Summary
该方法的目的是在体外生成心脏场特异性心脏祖细胞,以研究祖细胞的规范和功能特性,并生成用于心脏病建模的腔内特定心脏细胞。
Abstract
多能干细胞为理解心脏发育和疾病以及再生医学提供了巨大的潜力。虽然发展性心脏病学的最新进展导致从多能干细胞中产生心脏细胞,但不清楚这两个心脏领域——第一和第二心脏场(FHF和SHF)——是否诱导多能干细胞系统。为了解决这个问题,我们生成了一个方案,用于体外规范和分离心脏领域特定的心脏祖细胞。我们使用携带Hcn4-GFP和Tbx1-Cre的胚胎干细胞系;罗莎-RFP记者分别从FHF和SHF,和活细胞免疫染色的细胞膜蛋白Cxcr4,一个SHF标记。通过这种方法,我们生成了祖细胞,重述了它们体内对应物的功能特性和转录组。我们的协议可用于研究两个心脏场的早期规范和分离,并生成用于心脏病建模的腔室特定心脏细胞。由于这是一个体外器官系统,它可能无法提供精确的解剖信息。然而,该系统克服了胃化阶段胚胎的不良可及性,可以针对高通量屏幕进行升级。
Introduction
多能干细胞(PSCs)的使用彻底改变了心脏再生领域和个性化医学领域,患者特异性肌细胞用于疾病建模和药物治疗1、2、3、4.最近,用于生成心房与心室以及心脏起搏器样 PSC 衍生心肌细胞的体外方案已经开发出来5、6。然而,心脏生成是否可以在体外重建,以研究心脏发育,并随后产生心室特异性心脏细胞仍不清楚。
在早期胚胎发育过程中,在BMP4、Wnts和ActivinA等分泌形态素的影响下,中皮细胞形成原始条纹7。以Mesp1的表达为标志的心脏心皮细胞,在前和后迁移形成心脏新月,然后原始心脏管7,8。这个迁移组细胞包括两个非常不同的心脏祖细胞(CPCs)群体,即第一和第二心脏场(FHF和SHF)9,10。来自SHF的细胞具有高度增殖性和迁移性,主要负责心脏管的伸长和循环。此外,SHF细胞分化到心肌细胞,成纤维细胞,平滑肌肉和内皮细胞,因为他们进入心脏管形成右心室,右心室流出道和大部分两个atria7,10。相反,FHF细胞的增殖性和迁移性较少,主要分化为心肌细胞,因为它们产生左心室和11室的较小部分。此外,SHF祖细胞的表达有Tbx1、FGF8、FGF10和Six2的表达,而FHF细胞表示Hcn4和Tbx511、12、13、14、15。
PSC可以分化到所有三个生殖层,然后分化到体内的任何细胞类型4,16。因此,它们为理解心脏发育和模拟导致先天性心脏病的特定发育缺陷提供了巨大的潜力,而先天性心脏病是导致先天缺陷的最常见原因17。先天性心脏病的一大亚群包括室特异性心脏异常18、19。然而,目前还不清楚这些是否源于异常的心场发展。此外,鉴于心肌细胞在出生后无法增殖,人们已为心脏再生1、7、20创建心脏组织进行了广泛的努力。考虑到心脏室之间的生理和形态差异,使用PSC生成腔部特定心脏组织非常重要。虽然发展性心脏病学的最新进展导致PSC产生强大的心脏细胞,但尚不清楚这两个心脏场是否可以诱导在PSC系统中。
为了在体外重述心脏发生,并研究CPC的规格和性质,我们以前使用一种基于PSC衍生心脏球体的系统21、22、23、24。最近,我们分别在FHF基因Hcn4和SHF基因Tbx1(mESCs Tbx1-Cre)的控制下,用GFP和RFP报告机生成了小鼠胚胎干细胞(mESCsTbx1-Cre;罗莎-RFP;HCN4-GFP) 25.体外分化的meESCs形成心脏球体,其中GFP+和RFP+细胞从两个不同的间皮细胞区域出现,以互补的方式模式化。由此产生的GFP+和RFP+细胞分别表现出FHF和SHF特性,由RNA测序和克隆分析确定。重要的是,使用携带Isl1-RFP报告器(mESCIsl1-RFP)的mESCs,我们发现SHF细胞忠实地被细胞表面蛋白CXCR4标记,这可以实现无转基因心脏场特异性细胞的分离。本议定书将描述心脏领域特定PC的产生和分离,从mESCs,这可能是研究腔部特定心脏病的宝贵工具。
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Protocol
注:在体外生成心脏场特异性小鼠心脏祖细胞(图1)。
1. 鼠标 ESC 的维护
- 生长 mESC (mESCTbx1-Cre;罗莎-RFP;HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25上 0.1% (w/v) 明胶涂层 T25 烧瓶在 2i 培养基 (870 mL 的格拉斯考最低必需介质 (GMEM), 100 mL 的胎儿牛血清 (FBS), 10 mL 的 GlutaMAX, 10 mL 的非必需氨基酸, 10 mL 钠丙酸酯,3 μL β-甲苯醇,20 μL 的 Lif (200 U/mL),0.3 μM CHIR99021 和 0.1 μM PD0325901。
- 当细胞达到70-80%汇合时,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞一次,然后加入1mL的胰蛋白酶,在37°C下孵育3分钟,分离到单个细胞中。
- 通过在Dulbecco的改性鹰介质(DMEM)中加入4 mL的10%FBS来中和胰蛋白酶。使用自动细胞计数器对单元格进行计数。
- 离心机 +3 x 105细胞,在 270 x g和室温下 3 分钟。
- 吸气上清液,将细胞重新悬浮在5 mL的2i介质中,再用0.1%(w/v)明胶涂层T25烧瓶重新板,以便进行维护。
2. 使用心脏球体生成心脏祖细胞
- 离心 2.5 x 106细胞从步骤 1.3 在 270 x g和室温下 3 分钟。
- 吸出上清液,在25 mL的SFD培养基(105细胞/mL)中重新悬浮细胞。根据实验的规模,可以相应地调整 mESC 编号。
注:SFD介质含有715 mL的Iscove的改性Dulbeco的介质(IMDM),250 mL的火腿的F12,5mL的N2补充,10mL的B27减去维生素A,5 mL的10%的BSA(在PBS中),7.5 mL的谷胱甘肽和7.5 mL的青霉素-链霉素。在使用前加入单糖甘油的抗坏血酸(50毫克/升)和3.9 x 10-3%(v/v)。 - 将细胞悬浮液板板入一个150毫米x25毫米无菌板,在5%CO2培养箱中37°C孵育48小时。
- 在145 x g和室温下收集所有形成的心脏球体和离心机3分钟,选择性地分离球形并避免单个细胞。
- 在 SFD 介质的 25 mL 中吸出上液并重新悬浮球体,使用 1 纳克/mL 的 Activin A 和 1.5 纳克/mL 的 BMP4 进行分化感应。将球体板在同一 150 mm x 25mm 无菌板中,在 5% CO2培养箱中以 37°C 孵育 40 小时。
注:Activin A (0-3 纳克/mL) 和 BMP4 (0.5-2 纳克/mL) 的不同浓度可用于分化优化,具体取决于 mESC 线路。 - 在145 x g和室温下收集所有心脏球体和离心机3分钟。
- 吸气上清液,在SFD介质的25 mL中重新悬浮球体。在超低附件75 cm2烧瓶中转移重新悬浮的HB,并在5%CO2培养箱中37°C孵育48小时。
3. 使用荧光报告器分离心脏场特定心脏祖细胞
- 在145 x g和室温下,离心球形3分钟,吸出上清液。加入1mL的胰蛋白酶,在37°C孵育3分钟。通过移液分离细胞,混合良好。
- 在 DMEM 中加入 4 mL 的 10% FBS,以灭活胰蛋白酶,并通过移液很好地混合。要去除未分离的 HB,请使用 70 mm 滤网过滤混合物,并在 270 x g和室温下将过滤细胞离心 3 分钟。
- 对携带荧光报告器的CPC进行分类(来自mESCsTbx1-Cre的CPC;罗莎-RFP;HCN4-GFP),吸出上清液,并加入500 μL的FACS分拣溶液(1%(v/v)FBS,200 mM HEPES和10 mM的EDTA在PBS中重新悬浮。
- 要在分拣前去除所有细胞簇,请使用带 40 μm 细胞滤网的 5 mL 聚苯乙烯圆底管再次过滤细胞。将细胞放在冰上,直到分类。
- 对细胞进行分类以分离Tbx1-Cre;使用荧光活细胞分拣机(FACS)的罗莎-RFP和HCN4-GFP阳性CP。在 FBS 的 1 mL 中收集排序的单元格。将细胞样本和分类细胞保持在4°C。
4. 使用Cxcr4作为细胞表面蛋白标记分离心脏场特定心脏祖细胞
- 要根据表面蛋白受体Cxcr4的表达分离第一和第二心场CPC,使用mESCIsl1-RFP线。从步骤3.3吸出上液,在含有1:200(vol/vol)PerCP-efluor 710结合抗Cxcr4抗体的PBS中,在300μL的10%FBS中重新悬浮单个CPC。
- 在室温下孵育5分钟,加入1-2 mL的冷PBS洗涤。在270 x g和室温下将单个CP离心3分钟,再洗两次,然后离心。
- 吸出上清液,并添加 500 μL 的 FACS 分拣解决方案,以重新悬浮单个 CPC 并按步骤 3.4 进行过滤。
- 使用 FACS 隔离 Cxcr4+ 和 Cxcr4- 单元。在 FBS 的 1 mL 中收集排序的单元格。将细胞样本和分类细胞保持在4°C。
5. 分离心场特定心脏祖细胞的分析
- 离心机在 270 x g和室温下对 CPC 分类 3 分钟。分类的细胞可用于基因和蛋白质表达分析,也可以在以后的点重新培养以进行分析。
- 要重新培养分离的CPC,吸出上清液,在SFD培养基中重新悬浮细胞,并在384孔板中重新加压+3 x 104个细胞,涂有0.1%(w/v)明胶。 如果分拣后细胞死亡增加,在样品中加入10μM的Y-27632(ROCK抑制剂)。重新养殖两天后,应该注意自发的殴打。
- 分析镀层聚氯器分化心肌细胞的能力,在分化的第12天收集细胞。使用步骤1.2-1.5中所述的胰蛋白酶分离出单个CM.将细胞重新悬浮在4%(w/v)甲醛(PFA)中,并在室温下孵育30分钟以修复细胞。
- 在895 x g和室温下将细胞离心3分钟。吸出上清液,重新悬浮PBS中的细胞以洗涤PFA。再次重复此步骤。
- 吸出上清液,在PBS中重新悬浮10%FBS中的细胞。用小鼠抗肌钙蛋白T抗体(1:500)孵育一半的细胞样本,并使用样品的其余部分作为阴性对照。在室温下孵育30分钟。
- 使用 PBS 将细胞洗涤两次,如步骤 5.4 中所述。在PBS中用1:500驴抗小鼠IgG(H+L)二次抗体,Alexa Fluor 647结合,将上清液中两个细胞样本重新悬浮在10%的FBS中。在室温下孵育30分钟。
- 在步骤 5.6 中,使用 PBS 洗涤两次。吸出上清液,在200μL的PBS中重新悬浮细胞。使用流式细胞计分析细胞。
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Representative Results
经过大约132小时的分化后,可以使用荧光显微镜检测Tbx1-RFP和Hcn4-GFPCP(图2)。通常,GFP 和 RFP 细胞大约同时出现。聚居会的两种人口继续以接近和通常互补的模式扩大。调整Activin A和BMP4的浓度将改变FHF与SHFCPC的百分比(图3)。体外CPC规格主要由BMP4浓度决定。因此,我们的心脏球形系统可用于研究CPC规范。
同样,使用 Isl1-RFP 报告器 mESC 线路,经过 132 小时的分化后,出现 Isl1-RFP+ CPC。在 CXCR4、Isl1-RFP+、Cxcr4+ 与 Isl1-RFP+ 的 PC 免疫染色后,可以分离 Cxcr4- 细胞(图 4)。
为了分析mESC衍生的CPC分化心肌细胞的能力,可以在分化的第12天进行心脏肌蛋白T的免疫染色。与FHF细胞主要分化为肌细胞的模型一致,从Hcn4-GFP+CPCs衍生的细胞主要是肌基(图5A,B)。同样,从Isl1+、CXCR4-CPC衍生的细胞也产生心肌细胞,与Isl1+、CxCR4-CPC(图5C)相比,其百分比要高得多。
有时,mESC 无法有效地区分并形成非常低的数字心场特定的 CPC(图6)。
图 1:心脏场特异性心脏祖细胞体外规范的原理表。mESCs 在 48 小时内形成球形。然后暴露于Activin A和BMP444将导致中皮感应。心脏祖细胞大约在36小时后发育。第二或第一心脏场的祖细胞可以使用荧光活化细胞分拣进行分类。第二心脏场细胞以Tbx1-RFP表达与Hcn4-GFP标记的第一心脏场为标记。或者,Isl1-RFP 标记 CPC 并使用实时免疫染色对 Cxcr4 可以排序 Isl1+, Cxcr4+ vs Isl1+, Cxcr4- CpCs 分别代表第二和第一心脏场细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:CPC 规范后心脏球体的代表性图像。RFP 标记 Tbx1+,GFP 标记 Hcn4+ CPC。两个细胞群以互补模式在近距离形成。刻度条 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:暴露于不同浓度的Activin A和BMP4后,心脏球体的流动细胞学分析。调整两种变形素的浓度会导致 Tbx1+ 和 Hcn4+ CPC 的不同百分比。这两个种群主要受调整BMP4浓度的影响。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:表达Isl1的心脏祖细胞的流式细胞分析,对Cxcr4进行免疫染色。心脏祖细胞首先根据其Isl1表达进行门控,然后Isl1+,Cxcr4+vs Isl1+,Cxcr4-细胞被排序。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:从心脏场特异性CPC衍生的细胞的流式细胞分析,该CPC为心脏肌钙蛋白T染色。(A) 与FHF细胞较高的肌源电位一致,Hcn4-GFP+细胞中高比例的Hcn4-GFP+细胞分化为肌细胞。(B) 分析所有 mESC 衍生的心肌细胞,其中绝大多数是 Hcn4-GFP+。(C) Cxcr4- CPC 分化为较高的心肌细胞百分比。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:对体外分化失败/低效率的代表性细胞学分析。(A) 经过132小时分化后的流式细胞学分析,显示Hcn4-GFP细胞没有形成,Tbx1-RFP+细胞的百分比非常低。(B) 表达Isl1极低水平的mESC的微分效率低。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在我们的协议中,我们描述了一种生成心脏球体和隔离心脏场特定Pc的方法。这些可用于研究CPC规范的机制及其特性,以及心脏室特定疾病建模。以前发表的一项工作使用mESC线与两个荧光报告器(Mef2c/Nkx2.5)在体外研究心形生成,然而,这两个标记在胚胎日9.5-10时,心肌细胞已经形成26。据我们所知,目前没有在体外分离心脏领域特定CP的方法。更重要的是,我们的协议也可以应用于人类干细胞,CXCR4可用于分离表达高浓度Isl125的SHF CPC。此外,我们的双荧光报告器 mESC 系列可用于筛选可能影响 PC 中心场规格或细胞极性的化合物和转录因子的库。
协议中的关键步骤之一是 mESC 的起始数量。使用低或高数字将显著影响心脏球体的大小和分化效率。我们建议测试不同的 mESC 线的不同细胞数 (7.5-10 x 104细胞/mL)。或者,如果心脏球体的大小仍然显著变化,则含有指定尺寸微孔的孔板也可用于增加可重复性。调查人员还应注意中皮诱导的具体时间和持续时间以及细胞分拣的时间。此外,对于不同的mESC线,在测试其在心脏球体中生成CPC的能力之前,需要对形态素浓度进行优化。使用较旧/过期的细胞因子或细胞培养基,或形态原浓度不一致将影响分化效率。最后,经过超过15-20次的mESC线路似乎失去了有效区分的能力。
我们的差异化系统允许特定的修改。Cxcr4 可用作 MESC 线路中 SHF CPC 的唯一标记,无需荧光报告器。但是,在对 Cxcr4+ 与 Cxcr4- CPC25进行排序之前,调查人员仍应优化分化协议,以增加 Isl1+ CPC 的百分比。此外,Activin A 可以替代规范的 Wnt 激动剂/活化剂,如 Wnt3a 或 CHIR99021(GSK3b 抑制剂),以进一步提高 SHF CPCs25的规格。
该协议允许使用定义良好的条件、延时监控和不受限制的单元数来研究 CPC 规范。因此,与分析胚胎相比,它更简单、更高效、成本更低。然而,它仍然是一个体外系统,其中心场特异性CPCs的绝对基因表达值可能与体内基因表达水平没有紧密关联。因此,在我们的系统中,只有 BMP4 可以指定来自两个心脏领域的 CPC,并可以显著更改其各自的比率。此外,在差别化效率方面可能存在可变性。
总之,利用mESC荧光报告线或细胞膜蛋白的免疫染色,我们重述了体外心脏生成和分离心脏场特异性CPC。这允许研究早期信号,以调解CPC规范和功能属性,以及建模心脏场/室特定的先天性心脏病。
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Disclosures
作者没有任何披露。
Acknowledgments
E.T.得到了《重要魔法》和《AHA》的支持。C. K. 得到 NICHD/NIH (R01HD086026)、AHA 和 MSCRF 的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
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