Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы манипулировать цветными узорами прыгающих пауков и других очень маленьких членистоногих с краской, чтобы изучать вопросы, связанные с сексуальным отбором, сексуальным каннибализмом, хищничество, асоэмматизм, или любой другой области животного окраски.
Abstract
В области поведенческой экологии, многие эксперименты призваны исследовать эволюционные цели красочных черт в контексте сексуального отбора и хищничества. Методы различны, но в основном состоят из изменения цветовых моделей людей с различными колоритом. Такие методы использовались во многих позвоночных таксонов, особенно у птиц, но оставались слаборазвитыми для беспозвоночных из-за сложности эффективного манипулирования цветом в малых организмах. Вместо этого, чтобы манипулировать появлением беспозвоночных, ученые, как правило, модифицировали среду освещения для фильтрации определенных длин волн. Однако такой метод влияет не только на фенотипические черты интереса, но и на весь внешний вид индивидуума и окружающих его лиц. Здесь, сворачивать методы, ранее используемые на красочных птиц, мы представляем способы манипулирования цветами малых членистоногих, используя одинаково символичных, но недоизученных видов: красочные прыжки пауков.
Introduction
Животные часто имеют сложные цветовые узоры, которые они отображают во время сексуальных контактов, агонистические встречи, или для сдерживания хищничества. Эти признаки могут передавать информацию для приемников, таких как индивидуальное качество сигналера как помощник1, боевые способности, как конкурент2, или вкусовых качеств, как добыча пункта3. Чтобы понять адаптивные цели красочных черт, исследователи разработали эксперименты, которые связаны с манипулированием цветов различными способами. Некоторые исследователи использовали цветные приманки раздражители, такие как модели4,5,6,7,8, фотографии9, или видео10,11, 12 , которые представляются получателям в поведенческих экспериментах. Другие, особенно при использовании беспозвоночных, манипулировали среды освещения, чтобы повлиять на появление цветов живых особей13,14,15,16, 17. все эти манипуляции, в то время как гениальный, имеют недостаток удаления потенциально важное естественное поведение и/или затрагивающих гораздо больше, чем черта интереса. У крупных позвоночных, таких как птицы, исследователи очень часто манипулируют цветом непосредственно на живых животных (обзор в Хилл и Макгроу, 200618). Индивидуальные перья или клювы были непосредственно окрашены маркеры2,19,20,21,22,23,24, красители, содержащие перекиси водорода часто используется в волосах кожи25,26,27, или различных красок, включая Лак для ногтей28. В беспозвоночных, такие исследования, которые манипулируют цветовых паттернов непосредственно на живых животных сравнительно редки, но до сих пор при условии огромного понимания функции и эволюции цвета29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39. Даже членистоногих исследования, кажется, предвзято к большим таксонов, которые могут быть более легко обрабатываются и окрашены, оставляя цветовые узоры в очень малых видов относительно недоизучены.
Здесь мы описали тонкую технику манипуляции цветом, которая была разработана для очень маленьких животных таксонов. В частности, этот метод включает в себя манипулирование лицевой окраской самцов прыгающих пауков под микроскопом для того, чтобы исследовать важность таких красочных черт в контексте выбора мате и сексуального каннибализма. В данном случае мы использовали в качестве модели вид (рис. 1) Хабронатус пирритрикс (СОБРАННЫЙ из феникса, аз, США). Мы опубликовали результаты экспериментальной работы с использованием некоторых из этих методов в другом месте38,39, но здесь мы описываем методы более подробно, чем это было сделано ранее, таким образом, чтобы сделать их доступными для других попытка воспроизвести их или адаптировать их для использования на других очень маленьких таксонов. Такие протоколы должны открывать экспериментальные возможности для животных, которые могут быть такими же красочными, как и самые символичные птицы, но обычно малоизученные.
Protocol
1. Подготовка оборудования
- Выберите подходящие краски.
- Для успешного применения используйте краски, которые быстро сохнет и имеют текстуру, которая легко манипулировать с тоньше. Продукты, которые были использованы успешно включают в себя неводонепроницаемые карандаши для глаз, которые могут быть разбавленной водой, и эмалью краски, которые могут быть разбавленной с эмалью тоньше (таблица материалов).
- При живописи пауков, считают, что панцирь большинства видов имеет закаленный экзоскелет в то время как мягкий живот часто тянется и сужает с кормлением40.
- Краски эмаль производят твердое, закаленное покрытие на расписной поверхности; Таким образом, применять их на твердые части кутикулы (например, панцирь, ноги, педипальпс). Такие покрытия эмали менее эффективны для животы паука, потому что они снимают паука, как живот меняет форму с кормлением.
- В противоположность этому, карандаши для глаз не производят затвердевшего покрытия, а скорее просачиваются в цветные чешуйки тела; как таковой, используйте их на обеих твердых и мягких частях тела (включая Спайдер животы).
Примечание: в предстоящих шагах представлена наиболее тонкая техника, состоящая из окраски лица и родословную пауков; используется эмаль краска, которая является наиболее обобщению методом из-за цветового разнообразия эмали краски доступны.
- Перед тестированием краски на живых животных, если это возможно, сначала измерить спектральные свойства краски (просто применительно к бумаге или другой поверхности) с помощью УФ-VIS отражательный спектрофотометр, чтобы убедиться, что есть не любые нежелательные пики УФ в спектре, который были бы невидимы для людей, но, возможно, видны изучаемых видов.
- Используйте Рассекающий Микроскоп, подключенный к камере и компьютеру, чтобы более легко сфотографировать исход манипуляции для документации и увеличения воспроизводимости (таблица материалов).
- Включите Микроскоп, компьютер и программное обеспечение, которое обрабатывает ввод камеры.
- Выберите соответствующий масштаб, на котором будет сделана окончательная картинка.
- Stick насекомых крепления штифт или небольшой гвоздь (с головой указал наружу) в шар, не закалка моделирования глины (примерно размером с виноград). (Живой паук будет окрашен будет временно установлен на голову этого штифта в шаге 3,1 ниже). Поместите глины моделирования и ПИН-код под микроскопом, чтобы настроить цели так, что они примерно сосредоточиться на голове штифт (где паук должен быть установлен).
- Убедитесь, что цели находятся на нужном расстоянии для глаз художника, и что камера не препятствует поле зрения во время живописи (как в случае, если камера установлена в одном из окуларс, препятствуя глубину восприятия).
- Перенесите паука в чистую пластиковую пробирку (около 12 драм, без паутиной или мертвой добычи).
- Подготовить монтаж и покраску оборудования.
- Поместите дополнительное тонкое насекомое крепления в шар не-закалки глины моделирования (в дополнение к той, которая используется в шаге 1.2.3) и поместите их на левой стороне микроскопа (для правша людей). Этот штифт будет использоваться, чтобы аккуратно регулировать положение ног паука и родословных (по необходимости) во время рисования.
- Получить небольшой кусок абсорбирующей бумаги (например, бумажное полотенце), кусок белой бумаги принтера, краски применять (здесь, эмаль краска), отдельные контейнеры тоньше краски (по одному для каждого цвета плюс один хранится прозрачный и чистый), индивидуальные микро щетки для каждого цвета (см. таблицу материалов), и одна микро-кисть, которая будет использоваться только с чистого тоньше, все позиционируется в организованном порядке справа от микроскопа (для правша людей).
- Используя зубочистку, добавьте каплю краски в открытое пластиковое блюдо (например, маленькую чашку Петри или флакон) и добавьте растворитель краски, например, с помощью небольшого шприца. Смешайте два с зубочисткой к правильной консистенции (когда краска полностью однородно, но не слишком жидкий), тестируя его на белой бумаге принтера с микро-щеткой.
Примечание: в некоторых случаях, если краска быстро высыхает, подготовить его с немного больше жидкости, чем хотелось для применения, и пусть щетки замочить в кастрюле краски до последующего использования (шаг 4). - Положите горох размера капли воды на основе клея (см. таблицу материалов) на углу бумаги принтера.
Примечание: это должно быть последней стадии подготовки и следующий шаг должен произойти сразу же после этого, так что клей не высыхает.
2. анестезирующее паука
- С пауком во флакон и рука сложил над открытием для предотвращения побега, медленно добавить CO2 газ до тех пор, пока третья пара паук ноги простирается до 180 градусов.
- Используйте время воздействия CO2 примерно 20 секунд до 1,5 минут, в зависимости от среднего размера вида и на индивидуальный паук. Мы нашли расширение третьей пары ног, чтобы быть надежным показателем надлежащего уровня анестезии в х. пирритрикс, но это, вероятно, варьируется между видами. Если использовать эти методы с различными видами в первый раз, первый тест анестезии на нескольких образцах, чтобы оценить их реакцию.
- Дайте паукам, как мало CO2 , как можно достичь необходимого уровня анестезии. В то время как короткие периоды анестезии, описанные здесь, не произвели никакой смертности (и никаких заметных поведенческих различий от неанестезированных пауков), дайте всем животным в эксперименте равные уровни анестезии (включая фиктивные средства управления).
- Держите флакон закрыт после добавления CO2 для поддержания паука под наркозом; Таким образом, включить это время при расчете, как долго паук подвергается CO2.
- После того, как паук был удален из пробирку, чтобы начать манипуляции цвета, он будет оставаться полностью обезболиваются примерно от 1 до 2 минут; Поэтому выполните следующие действия (разделы 3-6) оперативно. Из-за этого ограниченного времени окно, попытка следующий метод живописи с мертвыми образцами первой (для практики), прежде чем пытаться рисовать живые пауки.
3. Монтаж паука под микроскопом
- Добавить очень небольшое количество клея на головку крепления контактный или гвоздь в глины моделирования подготовлены в поле зрения микроскопа.
Примечание: Используйте наименьшее количество клея, который позволяет поддерживать паук в месте, чтобы убедиться, что я) паук не соскальзывают булавья (если слишком много клея используется), и II) паук умудряется освободиться после пробуждения. - Аккуратно сдвиньте наркотизированного паука со своего флакона на стол с вентральной стороной вверх.
Примечание: потому что животы спайдеров мягки, внимательность необходимо принять для того чтобы не выстучать или не упасть спайдеры на таблицу, по мере того как это может причинить ушиб. - Аккуратно нажмите на булавику (с клеем) на грудине паука (Центральная область, где ножки паука прикрепляются к телу) таким образом, что паук слегка отскочит и расширит свои ноги под небольшим давлением. Для экстренного контроля прилотого давления, держите глину моделирования с обеими руками, имеющ обе руки стабилизировался твердо против таблицы.
- Переместите моделирование глины под микроскопом так, чтобы область краски вверх и в фокусе.
4. живопись паука
- Оцените консистенцию краски до прикосновения кисти к пауку.
- Повторно проверьте консистенцию краски (используйте впитывающую бумагу, чтобы вытирать кисти, если они были сохранены в тоньше), отрегулируйте снова при необходимости, и всегда сначала попробуйте применить краску на бумаге принтера, чтобы контролировать количество краски, содержащихся в волосах кисти.
- С правой стороны, и, глядя через микроскоп, довести кончик кисти в поле зрения, и убедитесь, что (во второй раз), что кисть волосы не содержат слишком много краски, и в этом случае стереть часть его на бумагу для принтера.
- Проверьте консистенцию краски на паука.
- Сенсорный паук с кистью на крупнейшей области, которые должны быть окрашены более. Это будет информировать художника ли последовательность и количество краски права (т.е., когда краска слегкаи медленно впитывается в волосы/весы паука).
- Если краска не будет применена, Замочите кисть в краску и вернитесь к шагу 4,1, чтобы повторить процедуру.
- Если краска впитывается в быстро и разливов на область, которая не должна быть покрыта краской, и предполагая, что разлив минимальна и что человек может по-прежнему принимать участие в эксперименте, протрите кисть на абсорбирующей бумаги и вернуться к шагу 4,1 повторить процедуры.
Примечание: этот тип жидкой утечки не может быть исправлена. Если утечки достигает хелицеры или глаза, или другие части, которые могут быть смертельными или токсичными для человека, рассмотреть вопрос о размещении паук немедленно в морозильнике, чтобы усыпить его, прежде чем он просыпается и исключая паука из эксперимента.
- Сенсорный паук с кистью на крупнейшей области, которые должны быть окрашены более. Это будет информировать художника ли последовательность и количество краски права (т.е., когда краска слегкаи медленно впитывается в волосы/весы паука).
- Краска всех областях, которые нуждаются в цветах следующие шаги 4,1 и 4,2.
- Если раскрашивания лица паука, используйте дополнительный тонкий штифт с левой рукой, чтобы удерживать Передние лапы и родословных (чтобы они не были в пути кисти). Это лучше всего делать, глядя в Микроскоп, чтобы избежать повреждения придатков паука. Кроме того, если картина лицо паука, и в зависимости от кисти используется для краски, рассмотреть картину обе стороны лица, прежде чем пытаться нарисовать центральную часть между глазами-как окрашенные области могут быть объединены путем проведения кисти параллельно паук лицо и вызывая действия капилляров.
Примечание: при покраске лица паука, легче всего сначала покрасить сторону ближайшей доминирующей рукой, а затем повернуть шарик глины (с установленным пауком) вокруг под микроскопом, чтобы нарисовать другую сторону, а затем посередине. - При покраске педипальпс или ножек Убедитесь в том, что не прикасайтесь к стыкам, если краска затвердевания одна (например, эмаль краска), и убедитесь, что не применять краску для органов спермы мужчины (на нижней стороне дистальной сегмент педипальпс).
- Если раскрашивания лица паука, используйте дополнительный тонкий штифт с левой рукой, чтобы удерживать Передние лапы и родословных (чтобы они не были в пути кисти). Это лучше всего делать, глядя в Микроскоп, чтобы избежать повреждения придатков паука. Кроме того, если картина лицо паука, и в зависимости от кисти используется для краски, рассмотреть картину обе стороны лица, прежде чем пытаться нарисовать центральную часть между глазами-как окрашенные области могут быть объединены путем проведения кисти параллельно паук лицо и вызывая действия капилляров.
5. Принимая картину паука
- Переключите цель в режим камеры.
- Сфотографируйте с помощью компьютерного программного обеспечения, убедившись, что масштаб выбрал это один выбран на Микроскоп, так что масштаб бар может быть добавлен.
6. выпускать паука от штыря или ногтя
- Когда паук начинает двигаться, удерживайте штифт так, чтобы передние лапы паука касались флакона паука.
- Пусть паук освободить себя, и при необходимости, Осторожно наклоните штифт, чтобы помочь паук вытащить себя от сушеного клея.
- Если паук просыпается, прежде чем картина завершена, позволяют паук по крайней мере 15 минут, чтобы восстановиться, прежде чем снова под наркозом. Если это будет сделано, убедитесь, что все группы получают те же уровни анестезии (в том числе фиктивных обработанных лиц, если это применимо).
Примечание: пауки появляются возобновить свое нормальное поведение быстро после манипуляций (< 15min), но мы рекомендуем стандартизировать время отдыха 12 часов до использования паука в поведенческий тест.
- Если паук просыпается, прежде чем картина завершена, позволяют паук по крайней мере 15 минут, чтобы восстановиться, прежде чем снова под наркозом. Если это будет сделано, убедитесь, что все группы получают те же уровни анестезии (в том числе фиктивных обработанных лиц, если это применимо).
7. анализ поведения пауков
- Сравните поведение неманипулированных, фиктивных обработанных субъектов для оценки потенциальной токсичности приложения (которое может варьироваться в зависимости от конкретного типа краски, цвета, области применения и вида исследования). Соответствующее поведение для сравнения может включать скорость активности, тип выполняемых действий, успех в выполнении конкретных видов деятельности (например, захват добычи) и т.д.
- Используйте фиктивные обработанные пауки как часть экспериментального дизайна (например, получение краски приложения на невидимой области или с нейтральными цветными красками применительно к той же области) для того, чтобы только изменить цвет человека, контролируя при этом для других факторов (например, обработка времени, запаха, текстуры поверхности и т. д.).
Примечание: Если картина ноги или педипальпс, рассмотреть возможность, что это может помешать сенсорные волоски (распространены на ноги паука и родословные, см. Foelix 201040) и, в этих случаях фиктивные обработанные самцы должны иметь нейтральные цвета краски применительно к же областях, как контроль. - При разработке новых методов, сравнить окрашенные пауков с неманипулируемым пауков для оценки ли цвет-манипулировать лица по-прежнему ведут себя нормально.
- Используйте фиктивные обработанные пауки как часть экспериментального дизайна (например, получение краски приложения на невидимой области или с нейтральными цветными красками применительно к той же области) для того, чтобы только изменить цвет человека, контролируя при этом для других факторов (например, обработка времени, запаха, текстуры поверхности и т. д.).
8. Измерение отражаемости свойств цветовой манипуляции на окрашенный предмет
- После эвтаназии (после того, как пауки были вовлечены в эксперимент или специально умерщвлены для этой цели, см. Примечание ниже), измерить спектральные свойства цветовой манипуляции с использованием стандартного портативного спектрофотометра УФ-VIS (таблица материалов ), особенно в районах диаметром более 1 мм.
- Для небольших участков используйте изготовленный на заказ микроспектрофотометр (ультрафиолетовый спектрофотометр, проложенном через микроскоп) для более легких и точных измерений, хотя оптика микроскопа вырезается ультрафиолетовым светом, а это означает, что измерения ограничиваются человека-видимые длины волн (см. Тейлор et al. 201141).
- В тех случаях, когда цветные участки являются крайне малыми и требуются данные о УФ-отражаемости, используйте коммерчески доступные микроспектрофотометры УФ-VIS, хотя они и стоят дороже (см. Тейлор et al. 201442).
Примечание: источник света ультрафиолетовых спектрофотометров содержит ультрафиолетовый свет и может быть опасен для глаз животных (в том числе и для нас), поэтому спектральные меры должны быть сделаны только после усыплянии животных, а не просто под наркозом. Для эмали окрашенные пауков, это может быть сделано после того, как пауки были использованы в экспериментах, поскольку краска не стираться (см. репрезентативные результаты ниже). Для краски на водной основе, которые иногда могут исчезать после нескольких дней или недель, набор пауков может быть принесен в жертву для измерения в то время, когда их коллега будет участвовать в эксперименте (для захвата данных, которые отражают фактические манипуляции цвета, используемые в эксперимента). Отчетность спектральных свойств краски позволит репликацию другими исследователями, которые могут захотеть повторить цветоманипуляции, но не имеют доступа к тем же конкретным продуктам краски.
Representative Results
Эффективность цветоманипуляции
С помощью этих методов, различные степени цвета манипуляции эффективны, в том числе сокрытие цвета полностью или уменьшения или повышения их интенсивности. Об этом свидетельствуют как фотографии, так и измерения спектральной отражаемости (Рисунок 2, Рисунок 3и Рисунок 4). Здесь мы показываем цвет-манипулировать мужской Хабронатус пирритрикс по сравнению с естественными красными лицом мужчин. Спектральные свойства измерялись с помощью спектрофотометра УФ-VIS (см. таблицу материалов), которые точно могут измерять цветные области размером до 1 мм в диаметре. Измерения проводились относительно диффузного белого стандарта (см. таблицу материалов).
В редких случаях (5 из 108 мужчин окрашены черной подводкой для глаз 1 (см. таблицу материалов) на их лице), водорастворимый подводка для глаз начал стирали лица пауков через неделю или две. Это не наблюдалось для другой марки подводка для глаз (подводка для глаз 2; см. таблицу материалов). В обоих случаях, клетки паука были распылены с водой три-пять раз в неделю. Различные условия содержания могут повлиять на износ краски на водной основе. Эмаль краска была еще нетронутыми для всех манипулировать мужчинами (n = 221), даже для тех, кто еще жив после 6 месяцев.
Потенциальная токсичность манипулирования цветом
Следует избегать попадания краски на глаза пауков, чтобы не препятствовать их зрение, ни на их chelicerae, рот частей и других отверстий, и, возможно, другие мягкие части тела для предотвращения возможного проглатывания и отравления. Следует также быть осторожными с живописью суставов или частей, которые содержат сенсорные волоски (например, ноги и родословные), чтобы не ограничивать их подвижность или сенсорную систему. Тем не менее, если такие цветовые манипуляции на этих участках тела необходимы, или если есть какие-либо сомнения по поводу возможности тонких негативных последствий, то лучше применять краски для физических лиц во всех категориях лечения. Таким образом, можно было бы избежать непреднамеренно манипулирования сенсорными системами лиц таким образом, что может быть предвзятым в отношении одного из методов лечения только. Например, в эксперименте с использованием мужских манипуляциям, показанных на рисунке 4, цель заключалась в увеличении и уменьшении количества красных пятен, отображаемых мужчинами во время ухаживания. Поскольку некоторые мужчины получат свои естественные красные лица скрыты с серой краской эмали (для уменьшения количества красных отображается), другие мужчины, для которых мы хотели сохранить красное лицо были окрашены в красный цвет над их естественно красное лицо с тем же продуктом, как серый лицом Мужчин. Аналогичным образом, так как мы хотели бы добавить красные пятна на Родословное на некоторых мужчин, чтобы увеличить количество красных пятен отображается, серая краска была использована для покрытия Родословное других мужчин, так что все мужчины будут окрашены в этой чувствительной области (см. Рисунок 4) . Хотя эта стратегия предпочтительна, она не всегда возможна. Например, в другом эксперименте, красная окраска была удалена с помощью черной подводкой для глаз дает тот же спектрального свойства, как основной кутикулы мужского пола, оставляя другие мужские цвета нетронутыми и природных (рис. 2). В этом случае, для естественного перспективных мужчин, такое же количество подводка для глаз был применен к области на верхней части их панцирь только за их передних медианных глаз (область, которая не ясно видна для женщин), для контроля потенциального запаха или общей токсичности Продукта. Тем не менее, место, где краска применяется может повлиять на пауков по-разному. Поэтому, чтобы оценить тонкие различия в способе или месте, где краска была применена, может иметь на целостности паука, поведение обоих типов мужчин в контексте, который был релевантными к нашим гипотезам (относительно выбора мате и сексуального каннибализма) сравнивали. Самцы были поставлены два на два в присутствии женщины, и мы сравнили их задержку, чтобы стать активными, их задержка ухаживания, и общая продолжительность они потратили ухаживания с общими линейными смешанными моделями эффекта (используя функцию lmer с пакетом R lme443 в версии R 3.5.244 с женской идентичностью как случайный эффект, и используя критерий максимальной вероятности для получения p-значений). В этом случае все сравнения не выявили различий между процедурами (см. таблицу 1), и поэтому был сделан вывод о том, что мы не вводим предвзятости в пользу той или иной категории лечения.
В любом случае, при наличии очень похожие категории лечения (рис. 4), или только фиктивные обработанные лица (рис. 2 и рис. 3), исследователи должны оценить, как их модели видов, пострадавших от краски они используют и убедитесь, что они по-прежнему ведут себя аналогичным и экологически соответствующим образом. Можно записать данные для оценки возможного воздействия токсичности в максимально возможной степени, например, путем сопоставления коэффициентов активности между обработанними и неманипулируемым физическим лицам. Наши пауки окрашены эмалью краской, как на рисунке 4 были по сравнению с неманипулировали мужчин в ином идентичный контекст. В частности, мужчины были введены отдельно к женской клетке и их задержка, чтобы оставить флакон, задержка ухаживания и ухаживания скорость (до совокупления, и до нападения или разобраны) сравнивали. Не обнаружено различий (при использовании аналогичных линейных смешанных моделей эффекта, как выше), и поэтому мы пришли к выводу, что наши окрашенные самцы вели себя естественно (таблица 2).
Наконец, важно отметить, что любые пауки в экспериментах (как правило, женщины), которые разобраны цвета манипулировать мужчины никогда не появились страдать от негативных последствий. Пауки переварить свою добычу внешне, как правило, оставляя окрашенные области кутикулы позади. Однако, если адаптировать этот метод для других систем, где цвет-манипулировать животными будут потребляться, следует оценить потенциальные риски токсичности.
Рисунок 1 . Взрослый самец Хабронтус пирритрикс , иллюстрирующий, как крошечные их цветные участки тела. Фотограф Лайла Басс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 . Экспериментальная цветоманипуляция используется для сокрытия красной окраски лица в Хабронте пирритрикс. (A) нетронутые красные лица окраску до цвета манипуляции. (B) лицевой окраски одного и того же мужчины после сокрытия естественной красной окраски с черной подводкой для глаз 1. (C) представитель отражаемости спектры для естественного Красного лица, естественной базовой черной кутикулы, и красное лицо окрашены черной подводкой для глаз 2. Изменено с Тейлор и Макгроу 201339. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 . Экспериментальная цветоманипуляция используется для уменьшения размера и покраснения Красного лицевого пластыря мужского Хабронтуса пирритрикса. (A) нетронутые красные лица окраску до цвета манипуляции. (B) лицевой окраски одного и того же мужчины после нанесения разбавленной черной подводки для глаз (городской Распад) в переднюю часть лица, и не разбавленной черной подводкой для глаз по краям лицевого пластыря, чтобы уменьшить размер красной области. (C) среднее Спектральные кривые из фиктивного управления мужчин (n = 21) и цветных мужчин (n = 21), по сравнению с населением среднее (n = 57) и 10 драббест мужчин из предыдущего исследования41. Рисунок воспроизводится с Тейлор et al. 201438. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4 . Экспериментальные манипуляции цвета используются для изменения цвета красный лицевой патч мужского Хабронтаус пирритрикс. Хабронтus пирритрикс окрашен (а) красным, (б) красным и серым, а (с) серой эмальной краской над их натуральным красным лицом и естественно кремового цвета педипальсом. (D) означают Спектральные кривые для неманипулированных самцов (n = 9), а самцы с лицом, покрытыми красной эмальной краской (n = 9). Применяя яркий красный над лицом паука, мы эффективно улучшили его красный лицевой окраски. Потому что эмаль краска полностью покрывает основные весы, цвет также может быть изменен полностью, как и в случае с серой эмалью. (E) в этом эксперименте, красный и серый краски эмали были выбраны, чтобы быть согласованы для полной яркости (общая отражаемости над диапазоном длин волн, видимых для этих пауков). Различия в масштабе Y-осей в D и E обусловлены различными методами (например, расстоянием до образца и размером измеряемых участков) для измерения цветовых образцов на бумаге (E) против прямых измерений цвета на лице паука (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
| N | Зависимая переменная | P | T | Красно-лицом | ± SE | С черным лицом | ± SE | НФИД |
| 202b | Мужская задержка, чтобы оставить блюдо | 0,35 | -0,93 | 140,0 | 23,9 | 109,8 | 23,9 | 102 |
| 179c | Мужская задержка в суд | 0,74 | 0,33 | 983,4 | 127,1 | 1031,0 | 126,5 | 95 |
| 204a | Мужские усилия ухаживания | 0,52 | 0,63 | 181,2 | 24,4 | 203,0 | 24,4 | 102 |
| 204a | Мужские усилия ухаживания до любого нападения | 0,41 | 0,68 | 89,0 | 15,7 | 97,5 | 15,7 | 102 |
Таблица 1. Влияние мужского цвета лица манипуляции на поведение, когда окрашенные с черным подводка для глаз против фиктивный лечение (рис. 2). Структура каждой модели дается, а также среднее оценок в секундах (± SE) для каждой группы обработки. N = количество самцов, p и t = p-значение и т-значение для мужского лечения, НФИД = количество уровней в случайном эффекте женской идентичности. в качестве Из 104 мужских тестов, выполненных, 102 были успешно записаны, что привело к 204 уникальных мужчин наблюдается. 2 мужчины были разобраны самкой до когда-либо выходе из чашки Петри. c25 самцы были разобраны самкой до когда-либо ухаживал за женщиной.
| N | Зависимая переменная | P | T | Даже | ± SE | Окрашены | ± SE |
| 32a | Мужская задержка, чтобы оставить блюдо | 0,87 | -0,17 | 380,8 | 143,1 | 345,4 | 152,4 |
| 31b | Мужская задержка в суд | 0,93 | -0,09 | 502,6 | 105,8 | 488,1 | 116,6 |
| 31b | Мужские усилия ухаживания | 0,74 | -0,33 | 2324,3 | 455,0 | 2102,1 | 484,4 |
| 31b | Мужские усилия ухаживания до любого нападения | 0,68 | 0,42 | 1495,1 | 450,8 | 1770,1 | 479,9 |
Таблица 2. Влияние мужских цветовых манипуляций на поведение, при окрашивается красной или серой эмалью краской (n = 15, рис. 4) против неманипулированных самцов (n = 17). Структура каждой модели дается, а также среднее оценок в секундах (± SE) для каждой группы обработки. N = количество самцов, p и t = p-значение и т-значение для мужского лечения. 17 неманипулированных самцов были сравнены с подмножеством всех раскрашенных самцов в нашем эксперименте (n = 221). В частности, их сравнивали с 15 нарисованные самцы (5 красных (рис. 2a), 5 красных и серых (рис. 2a) и 5 серый (рис. 2a)) тестировались в том же контексте (в присутствии самки) и в тот же конкретный период времени. Это важно, поскольку неманипулированных мужчин были протестированы в конце эксперимента (в августе и сентябре 2018), что соответствует концу их естественного сезона размножения и где мужчины, как правило, менее активны. Сохранение всех этих переменных равных позволяет нам сравнивать обработки живописи без введения других предубеждений. б Один самец (все серые) был разобраны до когда-либо ухаживания женщины.
Discussion
Здесь мы показываем, что цвета крошечных частей тела членистоногих может эффективно манипулировать с помощью красителей, таких как макияж и эмаль краски.
Первый критический шаг для достижения таких деликатных манипуляций, чтобы иметь возможность обездвиживать мелких животных, которые обычно не могут быть сдержаны в одной руке. Здесь, чтобы иметь возможность рисовать чувствительные области, такие как прыжки лица паука, мы обезболированных лиц с CO2 и монтируется их на голове штифта. Это позволяет работать близко к глаза паука с меньшим напряжением, чем паук, скорее всего, опыт, если он бодрствовал (со светом из микроскопа сияющий в их лицах во время процесса живописи).
Метод также требует получения качественных микрокистей хорошего качества, и, что наиболее критично, подходящих красителей. Самый трудный шаг в прикладывать краску без просыпания но с хорошим охватом получить правую последовательность. Поэтому красящие вещества должны быть легко разбавлены тоньше и легко высушены для утолщения. Можно использовать различные виды красок; здесь, результаты представлены водорастворимыми (не водонепроницаемыми) подводны для глаз и эмалью краски. Non водонепроницаемые карандаши для глаз имеют то преимущество, что легко сжиженный при смешите с водой. Тем не менее, это торгует с разбавления пигментации (которые не могут или могут быть желательными (см., например, рис. 3)). Краски эмали имеют консистенцию, которая может легко контролироваться путем добавления тоньше эмали, в то же время обеспечивая полный охват. Однако, эта характеристика торгует с возможностью поддержания волос или структуры шкалы части тела покрашенной. Кроме того, эмаль краски долговечном. Недостатком этого является то, что эмаль краски и тоньше излучают сильные запахи во время применения и перед сушкой. Еще одна трудность в отношении окраски вещества могут быть, чтобы найти правильный оттенок, с правом спектральных свойств. Это, например, трудно получить красный карандаш для глаз, чтобы использовать параллельно с черной подводкой для глаз, как карандаши для глаз часто более розовый, чем красный. Кроме того, трудно получить Макияж порошок (или пигменты), которые не содержат каких-либо блеск (которые иногда могут быть видны только под микроскопом). Многие продукты косметики также отражают УФ-излучение, которое, будучи невидимым для экспериментаторов, может быть заметным для изучаемых животных.
Манипулирование окраски членистоногих, непосредственно применяя красители на их части тела поставляется с преимуществами и неудобствами по сравнению с другими методами. Его основным ограничением является то, что нельзя абсолютно уволить возможность некоторых тонких эффектов токсичности. Однако, можно обеспечить не вводить смещения против одной группы обработки путем прикладывать краску к всем категориям обработки, и/или одно может испытать ли применение краски мешает с поведениями интереса. С методами, представленными здесь, мы собрали достаточно доказательств, чтобы предположить, что краска применение привело к незначительным, чтобы не отрицательный эффект (Таблица 1 и Таблица 2). Основным преимуществом этого метода является то, что крошечные пятна цвета могут быть ориентированы, их цвет "Удалить" (см. Рисунок 2), сделал скучнее (рис. 3) или ярче (Рисунок 4), в отрыве от остальной части окраски тела и человека Среды. Это контрастирует с наиболее распространенным альтернативным методом, который состоит из манипулирования условиями освещения, и тем самым изменение визуального внешнего вида всего человека и его окрестностей. В самом деле, даже если не специально манипулирования условиями освещения, можно успешно манипулировать цветом и увидеть ограниченное или нет последствий этой манипуляции, если освещение не подходит39. Таким образом, важно измерить и рассмотреть световой среды, где любые эксперименты будут проводиться (например, Измерение освещенности) и убедитесь, что близко соответствуют его естественного освещения условий (например, с использованием полного спектра лампочки, которые имитируют естественного света, когда в неволе). В целом, с помощью микро кисти и Микроскоп, этот протокол позволяет более точно манипуляции крошечных цветовых патчей, чем большинство других прямых методов окраски, которые были использованы ранее на беспозвоночных. Большинств предыдущие изучения использовали животных с пятнами цвета которые относительно большие сравненные к лицам прыгая спайдеров (например, манипуляция цветов крыла бабочки29,34,35, тела взрослого гехепараны ("истинные жуки")30,36 и кузнечиков31, или ноги относительно больших пауков волка32,33,37). Представленные здесь методы открывают возможности для изучения удивительного разнообразия цветовых пятен на таксонов, которые недоизучены из-за их небольшого размера.
Аналогичные методы могут быть применены к другим членистоногих, которые могут быть обездвижены или анестезированные и для областей, где краска не повлияет на мобильность или здоровье человека (например, за исключением таких областях, как суставы, структуры, такие как волосы или ароли, которые необходимы для надлежащей двигательного движения, частей рта или других отверстий, таких как дыхательные сооружения). Эти методы также могут быть расширены, чтобы включить большую палитру красителей, красок и макияж, которые широко доступны.
Наконец, эти деликатные методы могут быть использованы не только для манипулирования цветом на малых организмов, но и манипулировать узорами (например, полосы) в относительно больших организмов. Это должно быть полезным для широкого круга исследователей, которые могут адаптировать наши методы для их собственных исследований полового отбора, коммуникации, сигналы апоспоматической добычей, и других контекстах, в которых животные используют цвет.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование из национального научного фонда (IOS-1557867 для лат), Флоридский музей естественной истории, и энтомологии и Нематологии Департамента университета Флориды. Публикация плата этой статье был профинансирован в части университета Флориды открытого доступа Издательский Фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CO2 tank | AirGas (Radnor, PA) | #CD 50 | to anesthesize spiders |
| Enamel paint thinner | Testors (Vernon Hills, IL) | 75611792569 | to thin enamel paint |
| Flat enamel paint | Testors (Vernon Hills, IL) | red: 075611115009, black: 075611114903, white: 075611116808 | can be thinned with enamel paint thinner |
| Light microscope | Zeiss (Jena, Germany) | stemi 508 | to paint small areas with precision |
| Light microscope camera | Zeiss (Jena, Germany) | Axiocam 105 color | to take picture before and after manipulation for documentation |
| Light microscope camera software | Zeiss (Jena, Germany) | Zen 2 blue edition | to process pictures taken before and after manipulation |
| Liquid liner eyeliner, shade “Perversion” | Urban Decay (Costa Mesa, CA) | (discontinued) | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 2 |
| MegaLiner liquid eyeliner, black | WetnWild (Los Angeles, CA) | SKU# 871A | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 1 |
| Micro brushes | MicroMark (Berkeley Heights, NJ) | #84648 | to allow precise painting of small areas |
| Non-hardening modelling clay | Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC) | 18165 | to stick small nail or insect pin in and flexily adjust their angles |
| Small nail or insect mounting pins | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #1208B7 | to glue spiders on as well as moving away spider’s appendages in front of the area to paint |
| Small plastic containers such as the lids of snap-cap insect collection vials | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #8912 | to mix paint and thinner to the right consistency |
| Small syringe | Fisher Scientific | 1482910F | to transfer small amount of enamel thinner |
| Spectralon white standard | Labsphere Inc. (North Sutton, NH) | WS-1-SL | to measure spectral properties of colors |
| UV-VIS spectrophotometer | Ocean Optics (Dunedin, FL) | USB 2000 (spectrophotometer) with PX-2 (light source) | to measure spectral properties of colors |
| Water soluble school glue | Elmer's (High Point, NC) | #E304 | to mount the spiders onto a nail/pin |
| Wood toothpicks | Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN) | #253-05-0125 | to transfer drops of enamel paint |
References
- Baeta, R., Faivre, B., Motreuil, S., Gaillard, M., Moreau, J. Carotenoid trade-off between parasitic resistance and sexual display: an experimental study in the blackbird (Turdus merula). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 275 (1633), 427-434 (2008).
- Ninnes, C. E., Webb, S. L., Andersson, S. Are red bishops red enough? On the persistence of a generalized receiver bias in Euplectes. Behavioral Ecology. 28 (1), 117-122 (2017).
- Mappes, J., Marples, N., Endler, J. A. The complex business of survival by aposematism. Trends in Ecology & Evolution. 20 (11), 598-603 (2005).
- Clark, D. L., Macedonia, J. M., Rowe, J. W., Kamp, K., Valle, C. A. Responses of Galápagos Lava Lizards (Microlophus bivittatus) to Manipulation of Female Nuptial Coloration on Lizard Robots. Herpetologica. 73, (2017).
- Finkbeiner, S. D., Briscoe, A. D., Reed, R. D. Warning signals are seductive: Relative contributions of color and pattern to predator avoidance and mate attraction in Heliconius butterflies. Evolution. 68 (12), 3410-3420 (2014).
- Moore, M. P., Martin, R. A. Intrasexual selection favours an immune-correlated colour ornament in a dragonfly. Journal of Evolutionary Biology. 29 (11), 2256-2265 (2016).
- Nokelainen, O., Valkonen, J., Lindstedt, C., Mappes, J. Changes in predator community structure shifts the efficacy of two warning signals in Arctiid moths. Journal of Animal Ecology. 83 (3), 598-605 (2014).
- Yewers, M. S. C., Pryke, S., Stuart-Fox, D. Behavioural differences across contexts may indicate morph-specific strategies in the lizard Ctenophorus decresii. Animal Behaviour. 111, 329-339 (2016).
- Baldwin, J., Johnsen, S. The male blue crab, Callinectes sapidus, uses both chromatic and achromatic cues during mate choice. The Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1184 (2012).
- Künzler, R., Bakker, T. C. M. Female preferences for single and combined traits in computer animated stickleback males. Behavioral Ecology. 12 (6), 681-685 (2001).
- Landmann, K., Parzefall, J., Schlupp, I. A sexual preference in the Amazon molly, Poecilia formosa. Environmental Biology of Fishes. 56 (3), 325-331 (1999).
- Nelson, X. J., Jackson, R. R. A predator from East Africa that chooses malaria vectors as preferred prey. PLoS ONE. 1 (1), e132 (2006).
- Bajer, K., Molnár, O., Török, J., Herczeg, G. Female European green lizards (Lacerta viridis) prefer males with high ultraviolet throat reflectance. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (12), 2007-2014 (2010).
- Gerlach, T., Sprenger, D., Michiels, N. K. Fairy wrasses perceive and respond to their deep red fluorescent coloration. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 281 (1787), 20140787 (2014).
- Girard, M. B., Elias, D. O., Kasumovic, M. M. The role of red coloration and song in peacock spider courtship: insights into complex signaling systems. Behavioral Ecology. 29 (6), 1234-1244 (2018).
- Lim, M. L. M., Land, M. F., Li, D. Sex-specific UV and fluorescence signals in jumping spiders. Science. 315 (5811), 481 (2007).
- Xu, M., Fincke, O. M. Ultraviolet wing signal affects territorial contest outcome in a sexually dimorphic damselfly. Animal Behaviour. 101, 67-74 (2015).
- Hill, G. E., McGraw, K. J. Bird coloration: function and evolution. 2, Harvard University Press. 137-200 (2006).
- Chaine, A. S., Roth, A. M., Shizuka, D., Lyon, B. E. Experimental confirmation that avian plumage traits function as multiple status signals in winter contests. Animal Behaviour. 86 (2), 409-415 (2013).
- Hasegawa, M., Arai, E. Experimentally reduced male ornamentation increased paternal care in the Barn Swallow. Journal of Ornithology. 156 (3), 795-804 (2015).
- Lawes, M. J., Pryke, S. R., Andersson, S., Piper, S. E. Carotenoid status signaling in captive and wild red-collared widowbirds: independent effects of badge size and color. Behavioral Ecology. 13 (5), 622-631 (2002).
- Quesada, J., et al. Plumage coloration of the blue grosbeak has no dual function - A test of the armament-ornament model of sexual selection. The Condor. 115 (4), 902-909 (2013).
- Safran, R. J., et al. The maintenance of phenotypic divergence through sexual selection: An experimental study in barn swallows Hirundo rustica. Evolution. 70 (9), 2074-2084 (2016).
- Tringali, A., Bowman, R. Plumage reflectance signals dominance in Florida scrub-jay, Aphelocoma coerulescens, juveniles. Animal Behaviour. 84 (6), 1517-1522 (2012).
- Jerónimo, S., et al. Plumage color manipulation has no effect on social dominance or fitness in zebra finches. Behavioral Ecology. 29 (2), 459-467 (2018).
- Hill, G. E. Plumage coloration is a sexually selected indicator of male quality. Nature. 350 (6316), 337-339 (1991).
- Wolfenbarger, L. L. Female mate choice in northern cardinals: is there a preference for redder males? The Wilson Bulletin. 111 (1), 76-83 (1999).
- ten Cate, C., Verzijden, M. N., Etman, E. Sexual imprinting can induce sexual preferences for exaggerated parental traits. Current Biology. 16 (11), 1128-1132 (2006).
- Davis, A. K., Cope, N., Smith, A., Solensky, M. J. Wing color predicts future mating success in male monarch butterflies. Annals of the Entomological Society of America. 100 (2), 339-344 (2007).
- Exnerová, A., et al. Avoidance of aposematic prey in European tits (Paridae): learned or innate? Behavioral Ecology. 18 (1), 148-156 (2006).
- Forsman, A., Appelqvist, S. Visual predators impose correlational selection on prey color pattern and behavior. Behavioral Ecology. 9 (4), 409-413 (1998).
- Hebets, E. A. Subadult experience influences adult mate choice in an arthropod: exposed female wolf spiders prefer males of a familiar phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (23), 13390 (2003).
- Hebets, E. A., Cuasay, K., Rivlin, P. K. The role of visual ornamentation in female choice of a multimodal male courtship display. Ethology. 112 (11), 1062-1070 (2006).
- Kingsolver, J. G. Experimental manipulation of wing pigment pattern and survival in western white butterflies. The American Naturalist. 147 (2), 296-306 (1996).
- Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: Female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. The American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
- Prudic, K. L., Skemp, A. K., Papaj, D. R. Aposematic coloration, luminance contrast, and the benefits of conspicuousness. Behavioral Ecology. 18 (1), 41-46 (2006).
- Rutledge, J. M., Miller, A., Uetz, G. W. Exposure to multiple sensory cues as a juvenile affects adult female mate preferences in wolf spiders. Animal Behaviour. 80 (3), 419-426 (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Natural variation in condition-dependent display colour does not predict male courtship success in a jumping spider. Animal Behaviour. 93, 267-278 (2014).
- Taylor, L. A., McGraw, K. J. Male ornamental coloration improves courtship success in a jumping spider, but only in the sun. Behavioral Ecology. 24 (4), 955-967 (2013).
- Foelix, R. Biology of spiders. Third edn. , Oxford University Press. (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Condition dependence of male display coloration in a jumping spider (Habronattus pyrrithrix). Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1133-1146 (2011).
- Taylor, L. A., Maier, E. B., Byrne, K. J., Amin, Z., Morehouse, N. I. Colour use by tiny predators: jumping spiders show colour biases during foraging. Animal Behaviour. 90, 149-157 (2014).
- Bates, D., Maechler, M., Bolker, B., Walker, S. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org (2018).
