Summary
Formålet med denne metode er at generere hjerte felt-specifikke hjerte progenitorceller in vitro for at studere stamcelle specifikation og funktionelle egenskaber, og at generere kammer specifikke hjerte celler til hjertesygdomme modellering.
Abstract
Pluripotente stamceller giver et stort potentiale for at forstå hjerte udvikling og sygdom og for regenerativ medicin. Mens de seneste fremskridt inden for udviklings kardiologi har ført til generering af hjerte celler fra pluripotente stamceller, er det uklart, om de to hjerte felter-det første og andet hjerte felt (FHF og SHF)-er induceret i pluripotente stamceller systemer. For at løse dette, vi genereret en protokol til in vitro specifikation og isolering af hjerte felt-specifikke hjerte progenitorceller. Vi brugte embryonale stamceller linjer transporterer Hcn4-GFP og Tbx1-CRE; Rosa-RFP reportere af henholdsvis FHF og SHF, og levende celle immunofarvning af cellemembranen protein Cxcr4, en SHF markør. Med denne tilgang genererede vi stamceller, som generovere de funktionelle egenskaber og transkriptomer af deres in vivo-modparter. Vores protokol kan udnyttes til at studere tidlig specifikation og adskillelse af de to hjerte felter og til at generere kammer-specifikke hjerte celler til hjertesygdomme modellering. Da dette er et in vitro organoid system, det kan ikke give præcise anatomiske oplysninger. Men dette system overvinder den ringe tilgængelighed af gastrulation-Stage embryoner og kan opskaleres til høj-gennemløb skærme.
Introduction
Brugen af pluripotente stamceller (PSCs) har revolutioneret området for hjerte regenerering og personlig medicin med patientspecifikke myocytter til sygdoms modellering og lægemiddel terapier1,2,3, 4. for nylig er der udviklet in vitro-protokoller for generering af atrieflimren vs ventrikulær såvel som pacemaker-lignende PSC-afledte kardiomyocytter:5,6. Men, om cardiogenesis kan genoprettes in vitro til at studere hjertets udvikling og efterfølgende generere ventrikulære kammer-specifikke hjerte celler er stadig uklart.
Under tidlig fosterudvikling, mesodermal celler under indflydelse af udskilte morfogener såsom BMP4, Wnts og Activin en form primitive stribe7. Hjertemesodermal celler præget af Mesp1, migrere Anteriort og i det seneste til at danne hjerte Halvmåne og derefter den primitive hjerte tube7,8. Denne migrerende gruppe af celler omfatter to meget forskellige populationer af hjerte progenitorceller (CPCS), nemlig den første og den anden hjerte felt (FHF og SHF)9,10. Celler fra SHF er meget proliferativ og migrerende og er primært ansvarlige for forlængelse og loop af hjerte røret. Desuden, SHF celler differentiere til cardiomyocytes, fibroblaster, glatte muskler og endotel celler, som de kommer ind i hjerte røret til at danne den højre ventrikel, højre ventrikel udstrømning tarmkanalen og stor del af både Atria7,10. I modsætning hertil er FHF-celler mindre proliferativ og migrerende og differentiere hovedsageligt til kardiomyocytter, da de giver anledning til venstre ventrikel og en mindre del af Atria11. Desuden er SHF-progenitorer præget af Tbx1, FGF8, FGF10 og Six2, mens FHF-cellerne udtrykker Hcn4 og Tbx511,12,13,14,15.
Kvikskrankerne kan skelne til alle tre kimlag og efterfølgende til enhver celletype i kroppen4,16. Derfor tilbyder de et enormt potentiale for at forstå hjertets udvikling og for modellering af specifikke udviklingsmæssige defekter, der resulterer i medfødt hjertesygdom, den hyppigste årsag til fødselsdefekter17. En stor under gruppe af medfødte hjertesygdomme omfatter kammer-specifikke kardielle abnormiteter18,19. Men, det stadig uklart, om disse stammer fra unormal hjerte felt udvikling. Desuden, i betragtning af den manglende evne til kardiomyocytes at formere sig efter fødslen, har der været omfattende bestræbelser på at skabe hjerte-væv til hjerte Regeneration1,7,20. I betragtning af de fysiologiske og morfologiske forskelle mellem hjertekamrene er dannelsen af kammer specifikt hjerte vævet ved hjælp af kvikskrankerne af væsentlig betydning. Mens de seneste fremskridt inden for udviklings kardiologi har ført til robust generering af hjerte celler fra kvikskrankerne, er det stadig uklart, om de to hjerte felter kan induceres i PSC-systemer.
For at rekapitulere cardiogenesis in vitro og studere specifikationerne og egenskaberne for CPC'er, brugte vi tidligere et system baseret på differentiering af PSC-afledte hjerte sfæroider21,22,23,24. For nylig genererede vi muse embryonale stamceller (Mesc'er) med GFP og RFP-reportere under kontrol af henholdsvis FHF-genet Hcn4 og SHF-genet Tbx1 (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro-opdelte Mesc'er dannede hjertesfæroider, hvor GFP + og RFP +-celler optrådte fra to forskellige områder af mesodermal celler og mønstret på en komplementær måde. De resulterende GFP +-og RFP +-celler udviste henholdsvis FHF-og SHF-karakteristika, bestemt af RNA-sekvensering og klon analyser. Det er vigtigt, at vi ved hjælp af Mesc'er med Isl1-RFP-reporter (mESCIsl1-RFP) opdagede, at SHF-cellerne var trofast mærket af celleoverflade protein CXCR4, og dette kan muliggøre isolering af hjerte feltspecifikke celler uden transgener. Nærværende protokol vil beskrive dannelsen og isoleringen af hjerte feltspecifikke CPC'er fra Mesc'er, som kan tjene som et værdifuldt værktøj til at studerekammer specifik hjertesygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: In vitro-generering af hjerte feltspecifikke muse hjerte progenitorceller (figur 1).
1. vedligeholdelse af muse-Esc'er
- Dyrke Mesc'er (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mescISL1-RFP)25 på 0,1% (w/v) gelatine belagte T25-kolber i 2i medium (870 ml af glaskoens mindste essentielle medium (gmem), 100 ml føtal bovint serum (FBS), 10 mL glutamax, 10 ml ikke-essentielle aminosyrer, 10 ml natrium pyruvat, 3 μL beta-mercaptoethanol, 20 μL LIF (200 e/mL), 0,3 μM CHIR99021 og 0,1 μM PD0325901).
- Når cellerne når 70-80% sammenløbet, skylles cellerne én gang med fosfatbufferopløsning (PBS), hvorefter de adskilles i enkeltceller ved tilsætning af 1 mL trypsin og inkuperer ved 37 °C i 3 min.
- Neutralisér trypsin ved at tilsætte 4 mL 10% FBS i Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM). Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celle tæller.
- Centrifuge ~ 3 x 105 celler i 3 min ved 270 x g og stuetemperatur.
- Der aspirerer supernatanten, resuspender cellerne i 5 mL 2i-medium og-replate på 0,1% (w/v) gelatine belagte T25-kolber til vedligeholdelse.
2. dannelse af Hjerteprogenitorceller ved brug af Hjertesfæroider
- Centrifuge 2,5 x 106 celler fra trin 1,3 i 3 min ved 270 x g og stuetemperatur.
- Supernatanten aspirerer, og cellerne resuspenderes i 25 mL SFD-medium (105 celler/ml). Afhængigt af eksperimentets omfang kan mESC-nummeret justeres i overensstemmelse hermed.
Bemærk: SFD medium indeholder 715 mL af Iscove modificerede Dulbecco's medium (IMDM), 250 mL skinke F12, 5 mL N2-supplement, 10 mL B27 minus vitamin A, 5 mL 10% (w/v) BSA (i PBS), 7,5 mL GlutaMAX og 7,5 mL penicillin-streptomycin. Tilsæt ascorbinsyre (50 mg/mL) og 3,9 x 10-3% (v/v) monothioglycerol før brug. - Ophæng cellesuspensionen i 1 150 mm x 25 mm steril plade, og inkuberes ved 37 °C i 5% CO2 -inkubatoren til 48 h. hjerte sfæroider skal dannes inden for 24 timer.
- Saml alle de dannede hjerte sfæroider og centrifuger i 3 min ved 145 x g og rumtemperatur for selektivt at isolere sfæroider og undgå enkeltceller.
- Supernatanten opsugeres, og spheroiderne resuspenderes i 25 mL SFD-medium med 1 ng/mL Activin A og 1,5 ng/mL BMP4 til differentierings induktion. Sfæroider skal være i samme 150 mm x 25mm sterile plade og inkube dem ved 37 °C i 5% CO2 -inkubatoren til 40 h.
Bemærk: Forskellige koncentrationer af Activin A (0-3 ng/mL) og BMP4 (0,5-2 ng/mL) kan anvendes til differentierings optimering afhængigt af mESC-linjen. - Saml alle hjertets sfæroider og centrifuge i 3 min ved 145 x g og stuetemperatur.
- Supernatanten aspirerer, og SFD-mediet opslæbe i 25 mL. Det opslæmmede EBs overføres til en ultra-lav fastgørelse 75 cm2 kolbe og inkuberer dem ved 37 °c i 5% Co2 -inkubatoren til 48 h.
3. isolering af hjerte feltspecifikke Hjerteprogenitorceller ved hjælp af fluorescerende reportere
- Centrifuge hjertesfæroider ved 145 x g og rumtemperatur i 3 minutter og Aspirér supernatanten. Der tilsættes 1 mL trypsin og inkueres ved 37 °C i 3 min. Bland godt ved pipettering for at adskille cellerne.
- Der tilsættes 4 mL 10% FBS i DMEM for at inaktivere trypsin og blandes godt ved pipettering. For at fjerne det ikke-dissocierede EBs filtreres blandingen ved hjælp af en 70 mm si, og filt rerede celler centrifugeres i 3 min ved 270 x g og stuetemperatur.
- Til sortering af CPC'er med fluorescerende reportere (CPC'er afledt af mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspirerer supernatanten og tilsæt 500 ΜL FACS sorterings opløsning (1% (v/v) FBS, 200 mm Hepes og 10 mm EDTA i PBS) for at gensuspendere.
- Hvis du vil fjerne alle celle klynger før sortering, skal du filtrere cellerne igen ved hjælp af et 5 mL polystyren rund-bunden rør med en 40 μm celle filter. Opbevar cellerne på is indtil sortering.
- Sortere cellerne for at isolere Tbx1-CRE; Rosa-RFP og HCN4-GFP positive CPC'er ved hjælp af en fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS). Saml de sorterede celler i 1 mL FBS. Opbevar celle prøven og de sorterede celler ved 4 °C.
4. isolering af hjerte feltspecifikke Hjerteprogenitorceller ved hjælp af Cxcr4 som en celleoverflade protein markør
- For at isolere første vs andet hjerte felt CPC'er baseret på udtrykket af overfladen protein receptor Cxcr4, bruge mESCIsl1-RFPlinje. Supernatanten aspireres fra trin 3,3, og de enkelte CPC'er resuspenderes i 300 μL af 10% FBS i PBS, der indeholder 1:200 (Vol/Vol) PerCP-efluor 710 konjugeret anti-Cxcr4-antistof.
- Der inkupereres ved stuetemperatur i 5 minutter og vaskes ved tilsætning af 1-2 mL kold PBS. Der centrifugeres på de enkelte CPC'er i 3 min ved 270 x g og rumtemperatur, og der vaskes yderligere to gange efterfulgt af centrifugering.
- Aspirér supernatanten og tilsæt 500 μL FACS sorterings løsning for at gensuspendere de enkelte CPC'er og filtrere som i trin 3,4.
- Isoler Cxcr4 + og Cxcr4-celler ved hjælp af FACS. Saml de sorterede celler i 1 mL FBS. Opbevar celle prøven og de sorterede celler ved 4 °C.
5. analyse af isolerede hjerte feltspecifikke Hjerteprogenitorceller
- Centrifuge sorterede CPC'er i 3 min ved 270 x g og stuetemperatur. Sorterede celler kan bruges til analyser af gen-og protein udtryk, eller de kan blive reculeret til analyser på senere tidspunkter.
- Til re-kultur isolerede CPC'er, aspirerer supernatanten, resuspender cellerne i SFD medium og replate ~ 3 x 104 celler pr brønd af en 384-brønd plade belagt med 0,1% (w/v) gelatine. Hvis øget celledød er noteret efter sortering, tilsættes 10 μM Y-27632 (ROCK-hæmmer) til prøven. To dage efter reculture, spontan slå skal bemærkes.
- For at analysere evnen af forgyldte CPC'er til at differentiere til kardiomyocytter, indsamle cellerne på dag 12 af differentiering. Brug trypsin som beskrevet i trin 1.2-1.5 til at isolere enkelt CMs. Resuspender cellerne i 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) og inkube i 30 minutter ved stuetemperatur for at fastsætte cellerne.
- Cellerne centrifugeres i 3 minutter ved 895 x gog stuetemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i PBS for at vaske PFA. Gentag dette trin en gang til.
- Supernatanten aspirerer, og cellerne resuspenderes i 10% FBS i PBS. Der inkuleeres halvdelen af celle prøven med mus anti-Troponin T antistof (1:500), og resten af prøven anvendes som en negativ kontrol. Der inkurueres i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne to gange som beskrevet i trin 5,4 ved hjælp af PBS. Aspirer supernatanten og genudsætter begge celleprøver i 10% FBS i PBS med 1:500 æsel anti-Mouse IgG (H + L) sekundært antistof, Alexa fluor 647 konjugat. Der inkurueres i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask to gange med PBS som i trin 5,6. Supernatanten aspirerer, og cellerne resuspenderes i 200 μL PBS. Brug et flow flowcytometer til at analysere cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ca. 132 h differentiering kan Tbx1-RFP og Hcn4-GFP-CPC'er detekteres ved hjælp af et fluorescerende mikroskop (figur 2). Generelt forekommer GFP-og RFP-celler omtrent omkring samme tid. De to populationer af CPC'er fortsætter med at ekspandere i umiddelbar nærhed og almindeligvis i et komplementært mønster. Justering af koncentrationen af Activin A og BMP4 vil ændre procenterne for FHF vs SHF CPC'er (figur 3). CPC-specifikationen in vitro blev primært bestemt af koncentrationen af BMP4. Derfor kan vores hjerte sfæoide system bruges til at studere CPC specifikation.
På samme måde som ved hjælp af Isl1-RFP reporter mESC linje, efter 132 h af differentiering, Isl1-RFP + CPCs vises. Efter immunofarvning af CPC'er for CXCR4, Isl1-RFP +, Cxcr4 + vs Isl1-RFP +, kan Cxcr4-celler isoleres (figur 4).
For at analysere muligheden af mESC-afledte CPC'er til at differentiere til kardiomyocytter, immun farvning for hjerte Troponin T kan udføres på dag 12 af differentiering. Efter aftale med den model, at FHF-celler hovedsagelig adskiller sig til myocytter, er celler afledt af Hcn4-GFP + CPC'er hovedsageligt myogene (figur 5A, B). Tilsvarende giver celler fra Isl1 +, CXCR4-CPC'er også anledning til kardiomyocytter ved langt højere procenter i forhold til Isl1 +, CXCR4-CPC'er (figur 5C).
Lejlighedsvis, mESCs undlader at differentiere effektivt og danne meget lave tal hjerte felt-specifikke CPC'er (figur 6).
Figur 1 : Skematisk fremstilling af in vitro specifikation af hjerte feltspecifikke hjerteprogenitorceller. Mesc'er danner sfæroider inden for 48 h. Derefter vil eksponeringen for Activin A og BMP4 for 40 h føre til mesodermal induktion. Hjerte progenitorceller udvikler ca. 36 timer senere. Progenitors af det andet eller første hjerte felt kan sorteres ved hjælp af fluorescerende aktiverede celle sortering. Anden hjerte felt celler er markeret med Tbx1-RFP udtryk vs første hjerte felt, der er markeret af Hcn4-GFP. Alternativt, Isl1-RFP mærker CPC'er og ved hjælp af levende immun farvning mod Cxcr4 man kan sortere Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-CPC'er, der repræsenterer anden vs første hjerte felt celler hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentativt billede af hjertesfæroider efter CPC-specifikationen. RFP mærker Tbx1 + og GFP mærker Hcn4 + CPC'er. De to cellepopulationer dannes i umiddelbar nærhed i et gratis mønster. Skala stænger = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Flow cytometrisk analyse af hjertesfæroider efter eksponering for forskellige koncentrationer af Activin A og BMP4. Justering af koncentrationerne af de to morfogener fører til forskellige procenter af Tbx1 + og Hcn4 + CPC'er. De to populationer blev hovedsagelig påvirket af justering af BMP4 koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Flow cytometrisk analyse af hjerte progenitorceller, der udtrykker Isl1 og er immunofarvede for Cxcr4. Hjerte progenitorer blev først gated baseret på deres Isl1 udtryk og derefter Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-celler blev sorteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Flow cytometrisk analyse af celler afledt af hjerte feltspecifikke CPC'er plettet for Hjertetroponin T. (A) i overensstemmelse med FHF-cellernes højere myogene potentiale differentierer en høj procentdel af HCN4-gfp +-celler til myocytter. B) analyse af alle mesc-afledte kardiomyocytter, hvor langt de fleste er HCN4-gfp +. C) Cxcr4-CPC'er skelner til en højere procentdel af kardiomyocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Repræsentative cytometriske analyser af mislykkede/lave effektivitets- in vitro -differentieringer. (A) flow cytometri analyse efter 132 h differentiering viser ingen dannelse af HCN4-gfp celler og en meget lav procentdel af TBX1-RFP + celler. B) mesc'er med lav differentierings effektivitet, der udtrykker meget lave niveauer af Isl1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vores protokol beskriver vi en metode til generering af hjertesfæroider og isolerede hjerte-feltspecifikke CPC'er. Disse kan bruges til at studere mekanismer af CPC specifikation og deres egenskaber, samt for hjertekammer-specifikke sygdom modellering. Et tidligere publiceret arbejde brugte en mESC linje med to fluorescerende reportere (Mef2c/NKX 2.5) til at studere cardiogenesis in vitro, men begge disse markører udtrykkes på embryonale dag 9.5-10, når kardiomyocytter allerede er dannet26. Til vores viden, er der i øjeblikket ingen metoder til isolering af hjerte felt-specifikke CPC'er in vitro. Endnu vigtigere, vores protokol kan også anvendes til menneskelige stamceller, hvor CXCR4 kan bruges til at isolere SHF CPC'er, der udtrykker høje niveauer af Isl125. Desuden kan vores dobbelte, fluorescerende reporter mESC linje bruges til at screene biblioteker af forbindelser og transskription faktorer, der kan påvirke hjerte felt specifikation eller celle polaritet i CPC'er.
Et af de kritiske trin i protokollen er startantallet af Mesc'er. Brug af lave eller høje tal vil i høj grad påvirke størrelsen af hjertesfæroider og differentierings effektivitet. Vi anbefaler, at du tester forskellige cellenumre (7,5-10 x 104 celler/ml) for forskellige mesc-linjer. Alternativt kan plader med brønde, der indeholder mikrobrønde af specificeret størrelse, også anvendes til at øge reproducerbarhed, hvis de kardiale sfæroider er meget variable. Investigatorerne bør også være opmærksomme på den specifikke timing og varighed af mesodermal induktion samt timingen af celle sortering. Desuden, for forskellige mESC linjer, optimering af morphogen koncentrationer skal udføres før testning deres evne til at generere CPC'er i hjertesfæroider. Brugen af ældre/udløbne cytokiner eller cellekulturer medium, eller inkonsekvente koncentrationer af morfogener vil påvirke differentieringen effektivitet. Endelig, mESC linjer, der er blevet passage for mere end ~ 15-20 gange, synes at miste deres evne til at differentiere effektivt.
Vores differentierings system giver mulighed for specifikke ændringer. Cxcr4 kan bruges som en eneste markør for SHF CPC'er i mESC linjer uden en fluorescerende reporter. Dog bør investigatorerne stadig optimere differentierings protokollen for at øge procentdelen af Isl1 + CPC'er før sortering Cxcr4 + vs Cxcr4-CPCs25. Derudover kan Activin A erstattes med kanoniske WNT-agonister/aktivatorer såsom Wnt3a eller CHIR99021 (GSK3b-hæmmer) for yderligere at øge specifikationen af SHF CPCs25.
Denne protokol gør det muligt at studere CPC-specifikationen ved hjælp af veldefinerede betingelser, tidsforskudt overvågning og ubegrænset antal celler. Således er det mere facile, effektiv og mindre dyrt i forhold til at analysere embryoner. Ikke desto mindre er det stadig et in vitro-system, hvor de absolutte genekspressions værdier for hjerte specifikke CPC'er måske ikke hænger tæt sammen med in vivo-genekspressions niveauer. Således i vores system, alene BMP4 kunne specificere CPC'er fra begge hjerte felter og kan i væsentlig grad ændre deres respektive nøgletal. Derudover kan der forekomme variabilitet med hensyn til differentierings effektiviteten.
Afslutningsvis, ved hjælp af mESC fluorescerende reporter linjer eller immun farvning af celle membran proteiner, vi rekapitulated cardiogenesis in vitro og isolerede hjerte felt-specifikke CPC'er. Dette giver mulighed for undersøgelse af tidlige signaler, der formidler CPC specifikation og funktionelle egenskaber samt modellering hjerte felt/kammer-specifikke medfødte hjertesygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet for afsløringer.
Acknowledgments
E. T. blev støttet af The Magic that Matters og AHA. C. K. blev støttet af tilskud fra NICHD/NIH (R01HD086026), AHA og MSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
