Summary
Målet med detta protokoll är att manipulera färg mönster av hoppande spindlar och andra mycket små leddjur med färg för att studera frågor som rör sexuellt urval, sexuell kannibalism, predation, aposematism, eller något annat område av djur färgning.
Abstract
Inom området beteende ekologi, är många experiment utformade för att undersöka de evolution ära syftena med färgglada egenskaper i samband med sexuell selektion och predation. Metoder är olika men oftast består av att ändra färg mönster av individer med olika färg ämnen. Sådana tekniker har använts på många ryggradsdjur, särskilt hos fåglar, men har för bli vit underutvecklade för ryggradslösa djur på grund av svårigheten att effektivt manipulera färg i små organismer. I stället, för att manipulera uppkomsten av ryggradslösa djur, har forskarna vanligt vis ändrat ljus miljön för att filtrera bort vissa våg längder. Emellertid, en sådan metod påverkar inte bara fenotypisk drag av intresse utan hela utseendet på individen och dess omgivning. Här, skala ner de tekniker som tidigare använts på färgglada fåglar, presenterar vi sätt att manipulera färgerna på små leddjur, med lika emblematiska men understuderade arter: de färgglada hoppande spindlar.
Introduction
Djur har ofta utarbeta färg mönster som de visar under sexuella möten, agonistiska möten, eller att avskräcka predation. Dessa egenskaper kan förmedla information till mottagare som neurotransmission individuella kvalitet som en Mate1, Fighting förmåga som konkurrent2, eller smaklighet som ett byte post3. För att förstå de adaptiva syftena med färgglada egenskaper har forskarna utformat experiment som involverar manipulerande färger på olika sätt. Vissa forskare har använt färgade lockbete stimuli såsom modeller4,5,6,7,8, fotografier9, eller videor10,11, 12 som presenteras för mottagare i beteendemässiga experiment. Andra, särskilt när de använder ryggradslösa djur, har manipulerat ljus miljön för att påverka utseendet på färger levande individer13,14,15,16, 17. alla dessa manipulationer, medan geniala, har nack delen att ta bort potentiellt viktiga naturliga beteende och/eller påverkar mycket mer än den egenskap av intresse. I stora ryggradsdjur, som fåglar, manipulerar forskare ofta färg direkt på levande djur (ses över i Hill och McGraw, 200618). Enskilda fjädrar eller nävar har färgats direkt med markörer2,19,20,21,22,23,24, färg ämnen som innehåller väteperoxid används ofta i hår Blonde ring25,26,27, eller olika färger inklusive nagellack28. I ryggradslösa djur, sådana studier som manipulerar färg mönster direkt på levande djuren är jämförelse vis sällsynta men har fortfarande gett enorm insikt i funktion och utveckling av färg29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39. Även leddjur studier verkar vara partiska mot större taxa som lättare kan hanteras och målas, lämnar färg mönster i mycket små arter relativt understuderade.
Här beskriver vi en delikat färg manipulation teknik som utvecklades för mycket små djur taxa. Specifikt, denna metod innebär att manipulera ansikts färgning av manliga hoppande spindlar under ett Mikroskop för att undersöka vikten av sådana färgglada drag i samband med Mate val och sexuell kannibalism. I detta fall använde vi Habronattus pyrrithrix (som samlats in från Phoenix, AZ, USA) som en modell art (figur 1). Vi har publicerat resultaten från experimentellt arbete med hjälp av några av dessa tekniker någon annan stans38,39, men här beskriver vi metoderna mer detaljerat än vad som har gjorts tidigare, på ett sätt som bör göra dem tillgängliga för andra försök att replikera dem eller anpassa dem för användning på andra mycket små taxa. Sådana protokoll bör öppna experimentella möjligheter på djur som kan vara lika färgglada som de mest emblematiska fåglarna men som vanligt vis unders öks.
Protocol
1. förberedelse av utrustning
- Välj lämpliga färger.
- För lyckad applicering, Använd färger som är snabbtorkande och har en textur som lätt kan manipuleras med tunnare. Produkter som har använts framgångs rikt inkluderar icke-vattentäta eyeliners som kan för tunnas med vatten, och emalj färger som kan för tunnas med emalj tunnare (tabell över material).
- Vid målning spindlar, anser att skölden av de flesta arter har ett härdat exoskelett medan den mjuka buken ofta sträcker sig och constricts med utfodring40.
- Emalj målar producera en solid, härdad beläggning på den målade ytan; därför tillämpa dem på hårda delar av nagelbanden (t. ex., Carapace, ben, pedipalps). Sådana emalj beläggningar är mindre effektiva för spindel abdomens eftersom de lossnar från spindeln som buken förändringar form med utfodring.
- I kontrast, eyeliners inte producerar en härdad beläggning, men snarare sippra in i den färgade kroppen skalor; som sådana, använda dem på både hårda och mjuka kropps delar (inklusive spindel abdomens).
Obs: i de kommande stegen, den mest känsliga tekniken presenteras som består av målning ansiktet och pedipalps av spindlar; emalj färg används, vilket är den mest generaliserbara metod på grund av färg mångfalden av emalj färg finns.
- Innan du testar färger på levande djur, om möjligt, först mäta de spektrala egenskaperna hos färgen (helt enkelt appliceras på papper eller annan yta) med hjälp av en UV-VIS reflektans spektrofotometer för att säkerställa att det inte finns några oönskade UV-toppar i det spektrum som vara osynlig för människor, men möjligen synlig för de studerade arterna.
- Använd en dissekera Mikroskop ansluten till en kamera och en dator för att lättare ta bilder av resultatet av manipulation för dokumentation och öka replikerbar het (tabell över material).
- Slå på Mikroskop, dator och program vara som bearbetar kamerans ingång.
- Välj relevant zoom där den slutliga bilden ska tas.
- Stick en insekt fäststift eller en liten spik (med huvudet spetsiga utåt) i en boll av icke-härdande modellering lera (ungefär storleken av en druva). (Den levande spindel till vara målat vilja bli temporär monterad till huvud av den här nåla fast i steg 3,1 nedan). Placera modellerings leran och stift under Mikroskop för att justera målen så att de grovt fokus på huvudet av stiftet (där spindeln ska monteras).
- Se till att målen är på rätt avstånd för målarens ögon, och att kameran inte hindrar synfält under målning (vilket är fallet om kameran är monterad i en av de okare, hindrar djup perception).
- Överför spindel till en ren plast Snap-Cap injektions flaska (runt 12 DRAM, utan någon vävning eller döda byten).
- Förbered monterings-och målar utrustning.
- Placera en extra tunn insekt fäststift i en boll av icke-härdande modellering lera (utöver den som används i steg 1.2.3) och placera dem på vänster sida av Mikroskop (för högerhänt människor). Detta stift kommer att användas för att försiktigt justera positionerna av spindelns ben och pedipalps (efter behov) under målning.
- Få en liten bit av absorberande papper (t. ex. en pappers hand duk), en bit vitt skrivar papper, de färger att tillämpa (här, emalj färg), separata behållare av thinner (en för varje färg plus en hålls transparent och ren), enskilda mikro borstar för varje färg (se tabell över material), och en mikro borste för att endast användas med ren thinner, alla placerade på ett organiserat sätt till höger om Mikroskop (för högerhänta personer).
- Med hjälp av en tandpetare, tillsätt en droppe färg i en öppen plast skålen (såsom en liten petriskål eller en injektions flaska mössa) och tillsätt thinner, till exempel med en liten spruta. Blanda de två med tandpetare till rätt konsistens (när färgen är helt homogeniserad, men inte alltför rinnande) genom att testa den på den vita skrivaren papper med en mikro borste.
Obs: i vissa fall, om färgen torkar snabbt, förbereda den med lite mer vätska än vad som önskas för applicering, och låt borstarna blöt i potten av thinner tills senare användning (steg 4). - Sätt en ärtstor droppe vattenbaserat lim (se material tabell) på ett hörn av skrivar papperet.
Obs: detta måste vara den sista etappen av preparatet och nästa steg måste ske omedelbart efter detta, så att limmet inte torkar ut.
2. anesthetizing spindeln
- Med spindeln i injektions flaskan och en handcupped över öppningen för att förhindra flykt, Tillsätt långsamt CO2 gas tills spindelns tredje par ben sträcker sig till 180 grader.
- Använd en tid av exponering för CO2 av cirka 20 sekunder till 1,5 minuter, beroende på den genomsnittliga storleken på arten och på den enskilda spindeln. Vi har funnit förlängningen av det tredje paret av ben för att vara en pålitlig indikator på rätt nivå av anestesi i H. pyrrithrix, men detta sannolikt varierar mellan arter. Om du använder dessa tekniker med en annan art för första gången, testa först anestesi på några prover för att bedöma deras svar.
- Ge spindlar så lite CO2 som möjligt för att uppnå den nödvändiga nivån av anestesi. Medan de korta perioder av anestesi som beskrivs här producerade ingen dödlighet (och inga märkbara beteendemässiga skillnader från icke-sövda spindlar), ge alla djur i ett experiment lika nivåer av anestesi (inklusive simulerade kontroller).
- Håll injektions flaskan stängd efter tillsats av CO2 för att bibehålla spindeln under anestesi; Därför inkludera denna tid vid beräkning av hur länge spindeln utsätts för CO2.
- När spindeln har tagits bort från injektions flaskan för att börja färg manipulation, det kommer att förbli fullt sövda i cirka 1 till 2 minuter; gör därför följande steg (avsnitt 3-6) omgående. På grund av detta begränsade tidsfönster, försök följande målning metod med döda exemplar först (för övning) innan du försöker måla levande spindlar.
3. montering av spindeln under Mikroskop
- Tillsätt en mycket liten mängd lim på huvudet av fäststiftet eller spik i modellering lera utarbetats i synfältet av Mikroskop.
Obs: Använd den minsta mängden lim som gör det möjligt att underhålla spindeln på plats för att säkerställa att i) spindeln inte glida av Pinhead (om för mycket lim används), och II) spindeln lyckas frigöra sig efter att vakna upp. - Skjut försiktigt den bedövade spindeln från injektions flaskan på bordet med dess ventrala sida uppåt.
Obs: eftersom spindlar ' abdomens är mjuka, bör man vara noga med att inte knacka eller släppa spindlar på bordet, eftersom detta kan orsaka skada. - Tryck försiktigt på pinhuvudet (med lim) på spindelns bröst benet (det centrala område där spindelns ben fäster vid kroppen) så att spindeln kommer att studsa lite och förlänga benen under det lilla tryck som appliceras. För extra kontroll av trycket appliceras, hålla modellering lera med båda händerna, med båda händerna stabiliserats stadigt mot bordet.
- Flytta modellerings leran under Mikroskop så att området att måla är vänd uppåt och i fokus.
4. målning av spindeln
- Bedöm färgen konsistens innan du rör pensel till spindeln.
- Testa om färgen konsistens (Använd absorberande papper för att torka av borstarna om de var kvar i tunnare), justera igen om det behövs, och alltid först försöka tillämpa färg på skrivaren papper för att styra för den färg kvantitet som finns i borsten hårstrån.
- Med höger hand och medan du tittar genom Mikroskop, ta spetsen av borsten i synfältet, och se (en andra gång) att borsten håren inte innehåller för mycket färg, i vilket fall torka en del av det på skrivarens papper.
- Testa färgen konsistens på spindeln.
- Vidrör spindeln med borsten på det största området som måste målas över. Detta kommer att informera målaren om konsistens och kvantitet av färg är rätt (dvs närfärgen något och sakta suger in i håret/skalor av spindeln).
- Om ingen färg får appliceras, Blötlägg borsten i färgen och återgå till steg 4,1 för att upprepa proceduren.
- Om färgen suger i snabbt och spiller över på ett område som inte bör täckas av färg, och förutsatt att spill är minimal och att individen fortfarande kan delta i experimentet, torka borsten på det absorberande papperet och återgå till steg 4,1 för att upprepa förfarandet.
Obs: denna typ av vätske spill kan inte åtgärdas. Om spill når chelicerae eller ögonen, eller andra delar som kan vara dödliga eller giftiga för individen, överväga att placera spindeln omedelbart i frysen för att euthanize det innan det vaknar upp och utesluta spindeln från experimentet.
- Vidrör spindeln med borsten på det största området som måste målas över. Detta kommer att informera målaren om konsistens och kvantitet av färg är rätt (dvs närfärgen något och sakta suger in i håret/skalor av spindeln).
- Måla alla områden som behöver färger enligt steg 4,1 och 4,2.
- Om målning ansiktet av spindeln, använda den extra tunna stift med vänster hand för att hålla ner de främre benen och pedipalps (så att de kommer att vara ur vägen för pensel). Detta görs bäst medan du tittar genom Mikroskop för att undvika att skada spindelns bihang. Dessutom, om målning ansiktet på spindeln, och beroende på de penslar som används för att måla, överväga att måla båda sidor av ansiktet innan du försöker måla den centrala delen mellan ögonen-båda målade områden kan förenas genom att hålla borsten parallellt med spindel ansiktet och inducera kapillärverkan.
Obs: när du målar ansiktet på spindeln, är det lättast att först måla den sida närmast dominerande handen, och sedan rotera bollen av lera (med den monterade spindeln) runt under Mikroskop för att måla den andra sidan, följt av mitten. - När måla pedipalps eller ben, se till att inte röra någon lederna om färgen är en härdning en (t. ex. emalj färg), och se till att inte tillämpa färg på hanens spermier leverans organ (på under sidan av distala segmentet av pedipalps).
- Om målning ansiktet av spindeln, använda den extra tunna stift med vänster hand för att hålla ner de främre benen och pedipalps (så att de kommer att vara ur vägen för pensel). Detta görs bäst medan du tittar genom Mikroskop för att undvika att skada spindelns bihang. Dessutom, om målning ansiktet på spindeln, och beroende på de penslar som används för att måla, överväga att måla båda sidor av ansiktet innan du försöker måla den centrala delen mellan ögonen-båda målade områden kan förenas genom att hålla borsten parallellt med spindel ansiktet och inducera kapillärverkan.
5. med spindelns bild
- Byt mål till kamera läget.
- Ta en bild med hjälp av dator program, se till att zooma plockade är den som valts på Mikroskop, så att en skala bar kan läggas till.
6. frigöra spindeln från stiftet eller nageln
- När spindeln börjar röra sig, håll stiftet så att spindelns fram benen vidrör spindelns injektions flaska.
- Låt spindeln släppa sig själv, och om det behövs, försiktigt luta stiftet för att hjälpa spindeln dra sig bort från det torkade limmet.
- Om spindeln vaknar innan målningen är klar, låt spindeln minst 15 minuter att återhämta sig innan de bedövas igen. Om detta görs, se till att alla grupper får samma nivåer av anestesi (inklusive simulerade individer, om tillämpligt).
Obs: spindlar verkar återuppta sitt normala beteende snabbt efter manipulation (< 15min) men vi rekommenderar en standardisering vila tid på 12 timmar innan du använder spindeln i ett beteende test.
- Om spindeln vaknar innan målningen är klar, låt spindeln minst 15 minuter att återhämta sig innan de bedövas igen. Om detta görs, se till att alla grupper får samma nivåer av anestesi (inklusive simulerade individer, om tillämpligt).
7. analys av spindlar beteende
- Jämför beteendet hos omanipulerade, simulerad, och manipuleras ämnen för att bedöma den potentiella toxiciteten av ansökan (som kan variera beroende på färg typ, färg, applikations område, och studie arter). Relevant beteende att jämföra kan inkludera aktivitets frekvens, typ av aktivitet som utförs, framgång i att utföra specifika aktiviteter (t. ex. fånga byten), etc.
- Använd simulerade spindlar som en del av experimentell design (till exempel ta emot färg ansökan på ett icke-synligt område eller med neutrala färger som tillämpas på samma områden) för att bara ändra färgen på individen medan du kontrollerar för andra faktorer (t. ex. hanterings tid, lukt, ytstruktur osv.).
Anmärkning: om målning ben eller pedipalps, överväga möjligheten att detta kan störa sensoriska hårstrån (utbredd på spindel ben och pedipalps, se Foelix 201040) och, i dessa fall simulerade män bör ha neutral-färgade färger appliceras på samma områden som en kontroll. - När man utvecklar nya metoder, jämför målade spindlar med oförmanipulerade spindlar för att bedöma om färgmanipulerade individer fortfarande beter sig normalt.
- Använd simulerade spindlar som en del av experimentell design (till exempel ta emot färg ansökan på ett icke-synligt område eller med neutrala färger som tillämpas på samma områden) för att bara ändra färgen på individen medan du kontrollerar för andra faktorer (t. ex. hanterings tid, lukt, ytstruktur osv.).
8. mätning av reflektans egenskaper hos färg manipulationen på det målade motivet
- När euthanized (efter spindlar var inblandade i ett experiment eller specifikt euthanized för detta ändamål, se anmärkning nedan), mäta de spektrala egenskaperna hos färg manipulation med hjälp av en vanlig bärbar UV-VIS spektrofotometer (tabell över material ), särskilt för områden som är större än 1 mm i diameter.
- För mindre områden, Använd en specialbyggd mikrospektrofotometer (en UV-VIS spektrofotometer som dirigeras genom ett Mikroskop) för enklare och mer precisa mätningar, även om optiken i mikroskopet skär ut UV-ljus, vilket innebär att mätningarna är begränsade till mänskliga synliga våg längder (se Taylor et al. 201141).
- I de fall där färgmanipulerade områden är extremt små och UV-reflektans data krävs, Använd kommersiellt tillgängliga UV-VIS mikrospektrofotometrar, även om de är dyrare (se Taylor et al. 201442).
Anmärkning: ljus källan till UV-VIS spektrofotometrar innehåller UV-ljus och kan vara farlig för djurens ögon (inklusive vår) så spektralmått bör endast göras efter att djuren avlivas och inte bara bedövas. För emalj-målade spindlar kan detta göras efter att spindlarna har använts i experiment eftersom färgen inte slits av (se representativa resultat nedan). För vattenbaserad färg som ibland kan blekna efter dagar eller veckor, kan en uppsättning spindlar offras för mätning vid den tidpunkt då deras motsvarighet skulle vara inblandade i ett experiment (för att fånga data som återspeglar den faktiska färg manipulation som används i ett experiment). Om du rapporterar de spektrala egenskaperna hos färgerna kommer andra forskare som kanske vill replikera färg manipulationen att replikeras, men inte ha till gång till samma specifika färg produkter.
Representative Results
Effektiviteten av färg-manipulation
Med hjälp av dessa tekniker, olika grader av färg manipulation är effektiva, inklusive dölja färger helt eller minska eller öka deras intensitet. Detta framgår av både fotografier och mätningar av spektralreflektans (figur 2, figur 3och figur 4). Här visar vi färgmanipulerade manliga Habronattus pyrrithrix jämfört med naturliga röd-faced män. Spektralegenskaper mättes med en UV-VIS spektrofotometer (se tabell över material) som exakt kan mäta färgade områden så små som 1 mm i diameter. Mätningar har gjorts i förhållande till en vit standard för diffus reflektans (se material tabell).
I sällsynta fall (5 av 108 hanar målade med svart eyeliner 1 (se tabell över material) på deras ansikte), började den vattenlösliga eyelinern att slitas av spindlarnas ansikten efter en vecka eller två. Detta observerades inte för det andra märket av eyeliner (eyeliner 2; se material tabell). I båda fallen besprutades spindelns burar med vatten tre till fem gånger per vecka. Olika underhålls förhållanden kan påverka förslitningen av vattenbaserad färg. Emaljfärgen var fortfarande intakt för alla manipulerade hanar (n = 221), även för dem som fortfarande lever efter 6 månader.
Potentiell toxicitet av färg manipulation
Man bör undvika att få måla på spindlarnas ögon för att inte hindra deras vision, inte heller på deras chelicerae, mun delar och andra öppningar, och möjligen andra mjuka kropps delar för att förhindra eventuell förtäring och förgiftning. Man bör också vara försiktig med målning fogar eller delar som innehåller sensoriska hårstrån (såsom ben och pedipalps) för att inte begränsa deras rörlighet eller sensoriska system. Men om sådana färg manipulationer på dessa kropps områden är nödvändiga, eller om det finns några tvivel om möjligheten till subtila negativa effekter, är det då bäst att tillämpa färger till individer i alla behandlings kategorier. På så sätt skulle man undvika att oavsiktligt manipulera sensoriska system av individer på ett sätt som kan vara vinklade mot en av behandlingarna bara. Till exempel, i ett experiment med män manipuleras visas i figur 4, målet var att öka och minska antalet röda fläckar som visas av män under uppvaktning. Eftersom vissa män skulle få sina naturliga röda ansikten dolda med grå emalj färg (för att minska mängden rött visas), de andra hanar som vi ville behålla ett rött ansikte målades rött över deras naturligt röda ansikte med samma produkt som grå-faced Män. Likaså, eftersom vi ville lägga till röda fläckar till pedipalp på vissa hanar att öka mängden röda färg fläckar visas, grå färg användes för att täcka pedipalp av andra män så att alla män skulle målas på detta känsliga område (se figur 4) . Denna strategi är kanske inte alltid genomförbar, även om den är att föredra. Till exempel, i ett annat experiment, den röda färg togs bort med hjälp av en svart eyeliner ger samma spektral egenskap som den underliggande nagelbanden av hanen, samtidigt som de andra manliga färgerna intakt och naturligt (figur 2). I detta fall, för naturliga söker män, samma mängd eyeliner applicerades på området på toppen av sin skölden precis bakom deras främre median ögon (ett område som inte är tydligt för kvinnor), för att kontrol lera för potentiell lukt eller övergripande toxicitet av Produkt. Platsen där färgen appliceras kan dock påverka spindlar på olika sätt. Därför, för att bedöma subtila skillnader i vägen eller den plats där färgen tillämpades kan ha på integriteten av spindeln, beteendet hos båda typerna av män i ett sammanhang som var relevant för våra hypoteser (i förhållande till Mate val och sexuell kannibalism) jämfördes. Hanar sattes två-av-två i närvaro av en kvinnlig, och vi jämförde deras försening att bli aktiv, deras försening till uppvaktning, och den totala varaktigheten de tillbringade uppvakta med allmänna linjära blandad effekt modeller (med hjälp av funktionen lmer med R-paketet lme443 i R version 3.5.244 med den kvinnliga identiteten som en slumpmässig effekt och med det maximala sannolikhets kriteriet för att erhålla p-värden). I detta fall visar alla jämförelser inga skillnader mellan behandlingarna (se tabell 1) och därför drogs satsen att vi inte införde någon bias till förmån för den ena eller den andra behandlings kategorin.
I båda fallen bör forskarna, när de har mycket likartade behandlings kategorier (figur 4), eller endast simulerade individer (figur 2 och figur 3), bedöma hur deras modell arter påverkas av färgen de använder och se till att de fortfarande beter sig på ett liknande och ekologiskt relevant sätt. Man kan registrera data för att bedöma de möjliga effekterna av toxicitet så mycket som möjligt, till exempel genom att jämföra aktivitets frekvenser mellan behandlade och oförmanipulerade individer. Våra spindlar målade med emalj färg som i figur 4 jämfördes med oförmanipulerade hanar i en annars identisk kontext. Specifikt var hanar infördes ensamma till en kvinnlig bur och deras fördröjning att lämna flaskan, försening till uppvaktning och uppvaktning ränta (före parning, och innan de attackerade eller cannibalized) jämfördes. Inga skillnader hittades (vid användning av liknande linjära blandade effekt modeller som ovan) och vi drog därför satsen att våra målade hanar uppförde sig naturligt (tabell 2).
Slutligen, det är viktigt att notera att alla spindlar i experiment (vanligt vis honor) som cannibalized färgmanipulerade hanar aldrig verkade lida av negativa effekter. Spindlar smälta sitt byte externt, vanligt vis lämnar de målade områdena i nagelbanden bakom. Om man anpassar denna metod för andra system där färgmanipulerade djur kommer att konsumeras, bör man dock bedöma de potentiella riskerna för toxicitet.
Figur 1 . Adult hane Habronattus pyrrithrix som illustrerar hur små deras färgade kropps regioner är. Fotograferad av Lyle buss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Experimentell färg manipulation används för att dölja röda ansikts färgning i Habronattus pyrrithrix. (A) den intakta röda ansikts färgen före färg manipulation. (B) ansikts färgning av samma hane efter att dölja den naturliga röda färgen med svart eyeliner 1. (C) representativ reflektans spektra för det naturliga röda ansiktet, den naturliga underliggande svarta nagelbanden, och det röda ansiktet målat med svart eyeliner 2. Modifierad från Taylor och McGraw 201339. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Experimentell färg manipulation används för att minska storleken och rodnad av den röda ansikts plåstret av manliga Habronattus pyrrithrix. (A) intakt röd ansikts färgning före färg manipulation. (B) ansikts färgning av samma manliga efter applicering utspädd svart eyeliner (Urban Decay) till den främre delen av ansiktet, och icke-spädd svart eyeliner längs kanterna av ansiktet plåstret för att minska storleken på det röda området. C) genomsnittliga spektralkurvor för simulerade kontroll hanar (n = 21) och färgmanipulerade hanar (n = 21), jämfört med populations medelvärdet (n = 57) och de 10 drabbest hanarna från en tidigare studie41. Figur återges från Taylor et al. 201438. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Experimentell färg manipulation används för att ändra färgen på den röda ansikts lapp av manliga Mer från Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix hanar målade med (a) röd, (B) röd och grå, och (c) grå emalj måla över deras naturliga röda ansikte och naturligt krämfärgade pedipalps. D) genomsnittliga spektralkurvor för omanipulerade hanar (n = 9) och hanar med ansiktet täckt med röd emalj (n = 9). Genom att applicera en ljusare röd över spindelns ansikte, förbättrade vi effektivt sin röda ansikts färgning. Eftersom emalj färg helt täcker de underliggande skalor, färg kan också ändras helt, vilket är fallet med den grå emalj. (E) i detta experiment, röda och grå emalj färger valdes att matchas för total ljus styrka (total reflektans över intervallet av våg längder synliga för dessa spindlar). Skillnader i skalan på Y-axlarna i D och E beror på olika tekniker (t. ex. avståndet till provet och storleken på de uppmätta områdena) för att mäta färgprover på papper (E) kontra direkta mätningar av färger på spindeln (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| N | Beroende variabel | P | T | Rödbrusig | ± SE | Svart-faced | ± SE | nFID är |
| 202b | Manlig fördröjning att lämna skålen | 0,35 | -0,93 | 140,0 | 23,9 | 109,8 | 23,9 | 102 |
| 179c | Manlig försening till domstol | 0,74 | 0,33 | 983,4 | 127,1 | 1031,0 | 126,5 | 95 |
| 204en | Manliga uppvaktning ansträngning | 0,52 | 0,63 | 181,2 | 24,4 | 203,0 | 24,4 | 102 |
| 204en | Manlig uppvaktning ansträngning innan någon attack | 0,41 | 0,68 | 89,0 | 15,7 | 97,5 | 15,7 | 102 |
I tabell 1. Effekt av manliga ansikte färg manipulation på beteende, när målade med svart eyeliner vs. Sham behandlas (figur 2). Strukturen för varje modell anges, liksom de genomsnittliga uppskattningarna i sekunder (± SE) för varje behandlings grupp. N = antal hanar, p och t = p-värde och t-värde för den manliga behandlingen, nFID = antalet nivåer i den slumpmässiga effekten av kvinnlig identitet. en Av de 104 manliga testerna utfördes, 102 var framgångs rikt inspelade, vilket leder till 204 unika hanar observerats. b2 hanar kannibaliserade av honan innan de någonsin lämnar petriskål. c25 hanar kanniserades av honan innan de någonsin uppvakta honan.
| N | Beroende variabel | P | T | Unmanipulated | ± SE | Målade | ± SE |
| 32en | Manlig fördröjning att lämna skålen | 0,87 | -0,17 | 380,8 | 143,1 | 345,4 | 152,4 |
| 31b | Manlig försening till domstol | 0,93 | -0,09 | 502,6 | 105,8 | 488,1 | 116,6 |
| 31b | Manliga uppvaktning ansträngning | 0,74 | -0,33 | 2324,3 | 455,0 | 2102,1 | 484,4 |
| 31b | Manlig uppvaktning ansträngning innan någon attack | 0,68 | 0,42 | 1495,1 | 450,8 | 1770,1 | 479,9 |
I tabell 2. Effekt av manliga ansikte färg manipulation på beteende, när målade med röd eller grå emalj färg (n = 15, figur 4) vs. omanipulerade hanar (n = 17). Strukturen för varje modell anges, liksom de genomsnittliga uppskattningarna i sekunder (± SE) för varje behandlings grupp. N = antal hanar, p och t = p-värde och t-värde för den manliga behandlingen. en17 omanipulerade hanar jämfördes med en delmängd av alla målade hanar i vårt experiment (n = 221). Närmare bestämt jämfördes de med 15 målade hanar (5 röda (figur 2A), 5 röda och grå (figur 2b) och 5 grå (figur 2C)) testade i samma sammanhang (i närvaro av en hona) och under samma specifika tids period. Detta är viktigt eftersom omanipulerade hanar testades mot slutet av experimentet (i augusti och september 2018), vilket motsvarar slutet av deras naturliga häcknings säsong och där hanar i allmänhet är mindre aktiva. Att hålla alla dessa andra variabler lika tillåter oss att jämföra målningen behandling utan att införa andra fördomar. b En manlig (alla grå) var cannibalized innan någonsin uppvakta honan.
Discussion
Här visar vi att färgerna på små kropps delar av leddjur effektivt kan manipuleras med hjälp av färg ämnen som smink och emalj färger.
Det första kritiska steget för att uppnå en sådan delikat manipulation är att kunna immobilisera små djur som vanligt vis inte kan hållas tillbaka i sin hand. Här, för att kunna måla känsliga områden som hoppar spindelns ansikte, bedövade vi individer med CO2 och monterade dem på huvudet av en nål. Detta gör det möjligt att arbeta nära spindelns ögon med mindre stress än spindeln skulle sannolikt uppleva om det var vaken (med ljus från Mikroskop lyser i deras ansikten under målningen processen).
Metoden kräver också att få bra kvalitet mikroborstar, och, mest kritiskt, lämpliga färg ämnen. Det svåraste steget i att tillämpa färg utan spill men med god täckning är att få rätt konsistens. Därför, färg ämnen måste lätt spädas med en tunnare, och lätt torkas ut för förtjockning. Olika typer av färger kan användas; Här presenteras resultaten med vattenlösliga (icke-vattentäta) eyeliners och emalj färger. Icke-vatten täta eyeliners har fördelen att de lätt kan kondenseras när de blandas med vatten. Emellertid, detta avslut med utspädning av pigmentering (som inte kan eller kan vara önskvärt (se till exempel figur 3)). Emalj färger har en konsistens som lätt kan kontrol leras genom att tillsätta emalj tunnare, samtidigt som den ger full täckning. Emellertid, denna karakteristiska avslut med möjligheten att bibehålla håret eller skala struktur av kroppen del målade. Dessutom, emalj färger är långvariga. Nack delen med detta är att emalj färg och tunnare avger starka lukter under applicering och före torkning. Ytterligare en svårighet när det gäller färg ämnen kan vara att hitta rätt nyans, med rätt spektralegenskaper. Det är till exempel svårt att få röd eyeliner att använda parallellt med svart eyeliner, som eyeliners är ofta mer rosa än rött. Det är också svårt att få smink pulver (eller pigment) som inte innehåller något glitter (som ibland kan bara synas under Mikroskop). Många Makeup produkter reflekterar också UV-ljus som, medan osynliga för experimenterare, kan vara iögonfallande för de studerade djuren.
Manipulera färgning av leddjur genom att direkt tillämpa färg ämnen på sina kropps delar kommer med fördelar och olägenheter jämfört med andra metoder. Dess huvudsakliga begränsning är att man inte absolut kan avfärda möjligheten av några subtila toxicitetseffekter. Man kan dock se till att inte införa fördomar mot en behandlings grupp genom att måla alla behandlings kategorier, och/eller man kan testa om färgen ansökan stör beteenden av intresse. Med de metoder som presenteras här samlade vi tillräckligt med bevis som tyder på att färgen ansökan ledde till försumbar till ingen negativ effekt (tabell 1 och tabell 2). Den största fördelen med denna metod är att små fläckar av färg kan riktas, deras färg "bort" (se figur 2), gjorde mattare (figur 3) eller ljusare (figur 4), isolerat från resten av kroppen färg och individens Miljö. Detta kontrasterar mot den vanligaste alternativa metoden som består i att manipulera ljus förhållandena, och därigenom ändra det visuella utseendet hos hela individen och dess omgivning. I själva verket, även när inte specifikt manipulera ljus förhållanden, kan man framgångs rikt manipulera färg och se begränsade eller inga effekter av denna manipulation om ljus miljön inte är lämplig39. Därför är det viktigt att mäta och överväga ljus miljön där alla experiment kommer att utföras (dvs mäta irradians) och se till att noga matcha den med naturliga ljus förhållanden (till exempel med hjälp av fullt spektrum glöd lampor som efterliknar naturligt ljus i fångens Kap). Sammantaget, genom att använda mikro borstar och ett Mikroskop, detta protokoll möjliggör mer exakt manipulering av små färg fläckar än de flesta andra direkta färg läggnings metoder som har använts tidigare på ryggradslösa djur. De flesta tidigare studier har använt djur med färg fläckar som är relativt stora jämfört med ansikten hoppande spindlar (t. ex. manipulation av Butterfly Wing färger29,34,35, kropparna av vuxna hemipterans ("sanna buggar")30,36 och gräshoppor31, eller benen av relativt stora varg spindlar32,33,37). De metoder som presenteras här öppnar möjligheter att studera den fantastiska mångfalden av färg fläckar på taxa som unders öks på grund av sin ringa storlek.
Liknande tekniker kan tillämpas på andra leddjur som kan immobiliseras eller bedövas och för områden där färg inte skulle påverka rörligheten eller hälsan hos den enskilde (dvs., exklusive områden som leder, strukturer som hår eller arolia som behövs för lämplig förflyttning, mun delar eller andra öppningar såsom andnings strukturer). Dessa tekniker kan också utvidgas till att omfatta en större palett av färg ämnen, färger och Makeups som är allmänt tillgängliga.
Slutligen kan dessa känsliga tekniker användas inte bara för att manipulera färg på små organismer, men också för att manipulera mönster (t. ex. ränder) i relativt större organismer. Detta bör vara fördelaktigt för en mängd olika forskare som kan anpassa våra metoder till sina egna studier av sexuellt urval, kommunikation, varsel byten signaler, och andra sammanhang där djuren använder färg.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från National Science Foundation (IOS-1557867 till LAT), Florida Museum of Natural History, och entomologi och Nematology institutionen vid University of Florida. Publicerings avgiften för denna artikel finansierades delvis av University of Florida Open Access Publishing Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CO2 tank | AirGas (Radnor, PA) | #CD 50 | to anesthesize spiders |
| Enamel paint thinner | Testors (Vernon Hills, IL) | 75611792569 | to thin enamel paint |
| Flat enamel paint | Testors (Vernon Hills, IL) | red: 075611115009, black: 075611114903, white: 075611116808 | can be thinned with enamel paint thinner |
| Light microscope | Zeiss (Jena, Germany) | stemi 508 | to paint small areas with precision |
| Light microscope camera | Zeiss (Jena, Germany) | Axiocam 105 color | to take picture before and after manipulation for documentation |
| Light microscope camera software | Zeiss (Jena, Germany) | Zen 2 blue edition | to process pictures taken before and after manipulation |
| Liquid liner eyeliner, shade “Perversion” | Urban Decay (Costa Mesa, CA) | (discontinued) | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 2 |
| MegaLiner liquid eyeliner, black | WetnWild (Los Angeles, CA) | SKU# 871A | non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 1 |
| Micro brushes | MicroMark (Berkeley Heights, NJ) | #84648 | to allow precise painting of small areas |
| Non-hardening modelling clay | Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC) | 18165 | to stick small nail or insect pin in and flexily adjust their angles |
| Small nail or insect mounting pins | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #1208B7 | to glue spiders on as well as moving away spider’s appendages in front of the area to paint |
| Small plastic containers such as the lids of snap-cap insect collection vials | BioQuip (Rancho Dominguez, CA) | #8912 | to mix paint and thinner to the right consistency |
| Small syringe | Fisher Scientific | 1482910F | to transfer small amount of enamel thinner |
| Spectralon white standard | Labsphere Inc. (North Sutton, NH) | WS-1-SL | to measure spectral properties of colors |
| UV-VIS spectrophotometer | Ocean Optics (Dunedin, FL) | USB 2000 (spectrophotometer) with PX-2 (light source) | to measure spectral properties of colors |
| Water soluble school glue | Elmer's (High Point, NC) | #E304 | to mount the spiders onto a nail/pin |
| Wood toothpicks | Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN) | #253-05-0125 | to transfer drops of enamel paint |
References
- Baeta, R., Faivre, B., Motreuil, S., Gaillard, M., Moreau, J. Carotenoid trade-off between parasitic resistance and sexual display: an experimental study in the blackbird (Turdus merula). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 275 (1633), 427-434 (2008).
- Ninnes, C. E., Webb, S. L., Andersson, S. Are red bishops red enough? On the persistence of a generalized receiver bias in Euplectes. Behavioral Ecology. 28 (1), 117-122 (2017).
- Mappes, J., Marples, N., Endler, J. A. The complex business of survival by aposematism. Trends in Ecology & Evolution. 20 (11), 598-603 (2005).
- Clark, D. L., Macedonia, J. M., Rowe, J. W., Kamp, K., Valle, C. A. Responses of Galápagos Lava Lizards (Microlophus bivittatus) to Manipulation of Female Nuptial Coloration on Lizard Robots. Herpetologica. 73, (2017).
- Finkbeiner, S. D., Briscoe, A. D., Reed, R. D. Warning signals are seductive: Relative contributions of color and pattern to predator avoidance and mate attraction in Heliconius butterflies. Evolution. 68 (12), 3410-3420 (2014).
- Moore, M. P., Martin, R. A. Intrasexual selection favours an immune-correlated colour ornament in a dragonfly. Journal of Evolutionary Biology. 29 (11), 2256-2265 (2016).
- Nokelainen, O., Valkonen, J., Lindstedt, C., Mappes, J. Changes in predator community structure shifts the efficacy of two warning signals in Arctiid moths. Journal of Animal Ecology. 83 (3), 598-605 (2014).
- Yewers, M. S. C., Pryke, S., Stuart-Fox, D. Behavioural differences across contexts may indicate morph-specific strategies in the lizard Ctenophorus decresii. Animal Behaviour. 111, 329-339 (2016).
- Baldwin, J., Johnsen, S. The male blue crab, Callinectes sapidus, uses both chromatic and achromatic cues during mate choice. The Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1184 (2012).
- Künzler, R., Bakker, T. C. M. Female preferences for single and combined traits in computer animated stickleback males. Behavioral Ecology. 12 (6), 681-685 (2001).
- Landmann, K., Parzefall, J., Schlupp, I. A sexual preference in the Amazon molly, Poecilia formosa. Environmental Biology of Fishes. 56 (3), 325-331 (1999).
- Nelson, X. J., Jackson, R. R. A predator from East Africa that chooses malaria vectors as preferred prey. PLoS ONE. 1 (1), e132 (2006).
- Bajer, K., Molnár, O., Török, J., Herczeg, G. Female European green lizards (Lacerta viridis) prefer males with high ultraviolet throat reflectance. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (12), 2007-2014 (2010).
- Gerlach, T., Sprenger, D., Michiels, N. K. Fairy wrasses perceive and respond to their deep red fluorescent coloration. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 281 (1787), 20140787 (2014).
- Girard, M. B., Elias, D. O., Kasumovic, M. M. The role of red coloration and song in peacock spider courtship: insights into complex signaling systems. Behavioral Ecology. 29 (6), 1234-1244 (2018).
- Lim, M. L. M., Land, M. F., Li, D. Sex-specific UV and fluorescence signals in jumping spiders. Science. 315 (5811), 481 (2007).
- Xu, M., Fincke, O. M. Ultraviolet wing signal affects territorial contest outcome in a sexually dimorphic damselfly. Animal Behaviour. 101, 67-74 (2015).
- Hill, G. E., McGraw, K. J. Bird coloration: function and evolution. 2, Harvard University Press. 137-200 (2006).
- Chaine, A. S., Roth, A. M., Shizuka, D., Lyon, B. E. Experimental confirmation that avian plumage traits function as multiple status signals in winter contests. Animal Behaviour. 86 (2), 409-415 (2013).
- Hasegawa, M., Arai, E. Experimentally reduced male ornamentation increased paternal care in the Barn Swallow. Journal of Ornithology. 156 (3), 795-804 (2015).
- Lawes, M. J., Pryke, S. R., Andersson, S., Piper, S. E. Carotenoid status signaling in captive and wild red-collared widowbirds: independent effects of badge size and color. Behavioral Ecology. 13 (5), 622-631 (2002).
- Quesada, J., et al. Plumage coloration of the blue grosbeak has no dual function - A test of the armament-ornament model of sexual selection. The Condor. 115 (4), 902-909 (2013).
- Safran, R. J., et al. The maintenance of phenotypic divergence through sexual selection: An experimental study in barn swallows Hirundo rustica. Evolution. 70 (9), 2074-2084 (2016).
- Tringali, A., Bowman, R. Plumage reflectance signals dominance in Florida scrub-jay, Aphelocoma coerulescens, juveniles. Animal Behaviour. 84 (6), 1517-1522 (2012).
- Jerónimo, S., et al. Plumage color manipulation has no effect on social dominance or fitness in zebra finches. Behavioral Ecology. 29 (2), 459-467 (2018).
- Hill, G. E. Plumage coloration is a sexually selected indicator of male quality. Nature. 350 (6316), 337-339 (1991).
- Wolfenbarger, L. L. Female mate choice in northern cardinals: is there a preference for redder males? The Wilson Bulletin. 111 (1), 76-83 (1999).
- ten Cate, C., Verzijden, M. N., Etman, E. Sexual imprinting can induce sexual preferences for exaggerated parental traits. Current Biology. 16 (11), 1128-1132 (2006).
- Davis, A. K., Cope, N., Smith, A., Solensky, M. J. Wing color predicts future mating success in male monarch butterflies. Annals of the Entomological Society of America. 100 (2), 339-344 (2007).
- Exnerová, A., et al. Avoidance of aposematic prey in European tits (Paridae): learned or innate? Behavioral Ecology. 18 (1), 148-156 (2006).
- Forsman, A., Appelqvist, S. Visual predators impose correlational selection on prey color pattern and behavior. Behavioral Ecology. 9 (4), 409-413 (1998).
- Hebets, E. A. Subadult experience influences adult mate choice in an arthropod: exposed female wolf spiders prefer males of a familiar phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (23), 13390 (2003).
- Hebets, E. A., Cuasay, K., Rivlin, P. K. The role of visual ornamentation in female choice of a multimodal male courtship display. Ethology. 112 (11), 1062-1070 (2006).
- Kingsolver, J. G. Experimental manipulation of wing pigment pattern and survival in western white butterflies. The American Naturalist. 147 (2), 296-306 (1996).
- Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: Female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. The American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
- Prudic, K. L., Skemp, A. K., Papaj, D. R. Aposematic coloration, luminance contrast, and the benefits of conspicuousness. Behavioral Ecology. 18 (1), 41-46 (2006).
- Rutledge, J. M., Miller, A., Uetz, G. W. Exposure to multiple sensory cues as a juvenile affects adult female mate preferences in wolf spiders. Animal Behaviour. 80 (3), 419-426 (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Natural variation in condition-dependent display colour does not predict male courtship success in a jumping spider. Animal Behaviour. 93, 267-278 (2014).
- Taylor, L. A., McGraw, K. J. Male ornamental coloration improves courtship success in a jumping spider, but only in the sun. Behavioral Ecology. 24 (4), 955-967 (2013).
- Foelix, R. Biology of spiders. Third edn. , Oxford University Press. (2010).
- Taylor, L. A., Clark, D. L., McGraw, K. J. Condition dependence of male display coloration in a jumping spider (Habronattus pyrrithrix). Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1133-1146 (2011).
- Taylor, L. A., Maier, E. B., Byrne, K. J., Amin, Z., Morehouse, N. I. Colour use by tiny predators: jumping spiders show colour biases during foraging. Animal Behaviour. 90, 149-157 (2014).
- Bates, D., Maechler, M., Bolker, B., Walker, S. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org (2018).
