Summary
Målet med denne protokol er at manipulere farve mønstrene for at hoppe edderkopper og andre meget små leddyr med maling for at studere spørgsmål relateret til seksuel udvælgelse, seksuel kannibalisme, prædation, aposematisme, eller ethvert andet område af animalsk farvning.
Abstract
Inden for adfærdsmæssige økologi, mange eksperimenter er designet til at undersøge de evolutionære formål med farverige træk i forbindelse med seksuel udvælgelse og prædation. Metoder er forskellige, men for det meste består af at ændre farve mønstre af personer med forskellige farvestoffer. Sådanne teknikker har været anvendt på tværs af mange hvirveldyr taxa, især hos fugle, men er forblevet underudviklede for hvirvelløse dyr på grund af vanskeligheden ved effektivt at manipulere farve i små organismer. I stedet for at manipulere udseendet af invertebrater, har forskerne normalt modificeret belysnings miljøet for at filtrere visse bølgelængder. Men, en sådan metode påvirker ikke kun fænotypiske træk af interesse, men hele udseendet af den enkelte og dens omgivende. Her, skalering ned de teknikker, der tidligere anvendes på farverige fugle, præsenterer vi måder at manipulere farverne på små leddyr, ved hjælp af lige så emblematiske men understuderet arter: den farverige hoppe edderkopper.
Introduction
Dyr har ofte udførlige farve mønstre, som de viser under seksuelle møder, agonistiske møder, eller for at afskrække prædation. Disse egenskaber kan formidle oplysninger til modtagere såsom signaler individuelle kvalitet som en Mate1, kæmper evne som en konkurrent2, eller smagsevne som bytte element3. For at forstå de adaptive formål med farverige træk, forskere har designet eksperimenter, der involverer manipulere farver på forskellige måder. Nogle forskere har brugt farvede lokke stimuli såsom modeller4,5,6,7,8, fotografier9, eller videoer10,11, 12 , der præsenteres for modtagere i adfærdsmæssige eksperimenter. Andre, især når du bruger invertebrater, har manipuleret belysning miljø til at påvirke udseendet af farver af levende individer13,14,15,16, 17. alle disse manipulationer, mens genialt, har den ulempe at fjerne potentielt vigtige naturlige adfærd og/eller påvirker meget mere end det træk af interesse. I store hvirveldyr, såsom fugle, manipulerer forskerne meget ofte farve direkte på levende dyr (anmeldt i Hill og McGraw, 200618). Individuelle fjer eller næakker er direkte farvet med markører2,19,20,21,22,23,24, farvestoffer, der indeholder hydrogenperoxid, der ofte anvendes i hårlighteners25,26,27eller forskellige malinger, herunder neglelak28. I hvirvelløse dyr er sådanne undersøgelser, der manipulerer farve mønstre direkte på levende dyrearter, forholdsvis sjældne, men har stadig givet enorm indsigt i funktionen og udviklingen af farve29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39. Selv leddyr undersøgelser synes at være forudindtaget mod større taxa, der kan lettere håndteres og males, efterlader farve mønstre i meget små arter relativt undersøgt.
Her beskriver vi en delikat farve manipulation teknik, der blev udviklet til meget små dyre taxa. Specifikt, denne metode indebærer manipulerer ansigts farvning af mandlige hoppe spiders under et mikroskop for at undersøge betydningen af sådanne farverige træk i forbindelse med Mate valg og seksuel kannibalisme. I dette tilfælde brugte vi Habronattus pyrrithrix (indsamlet fra Phoenix, AZ, USA) som en model arter (figur 1). Vi har offentliggjort resultaterne af eksperimenterende arbejde ved hjælp af nogle af disse teknikker andetsteds38,39, men her beskriver vi metoderne mere detaljeret, end der er gjort tidligere, på en måde, der bør gøre dem tilgængelige for andre forsøg på at replikere dem eller tilpasse dem til brug på andre meget små taxa. Sådanne protokoller bør åbne op for eksperimentelle muligheder på dyr, der kan være lige så farverige som de mest emblematiske fugle, men som normalt er undersøgt.
Protocol
1. klargøring af udstyr
- Vælg passende maling.
- For en vellykket anvendelse, bruge maling, der er hurtig tørring og har en tekstur, der er let manipuleret med tyndere. Produkter, der har været anvendt med succes omfatter ikke-vandtætte øjenvipper, som kan fortyndes med vand, og emalje maling, som kan fortyndes med emalje tyndere (tabel over materialer).
- Når male edderkopper, mener, at skjoldet af de fleste arter har et hærdet Exoskelet, mens den bløde abdomen ofte strækker sig og konstrikter med fodring40.
- Emalje maling producerer en solid, hærdet belægning på den malede overflade; derfor anvende dem på hårde dele af neglebånd (f. eks. carapace, ben, pedipalps). Sådanne emalje belægninger er mindre effektive for edderkop Abdomens, fordi de skræl af edderkop som maven ændrer form med fodring.
- I modsætning hertil producerer øjenvipper ikke en hærdet belægning, men snarere sive ind i den farvede krop skalaer; som sådan, bruge dem på både hårde og bløde kropsdele (herunder edderkop Abdomens).
Bemærk: i de kommende trin præsenteres den mest delikate teknik, der består af at male ansigtet og pedipalps af edderkopper; emalje maling bruges, som er den mest generaliserbart metode på grund af farve mangfoldighed af emalje maling til rådighed.
- Før du tester maling på levende dyr, skal du, hvis det er muligt, først måle malings spektral egenskaber (anvendes blot på papir eller en anden overflade) ved hjælp af et UV-VIS refleksions Spektrofotometer for at sikre, at der ikke er uønskede UV-toppe i spektret, der ville være usynlige for mennesker, men muligvis synlige for de undersøgt arter.
- Brug et dissekerende mikroskop, der er sluttet til et kamera og en computer, til lettere at tage billeder af resultatet af manipulationen med henblik på dokumentation og øge replikerbarhed (tabel over materialer).
- Tænd for mikroskop, computer og software, der behandler kameraets input.
- Vælg den relevante zoom, hvor det endelige billede skal tages.
- Stick en insekt monterings stift eller en lille søm (med hovedet pegede udad) i en kugle af ikke-hærdende modellering ler (omtrent på størrelse med en drue). (Den levende edderkop, der skal males, vil midlertidigt blive monteret i spidsen af denne nål i trin 3,1 nedenfor). Placer modellerings ler og PIN under mikroskopet for at justere målene, så de groft fokuserer på spidsen af nålen (hvor edderkoppen skal monteres).
- Sørg for, at målene er på den rigtige afstand for maleren øjne, og at kameraet ikke hindrer synsfeltet under maleri (som det er tilfældet, hvis kameraet er monteret i en af de oculars, hindrer dybde perception).
- Overfør edderkoppen til et rent plastik hætteglas (ca. 12 DRAMs uden nogen form for gjord eller dødt bytte).
- Forbered monterings-og maler udstyr.
- Anbring en ekstra tynd insekt monterings stift i en kugle af ikke-hærdende modellerings ler (ud over den, der blev brugt i trin 1.2.3), og anbring dem på venstre side af mikroskopet (for højrehåndede personer). Denne stift vil blive brugt til forsigtigt at justere positionerne af edderkoppens ben og pedipalps (efter behov) under maleri.
- Få et lille stykke absorberende papir (såsom en papirhåndklæde), et stykke hvidt printerpapir, malinger til at anvende (her, emalje maling), separate beholdere af maling tyndere (en for hver farve plus en holdes gennemsigtig og ren), individuelle mikro pensler for hver farve (Se tabel over materialer), og en mikro børste til kun at blive brugt med ren tyndere, alle placeret i en organiseret måde på højre for mikroskop (for højrehåndet mennesker).
- Ved hjælp af en tandstikker tilsættes en dråbe maling i en åben plastik skål (f. eks. en lille Petri skål eller et hætteglas), og der tilsættes maling tyndere, for eksempel med en lille sprøjte. Bland de to med tandstikker til den rigtige konsistens (Når malingen er helt homogeniseret, men ikke for løbende) ved at teste det på den hvide printerpapir med en mikro børste.
Bemærk: i visse tilfælde, hvis malingen tørrer hurtigt, forberede det med lidt mere væske end ønsket for anvendelse, og lad børsterne suge i puljen af maling tyndere indtil senere brug (trin 4). - Sæt en ært dråbe vandbaseret lim (Se tabel over materialer) på et hjørne af printerpapiret.
Bemærk: dette skal være den sidste fase af præparatet og det næste skridt skal ske umiddelbart efter dette, således at limen ikke tørrer ud.
2. anæstetisering af edderkoppen
- Med edderkoppen i hætteglasset og en hånd Cupped over åbningen for at forhindre flugt, tilsæt langsomt CO2 gas indtil edderkoppens tredje par ben strækker sig til 180 grader.
- Brug et tidspunkt for udsættelse for CO2 på ca. 20 sekunder til 1,5 minutter, afhængigt af den gennemsnitlige størrelse af arterne og på den enkelte edderkop. Vi har fundet forlængelsen af det tredje par ben til at være en pålidelig indikator for det korrekte niveau af anæstesi i H. pyrrithrix, men dette sandsynligvis varierer på tværs af arter. Hvis du bruger disse teknikker med en anden art for første gang, skal du først teste anæstesi på et par prøver til at vurdere deres respons.
- Giv edderkopper så lidt CO2 som muligt for at opnå det nødvendige niveau af anæstesi. Mens de korte perioder af anæstesi beskrevet her produceret ingen dødelighed (og ingen mærkbare adfærdsmæssige forskelle fra ikke-bedøvet edderkopper), give alle dyr i et eksperiment lige niveauer af anæstesi (herunder Sham kontrol).
- Hold hætteglasset lukket efter tilsætning af CO2 for at vedligeholde edderkoppen under anæstesi; Medtag derfor denne tid, når du beregner, hvor længe edderkoppen udsættes for CO2.
- Når edderkoppen er blevet fjernet fra hætteglasset til at begynde farve manipulation, det vil forblive fuldt bedøvet i ca 1 til 2 minutter; Derfor skal du gøre følgende trin (afsnit 3-6) omgående. På grund af denne begrænsede tid vindue, forsøge følgende maleri metode med døde prøver først (for praksis), før du forsøger at male levende edderkopper.
3. montering af edderkop under mikroskop
- Tilsæt en meget lille mængde lim på hovedet af monterings stiften eller søm i modellering ler tilberedt i synsfeltet af mikroskopet.
Bemærk: Brug den mindste mængde lim, der gør det muligt at opretholde edderkoppen på plads for at sikre, at jeg) edderkoppen ikke glider ud af pinhovedet (hvis for meget lim bruges), og II) edderkopper formår at frigøre sig selv efter at vågne op. - Skub forsigtigt den anæstetiserede edderkop fra hætteglasset over på bordet med dens ventrale side opad.
Bemærk: fordi edderkopper er bløde, bør man være omhyggelig med ikke at trykke eller droppe edderkopper på bordet, da dette kan forårsage skade. - Tryk forsigtigt på pinhovedet (med lim) på edderkoppens brystben (det centrale område, hvor edderkoppens ben fastgøres til kroppen) sådan, at edderkoppen vil let hoppe og udvide benene under det lille tryk påført. For ekstra kontrol af det anvendte tryk, hold modellerings leret med begge hænder, idet begge hænder styres fast mod bordet.
- Flyt modellerings leret ind under mikroskopet, så det område, der skal males, vender opad og i fokus.
4. maleri edderkop
- Vurdere maling konsistens før rører pensel til edderkoppen.
- Retest malingen konsistens (brug absorberende papir til at tørre børsterne, hvis de blev vedligeholdt i den tyndere), justere igen, hvis det er nødvendigt, og altid først prøve at anvende maling på printerpapiret til at styre for maling mængde indeholdt i Børstehårene.
- Med højre hånd og mens du kigger gennem mikroskopet, bringe spidsen af børsten i synsfeltet, og sørg for (en anden gang), at Børstehårene ikke indeholder for meget maling, i hvilket tilfælde tørre noget af det på printeren papir.
- Test maling konsistens på edderkoppen.
- Rør edderkoppen med børsten på det største område, der skal males over. Dette vil informere maleren om konsistensen og mængden af maling er rigtig (dvs., når malingen lidt og langsomt suger ind i håret/skalaer af edderkoppen).
- Hvis der ikke påføres maling, skal du suge børsten ind i malingen og vende tilbage til trin 4,1 for at gentage proceduren.
- Hvis malingen opsuger hurtigt og flyder over på et område, der ikke bør dækkes af maling, og under forudsætning af, at spild er minimal, og at den enkelte stadig kan deltage i forsøget, skal du tørre børsten på det absorberende papir og vende tilbage til trin 4,1 for at gentage proceduren.
Bemærk: denne type væskespild kan ikke fastgøres. Hvis spild når chelicerae eller øjne, eller andre dele, der kan være dødbringende eller giftige for den enkelte, overveje at placere edderkop straks i fryseren for at aflive det, før det vågner op og eksklusive edderkop fra eksperimentet.
- Rør edderkoppen med børsten på det største område, der skal males over. Dette vil informere maleren om konsistensen og mængden af maling er rigtig (dvs., når malingen lidt og langsomt suger ind i håret/skalaer af edderkoppen).
- Mal alle områder, der har brug for farver, efter trin 4,1 og 4,2.
- Hvis du maler ansigtet af edderkoppen, skal du bruge den ekstra tynde nål med venstre hånd til at holde de forreste ben og pedipalps (så de vil være ude af vejen for pensel). Dette gøres bedst, mens du kigger gennem mikroskopet for at undgå at beskadige edderkoppens vedhæng. Hertil kommer, at hvis male ansigtet af edderkop, og afhængigt af de pensler, der anvendes til at male, overveje at male begge sider af ansigtet, før de forsøger at male den centrale del mellem øjnene-begge malede områder kan forenes ved at holde børsten parallelt med edderkop ansigt og inducerende kapillær handling.
Bemærk: når du maler ansigtet af edderkoppen, er det lettest at først male den side nærmest den dominerende hånd, og derefter rotere bolden af ler (med monteret edderkop) rundt under mikroskopet til at male den anden side, efterfulgt af midten. - Når male pedipalps eller ben, Sørg for ikke at røre nogen samlinger, hvis malingen er en hærdning en (såsom emalje maling), og sørg for ikke at anvende maling til den mandlige sæd levering organer (på undersiden af det distale segment af pedipalps).
- Hvis du maler ansigtet af edderkoppen, skal du bruge den ekstra tynde nål med venstre hånd til at holde de forreste ben og pedipalps (så de vil være ude af vejen for pensel). Dette gøres bedst, mens du kigger gennem mikroskopet for at undgå at beskadige edderkoppens vedhæng. Hertil kommer, at hvis male ansigtet af edderkop, og afhængigt af de pensler, der anvendes til at male, overveje at male begge sider af ansigtet, før de forsøger at male den centrale del mellem øjnene-begge malede områder kan forenes ved at holde børsten parallelt med edderkop ansigt og inducerende kapillær handling.
5. tager edderkop billede
- Skift målsætningen til kamera tilstanden.
- Tag et billede ved hjælp af computer softwaren, og sørg for, at den valgte zoom er den, der er valgt på mikroskopet, så der kan tilføjes en skaleringsbar.
6. frigivelse af edderkoppen fra PIN eller søm
- Når edderkoppen begynder at bevæge sig, skal du holde stiften, så edderkoppens forreste ben rører edderkoppens hætteglas.
- Lad Spider frigivelse selv, og hvis det er nødvendigt, forsigtigt hældning nålen til at hjælpe edderkoppen trække sig væk fra den tørrede lim.
- Hvis edderkoppen vågner, før maleriet er færdigt, skal du lade edderkoppen være mindst 15 minutter om at komme sig, før den bliver bedøvet igen. Hvis dette gøres, sikre, at alle grupper får de samme niveauer af anæstesi (herunder Sham-behandlede personer, hvis det er relevant).
Bemærk: edderkopper synes at genoptage deres normale adfærd hurtigt efter manipulation (< 15Min), men vi anbefaler en standardisere hviletiden på 12 timer før du bruger edderkoppen i en adfærds test.
- Hvis edderkoppen vågner, før maleriet er færdigt, skal du lade edderkoppen være mindst 15 minutter om at komme sig, før den bliver bedøvet igen. Hvis dette gøres, sikre, at alle grupper får de samme niveauer af anæstesi (herunder Sham-behandlede personer, hvis det er relevant).
7. analyse af edderkopper adfærd
- Sammenlign opførsel af umanipulerede, Sham-behandlede, og manipuleret til at vurdere den potentielle toksicitet af ansøgningen (som kan variere efter specifikke maling type, farve, applikationsområde, og studere arter). Relevant adfærd at sammenligne kunne omfatte aktivitet sats, type aktivitet udføres, succes med at udføre specifikke aktiviteter (f. eks fange bytte), osv.
- Brug Sham-behandlede edderkopper som en del af den eksperimentelle design (for eksempel modtager maling ansøgning på et ikke-synligt område eller har neutral-farvet maling anvendes til de samme områder) for kun at ændre farven på den enkelte, mens du kontrollerer for andre faktorer (f. eks. håndterings tidspunkt, lugt, overflade tekstur osv.).
Bemærk: Hvis du maler ben eller pedipalps, overveje muligheden for, at dette kan forstyrre sensoriske hår (fremherskende på edderkop ben og pedipalps, se Foelix 201040) og i disse tilfælde Skin-behandlede hanner skal have neutral-farvet maling anvendes på områder som kontrol. - Når du udvikler nye metoder, Sammenlign malede edderkopper med umanipulerede edderkopper til at vurdere, om farve-manipuleret individer stadig opfører sig normalt.
- Brug Sham-behandlede edderkopper som en del af den eksperimentelle design (for eksempel modtager maling ansøgning på et ikke-synligt område eller har neutral-farvet maling anvendes til de samme områder) for kun at ændre farven på den enkelte, mens du kontrollerer for andre faktorer (f. eks. håndterings tidspunkt, lugt, overflade tekstur osv.).
8. måling af refleksions egenskaberne for farve manipulationen på det malede motiv
- Når aflives (efter edderkopper var involveret i et eksperiment eller specifikt aflives til dette formål, se note nedenfor), måle spektral egenskaber af farve manipulation ved hjælp af en standard bærbar UV-Vis Spektrofotometer (tabel over materialer ), især for områder, der er større end 1 mm i diameter.
- For mindre områder anvendes et specialbygget mikrospektrofotometer (et UV-VIS Spektrofotometer, der dirigeres gennem et mikroskop) for lettere og mere præcise målinger, selv om optikken i mikroskopet skærer UV-lys ud, hvilket betyder, at målingerne er begrænset til synlige bølgelængder (Se Taylor et al. 201141).
- I tilfælde, hvor farve manipulerede områder er meget små, og der kræves UV-refleksions data, skal der anvendes UV-VIS-mikrospektrofotometre, der er kommercielt tilgængelige, selv om de er dyrere (Se Taylor et al. 201442).
Bemærk: lyskilden for UV-VIS-spektrofotometre indeholder UV-lys og kan være farlig for dyrenes øjne (herunder vores), så spektral foranstaltninger kun bør udføres, når dyrene er euthaniseret og ikke blot bedøvet. For emalje malede edderkopper, kan dette gøres efter edderkopper har været brugt i eksperimenter, da malingen ikke slides af (Se repræsentative resultater nedenfor). For vandbaseret maling, som sommetider kan falme efter dage eller uger, kunne et sæt edderkopper ofres til måling på det tidspunkt, hvor deres modpart ville være involveret i et eksperiment (til at indfange data, der afspejler den faktiske farve manipulation, der anvendes i forsøg). Rapportering af malings spektral egenskaber vil tillade replikering af andre forskere, der måske ønsker at replikere farve manipulation, men ikke har adgang til de samme specifikke maling produkter.
Representative Results
Effektiviteten af farve manipulation
Ved hjælp af disse teknikker, forskellige grader af farve manipulation er effektive, herunder skjule farver helt eller reducere eller øge deres intensitet. Dette fremgår af både fotografier og målinger af spektral refleksionsevne (figur 2, figur 3og figur 4). Her viser vi farve-manipulerede mandlige Habronattus pyrrithrix sammenlignet med naturlige røde-konfronteret mænd. Spektral egenskaber blev målt ved hjælp af et UV-VIS Spektrofotometer (se tabel over materialer), der præcist kan måle farvede områder så små som 1 mm i diameter. Målingerne blev taget i forhold til en diffus refleksions hvid standard (se tabel over materialer).
I sjældne tilfælde (5 ud af 108 hanner malet med sort eyeliner 1 (Se tabel over materialer) på deres ansigt), den vandopløselige eyeliner begyndte at bære off edderkopper ansigter efter en uge eller to. Dette blev ikke observeret for det andet mærke af eyeliner (eyeliner 2; Se tabel over materialer). I begge tilfælde blev edderkoppe bure sprøjtet med vand tre til fem gange om ugen. Forskellige vedligeholdelsesbetingelser kan påvirke slid på vandbaseret maling. Emalje malingen var stadig intakt for alle manipulerede hanner (n = 221), selv for dem der stadig lever efter 6 måneder.
Potentiel toksicitet af farve manipulation
Man bør undgå at få maling på edderkopper øjne for ikke at hindre deres syn, eller på deres chelicerae, munddele og andre åbninger, og eventuelt andre bløde kropsdele for at forhindre mulig indtagelse og forgiftning. Man bør også være forsigtig med maleri samlinger eller dele, der indeholder sensoriske hår (såsom ben og pedipalps) for ikke at begrænse deres mobilitet eller sanse system. Men hvis sådanne farve manipulationer på disse organ regioner er nødvendige, eller hvis der er nogen tvivl om muligheden for subtile negative virkninger, er det så bedst at anvende maling til enkeltpersoner i alle behandlingskategorier. På denne måde, man ville undgå utilsigtet at manipulere de sensoriske systemer af enkeltpersoner på måder, der kan være forudindtaget mod en af behandlingerne kun. For eksempel, i et eksperiment ved hjælp af hanner manipuleret vist i figur 4, var målet at øge og mindske antallet af røde pletter, der vises af mænd under bejder. Da nogle mænd ville få deres naturlige røde ansigter skjult med grå emalje maling (for at mindske mængden af rødt vises), de andre hanner, som vi ønskede at opretholde en rød ansigt blev malet rødt over deres naturligt røde ansigt med samme produkt som den grå-konfronteret Mænd. Tilsvarende, da vi ønskede at tilføje røde pletter til pedipalp på visse hanner til at øge mængden af røde farve pletter vises, grå maling blev brugt til at dække pedipalp af andre mænd, således at alle hanner ville blive malet på dette følsomme område (Se figur 4) . Selv om denne strategi er at foretrække, er den måske ikke altid gennemførlig. For eksempel, i et andet eksperiment, den røde farvning blev fjernet ved hjælp af en sort eyeliner giver den samme spektral egenskab som den underliggende kutikula af den mandlige, mens de andre mandlige farver intakt og naturlig (figur 2). I dette tilfælde, for naturligt udseende mænd, den samme mængde af eyeliner blev anvendt til området på toppen af deres skjoldet lige bag deres forreste median øjne (et område, der ikke er klart synlig for kvinder), til kontrol af potentiel lugt eller samlede toksicitet af Produkt. Men den placering, hvor malingen påføres kan påvirke edderkopper forskelligt. Derfor, for at vurdere subtile forskelle i vejen eller det sted, hvor malingen blev anvendt, kan have på integriteten af edderkoppen, opførsel af begge typer af mænd i en sammenhæng, der var relevant for vores hypoteser (i forhold til Mate valg og seksuel kannibalisme) blev sammenlignet. Mænd blev sat to-af-to i nærværelse af en kvindelig, og vi sammenlignede deres forsinkelse for at blive aktive, deres forsinkelse til at bejde, og den samlede varighed, de tilbragte bejder med generelle lineære blandet effekt modeller (ved hjælp af funktionen lmer med R-pakken lme443 i R version 3.5.244 med den kvindelige identitet som en tilfældig effekt, og ved hjælp af den maksimale sandsynlighed kriterium for at opnå p-værdier). I dette tilfælde viser alle sammenligninger ingen forskelle mellem behandlingerne (se tabel 1), og det konkluderedes derfor, at vi ikke indførte en bias til fordel for den ene eller den anden behandlings kategori.
I begge tilfælde, når de har meget ens behandlingskategorier (figur 4), eller kun fingeret behandlede individer (figur 2 og figur 3), bør forskerne vurdere, hvordan deres model arter påvirkes af den maling, de anvender, og sikre, at de stadig opfører sig på en lignende og økologisk relevant måde. Man kunne registrere data for at vurdere de mulige virkninger af toksicitet så meget som muligt, for eksempel ved at sammenligne erhvervsfrekvensen mellem behandlede og umanipulerede individer. Vores edderkopper malet med emalje maling som i figur 4 blev sammenlignet med umanipulerede hanner i en ellers identisk sammenhæng. Specifikt, mænd blev introduceret enkeltvis til en kvindelig bur og deres forsinkelse til at forlade hætteglasset, forsinkelse til bejle og bejle sats (før copulation, og før at blive angrebet eller kannibaliseret) blev sammenlignet. Der blev ikke fundet forskelle (ved brug af lignende lineære blandings modeller som ovenfor), og vi konkluderede derfor, at vores malede mænd opførte sig naturligt (tabel 2).
Endelig er det vigtigt at bemærke, at alle edderkopper i eksperimenterne (normalt kvinder), at cannibalized farve-manipulerede mænd aldrig syntes at lide af negative virkninger. Edderkopper fordøje deres bytte eksternt, normalt forlader de malede områder af neglebånd bag. Men hvis man tilpasser denne metode til andre systemer, hvor der forbruges farve manipulerede dyr, bør man vurdere den potentielle risiko for toksicitet.
Figur 1 . Voksne mandlige Habronattus pyrrithrix illustrerer, hvor lille deres farvede krop regioner er. Fotograferet af Lyle Buss. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Eksperimentel farve manipulation bruges til at skjule røde facial farvning i Habronattus pyrrithrix. (A) den intakte røde ansigts farvning før farve manipulation. (B) ansigtet farvning af den samme mand efter at skjule den naturlige røde farve med sort eyeliner 1. (C) repræsentative reflektans spektre for den naturlige røde ansigt, den naturlige underliggende sorte neglebånd, og den røde ansigt malet med sort eyeliner 2. Ændret fra Taylor og McGraw 201339. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Eksperimentel farve manipulation bruges til at reducere størrelsen og rødme af den røde ansigts plaster af mandlige Habronattus pyrrithrix. (A) den intakte røde ansigts farvning før farve manipulation. (B) ansigtet farvning af den samme mand efter påføring fortyndet sort eyeliner (Urban forfald) til forsiden af ansigtet, og ikke-fortyndet sort eyeliner langs kanterne af ansigtet patch til at reducere størrelsen af det røde område. C) gennemsnitlige spektral kurver for Sham-behandlede kontrol mænd (n = 21) og farve manipulerede hanner (n = 21) sammenlignet med populations middelværdien (n = 57) og de 10 drabbest hanner fra et tidligere studie41. Figur gengivet fra Taylor et al. 201438. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Eksperimentel farve manipulation bruges til at ændre farven på den røde ansigts plaster af mandlige Har du et navn? Habronattus pyrrithrix hanner malet med (a) rød, (B) rød og grå, og (C) grå emalje maling over deres naturlige røde ansigt og naturligt cremefarvede pedipalps. D) gennemsnitlige spektral kurver for umanipulerede hanner (n = 9) og hanner med ansigtet beklædt med rød emalje maling (n = 9). Ved at anvende en lysere rød over edderkoppens ansigt, vi effektivt forbedret sin røde facial farvning. Fordi emalje maling fuldt ud dækker de underliggende skalaer, kan farve også ændres helt, som det er tilfældet med den grå emalje. (E) i dette eksperiment, blev rød og grå emalje maling valgt til at blive matchet for total lysstyrke (total reflektans over intervallet af bølgelængder synlige for disse edderkopper). Forskelle i Y-aksernes omfang i D og E skyldes forskellige teknikker (f. eks. afstand til stikprøven og de målte områders størrelse) til måling af farveprøver på papir (E) vs. direkte målinger af farverne på edderkoppens Forside (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
| N | Afhængig variabel | P | T | Rødt ansigt | ± SE | Sort ansigt | ± SE | af nFID |
| 202b | Mand forsinkelse til at forlade fad | 0,35 af | -0,93 af | 140,0 af | 23,9 af | 109,8 af | 23,9 af | 102 af |
| 179c | Mandlig forsinkelse til domstolene | 0,74 af | 0,33 af | 983,4 af | 127,1 af | 1031,0 af | 126,5 af | 95 af |
| 204a | Mandlige bejder indsats | 0,52 af | 0,63 af | 181,2 af | 24,4 af | 203,0 af | 24,4 af | 102 af |
| 204a | Mandlige bejder indsats forud for ethvert angreb | 0,41 af | 0,68 af | 89,0 af | 15,7 af | 97,5 af | 15,7 af | 102 af |
Tabel 1. Effekten af mandlige ansigt farve manipulation på adfærd, når malet med sort eyeliner vs. Sham behandlet (figur 2). Strukturen af hver model er givet, samt de gennemsnitlige estimater i sekunder (± SE) for hver behandlingsgruppe. N = antallet af hanner, p og t = p-værdi og t-værdi for den mandlige behandling, nFID = antallet af niveauer i den tilfældige effekt kvindelige identitet. en Ud af de 104 mandlige tests udført, 102 blev indspillet, hvilket førte til 204 unikke mænd observeret. b2 hanner blev kannibaliseret af kvinden forud for nogensinde at forlade Petri skålen. c25 hanner blev kannibaliseret af kvinden forud for nogensinde at bejde den kvindelige.
| N | Afhængig variabel | P | T | Umanipulerede | ± SE | Malet | ± SE |
| 32a | Mand forsinkelse til at forlade fad | 0,87 af | -0,17 af | 380,8 af | 143,1 af | 345,4 af | 152,4 af |
| 31b | Mandlig forsinkelse til domstolene | 0,93 af | -0,09 af | 502,6 af | 105,8 af | 488,1 af | 116,6 af |
| 31b | Mandlige bejder indsats | 0,74 af | -0,33 af | 2324,3 af | 455,0 af | 2102,1 af | 484,4 af |
| 31b | Mandlige bejder indsats forud for ethvert angreb | 0,68 af | 0,42 af | 1495,1 af | 450,8 af | 1770,1 af | 479,9 af |
Tabel 2. Effekten af mandlig ansigt farve manipulation på adfærd, når malet med rød eller grå emalje maling (n = 15, figur 4) vs. umanipulerede hanner (n = 17). Strukturen af hver model er givet, samt de gennemsnitlige estimater i sekunder (± SE) for hver behandlingsgruppe. N = antal hanner, p og t = p-værdi og t-værdi for den mandlige behandling. en17 umanipulerede hanner blev sammenlignet med en delmængde af alle de malede hanner i vores eksperiment (n = 221). Specifikt blev de sammenlignet med 15 malede hanner (5 røde (figur 2a), 5 røde og grå (figur 2b) og 5 grå (figur 2c)) testet i samme sammenhæng (i tilstedeværelse af en kvindelig) og i samme specifikke tidsperiode. Dette er vigtigt, fordi umanipulerede hanner blev testet mod slutningen af eksperimentet (i august og september 2018), hvilket svarer til slutningen af deres naturlige ynglesæson, og hvor mænd generelt er mindre aktive. At holde alle disse andre variabler lige giver os mulighed for at sammenligne maleriet behandling uden at indføre andre fordomme. b En mandlig (alle grå) var cannibalized før nogensinde bejder den kvindelige.
Discussion
Her viser vi, at farverne på bittesmå kropsdele af leddyr effektivt kan manipuleres ved hjælp af farvestoffer som makeup og emalje maling.
Den første kritiske skridt til at opnå en sådan delikat manipulation er at være i stand til at immobilisere små dyr, der normalt ikke kan fastholdes i ens hånd. Her, at være i stand til at male følsomme områder som hoppe edderkop ansigt, vi bedøvet individer med CO2 og monteret dem på hovedet af en PIN. Dette tillader arbejde tæt på edderkoppens øjne med mindre stress end edderkoppen ville sandsynligvis opleve, hvis det var vågen (med lys fra mikroskopet skinner ind i deres ansigter under maleprocessen).
Metoden kræver også at få god kvalitet mikro pensler, og, mest kritisk, passende farvestoffer. Det sværeste skridt i at anvende maling uden spild, men med god dækning er at få den rigtige konsistens. Derfor skal farvestoffer let fortyndes med en tyndere, og let tørres ud til fortykkelse. Der kan anvendes forskellige typer maling; her præsenteres resultaterne med vandopløselige (ikke-vandtætte) eyeliner og emalje maling. Ikke-vandtætte øjenvipper har den fordel, at de er let flydende, når de blandes med vand. Men, dette handler ud med fortynding af pigmentering (som måske ikke eller kan være ønskeligt (Se f. eks figur 3)). Emalje maling har en konsistens, der nemt kan styres ved at tilføje emalje tyndere, mens der stadig giver fuld dækning. Men denne karakteristiske handler ud med mulighed for at opretholde håret eller skala struktur af kroppen del malet. Desuden er emalje maling langtidsholdbare. Ulempen ved dette er, at emalje maling og tyndere udsender stærke lugte under påføring og før tørring. En yderligere vanskelighed med hensyn til farvning stoffer kan være at finde den rigtige nuance, med de rigtige spektral egenskaber. Det er for eksempel svært at få røde eyeliner til at bruge parallelt med sort eyeliner, som eyeliner er ofte mere pink end rød. Det er også svært at få makeup pulver (eller pigmenter), der ikke indeholder glitter (som undertiden kun kan ses under mikroskopet). Mange makeup produkter afspejler også UV-lys, som, mens usynlige for de eksperimentere, kan være iøjnefaldende for de undersøgt dyr.
Manipulerende farvning af leddyr ved direkte at anvende farvestoffer på deres kropsdele kommer med fordele og ulemper i forhold til andre metoder. Dens vigtigste begrænsning er, at man ikke helt kan afvise muligheden for nogle subtile toksicitet virkninger. Men, man kan sikre ikke at indføre bias mod en behandling gruppe ved at anvende maling til alle behandlingskategorier, og/eller man kan teste, om maling ansøgning forstyrrer adfærd af interesse. Med de metoder, der præsenteres her, indsamlede vi nok beviser til at antyde, at maling ansøgningen førte til ubetydelig til ingen negativ effekt (tabel 1 og tabel 2). Den største fordel ved denne metode er, at små pletter af farve kan målrettes, deres farve ' fjernet ' (Se figur 2), lavet duller (figur 3) eller lysere (figur 4), isoleret fra resten af kroppen farvning og den enkeltes Miljø. Dette står i kontrast til den mest almindelige alternative metode, som består i at manipulere lysforholdene og derved ændre det visuelle udseende af hele individet og dets omgivelser. Faktisk, selv når der ikke specifikt manipulerer lysforhold, kan man med held manipulere farve og se begrænset eller ingen virkninger af denne manipulation, hvis belysningen miljø ikke er passende39. Derfor er det vigtigt at måle og overveje det lys miljø, hvor eventuelle eksperimenter vil blive gennemført (dvs. måle bestråling) og sørg for at nøje matche det til naturlige lysforhold (for eksempel ved hjælp af fuld spektrum pærer, der efterligner naturligt lys, når det er i fangenskab). Samlet, ved hjælp af mikro pensler og et mikroskop, denne protokol giver mulighed for mere præcis manipulation af bittesmå farve pletter end de fleste andre direkte farvestoffer metoder, der har været anvendt tidligere på invertebrater. De fleste tidligere undersøgelser har brugt dyr med farve patches, der er relativt store i forhold til ansigter hoppe edderkopper (f. eks manipulation af Butterfly vinge farver29,34,35, ligene af voksne hemipterans (' true bugs ')30,36 og græshopper31, eller benene på relativt store ulve edderkopper32,33,37). De metoder, der præsenteres her åbner op for muligheder for at studere den fantastiske mangfoldighed af farve pletter på taxa, der er under studeret på grund af deres lille størrelse.
Lignende teknikker kan anvendes på andre leddyr, der kan være immobiliseret eller bedøvet og for områder, hvor maling ikke ville påvirke mobiliteten eller sundheden for den enkelte (dvs., bortset fra områder som led, strukturer såsom hår eller arolia, der er nødvendige for passende bevægelse, munddele eller andre åbninger såsom åndedrætsværn). Disse teknikker kan også udvides til at omfatte en større palet af farvestoffer, maling, og makeups, der er bredt tilgængelige.
Endelig kan disse sarte teknikker bruges ikke kun til at manipulere farve på små organismer, men også til at manipulere mønstre (såsom striber) i relativt større organismer. Dette bør være til gavn for en bred vifte af forskere, der kan tilpasse vores metoder til deres egne undersøgelser af seksuel udvælgelse, kommunikation, aposematiske bytte signaler, og andre sammenhænge, hvor dyr bruger farve.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra National Science Foundation (IOS-1557867 til LAT), Florida Museum of Natural History, og Entomology og Nematology Department på University of Florida. Publikations gebyret for denne artikel blev delvist finansieret af University of Florida Open Access-udgivelses fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CO2 tank | AirGas (Radnor, PA) | #CD 50 | to anesthesize spiders |
| Enamel paint thinner | Testors (Vernon Hills, IL) | 75611792569 | to thin enamel paint |
| Flat enamel paint | Testors (Vernon Hills, IL) | red: 075611115009, black: 075611114903, white: 075611116808 | can be thinned with enamel paint thinner |
| Light microscope | Zeiss (Jena, Germany) | stemi 508 | to paint small areas with precision |
| Light microscope camera | Zeiss (Jena, Germany) | Axiocam 105 color | to take picture before and after manipulation for documentation |
| Light microscope camera software | Zeiss (Jena, Germany) | Zen 2 blue edition | to process pictures taken before and after manipulation |
| Liquid liner eyeliner, shade “Perversion” | Urban Decay (Costa Mesa, CA) | (discontinued) | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 2 |
| MegaLiner liquid eyeliner, black | WetnWild (Los Angeles, CA) | SKU# 871A | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 1 |
| Micro brushes | MicroMark (Berkeley Heights, NJ) | #84648 | to allow precise painting of small areas |
| Non-hardening modelling clay | Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC) | 18165 | to stick small nail or insect pin in and flexily adjust their angles |
| Small nail or insect mounting pins | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #1208B7 | to glue spiders on as well as moving away spider’s appendages in front of the area to paint |
| Small plastic containers such as the lids of snap-cap insect collection vials | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #8912 | to mix paint and thinner to the right consistency |
| Small syringe | Fisher Scientific | 1482910F | to transfer small amount of enamel thinner |
| Spectralon white standard | Labsphere Inc. (North Sutton, NH) | WS-1-SL | to measure spectral properties of colors |
| UV-VIS spectrophotometer | Ocean Optics (Dunedin, FL) | USB 2000 (spectrophotometer) with PX-2 (light source) | to measure spectral properties of colors |
| Water soluble school glue | Elmer's (High Point, NC) | #E304 | to mount the spiders onto a nail/pin |
| Wood toothpicks | Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN) | #253-05-0125 | to transfer drops of enamel paint |
References
- Baeta, R., Faivre, B., Motreuil, S., Gaillard, M., Moreau, J. Carotenoid trade-off between parasitic resistance and sexual display: an experimental study in the blackbird (Turdus merula). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 275 (1633), 427-434 (2008).
- Ninnes, C. E., Webb, S. L., Andersson, S. Are red bishops red enough? On the persistence of a generalized receiver bias in Euplectes. Behavioral Ecology. 28 (1), 117-122 (2017).
- Mappes, J., Marples, N., Endler, J. A. The complex business of survival by aposematism. Trends in Ecology & Evolution. 20 (11), 598-603 (2005).
- Clark, D. L., Macedonia, J. M., Rowe, J. W., Kamp, K., Valle, C. A. Responses of Galápagos Lava Lizards (Microlophus bivittatus) to Manipulation of Female Nuptial Coloration on Lizard Robots. Herpetologica. 73, (2017).
- Finkbeiner, S. D., Briscoe, A. D., Reed, R. D. Warning signals are seductive: Relative contributions of color and pattern to predator avoidance and mate attraction in Heliconius butterflies. Evolution. 68 (12), 3410-3420 (2014).
- Moore, M. P., Martin, R. A. Intrasexual selection favours an immune-correlated colour ornament in a dragonfly. Journal of Evolutionary Biology. 29 (11), 2256-2265 (2016).
- Nokelainen, O., Valkonen, J., Lindstedt, C., Mappes, J. Changes in predator community structure shifts the efficacy of two warning signals in Arctiid moths. Journal of Animal Ecology. 83 (3), 598-605 (2014).
- Yewers, M. S. C., Pryke, S., Stuart-Fox, D. Behavioural differences across contexts may indicate morph-specific strategies in the lizard Ctenophorus decresii. Animal Behaviour. 111, 329-339 (2016).
- Baldwin, J., Johnsen, S. The male blue crab, Callinectes sapidus, uses both chromatic and achromatic cues during mate choice. The Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1184 (2012).
- Künzler, R., Bakker, T. C. M. Female preferences for single and combined traits in computer animated stickleback males. Behavioral Ecology. 12 (6), 681-685 (2001).
- Landmann, K., Parzefall, J., Schlupp, I. A sexual preference in the Amazon molly, Poecilia formosa. Environmental Biology of Fishes. 56 (3), 325-331 (1999).
- Nelson, X. J., Jackson, R. R. A predator from East Africa that chooses malaria vectors as preferred prey. PLoS ONE. 1 (1), e132 (2006).
- Bajer, K., Molnár, O., Török, J., Herczeg, G. Female European green lizards (Lacerta viridis) prefer males with high ultraviolet throat reflectance. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (12), 2007-2014 (2010).
- Gerlach, T., Sprenger, D., Michiels, N. K. Fairy wrasses perceive and respond to their deep red fluorescent coloration. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 281 (1787), 20140787 (2014).
- Girard, M. B., Elias, D. O., Kasumovic, M. M. The role of red coloration and song in peacock spider courtship: insights into complex signaling systems. Behavioral Ecology. 29 (6), 1234-1244 (2018).
- Lim, M. L. M., Land, M. F., Li, D. Sex-specific UV and fluorescence signals in jumping spiders. Science. 315 (5811), 481 (2007).
- Xu, M., Fincke, O. M. Ultraviolet wing signal affects territorial contest outcome in a sexually dimorphic damselfly. Animal Behaviour. 101, 67-74 (2015).
- Hill, G. E., McGraw, K. J. Bird coloration: function and evolution. 2, Harvard University Press. 137-200 (2006).
- Chaine, A. S., Roth, A. M., Shizuka, D., Lyon, B. E. Experimental confirmation that avian plumage traits function as multiple status signals in winter contests. Animal Behaviour. 86 (2), 409-415 (2013).
- Hasegawa, M., Arai, E. Experimentally reduced male ornamentation increased paternal care in the Barn Swallow. Journal of Ornithology. 156 (3), 795-804 (2015).
- Lawes, M. J., Pryke, S. R., Andersson, S., Piper, S. E. Carotenoid status signaling in captive and wild red-collared widowbirds: independent effects of badge size and color. Behavioral Ecology. 13 (5), 622-631 (2002).
- Quesada, J., et al. Plumage coloration of the blue grosbeak has no dual function - A test of the armament-ornament model of sexual selection. The Condor. 115 (4), 902-909 (2013).
- Safran, R. J., et al. The maintenance of phenotypic divergence through sexual selection: An experimental study in barn swallows Hirundo rustica. Evolution. 70 (9), 2074-2084 (2016).
- Tringali, A., Bowman, R. Plumage reflectance signals dominance in Florida scrub-jay, Aphelocoma coerulescens, juveniles. Animal Behaviour. 84 (6), 1517-1522 (2012).
- Jerónimo, S., et al. Plumage color manipulation has no effect on social dominance or fitness in zebra finches. Behavioral Ecology. 29 (2), 459-467 (2018).
- Hill, G. E. Plumage coloration is a sexually selected indicator of male quality. Nature. 350 (6316), 337-339 (1991).
- Wolfenbarger, L. L. Female mate choice in northern cardinals: is there a preference for redder males? The Wilson Bulletin. 111 (1), 76-83 (1999).
- ten Cate, C., Verzijden, M. N., Etman, E. Sexual imprinting can induce sexual preferences for exaggerated parental traits. Current Biology. 16 (11), 1128-1132 (2006).
- Davis, A. K., Cope, N., Smith, A., Solensky, M. J. Wing color predicts future mating success in male monarch butterflies. Annals of the Entomological Society of America. 100 (2), 339-344 (2007).
- Exnerová, A., et al. Avoidance of aposematic prey in European tits (Paridae): learned or innate? Behavioral Ecology. 18 (1), 148-156 (2006).
- Forsman, A., Appelqvist, S. Visual predators impose correlational selection on prey color pattern and behavior. Behavioral Ecology. 9 (4), 409-413 (1998).
- Hebets, E. A. Subadult experience influences adult mate choice in an arthropod: exposed female wolf spiders prefer males of a familiar phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (23), 13390 (2003).
- Hebets, E. A., Cuasay, K., Rivlin, P. K. The role of visual ornamentation in female choice of a multimodal male courtship display. Ethology. 112 (11), 1062-1070 (2006).
- Kingsolver, J. G. Experimental manipulation of wing pigment pattern and survival in western white butterflies. The American Naturalist. 147 (2), 296-306 (1996).
- Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: Female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. The American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
- Prudic, K. L., Skemp, A. K., Papaj, D. R. Aposematic coloration, luminance contrast, and the benefits of conspicuousness. Behavioral Ecology. 18 (1), 41-46 (2006).
- Rutledge, J. M., Miller, A., Uetz, G. W. Exposure to multiple sensory cues as a juvenile affects adult female mate preferences in wolf spiders. Animal Behaviour. 80 (3), 419-426 (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Natural variation in condition-dependent display colour does not predict male courtship success in a jumping spider. Animal Behaviour. 93, 267-278 (2014).
- Taylor, L. A., McGraw, K. J. Male ornamental coloration improves courtship success in a jumping spider, but only in the sun. Behavioral Ecology. 24 (4), 955-967 (2013).
- Foelix, R. Biology of spiders. Third edn. , Oxford University Press. (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Condition dependence of male display coloration in a jumping spider (Habronattus pyrrithrix). Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1133-1146 (2011).
- Taylor, L. A., Maier, E. B., Byrne, K. J., Amin, Z., Morehouse, N. I. Colour use by tiny predators: jumping spiders show colour biases during foraging. Animal Behaviour. 90, 149-157 (2014).
- Bates, D., Maechler, M., Bolker, B., Walker, S. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org (2018).
