Summary
الغرض من هذه الطريقة هو توليد القلب حقل محدد خلايا القلب السلف في المختبر من أجل دراسة مواصفات الخلية السلف والخصائص الوظيفية، وتوليد خلايا القلب غرفة محددة لنمذجة أمراض القلب.
Abstract
الخلايا الجذعية متعددة القدرات توفر إمكانات كبيرة لفهم نمو القلب والمرض والطب التجديدي. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد خلايا القلب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات، فإنه من غير الواضح ما إذا كان حقلي القلب - الأول والثاني من مجالي القلب (FHF وSHF) - مستحثة في أنظمة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. لمعالجة هذا، وضعنا بروتوكولا للمواصفات في المختبر وعزل القلب حقل محدد خلايا القلب السلف. استخدمنا خطوط الخلايا الجذعية الجنينية تحمل HCN4-GFP وTbx1-Cre; [روسا-رفب] مراسلات من ال [فهف] وال [سهف], على التّوالي, وحيّة خلية [إيمّونّينغ] من الخلية غشاء بروتين [إكسككر4], [شف] علامة. مع هذا النهج، قمنا بإنشاء خلايا السلف التي تلخص الخصائص الوظيفية والنسخ من نظرائهم في الجسم الحي. يمكن استخدام بروتوكولنا لدراسة المواصفات المبكرة والفصل في مجالي القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بالحجرة لنمذجة أمراض القلب. وبما أن هذا النظام هو في المختبر، فإنه قد لا توفر معلومات تشريحية دقيقة. ومع ذلك، فإن هذا النظام يتغلب على ضعف إمكانية الوصول إلى الأجنة في مرحلة التقطير ويمكن رفعها للشاشات عالية الإنتاجية.
Introduction
وقد أحدث استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) ثورة في مجال تجديد القلب والطب الشخصي مع الخلايا النخاعية الخاصة بالمريض لنمذجة الأمراض والعلاجات الدوائية1،2،3، 4.في الآونة الأخيرة, في المختبر وقد وضعت بروتوكولات لتوليد الأذيني مقابل البطين وكذلك منظم ضربات القلب مثل PSC-مشتقات خلايا القلب 5,6. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن إعادة تكوين القلب في المختبر لدراسة نمو القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بغرفة البطين لا يزال غير واضح.
خلال النمو الجنيني المبكر، الخلايا الجلدية تحت تأثير مورفيوجينات مفرزة مثل BMP4، Wnts وActivin A شكل سلسلة البدائية7. خلايا القلب الأدمة التي تميزت بالتعبير عن Mesp1، تهاجر بشكل أمامي وأخير لتشكيل الهلال القلبي ثم أنبوب القلب البدائية7،8. هذه المجموعة المهاجرة من الخلايا تشمل اثنين من السكان متميزة جدا من خلايا السلف القلبية (CPCs)، وهما حقل القلب الأول والثاني (FHF وSHF)9،10. الخلايا من SHF هي تكاثرية للغاية والهجرة وهي مسؤولة في المقام الأول عن اطالة وحلقة من أنبوب القلب. بالإضافة إلى ذلك، خلايا SHF تفرق لخلايا القلب والخلايا الليفية والعضلات الملساء والخلايا البطانية عند دخولها إلى أنبوب القلب لتشكيل البطين الأيمن، والقناة الهوائية اليمنى والجزء الأكبر من كلا الأذين7،10. وعلى النقيض من ذلك، خلايا FHF هي أقل تكاثرية والهجرة وتفرق أساسا لخلايا القلب كما أنها تؤدي إلى البطين الأيسر وجزء أصغر من الأذين11. وعلاوة على ذلك، تتميز السلف SHF من خلال التعبير عن Tbx1، FGF8، FGF10 و Six2 في حين أن الخلايا FHF التعبير عن HCN4 و Tbx511،12،13،14،15.
يمكن لـ PSCs التفريق بين الطبقات الجرثومية الثلاث وبالتالي إلى أي نوع من الخلايا في الجسم4و16 . ولذلك، فإنها توفر إمكانات هائلة لفهم نمو القلب ونمذجة عيوب نمو محددة تؤدي إلى أمراض القلب الخلقية، والسبب الأكثر شيوعا للعيوب الخلقية17. مجموعة كبيرة من أمراض القلب الخلقية تشمل تشوهات القلب الخاصة بغرفة18,19. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه تنبع من تطور حقل القلب الشاذة. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لعدم قدرة خلايا القلب في الانتشار بعد الولادة، كانت هناك جهود واسعة النطاق لخلق أنسجة القلب لتجديد القلب1،7،20. وبالنظر إلى الاختلافات الفسيولوجية والمورفولوجية بين غرف القلب، فإن توليد أنسجة القلب الخاصة بالحجرات باستخدام مراكز الأمن العام أمر ذو أهمية كبيرة. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد قوي من خلايا القلب من مراكز الأمن العام، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان يمكن أن يسبب هاتي في مجالي القلب في أنظمة PSC.
لتلخيص توليد القلب في المختبر ودراسة مواصفات وخصائص CPCs، استخدمنا سابقا نظام يستند إلى تمييز SPHeroids القلب المشتقة PSC21،22،23،24. في الآونة الأخيرة، قمنا بإنشاء الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) مع GFP ومراسلي RFP تحت سيطرة الجين HCN4 FHF وجين SHF Tbx1، على التوالي (mESCsTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP) 25. في المختبر mESCs متباينة شكلت كرويات القلب التي GFP + وخلايا RFP + ظهرت من منطقتين متميزتين من الخلايا الأدمية ومنقوشة بطريقة تكميلية. وأظهرت الخلايا الناتجة عن ذلك GFP+ وRFP+ خصائص FHF وSHF، على التوالي، التي تحددها التحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي والتحليلات الكلونية. الأهم من ذلك، باستخدام mESCs تحمل مراسل Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP)،اكتشفنا أن خلايا SHF تميزت بإخلاص من قبل بروتين سطح الخلية CXCR4، وهذا يمكن أن تمكن عزل خلايا القلب الميدانية الخاصة دون transgenes. وسيصف هذا البروتوكول توليد وعزل مراكز القلب الأساسية الخاصة بحقول القلب عن الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم، مما قد يكون بمثابة أداة قيمة لدراسة أمراض القلب الخاصة بالحجرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: في المختبر جيل من خلايا القلب القلب القلب حقل محدد (الشكل 1).
1- صيانة المعدات الاستراتيجية للفأرة
- النمو في الشركات الصغيرة والمتوسطة (mESCsTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP، mESCIsl1-RFP)25 على 0.1٪ (ث / الخامس) الجيلاتين المغلفة T25 قوارير في 2I المتوسطة (870 مل من الحد الأدنى من الغلاسكاو المتوسطة الأساسية (GMEM)، 100 مل من مصل الأبقار الجنين (FBS)، 10 مل من الجلوتاماكس، 10 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 10 مل من الصوديوم بيروفات، 3 ميكرولتر من بيتا-ميركابتوثانول، 20 ميكرولتر من ليف (200 U/mL)، 0.3 ميكرومتر CHIR99021 و 0.1 μM PD0325901).
- عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70-80٪، شطف الخلايا مرة واحدة مع حل الفوسفات العازلة (PBS) ثم ينقسم إلى خلايا واحدة عن طريق إضافة 1 مل من التريبسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- تحييد التربسين عن طريق إضافة 4 مل من FBS 10٪ في تعديل النسر المتوسط دولبيكو (DMEM). عد الخلايا باستخدام عداد خلية مؤتمتة.
- جهاز طرد مركزي ~ 3 x 105 خلايا لمدة 3 دقائق في 270 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
- ازه النوافي، وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من 2I المتوسطة وإعادة صفي على 0.1٪ (ث / الخامس) الجيلاتين المغلفة T25 قوارير للصيانة.
2. جيل من خلايا القلب الاستباقية باستخدام كرويات القلب
- جهاز الطرد المركزي 2.5 x 106 خلايا من الخطوة 1.3 لمدة 3 دقائق في 270 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
- ازه النوافيون وإعادة تعليق الخلايا في 25 مل من المتوسط SFD (105 خلايا / مل). اعتمادا على حجم التجربة، يمكن تعديل عدد mESC وفقا لذلك.
ملاحظة: يحتوي المتوسط SFD 715 مل من المتوسط دولبكو تعديل Iscove (IMDM)، 250 مل من F12 لحم الخنزير، 5 مل من N2-الملحق، 10 مل من B27 ناقص فيتامين A، 5 مل من 10٪ (ث / في) BSA (في PBS)، 7.5 مل من الجلوتاماكس و 7.5 مل من البنسلين-ستربتوميوسين. إضافة حمض الاسكوربيك (50 ملغ / مل) و 3.9 X 10-3٪ (v/ v) من مونوثيوجليسيرول قبل استخدام. - لوحة تعليق الخلية في واحد 150 مم × 25 ملم لوحة معقمة واحتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة ل48 ح. يجب أن تتشكل كرويات القلب في غضون 24 ساعة.
- جمع جميع كرويات القلب شكلت والطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 145 x ز ودرجة حرارة الغرفة لعزل بشكل انتقائي الكرويدات وتجنب الخلايا المفردة.
- استنشق الـ supernatant ويعاد تعليق الكرويات في 25 مل من المتوسط SFD مع 1 نانوغرام / مل من أكتيفين A و 1.5 نانوغرام / مل من BMP4 للحث التفريق. لوحة الكروية في نفس 150 مم × 25mm لوحة معقمة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة لمدة 40 ساعة.
ملاحظة: يمكن استخدام تركيزات مختلفة من أكتيفين A (0-3 نانوغرام/مل) وBMP4 (0.5-2 نانوغرام/مل) لتحسين التمايز اعتماداً على خط mESC. - جمع جميع كرويات القلب والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 145 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
- ازه ال [سوبرنتنت] و [رلّوب] ال [كرويرويدس] في 25 [مل] من [سفد] متوسّطة. نقل EBs إعادة تعليق في مرفق منخفض جدا 75 سم2 قارورة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة لمدة 48 ساعة.
3. عزل القلب حقل خلايا محددة القلب Progenitor باستخدام مراسلين الفلورسنت
- جهاز طرد مركزي كروي القلب في 145 x ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 min وينشق supernatant. أضف 1 مل من التربسين واحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- إضافة 4 مل من FBS 10٪ في DMEM إلى تعطيل التربسين وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب. لإزالة الخلايا غير المنفصلة، قم بتصفية المزيج باستخدام مصفاة 70 مم والطرد المركزي للخلايا الفلسمدة لمدة 3 دقائق عند 270 x غ ودرجة حرارة الغرفة.
- (ج) فرز الـ CPCs التي تحمل مراسلين فلوريين (CPCs المستمدة من الشركات الصغيرة والمتوسطةTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP)،يستنشق supernatant وإضافة 500 μL من حل فرز FACS (1٪ (v/v) FBS، 200 m HEPES و 10 m M من EDTA في PBS) لإعادة تعليق.
- لإزالة جميع مجموعات الخلايا قبل الفرز، قم بتصفية الخلايا مرة أخرى باستخدام أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة 5 مل مع مصفاة خلايا 40 ميكرومتر. إبقاء الخلايا على الجليد حتى الفرز.
- فرز الخلايا لعزل Tbx1-Cre; روزا-RFP وHCN4-GFP CPCs إيجابية باستخدام فارز خلية المنشط الفلورسنت (FACS). جمع الخلايا فرزها في 1 مل من FBS. احتفظ بالعينة الخلوية والخلايا المفرزة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. عزل القلب حقل محدد خلايا القلب Progenitor باستخدام Cxcr4 كعلامة بروتين سطح الخلية
- لعزل أول مقابل الثانية القلب حقل CPCs على أساس التعبير عن مستقبلات البروتين السطحي Cxcr4، استخدم خط mESCIsl1-RFP. انشر الـ supernatant من الخطوة 3.3 واعيد تعليق الـ CPCs المفردة في 300 ميكرولتر من 10% من الـ FBS في PBS التي تحتوي على 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 مترافق مع الأجسام المضادة Cxcr4.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min ويغسل عن طريق إضافة 1-2 مل من PBS الباردة. جهاز طرد مركزي لـ CPCs واحد لمدة 3 دقائق في 270 x ز ودرجة حرارة الغرفة وغسل مرتين أخرى تليها الطرد المركزي.
- ازه الـ supernatant وأضف 500 ميكرولتر من حل فرز FACS لإعادة تعليق CPCs واحد وتصفية كما هو الحال في الخطوة 3.4.
- عزل Cxcr4 + و Cxcr4-الخلايا باستخدام FACS. جمع الخلايا فرزها في 1 مل من FBS. احتفظ بالعينة الخلوية والخلايا المفرزة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
5. تحليل الخلايا القلبية محددة القلب حقل محدد
- جهاز الطرد المركزي فرز تمركز اتوى لمدة 3 دقائق في 270 × ز ودرجة حرارة الغرفة. يمكن استخدام الخلايا المنسّقّة لتحليلات تعبير الجينات والبروتين أو يمكن إعادة زرعها لإجراء التحليلات في وقت لاحق.
- لإعادة زرع CPCs معزولة، يستنشق supernatant، إعادة تعليق الخلايا في المتوسط SFD وإعادة صفيحة ~ 3 X 104 خلايا في البئر من لوحة 384-البئر المغلفة مع 0.1% (ث / الخامس) الجيلاتين. إذا لوحظت زيادة موت الخلية بعد الفرز، أضف 10 ميكروم من Y-27632 (مثبط اتّج) إلى العينة. وبعد يومين من إعادة الزراعة، ينبغي ملاحظة الضرب التلقائي.
- لتحليل قدرة CPCs مطلي للتمييز لخلايا القلب، وجمع الخلايا في اليوم 12 من التمايز. استخدام التربسين كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.5 لعزل CMs واحد.
- طرد مركزي الخلايا لمدة 3 دقائق في 895 x ز، ودرجة حرارة الغرفة. ازهر الـ supernatant وإعادة تعليق الخلايا في PBS لغسل PFA. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- ازهر النوافيون وإعادة تعليق الخلايا في 10٪ FBS في PBS. احتضان نصف عينة الخلية مع الأجسام المضادة للماوس تي مكافحة Troponin (1:500) واستخدام بقية العينة كتحكم سلبي. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مرتين كما هو موضح في الخطوة 5.4 باستخدام PBS. استنشق supernatant وإعادة تعليق كل من عينات الخلية في FBS 10٪ في PBS مع 1:500 حمار المضادة للماوس IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية، اليكسا فلور 647 متقارن. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل مرتين مع PBS كما في الخطوة 5.6. ازهر النوافيون ويعاد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS. استخدام السيتومتر تدفق لتحليل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وبعد ما يقرب من 132 ساعة من التمايز، يمكن الكشف عن Tbx1-RFP وHcn4-GFP CPCs باستخدام المجهر الفلورسنت (الشكل2). بشكل عام، GFP وRFP تظهر الخلايا تقريبا في نفس الوقت. ولا يزال السكان في مراكز اللاجئين يتوسعون على مقربة من بعضهم البعض ونمطا تكميليا. إن ضبط تركيزات أكتيفين أ وBMP4 سيغير النسب المئوية لـFHF مقابل مراكز المعالجة بالموجات فوق الـ SHF (الشكل 3). تم تحديد مواصفات التصنيف المركزي للمنتجات في المختبر في المقام الأول من خلال تركيز BMP4. ولذلك، يمكن استخدام نظام كروي القلب لدينا لدراسة مواصفات الحزب الشيوعى الصينى.
وبالمثل باستخدام خط mESC مراسل Isl1-RFP، بعد 132 ساعة من التمايز، تظهر الـ ISL1-RFP+ CPCs. بعد الصبغ المناعي من CPCs لCXCR4، Isl1-RFP +، Cxcr4 + مقابل Isl1-RFP +، يمكن عزل خلايا Cxcr4(الشكل4).
لتحليل قدرة CPCs المشتقة من mESC للتمييز لخلايا القلب، يمكن إجراء الاحتجين المناعي للقلب تروبونين T في اليوم 12 من التمايز. وبالاتفاق مع النموذج الذي تميز هف الخلايا أساسا لmyocytes، والخلايا المشتقة من HCN4-GFP + CPCs هي أساسا myogenic (الشكل5A,B). وبالمثل، فإن الخلايا المشتقة من Isl1+، CXCR4- CPCs تؤدي أيضا إلى خلايا عضلة القلب في نسب أعلى بكثير بالمقارنة مع Isl1 +، CXCR4- CPCs (الشكل5C).
وفي بعض الأحيان، تفشل الشركات الصغيرة والمتوسطة في التمييز بكفاءة وتشكلأعداداً منخفضة جداً من مراكز القلب الخاصة بحقول القلب (الشكل 6).
الشكل 1 التمثيل التخطيطي للمواصفات المختبرية لخلايا القلب الاستباقية الخاصة بحقل القلب. mESCs شكل كروية داخل 48 ح. ثم التعرض لActivin A و BMP4 لمدة 40 ساعة سيؤدي إلى الحث على الأدمة. خلايا سلف القلب تطوير ما يقرب من 36 ح في وقت لاحق. يمكن فرز الحقول الاستباقية لحقل القلب الثاني أو الأول باستخدام فرز الخلايا المنشطة. يتم وضع علامة خلايا حقل القلب الثاني بواسطة التعبير Tbx1-RFP مقابل حقل القلب الأول التي يتم وضع علامة بواسطة Hcn4-GFP. بدلا من ذلك، Isl1-RFP علامات CPCs واستخدام المناعية الحية ضد Cxcr4 يمكن للمرء فرز Isl1 +، Cxcr4 + مقابل Isl1 +، Cxcr4- CPCs التي تمثل الثانية مقابل خلايا حقل القلب الأول على التوالي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 صورة تمثيلية لكرويات القلب بعد مواصفات الحزب الشيوعى الصينى. علامات RFP Tbx1+ وGFP علامات Hcn4 + CPCs. تتشكل الخلايا السكانية اثنين في مكان قريب في نمط مجاني. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 التحليل السيتومتري للكرويات القلبية بعد التعرض لتركيزات مختلفة من أكتيفين أ و BMP4. ضبط تركيزات المورفيوجينات اثنين يؤدي إلى نسب مختلفة من Tbx1 + و Hcn4 + CPCs. وقد تأثر السكان أساساً بتعديل تركيز BMP4. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 التحليل السيتومتري للخلايا السلف القلبية التي تعبر عن Isl1 وهي مناعية لCxcr4. تم أولاً بوابات السلف القلبية على أساس تعبيرهم Isl1 ومن ثم Isl1+، Cxcr4 + مقابل Isl1+، تم فرز خلايا Cxcr4. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تحليل الخلايا الخلايا الانسيابية للخلايا المشتقة من مراكز القلب الخاصة بالقلب الملطخة بالقلب تروبونين تي. (أ) بما يتفق مع ارتفاع إمكانات myogenic من خلايا FHF، نسبة عالية من خلايا HCN4-GFP + التفريق مع myocytes. (ب) تحليل جميع خلايا القلب المشتقة من الـ mESC، حيث تكون الغالبية العظمى من خلايا القلب Hcn4-GFP+. (C) Cxcr4- CPCs تفرق إلى نسبة أعلى من خلايا القلب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 التحليلات المنهجية المنهجية للتباينات اللامنهجية في المختبر. (أ) تحليل الخلايا الانسيابية بعد 132 ساعة من التمايز لا تظهر أي تشكيل من خلايا HCN4-GFP ونسبة منخفضة جدا من Tbx1-RFP + الخلايا. (ب) انخفاض كفاءة التمايز بين الشركات الصغيرة والمتوسطة التي تعبر عن مستويات منخفضة جداً من المستويات الضئيلة من الـ Isl1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في بروتوكولنا، فإننا نوصف منهجية لتوليد كرويات القلب والقلب معزول حقل مراكز المعالجة بالقلب. ويمكن استخدام هذه الآليات لدراسة آليات مواصفات CPC وخصائصها، وكذلك لنمذجة الأمراض الخاصة بغرفة القلب. واحدة سابقا نشر عمل استعمل [مسك] خطّ مع اثنان [فلسنت] مراسلات ([مف2ك/نكإكس2.5]) أن يدرس [كرديوجنسس] في مختبر, مهما, عبّر عن كلا أنّ علامات في يوم جنينيّة 9.5-10 عندما [كرديوووسكتس] يكون سابقا شكّلت26. على حد علمنا، لا توجد حاليا أي طرق لعزل القلب في مجال محدد من مراكز المعالجة القلبية الاستراتيجية في المختبر. والأهم من ذلك، يمكن تطبيق بروتوكولنا على الخلايا الجذعية البشرية، حيث يمكن استخدام CXCR4 لعزل CPCs SHF التي تعبر عن مستويات عالية من Isl125. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا مزدوجة، خط مراسل الفلورسنت mESC يمكن استخدامها لفحص المكتبات من المركبات وعوامل النسخ التي يمكن أن تؤثر على مواصفات حقل القلب أو قطبية الخلية في CPCs.
ومن الخطوات الحاسمة في البروتوكول عدد بدء الشركات الصغيرة والمتوسطة. استخدام أعداد منخفضة أو عالية سوف تؤثر بشكل كبير على حجم كرويات القلب وكفاءة التمايز. نوصي باختبار أرقام خلايا مختلفة (7.5-10 x 104 خلايا/مل) لخطوط mESC مختلفة. بدلا من ذلك، إذا كان حجم كرويالقلب لا يزال متغيرا بشكل كبير، لوحات مع الآبار التي تحتوي على ميكروويل من حجم محدد يمكن أيضا أن تستخدم لزيادة استنساخ. وينبغي للمحققين أيضا أن تضع في اعتبارها توقيت محدد ومدة الحث الأدمة الاوmesodermal، فضلا عن توقيت فرز الخلايا. وعلاوة على ذلك، بالنسبة لخطوط mESC المختلفة، سوف تحتاج إلى تحسين تركيزات مورتوجين يتم تنفيذها قبل اختبار قدرتها على توليد CPCs في كرويات القلب. استخدام السيتوكينات القديمة / منتهية الصلاحية أو وسط ثقافة الخلية، أو تركيزات غير متناسقة من مورتوجينس سيؤثر على كفاءة التمايز. وأخيرا، خطوط mESC التي تم تمريرها لأكثر من 15-20 مرة، لا يبدو أن تفقد قدرتها على التمييز بكفاءة.
نظام التمايز لدينا يسمح بتعديلات محددة. يمكن استخدام Cxcr4 كعلامة وحيدة لـ SHF CPCs في خطوط mESC بدون مراسل فلوري. ومع ذلك، يجب على المحققين لا يزال تحسين بروتوكول التمايز لزيادة النسبة المئوية لـ Isl1+ CPCs قبل فرز Cxcr4+ مقابل Cxcr4- CPCs25. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استبدال Activin A بناهتات/منشطة Wnt الكنسية مثل Wnt3a أو CHIR99021 (مثبط GSK3b) لزيادة مواصفات CpCs 25.
يتيح هذا البروتوكول دراسة مواصفات التصنيف المركزي للمنتجات باستخدام شروط محددة جيداً، ورصد الفاصل الزمني، والأعداد غير المقيدة من الخلايا. وبالتالي، فإنه أكثر سهولة وكفاءة وأقل تكلفة بالمقارنة مع تحليل الأجنة. ومع ذلك، فإنه لا يزال نظام في المختبر حيث قيم التعبير الجيني المطلق من القلب حقل محدد CPCs قد لا ترتبط ارتباطا وثيقا مع مستويات التعبير الجيني في الجسم الحي. وهكذا، في نظامنا، يمكن فقط BMP4 تحديد CPCs من كلا مجالي القلب ويمكن أن يغير بشكل كبير نسب كل منها. بالإضافة إلى ذلك، قد توجد تباين فيما يتعلق بكفاءة التمايز.
في الختام، باستخدام خطوط مراسل الفلورسنت mESC أو الصبغ المناعي للبروتينات غشاء الخلية، ونحن خلاصة توليد القلب في المختبر ومعزولة القلب حقل مراكز المعالجة ببراءات وعوامل القلب. وهذا يسمح بدراسة الإشارات المبكرة التي تتوسط مواصفات CPC والخصائص الوظيفية، فضلا عن نمذجة القلب حقل / غرفة محددة أمراض القلب الخلقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يملك أصحاب البلاغ أي شيء للكشف عن المعلومات.
Acknowledgments
E. T. كان مدعوما من قبل السحر الذي يهم وAHA. C. K. كان مدعوما من قبل المنح من NICHD/NIH (R01HD086026)، AHA، وMSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
