen des Darmmikrobioms. Dieses Protokoll ermöglicht den Zugang von Darm mononukleären Zellen aus dem Dickdarm und, mit Modifikationen, zu Leukozyten des Dünndarms in einem dieser präklinischen murine Modelle.
Eine PubMed-Suche mit dem Suchbegriff "Darm UND Immunzelle UND Isolation" zeigt über 200 Publikationen, die Methoden zur Dünndarmverdauung zur Extraktion von Immunzellen beschreiben. Eine ähnliche Literatursuche nach Dickdarm ergibt jedoch keine gut abgegrenzten Protokolle, die die Isolierung von Immunzellen vom Dickdarm angeben. Dies kann daran liegen, dass der Dickdarm mehr muskel- und interstitielle Schichten hat, was es schwieriger macht, vollständig zu verdauen als der Dünndarm. Im Gegensatz zu bestehenden Protokollen verwendet dieses Protokoll speziell Collagenase E von Clostridium histolyticum ohne andere bakterielle Kollagene (Collagenase D/ Collagenase I). Wir zeigen, dass mit diesem Protokoll die Verdauung des Kolongewebes unter Beibehaltung der Qualität isolierter mononukleärer Darmimmunzellen (MNC) ohne Zugabe von antiklumpenden Reagenzien wie Natriumversenat (EDTA), Dispase II und Desoxyribonuklease I (DNAse I)21,22,23. Dieses Protokoll ist optimiert, um eine reproduzierbare robuste Extraktion von lebensfähigem MNC aus dem murinen Dickdarm für weitere gerichtete Studien zu ermöglichen und sollte sich für die Untersuchung der Immunologie des Dickdarms oder (mit Modifikationen) des Dünndarms24 , 25.
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Protocol
Alle Studien wurden im Rahmen von Nagetierforschungsprotokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Miami Miller School of Medicine überprüft und genehmigt wurden, das die veterinärmedizinischen Standards der American Association erfüllt. für Labortierwissenschaft (AALAS).
1. Vorbereitung von Lösungen
-
Wie in Tabelle 1 beschrieben, bereiten Sie den Colon Buffer, Silica-Based Density Separation Media 100%, Silica-Based Density Separation Media 66%, Silica-based Density Separation Media 44%, Collagenase E Digestion Buffer und FACS Buffer vor.
- Colon Buffer am Tag vor dem Eingriff vorbereiten und über Nacht bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 100% Silica-basierte Dichte Trennmittel am Tag vor dem Eingriff vor und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C, wobei sie am Morgen des Auftauvorgangs auf Raumtemperatur platziert werden.
- Bereiten Sie 66% und 44% Silica-basierte Separationsmedien am Morgen der Isolierung vor, mit Raumtemperatur 100% Silica-basierte DichteTrennung simermittel und Colon Buffer.
- Messen Sie die entsprechende Menge an Clostridium histolyticum-abgeleitete Collagenase E und lagern Sie bei -20 °C über Nacht vor dem Eingriff. Lösen Sie sich am nächsten Morgen im entsprechenden Volumen des Colon Buffer auf, um den Kollagen-Verdauungspuffer abzuleiten. Für alle Inkubationen mit Collagenase Verdauungspuffer am Tag des Eingriffs, die Lösungen auf 37 °C vorwärmen.
- Halten Sie für die gesamte Protokolltreppe eine Zentrifuge bei 20 °C und die Drehzahl von 859 x gbei inaktivierten Bremsen (0 Verzögerung) für die Gradientenzentrifugation. Stellen Sie eine weitere auf 4 °C und Drehzahl von 859 x g, mit der Standardverzögerung, für Waschschritte.
2. Ernte des Colon
- Euthanisieren Sie die Maus über CO2-Erstickung gefolgt von AALAC-zugelassener Bestätigungsmethode.
- Legen Sie die Maus in eine Supine-Position und sprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol. Mit großen Gewebescheren, machen Sie einen vertikalen Mittellinienschnitt und setzen Sie das intakte Peritoneum aus.
- Öffnen Sie das Peritoneum mit einer feinen Sezierschere. Verwenden Sie Zangen, um den kleinen Darm zur Seite zu bewegen und den absteigenden Dickdarm auszusetzen. Ziehen Sie am absteigenden Doppelpunkt leicht nach oben, um den rektalen Teil des Dickdarms maximal freizulegen. Schneiden Sie das distale Rektum tief im Becken und sezieren und entfernen Sie den gesamten Dickdarm als eine Einheit, vom distalen Rektum zur Cecal-Kappe.
- Übertragen Sie den Dickdarm in 20 ml gekühlten Colon Buffer in einem 50 ml Polypropylenrohr.
3. Reinigung des Colon
- Legen Sie den Dickdarm auf ein befeuchtetes Papiertuch und extrahieren Sie den festen Stuhl, indem Sie leichten Druck auf die Darmwand mit dem stumpfen Ende der Schere oder Zange ausüben.
- Legen Sie den Dickdarm in eine Petrischale und spülen Sie den Darm mit 10 ml gekühltem Colon Buffer mit einer 10 ml Spritze mit 18 G stumpfer Füllnadel.
- Übertragen Sie den Doppelpunkt auf ein Colon Buffer befeuchtetes Papiertuch und entfernen Sie die Mesenterie und Fett mit dem scharfen Ende der Schere.
- Legen Sie den Doppelpunkt in eine Petrischale gefüllt mit 5-10 ml gekühlten Colon Buffer Agitieren manuell, um den verbleibenden Koloninhalt zu waschen. Wiederholen Sie dies 2-3 Mal.
- Schneiden Sie den Dickdarm längs von seinem muskulöseren rektalen Ende auf den proximalen Dickdarm (erzeugt ein einzelnes rechteckiges offenes Dickdarmstück) in einer Petrischale, die mit frisch gekühltem Colon Buffer gefüllt ist. Entsorgen Sie vorhandene Medien und füllen Sie sie mit einem sauberen gekühlten Colon Buffer auf.
- Waschen Sie den Darm 3 Mal, indem Sie ihn in der Petrischale kräftig wirbeln und nach jeder Wäsche die 5-10 ml gekühlten Colon Buffer ersetzen.
- Legen Sie das rechteckige Kolongewebe auf ein mit Colon Buffer befeuchtetes Papiertuch und schneiden Sie es, indem Sie es horizontal und dann in kleine Fragmente (3 mm x 3 mm Abschnitte) schneiden.
- Sammeln Sie die Doppelpunktfragmente sorgfältig mit feinen Zangen in 20 ml gekühlten Colon Buffer in einem 50 ml Polypropylen konischenRohr.
- Waschen Sie die Doppelpunkt-Fragmente 3 mal, jede waschen in 20 ml Colon Buffer, durch kräftiges Wirbeln der Röhre für 30 s. Zwischen jeder Agitation, lassen Sie die Gewebefragmente auf den Boden des Rohres zu setzen. Dekant oder Vakuum aspirieren den Überstand und verhindern dabei den Verlust von Gewebefragmenten im Aspirationsprozess zwischen jeder Wäsche.
HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, das Rohr nach jeder Wäsche zu wechseln.
4. Kollagenase Verdauung 1
- Fügen Sie 20 ml des Kollagen-Verdauungspuffers zu den gewaschenen Doppelpunktfragmenten in der 50 ml Polypropylen-Konusröhre hinzu.
- Legen Sie das geschlossene 50 ml-Rohr bei 37 °C in einen inkubierten Orbital-Shaker mit der Rotationsrate von 2 x g für 60 min. Stellen Sie sicher, dass die Gewebefragmente während der Rührung in ständiger Bewegung sind; Erhöhen Sie ggf. die Rotationsrate schrittweise, um sicherzustellen, dass sich keine Gewebefragmente am Rohrboden absetzen.
5. Vorbereiten von Silica-basierten SeparationsmedienGradienten
- Bereiten Sie 66% und 44% Silica-basierte Dichtetrennmedien vor, indem Sie 100% Silica-basierte Dichtetrennmedien bei 20 °C (Raumtemperatur) und Colon Buffer verwenden.
- Gießen Sie 5 ml 66% Silica-basierte Dichtetrennmedien in jeweils 3 separate 15 ml Polypropylenrohre. Bereiten Sie 3 Röhren pro Dickdarm vor. Dadurch bildet sich die höhere Dichtebasis des Gradientenisolationsverfahrens, auf das Trennmedien mit niedrigerer Dichte geschichtet werden, um den Trennverlauf zu erzeugen.
- Bei 20 °C bis zum Gebrauch lagern.
6. Sammlung von Supernatant aus Digestion 1
- Sammeln Sie nur den Überstand mit einer 25 ml serologischen Pipette und filtern Sie den Überstand durch ein 40 m langepore Filtrationsgewebe-Zellsieb, das nach Abschluss der Collagenase Digestion 1 in ein sauberes 50 ml Polypropylen-Konusrohr gelegt wird. Achten Sie darauf, keine vorhandenen Gewebefragmente zu aspirieren.
HINWEIS: Bewahren Sie alle verbleibenden sichtbaren Gewebefragmente in der Röhre auf. Diese werden einer zweiten Kollagenase-Verdauung unterzogen (Schritt 8).
7. Quenching Collagenase Verdauungspuffer
- Füllen Sie das 50 ml Polypropylenrohr vollständig mit gekühltem Colon Buffer.
HINWEIS: Kollagenase ist bei 37 °C aktiv; daher wird dieses Enzym durch einen gekühlten Puffer inaktiviert. - Zentrifugieren Sie das Rohr bei 4 °C bei 800 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration. Waschzellen mit 25 ml frischem Colon Buffer und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min.
- Das Pellet in weniger als 1 ml frisch gekühltem Colon Buffer wieder aufhängen.
- Legen Sie das 50 ml Polypropylen konische Rohr auf Eis.
8. Kollagenase Verdauung 2
- Wiederholen Sie Schritt 4 (Verdauung 1) mit den verbleibenden Gewebefragmenten, die ab Schritt 6.1 zurückgehalten werden.
9. Gewebedisaggregation nach Verdauung 2
- Spülen Sie die Gewebefragmente zwischen dem Rohr und einer 10 ml Spritze kräftig zwischen dem Rohr und einer 10 ml Spritze durch eine 18 G stumpfe Nadel.
- Wiederholen Sie diese Spülung für mindestens 7-8 komplette Passagen, bis keine groben Gewebefragmente oder Trümmer sichtbar sind.
10. Filterzellen
- Übergeben Sie die Gewebedisaggregationssuspension durch ein 40 m-pore Filtrationsgewebe-Zellsieb in ein sauberes 50 ml Polypropylenrohr.
- Waschen Sie das Filtrationsgewebe Zellsieb mit 10 ml gekühlten Colon Buffer, um alle Zellen im Filter verstrickt zu erholen.
11. Quenching Collagenase Verdauung
- Füllen Sie das 50 ml Polypropylen Konusrohr bis zur Felge mit gekühltem Colon Buffer.
HINWEIS: Die Temperatur des Colon Buffer ist entscheidend, um die Abschreckung der Kollagenaseaktivität zu gewährleisten. - Drehen Bei 4 °C und 800 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration.
- Waschen durch Wiederaufheben in 25 ml frisch gekühlten Colon Buffer, gefolgt von Zentrifugation bei 4 °C, 800 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration.
- Das resuspendierte Pellet von Collagenase Digestion 1 (Schritt 7) ab Schritt 11.4 auf das entsprechende Rohr bündeln.
- Wiederholen Sie Schritt 11.4 (Waschen und Zentrifugieren).
12. Silica-basierte Dichtetrennung Medien Gradient Enkteilung
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 12-18 so schnell wie möglich aus, um eine schnelle Abschreckung der Kollagenaseaktivität zu gewährleisten.
- Nach Schritt 11.7, setzen Sie jedes Pellet in 24 ml insgesamt 44% Silica-basierte Dichte Separation Medien pro Dickdarm.
- Langsam Schicht 8 ml des Mediums von Schritt 12,1 auf jedes der drei Rohre, die in Schritt 5.2 (mit 66% Silica-basierteDichte Separationsmedien) hergestellt werden, mit einer 10 ml serologischen Pipette. Halten Sie einen stetigen und langsamen Fluss der 44% Dichtetrennmedien bei gleichzeitiger Schichtung des Farbverlaufs aufrecht, um Unterbrechungen der Schnittstelle zu vermeiden.
- Balancieren Sie sorgfältig alle Rohre innerhalb der Zentrifugeneimer mit einer Waage oder einem Gleichgewicht.
- Drehen Sie die Rohre 20 min bei 859 x g in einer Zentrifuge ohne Bremse bei 20 °C. Lassen Sie die Rotoren vor dem Entfernen der Rohre ruhen, wobei Darauf zu achten ist, dass die Zellen an der Gradientenschnittstelle nicht gestört werden.
13. Sammeln Sie mononukleäre Zellen von der Gradientenschnittstelle
- Visualisieren Sie die Gradientenschnittstelle (in der Nähe der 5-ml-Markierung), wobei in der Regel ein 1-2 mm dickes weißes Band (mit MNC) vorhanden ist.
HINWEIS: Man kann oder kann kein weißes Band sehen. MNC wird jedoch an dieser Schnittstelle sein und sollte die Klarheit der Gradientenschnittstelle trüben. - Vakuum-Aspirat und entsorgen Sie die oberen 7 ml des oberen Farbverlaufs, um einen einfacheren Pipettenzugriff auf die Schnittstelle zu ermöglichen.
- Mit kontinuierlicher manueller Absaugung und stetig rotierender Handgelenkbewegung, sammeln Sie die Schnittstellenschicht der Zellen in einem sauberen 50 ml Polypropylen konischen Rohr. Sammeln, bis die Schnittstelle zwischen den beiden Farbverläufen klar und refraktil (frei von Zellen) ist.
- Füllen Sie das Sammelrohr mit 50 ml gekühltem FACS Buffer. Drehen bei 4 °C, 800 x g für 5 min.
- Aspirieren Sie den Überstand über Vakuumaspiration und setzen Sie das Pellet in 1 ml FACS Buffer wieder aus.
- Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer bei einer Verdünnung von 1:2 mit geeigneten Methoden zum Ausschluss von toten Zellen.
- Fahren Sie mit FACS-Färbung oder anderen Assays mit frisch isoliertem kolonischen MNC fort.
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Representative Results
Bei der Arbeit mit murinen Darmerkrankungen Modellen ist es hilfreich, sowohl quantifizieren als auch qualitativ bewerten zu können, unter den MNC des Dickdarms, mehrere Immunzellen-Subsets, die am Entzündungsprozess beteiligt sind. Die durch die Anwendung dieses Protokolls erhaltene einzellige Suspension von MNC ermöglicht eine solche phänotypische Charakterisierung in robuster und reproduzierbarer Weise. Als Grundsatzbeweis für die Anwendung dieser Isolationsmethode unter verschiedenen experimentellen Einstellungen haben wir mit dieser Methode kolonischen MNC abgerufen und Multiparameter-Durchflusszytometrie n. B. an Zellen durchgeführt, die von Mäusen mit(Abbildung 1 und Abbildung 2 , allogene BMT) und ohne (Abbildung 2A, syngene BMT) signifikante immunvermittelte Darmverletzung nach BMT.
Durchflusszytometrie und Datenanalysen wurden durchgeführt, um die Fraktionen von apoptotischen und nekrotischen toten Lymphozyten zu vergleichen, wenn entweder Collagenase E oder D für die Isolierung verwendet wurde, mit oder ohne DNase 1-Behandlung. Die bei der Durchflusszytometrie verwendete Gating-Strategie ist in Abbildung 1Aenthalten. Nach Annexin V (Apoptose-Marker) und fixierbarer Live/Dead Blue Farbstoff (Nekrose-Marker) Färbung auf einzelligen Suspensionen nach jeder Isolierung zeigte Collagenase E ohne DNAse einen signifikant höheren Anteil an Annexin Vneg Live/Dead Blueneg live cells (median 43.3%, bereich 26.5%-59.9% ,n = 3) nach Isolation im Vergleich zu Collagenase D ohne DNAse (Median 8.7%, Bereich 3.6%-10.2%, n = 3), auch im Vergleich zu Kollagennase E + DNAse (Median 8.18%, Bereich 4.7%-20.4%, n = 3) Kollagenase D + DNAse (Median 15,10%, Bereich 9,9%-21,4%, n = 3). Darüber hinaus identifizierten wir Annexin VnegLive/Dead Blue+ nekrotische Zellen mit einem medianen Prozentsatz von 41,0% in der Gruppe Kollagenase E (Bereich 37,1%-58,8%, n = 3) gegenüber 90,0% in der Collagenase D-Gruppe (Bereich 69,7%-95,5%, n = 3), 75,9% in der Collagenase E + DNAse und 80,3% in der Gruppe Kollagenase D + DNAse (Bereich 65,7%-79,5%, Bereich 54,9%-89,9%, n = 3). Repräsentative FACS-Plots von n =1 Tier in jeder Gruppe sind abbildung 1B) dargestellt.
Als weiteren Beweis für die Konsistenz und Ausbeute lebensfähiger MNC mit diesem Verfahren bei erkrankten Mäusen wurde die multiparametrische Durchflusszytometrie auf den mNC angewendet, der von CD45.2 BALB/c-Empfängermäusen am Tag 7 isoliert wurde, nachdem sie BMT von entweder allogenen (CD45.1 C57BL/6 Spender) oder syngene (CD45.1 BALB/c Spender) BMT-Modelle. Unter Verwendung der absoluten MNC-Zahlen multipliziert mit prozentualen gated Immun-Subsets, die durch Durchflusszytometrie-Analysen ermittelt werden, konnte die durchschnittliche absolute Anzahl der aus dem Dickdarm des BMT-Empfängers extrahierten Spender-CD4+ und CD8+ T-Zellen berechnet und verglichen werden (n = 4 pro Gruppe, Abbildung 2A). Da es wichtig sein kann, seltene Immunzellpopulationen in solchen Mausmodellen zu identifizieren und/oder zu quantifizieren, haben wir seltene Teilmengen einschließlich spenderabgeleiteter (CD45.1+) Foxp3+ T regulatorischer Zellen (Treg) sowohl in syngenem als auch in allogenen BMT-Modellen bewertet. Die Gating-Strategie, um Spender-Treg-Zellen (CD4+CD25+FoxP3+) aus der antikörperbefleckten Einzelzellsuspension zu erreichen, wird gezeigt (Sequenz der Tore, die durch einen roten Pfeil abgegrenzt sind; Abbildung 2B). Mit dieser Methode konnten auch seltene Teilmengen wie spenderabgeleitete Kolosonden Treg infiltrierenden Empfängermaus-Doppelpunkte nach BMT analysiert werden (Abbildung 2C, repräsentatives Diagramm; n = 1).
Abbildung 3 zeigt eine erweiterte Anwendung dieser Methode in historischen Daten aus unserer Gruppe unter Verwendung des vorgestellten Protokolls zum Vergleich der Akkumulation von GVHD-induzierenden CD8+ mit CD4+ von Spendern abgeleiteten T-Zellen im Doppelpunkt von BALB/c-Mäusen, die entweder geschützt oder nicht geschützt sind. gvHD durch das prä-BMT-Behandlungspräparative (Konditionierungs-)Regime20. Die getesteten präparativen Therapien umfassten 800 cGy/myeloablative Ganzkörperbestrahlung (TBI800) oder nicht-myeloablative SBBI (400TBI), sowie nichtmyeloablative Konditionierung mit totaler lymphoider Bestrahlung (TLI), bei der die Bestrahlung an die Lymphe Knoten, Thymus und Milz mit Abschirmung von Schädel, Lunge, Gliedmaßen, Becken und Schwanz. Alle Konditionierungen wurden mit Antithymoseserum (ATS), einem immunmodulierenden Mittel, kombiniert. Bereits am 6. Tag nach BMT führte dieses kolonische MNC-Isolationsprotokoll zu robusten zytometrischen Flussanalysen im Vergleich zu identischen Analysen an mehr lymphozyten angereicherten GVHD-Zielorganen wie Milz und mesenterischen Lymphknoten (MLN) (Abbildung 3A)20 . Die reproduzierbare Isolierung des kolonischen MNC über BMT-Empfänger (n = 7-10 pro Behandlungsgruppe) ermöglichte einen robusten statistischen Vergleich der absoluten Anzahl von Spender-CD8+ Effektor-T-Zellen zwischen verschiedenen prätransplantaten konditionierenden Behandlungsgruppen ( Abbildung 3B), die wichtige Daten über Immunphänotypen lieferten, die zu Schlüsselstudien führten, die die angeborenen Immunmechanismen des GVHD-Schutzes von TLI im Gegensatz zur TBI-Prä-BMT-Konditionierung aufzeigten. 20
Abbildung 1: Zytometrische Flussanalyse Kolonik-MNC an Tag 7 nach BMT in allogenen Mausmodellsystemen, wenn mit Collagenase E und D mit und ohne DNAse 1 isoliert. Wildtyp (WT) (CD45.2+) BALB/c (H2Kd+) Mäuse erhielten BMT von CD45 congenic (CD45.1+) C57BL/6 Spendermäuse (allogene BMT, n = 3 pro Gruppe). WT (CD45.2+) BALB/c Empfängermäuse wurden 800cGy TBI (BALB/c) 1 Tag vor BMT verabreicht. Am Tag 7 nach BMT wurden einzellige Suspensionen des Empfängerdoppels nach den Methoden dieses Manuskripts mit der Verwendung von Collagenase E (100 U/mL), Collagenase E (100 U/mL) mit DNAse 1 (500 g/mL), Collagenase D (500 g/ml) oder Collagenase D (500 g/ml) hergestellt. mit DNAse 1 (500 g/ml) (n = 3 pro Gruppe). Die Zellen wurden mit Denantikörpern Live/dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue und CD11b-PE-Cy7 gebeizt. (A) Gating-Strategie für FACS-Analysen. Gate 0, Vorwärtsstreuung (FSC-A) und Seitenstreuung (SSC-A) auf der einzelligen Suspension von MNC zur Identifizierung von Leukozyten; Gate 1, Ausschluss von Nicht-Einzelzellen mit SSC-A; Gate 2, Ausschluss von Nicht-Einzelzellen mit FSC-A; Gate 3, Identifizierung von Annexin V-positiven (apoptotischen) und fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoffen Live/Dead-UV450+Annexin V-negative (nekrotische) Zellteilmengen. (B) Repräsentative FACS-Plots von Annexin V und fixierbare Lebensfähigkeitsfärbefärbung von gated leukozyten unter MNC für die 4 Versuchsgruppen. N =1 repräsentative Maus pro Gruppe in Gruppen: Collagenase E (100 U/mL), Collagenase E (100 U/mL) + DNAse 1 (500 g/ml), Collagenase D (500 g/ml) und Collagenase D (500 g/ml) + DNAse 1(500 g/ml). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Flusszytometrische Charakterisierung des kolonischen MNC an Tag 7 nach BMT in allogenen und syngenischen Mausmodellsystemen. WT (CD45.2+) C57BL/6 (H2Kd-neg) und BALB/c (H2Kd+) Mäuse erhielten BMT von CD45-congenic (CD45.1+) C57BL/6 und BALB/c Spendermäuse (syngene oder allogene BMT, n = 4 pro Versuchsgruppe). C57BL/6 und BALB/c Empfängermäuse erhielten präparative Konditionierungsschemata von 950cGy (C57BL/6) und 800cGy (BALB/c) myeloablative TBI, die einen Tag vor BMT geliefert wurden. Am Tag 7 nach BMT wurden nach den Methoden dieses Manuskripts einzellige Suspensionen des Empfängerkolons-MNC vorbereitet. Die Zellen wurden mit Live-dead-BV510, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-Cy7, CD25-PacificBlue, FoxP3-AF647 und CD11b-PE-Cy7 Antikörpern, N = 4 Mäuse pro Gruppe gefärbt. (A) Mittelwert - SEM-Absolutzahl (Log 10) CD45.1+ H-2kd-neg oder CD45.1+ H-2kd+ (Spendertyp, jeweils) CD11bnegCD4+ und CD8+ T-Zellen isoliert vom Empfängerdoppel punkt7 nach Konditionierung und CD45.1 C57BL/6 (Spender) - CD45.2 BALB/c (Empfänger) BMT. N = 4 pro Gruppe. (B) Gating-Strategie für FACS-Analysen. Gate 0, Vorwärtsstreuung (FSC-A) und Seitenstreuung (SSC-A) auf der einzelligen Suspension von MNC zur Identifizierung von Leukozyten; Gate 1, Ausschluss von Nicht-Einzelzellen mit SSC-A; Gate 2, Ausschluss von Nicht-Einzelzellen mit FSC-A; Gate 3, Live-Zell-Auswahl Gate 4, Trennung von hämatopoetischen Zellen von BMT-Spender-versus BMT-Empfänger-Ursprung; Tor 5, Auswahl von Spender-nicht-myeloischen Linienzellen; Gate 6, selektives Gating von CD4+ T-Zellen; Gate 7, separates Gating von CD4+CD25+FoxP3+ T regulatorischen (Treg) Zellen. Der rote Pfeil bezeichnet die Drilldown-Gating-Strategie. (C) Repräsentative FACS-Plots von CD25 und FoxP3-Färbung mit der Gating-Strategie in (B) am Tag 7 nach der Konditionierung und BMT im Doppelpunkt eines BALB/c-Empfängers allogener BMT (C57BL/6 Der Prozentsatz der Zellen in jedem Tor wird innerhalb des Gates angegeben. WT = Wildtyp; TBI = Gesamtkörperbestrahlung; BM = 10 x 106 CD45.1+ kongene C57BL/6 oder BALB/c Spenderknochenmarkzellen; Teff = T-Effektorzellen; Treg = Foxp3+ T regulatorische Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nicht myeloablative STL/ATS, aber keine TBI/ATS-Konditionierung verringert die Spender-TCR- +CD8+ Effektor T-Zellakkumulation. (A) Repräsentative FACS-Plots von CD4- und CD8-Färbung von gated H-2Kb+TCR+ Zellen von Spender H-2Kb+ C57BL/6-Mäusen in Milz (obere Reihe), mesenterischem Lymphknoten (MLN) (mittlere Reihe) und Doppelpunkt (untere Reihe) der Empfänger am Tag 6 nach Konditionierung und Transplantation. Der Prozentsatz der Zellen in jedem Tor wird über dem Tor angegeben. (B) Mittelwert - SEM absolute Zahl (Log 10) H-2Kb+TCR+CD8+ Zellen in Milz (oberes Panel), MLN (mittleres Panel) und Doppelpunkt (unteres Panel) der Empfänger an Tag 6 nach der Konditionierung und BMT. WT = Wildtyp; TBI = Gesamtkörperbestrahlung; TLI =: gesamte lymphoide Bestrahlung; ATS = Antithymoseserum; BM = 50 x 106 WT C57BL/6 SpenderKnochenmarkzellen; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 Spender Milzzellen; TBI800, TBI400 = cGy Dosen von myeloablativen (TBI800) oder nicht-myeloablativen (TBI400) TBI. *Diese Zahl wurde von van der Merwe et al.20geändert. Copyright 2013. Die American Association of Immunologists, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| lösung | formel |
| Colon-Puffer | 500 ml RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (wärmeaktiviert bei 56oC für 60 Minuten, pH-Wert auf 7,3 eingestellt) |
| Silica-basierte Dichte Gradient Media 100% (pro Doppelpunkt) | 22,5 ml Silica-Based Density Gradient Media + 2,5 ml 10x PBS. |
| Kieselsäure-basierte Dichte Gradient Media 66% (pro Doppelpunkt) | 10,72 ml Silica-based Density Gradient Media 100% + 5.28 ml Colon Buffer |
| Kieselsäure-basierte Dichte Gradient Media 44% (pro Doppelpunkt) | 11 ml Silica-based Density Gradient Media 100% + 14 ml Colon Buffer |
| Kollagenase Verdauungspuffer (pro Doppelpunkt) | 100 U/ml Kollagenase E aus Clostridium histolyticum, gelöst in 40 ml Colon Buffer |
| FACS-Puffer | 500 ml 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g Natriumazid |
Tabelle 1: Lösungsvorbereitungstabelle.
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Discussion
Dieses visuelle Protokoll beschreibt gut verträgliche Methoden zur Isolierung von mononukleären kolonischen Zellen einschließlich Lamina propria lymphozyten (LPL). Angesichts der Tatsache, dass dieses Protokoll bei der Bewertung schwerer Mauskolitismodelle nach der Transplantation optimiert wurde, bei denen entzündliche Zytokine und Gewebeverletzungen sich für eine schlechte Lebensfähigkeit von wiedergewonnenem MNC eignen, gehen wir davon aus, dass diese Methoden in andere Anwendungen, die eine phätotypische Analyse des kolonischen MNC erfordern. Dazu gehören, aber, sind nicht beschränkt auf die Bewertung von Dickdarmentzündungen in Maus-Modelle von entzündlichen Darmerkrankungen, Studien über Immunreaktionen von Kolitis-gezielte Behandlungen, und Colitis durch infektiöse Krankheitserreger produziert. Darüber hinaus deuten unsere Daten unter Verwendung von Isolierungen bei gesunden (syngenen BMT) Mäusen darauf hin, dass das Isolationsverfahren kein signifikantes entzündliches Infiltrat erfordert, um die Erkennung von Immunzellen in den MNC-Isolaten zu ermöglichen. Ähnliche Daten wurden mit unbehandelten gesunden (Nicht-BMT) Mäusen (Daten nicht gezeigt) gewonnen.
Mehrere wichtige Schritte dieses Protokolls unterscheiden es von anderen veröffentlichten Methoden und tragen zu hoher Ertragsfähigkeit und Rentabilität bei. Zum Beispiel ermöglicht die Optimierung der Clostridium histolyticum-abgeleitete Kollagenase E-Aktivität (100 U/ml Endaktivitätsniveau) konsistente Berechnungen für verschiedene Arten von Enzymen über Langstreckenexperimente26. Es gibt 28 verschiedene Mitglieder in der Kollagenfamilie, zusammen machen fast 30% aller Proteine im Säugetierkörper27. Darüber hinaus weisen verschiedene Gewebe unterschiedliche Verteilungen von Kollagen-Subtypen auf, die jeweils eindeutige Kollagennasen für die Verdauung erfordern28. Kollagenase aus C. histolyticum umfasst 6 verschiedene Proteine, die in zwei Klassen29,30eingeteilt sind. Die spezifische Art der verwendeten Kollagenase kann die Lebensfähigkeit und Gesamtqualität der zellenverändernd aus dem Doppelpunkt31verändern. Frühere Studien haben gezeigt, dass Kollagenase Typ C-2139 (Collagenase E) eine hohe Ausbeute an Lymphozyten unter MNC aus dem Dünndarm25ermöglicht. Diese Protokolle befassten sich jedoch nicht mit der Verdauung des Dickdarms, einem viel muskulöseren Organ mit deutlich komplexerer Kollagenzusammensetzung als der Dünndarm.
Angemessenheit und Zuverlässigkeit des enzymatischen Gewebeabbaus ist ein etablierter Faktor, der die Gesamtzellertrags- und Lebensfähigkeit beeinflusst, indem die Notwendigkeit wiederkehrender mechanischer Störungen (die ein erhöhtes mechanisches Trauma für das Gewebe induziert) minimiert wird. Aufgrund einer ausreichenden enzymatischen Verdauung des interstitiellen und schleimförmigen Kollagens mit einem Kollagennase-E-spezifischen Protokoll (im Vergleich zu Kollagenase D-vermittelten Verdauungsprotokollen im Standardeinsatz) minimiert dieses Protokoll die die Gewebefragmente, die erforderlich sind, um das Interstitium zu stören und Immunzellteilmengen in Suspension freizusetzen. Dies verbessert die Lebensfähigkeit isolierter MNC für nachfolgende Tests weiter. Wie aus den Daten (Abbildung 1B) gezeigt, entfallen dNAse und andere chemische oder mechanische Anti-Klumpen-Manöver, die über die Standardfiltration einer Einzelzellsuspension durch ein Sieb hinausgehen. Andere Berichte, die die Isolierung von Darmlymphoidzellen skizzieren, haben Dithiothreitol (DTT) und EDTA als Mukolytika verwendet, um sowohl die Ausbeute als auch die Lebensfähigkeit der isolierten mononukleären Leukozyten zu verbessern24.
Ein weiterer einzigartiger Aspekt dieses Protokolls, der die Zellausbeute verbessert, ist die Anwendung eines fein abgestimmten, auf Kieselsäure basierenden Dichtetrennmediengradienten. Andere Verdauungsmethoden Papiere veröffentlicht bisher verwenden nicht eine solche Dichte Trennung Gradient21,31. Nach der Erfahrung der Autoren und der Mitarbeiter, die dieses Protokoll nutzen, um funktionell aktive Lymphzellen zu isolieren, verbessert die Dichtegradientenreinigung jedoch sowohl die Lebensfähigkeit als auch die Reinheit von MNC, die nach der Verdauung wiederhergestellt wurden19 , 20 , 32.
Obwohl kein Schwerpunkt dieses Manuskripts, verdient es erwähnenswert für diejenigen, die mit Darmentzündung Modelle bei Mäusen arbeiten, ist, dass die Methoden in diesem Manuskript geändert werden können, um eine ähnliche hochwertige Isolierung von lebensfähigen MNC aus dem Dünndarm zu ermöglichen. Die Modifikation des primären Kolonprotokolls, das erforderlich ist, um dies zu erreichen, ist die Verwendung einer einzigen 90-min-Verdauung (anstelle von zwei 60-min-Verdauungen), wobei alle anderen Schritte (einschließlich Enzymaktivitätsniveau und Abschreckungsschritte) mit den gezeigten identisch sind. Diese Modifikation ergibt in der Regel einen Bereich von 0,8-4 x 106 MNC pro Dünndarm ohne oder 1,5-2,5 x 106 MNC mit der Einbeziehung des Terminal ileum einschließlich der Leukozyten-reichen Cecal-Kappe. Daher ist eine Neuheit dieses Protokolls, dass die Anwendung des Primärprotokolls auf den Dickdarm und das modifizierte Protokoll auf den Dünndarm, könnte man MNC mit hoher Reproduzierbarkeit und guter Lebensfähigkeit sowohl aus dünndarm als auch aus dem Dickdarm des einzelnen Versuchstiere im selben Experiment.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das beschriebene Protokoll eine effiziente und reproduzierbare Isolierung mononukleativer Zellen aus dem Dickdarm oder, mit Modifikationen, dem Dünndarm ermöglicht. Mit 2 kompetenten Bedienern, die zusammenarbeiten, können bis zu 10 separate Doppelpunkte an einem einzigen Tag verarbeitet und analysiert werden, und einzellige Suspensionen können für nachfolgende phänotypische und funktionelle Analysen innerhalb von 6-8 h aus der Gewebeernte bereit sein. Die Anwendung dieses Protokolls kann sich als wertvoll für andere Forschungsziele erweisen, die eine Immunbewertung von Darmentzündungen benötigen, so dass andere Forscher das Immunsystem des Mausdickdarms auf strenge und reproduzierbare Weise charakterisieren können.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien #1K08HL088260 und #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) und die Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) unterstützt. C57BL/6 und BALB/c Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden entweder in unserer Anlage gezüchtet oder von Jackson Labs oder Taconic bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
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