Summary
Formålet med denne metoden er å generere hjerte Feltspesifikke CARDIAC stamceller in vitro for å studere Stamcelle spesifikasjonen og funksjonelle egenskaper, og å generere kammer spesifikke CARDIAC celler for hjertesykdom modellering.
Abstract
Pluripotent stamceller tilbyr stort potensial for å forstå hjerte utvikling og sykdom og for regenererende medisin. Mens de siste fremskritt i utviklingsmessige kardiologi har ført til generering av CARDIAC celler fra Pluripotent stamceller, er det uklart om de to CARDIAC felt-den første og andre hjerte felt (FHF og SHF)-er indusert i Pluripotent stamceller systemer. For å løse dette, genererte vi en protokoll for in vitro spesifikasjon og isolering av hjerte felt-spesifikke CARDIAC stamceller. Vi brukte embryonale stamceller linjer bærer Hcn4-GFP og Tbx1-grobunn; Rosa-RFP journalister av FHF og SHF, henholdsvis, og live celle immunostaining av cellemembranen protein Cxcr4, en SHF markør. Med denne tilnærmingen genererte vi stamceller som recapitulate de funksjonelle egenskapene og transcriptome til deres in vivo motstykker. Vår protokoll kan utnyttes til å studere tidlig spesifikasjon og segregering av de to hjerte felt og å generere kammer-spesifikke CARDIAC celler for hjertesykdom modellering. Siden dette er et in vitro organoid system, kan det ikke gi presis anatomisk informasjon. Men, dette systemet overvinner dårlig tilgjengelighet av gastrulation-scenen embryo og kan oppskalert for høy gjennomstrømming skjermer.
Introduction
Bruken av Pluripotent stamceller (PSCer) har revolusjonert feltet av CARDIAC regenerering og personlig medisin med pasient-spesifikke myocytter for sykdoms modellering og narkotikabehandling1,2,3, 4. mer nylig har in vitro protokoller for generering av atrieflimmer vs ventrikkel samt pacemaker-lignende cardiomyocytes har blitt utviklet5,6. Men om cardiogenesis kan gjenopprettes in vitro for å studere hjerte utvikling og deretter generere ventrikkel kammer spesifikke CARDIAC celler er fortsatt uklart.
Under tidlig embryoutvikling, mesodermal celler under påvirkning av utskilt morphogens som BMP4, Wnts og Activin A danner primitive strek7. CARDIAC mesodermal celler preget av uttrykk for Mesp1, migrere anteriort og senere tid å danne CARDIAC halvmåne og deretter primitive hjerte tube7,8. Denne trekk gruppen av celler inneholder to svært distinkte populasjoner av hjerte stamceller (CPC), nemlig det første og det andre hjerte feltet (FHF og SHF)9,10. Celler fra SHF er svært proliferativ og trekk, og er primært ansvarlig for forlengelse og looping av hjertet røret. I tillegg SHF celler differensiere til cardiomyocytes, fibroblaster, glatt muskel og endothelial celler som de kommer inn i hjertet røret for å danne høyre ventrikkel, høyre ventrikkel utløp og stor del av både Atria7,10. I kontrast, FHF celler er mindre proliferativ og trekk og skille hovedsakelig til cardiomyocytes som de gir opphav til venstre ventrikkel og en mindre del av Atria11. I tillegger SHF forfedre preget av uttrykk for Tbx1, FGF8, FGF10 og Six2 mens FHF celler uttrykker Hcn4 og Tbx511,12,13,14,15.
PSCer kan differensiere til alle tre bakterie lag og deretter til en hvilken som helst celle type i kroppen4,16. Derfor tilbyr de enormt potensial for å forstå hjerte utvikling og for modellering spesifikke utviklingsmessige defekter som resulterer i medfødt hjertesykdom, den hyppigste årsaken til fødselen defekter17. En stor undergruppe av medfødt hjertesykdom inkluderer kammer-spesifikke CARDIAC unormalt18,19. Men det fortsatt uklart om disse stammer fra uregelrett hjerte feltutbygging. I tillegg, gitt manglende evne til cardiomyocytes å spre etter fødselen, har det vært omfattende anstrengelser for å skape hjerte vev for hjertet gjenfødelse1,7,20. Tatt i betraktning de fysiologiske og morfologiske forskjellene mellom CARDIAC kamre, generasjon av kammer-spesifikke CARDIAC vev bruker PSCer er av vesentlig betydning. Mens nylige fremskritt innen utviklings kardiologi har ført til en robust generasjon av CARDIAC celler fra PSCer, er det fortsatt uklart om de to hjerte feltene kan bli indusert i PSC-systemer.
For å recapitulate cardiogenesis in vitro og studere spesifikasjonen og egenskapene til CPC, har vi tidligere brukt et system basert på differensiering av PSC-avledet CARDIAC spheroids21,22,23,24. Nylig genererte vi mus embryonale stamceller (mESCs) med GFP og RFP journalister under kontroll av FHF genet Hcn4 og SHF genet Tbx1, henholdsvis (mESCsTbx1-grobunn; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro differensiert mESCs dannet CARDIAC spheroids der GFP + og RFP + celler dukket opp fra to forskjellige områder av mesodermal celler og mønstret på en komplementær måte. De resulterende GFP +-og RFP +-cellene viste henholdsvis FHF-og SHF-egenskapene, bestemt av RNA-sekvensering og klonal-analyser. Betydelig, benytter mESCs bærer det Isl1-RFP reporter (mESCIsl1-RFP), vi oppdaget det SHF celler var trofast Fair av cellen-overflate protein CXCR4, og denne kanne sette i stand isolasjon av hjertet åker-spesifikk celler uten transgenes. Den nåværende protokollen vil beskrive generering og isolering av hjerte Feltspesifikke CPC-er fra mESCs, som kan tjene som et verdifullt verktøy for å studere kammer spesifikk hjertesykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: In vitro generasjon av hjerte felt-spesifikk mus CARDIAC stamceller (figur 1).
1. vedlikehold av mus ESCs
- Grow mESCs (mESCsTbx1-grobunn; Rosa-RFP; HCN4-GFP, MESCISL1-RFP)25 på 0,1% (w/v) gelatin belagt T25 flasker i 2i medium (870 ml GLASCOW minimum viktig medium (GMEM), 100 ml fosterets storfe serum (FBS), 10 mL av GlutaMAX, 10 ml av ikke-essensielle aminosyrer, 10 ml natrium pyruvat, 3 μL av beta-mercaptoethanol, 20 μL av Lif (200 U/mL), 0,3 μM CHIR99021 og 0,1 μM PD0325901).
- Når cellene nå 70-80% samløpet, skyll cellene en gang med fosfat buffer løsning (PBS) og deretter distansere i enkeltceller ved å legge til 1 mL Trypsin og incubating ved 37 ° c i 3 min.
- Nøytralisere Trypsin ved å legge 4 mL 10% FBS i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM). Tell cellene ved hjelp av en automatisert celle teller.
- Sentrifuger ~ 3 x 105 celler i 3 min ved 270 x g og romtemperatur.
- Aspirer supernatanten, resuspend cellene i 5 mL 2i medium og replate på 0,1% (w/v) gelatin belagt T25 flasker for vedlikehold.
2. generering av CARDIAC stamceller bruke CARDIAC Spheroids
- Sentrifuger 2,5 x 106 celler fra trinn 1,3 i 3 minutter ved 270 x g og romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspend cellene i 25 mL av SFD medium (105 celler/ml). Avhengig av omfanget av eksperimentet kan mESC-nummeret justeres tilsvarende.
Merk: SFD medium inneholder 715 mL av Iscove ' s modifisert Dulbecco ' s medium (IMDM), 250 mL av ham ' s F12, 5 mL av N2-supplement, 10 mL av B27 minus vitamin A, 5 mL av 10% (w/v) BSA (i PBS), 7,5 mL av GlutaMAX og 7,5 mL av penicillin-Streptomycin. Tilsett askorbinsyre (50 mg/mL) og 3,9 x 10-3% (v/v) av monothioglycerol før bruk. - Plate cellen suspensjonen i 1 150 mm x 25 mm steril plate og ruge ved 37 ° c i 5% CO2 inkubator for 48 h. CARDIAC spheroids bør dannes innen 24 timer.
- Samle alle dannet CARDIAC spheroids og sentrifuger for 3 min ved 145 x g og romtemperatur å selektivt isolere spheroids og unngå enkeltceller.
- Aspirer supernatanten og resuspend spheroids i 25 mL av SFD medium med 1 ng/mL av Activin A og 1,5 ng/mL av BMP4 for differensiering induksjon. Plate spheroids i samme 150 mm x 25mm steril plate og ruge dem ved 37 ° c i 5% CO2 inkubator for 40 h.
Merk: Ulike konsentrasjoner av Activin A (0-3 ng/mL) og BMP4 (0,5-2 ng/mL) kan brukes til differensiering optimalisering avhengig av mESC linje. - Samle alle CARDIAC spheroids og sentrifuger for 3 min ved 145 x g og romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspend spheroids i 25 mL av SFD medium. Overfør resuspendert EBs i en ultra-lav vedlegg 75 cm2 kolbe og ruge dem ved 37 ° c i 5% co2 inkubator for 48 h.
3. isolering av hjerte Feltspesifikke CARDIAC stamceller bruke fluorescerende journalister
- Sentrifuger CARDIAC spheroids ved 145 x g og romtemperatur for 3min og aspirer supernatanten. Tilsett 1 mL Trypsin og ruge ved 37 ° c i 3 min. Bland godt med pipettering for å distansere cellene.
- Tilsett 4 mL 10% FBS i DMEM for å deaktivere Trypsin og bland godt med pipettering. For å fjerne ikke-dissosiert EBs, filtrere blandingen ved hjelp av en 70 mm sil og sentrifuger de filtrert cellene i 3 min ved 270 x g og romtemperatur.
- For å sortere CPC-er som frakter fluorescerende journalister (CPC avledet fra mESCsTbx1-grobunn; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspirer supernatanten og tilsett 500 μL av FACS sorterings løsning (1% (v/v) FBS, 200 mm HEPES og 10 mm av EDTA i PBS) til resuspend.
- Hvis du vil fjerne alle celle klynger før sortering, filtrerer du cellene på nytt ved hjelp av en 5 mL polystyren rund bunn rør med en 40 μm celle sil. Hold cellene på isen til sortering.
- Sorter cellene for å isolere Tbx1-grobunn; Rosa-RFP og HCN4-GFP positive CPC ved hjelp av en fluorescerende aktivert celle Sorter (FACS). Samle de sorterte cellene i 1 mL av FBS. Behold Celleprøven og sorterte celler ved 4 ° c.
4. isolering av hjerte Feltspesifikke CARDIAC stamceller bruke Cxcr4 som en Cell Surface protein markør
- For å isolere første kontra andre hjerte felt CPC basert på uttrykket av overflate protein reseptoren Cxcr4, bruker du mESCIsl1-RFP-linjen. Aspirer supernatanten fra trinn 3,3 og resuspend singelen CPC i 300 μL av 10% FBS i PBS inneholder 1:200 (Vol/Vol) PerCP-efluor 710 bøyd anti-Cxcr4 antistoff.
- Ruge ved romtemperatur for kl. og vask ved å legge 1-2 mL av kald PBS. Sentrifuger singelen CPC for 3 min ved 270 x g og romtemperatur og vask to ganger etterfulgt av sentrifugering.
- Aspirer supernatanten og tilsett 500 μL av FACS sorterings løsning for å resuspend enkelt CPC og filter som i trinn 3,4.
- Isoler Cxcr4 + og Cxcr4-celler ved hjelp av FACS. Samle de sorterte cellene i 1 mL av FBS. Behold Celleprøven og sorterte celler ved 4 ° c.
5. analyse av isolert hjerte Feltspesifikke CARDIAC stamceller
- Sentrifuger sortert CPC for 3 min ved 270 x g og romtemperatur. Sorterte celler kan brukes til gen-og protein uttrykks analyser, eller de kan recultured for analyser på senere tidspunkter.
- For å re-kulturen isolert CPC, aspirer den supernatanten, resuspend cellene i SFD medium og replate ~ 3 x 104 celler per brønn av en 384-brønn plate belagt med 0,1% (w/v) gelatin. Hvis økt celle død er bemerket etter sortering, tilsett 10 μM av Y-27632 (ROCK inhibitor) til prøven. To dager etter reculture, bør spontan juling bemerkes.
- For å analysere muligheten av belagt CPC å differensiere til cardiomyocytes, samle cellene på dag 12 av differensiering. Bruk Trypsin som beskrevet i trinn 1.2-1.5 for å isolere enkelt CMs. Resuspend cellene i 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) og ruge i 30 min ved romtemperatur for å fikse cellene.
- Sentrifuger cellene i 3 min ved 895 x g, og romtemperatur. Aspirer supernatanten og resuspend cellene i PBS å vaske PFA. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Aspirer supernatanten og resuspend cellene i 10% FBS i PBS. Ruge halvparten av Celleprøven med mus anti-Troponin T antistoff (1:500) og bruk resten av prøven som en negativ kontroll. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene to ganger som beskrevet i trinn 5,4 ved hjelp av PBS. Aspirer supernatanten og resuspend både celleprøver i 10% FBS i PBS med 1:500 esel anti-mus IgG (H + L) sekundære antistoff, Alexa fluor 647 bøye. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask to ganger med PBS som i trinn 5,6. Aspirer supernatanten og resuspend cellene i 200 til μL av PBS. Bruk en flyt flowcytometer til å analysere cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter ca 132 h av differensiering, kan Tbx1-RFP og Hcn4-GFP CPC oppdages ved hjelp av et fluorescerende mikroskop (figur 2). Vanligvis, GFP og RFP celler komme ca i nærheten det likt tid. De to populasjoner av CPC fortsetter å ekspandere i umiddelbar nærhet og ofte i et utfyllende mønster. Justering av konsentrasjonen av Activin A og BMP4 vil endre prosentene av FHF vs SHF CPC (Figur 3). CPC-spesifikasjonen in vitro ble først og fremst bestemt av konsentrasjonen av BMP4. Derfor kan vårt hjerte spheroid system brukes til å studere CPC-spesifikasjonen.
Tilsvarende bruker Isl1-RFP reporter mESC linje, etter 132 h av differensiering, Isl1-RFP + CPC vises. Etter immunostaining av CPC for CXCR4, Isl1-RFP +, Cxcr4 + vs Isl1-RFP +, Cxcr4-celler kan isoleres (Figur 4).
Å analysere evnen til mESC-avledet CPC å differensiere til cardiomyocytes, immunostaining for CARDIAC Troponin T kan utføres på dag 12 av differensiering. I samråd med den modellen som FHF celler skiller hovedsakelig til myocytter, er celler avledet fra Hcn4-GFP + CPC hovedsakelig myogenic (figur 5A, B). På samme måte, celler avledet fra Isl1 +, CXCR4-CPC også gi opphav til cardiomyocytes ved mye høyere prosenter i forhold til Isl1 +, CXCR4-CPC (figur 5C).
Av og til kan mESCs ikke differensiere effektivt og danne svært lave tall for hjerte felt spesifikk CPC (figur 6).
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av in vitro spesifikasjon av hjerte Feltspesifikke hjerte stamceller. mESCs form spheroids innen 48 h. Deretter eksponering for Activin A og BMP4 for 40 h vil føre til mesodermal induksjon. CARDIAC stamceller utvikle ca 36 h senere. Forfedre av andre eller første hjerte feltet kan sorteres ved hjelp av fluorescerende aktivert celle sortering. Andre hjerte feltet celler er preget av Tbx1-RFP uttrykk vs første hjertet feltet som er preget av Hcn4-GFP. Alternativt, Isl1-RFP merker CPC og bruke Live immunostaining mot Cxcr4 man kan sortere Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-CPC som representerer andre vs første hjerte felt celler hhv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representative bilde av CARDIAC spheroids etter CPC-spesifikasjonen. RFP merker Tbx1 + og GFP merker Hcn4 + CPC. De to celle populasjoner er dannet i umiddelbar nærhet i et gratis mønster. Skala stolper = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Flow analytiske analyse av CARDIAC spheroids etter eksponering for ulike konsentrasjoner av Activin A og BMP4. Justering av konsentrasjonen av de to morphogens fører til forskjellige prosenter av Tbx1 + og Hcn4 + CPC. De to befolkningsgruppene ble i hovedsak påvirket av justering av BMP4 konsentrasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Flow analytiske analyse av CARDIAC stamceller uttrykker Isl1 og er immunostained for Cxcr4. CARDIAC forfedre ble først gated basert på deres Isl1 uttrykk og deretter Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-celler ble sortert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Flow analytiske analyse av celler avledet fra hjerte felt-spesifikk CPC beiset for CARDIAC Troponin T. (A) i samsvar med høyere myogenic potensialet i FHF celler, en høy andel av HCN4-GFP + celler differensiere til myocytter. (B) analyse av alle mESC-avledet cardiomyocytes, hvor de aller fleste er HCN4-GFP +. (C) Cxcr4-CPC differensiere til en høyere prosentandel av cardiomyocytes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Representative analytiske analyser av mislykket/lav effektivitet in vitro differentiations. (A) Flow flowcytometri analyse etter 132 h av differensiering viser ingen dannelse av HCN4-GFP celler og en svært lav prosentandel av TBX1-RFP + celler. (B) lav differensiering effektiviteten av mESCs uttrykke svært lave nivåer av Isl1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår protokoll beskriver vi en metodikk for å generere hjerte-spheroids og isolerte hjerte Feltspesifikke CPC-er. De kan brukes til å studere mekanismer for CPC-spesifikasjonen og deres egenskaper, så vel som for CARDIAC kammer-spesifikk sykdom modellering. En tidligere publisert arbeid brukt en mESC linje med to fluorescerende journalister (Mef2c/Nkx 2.5) for å studere cardiogenesis in vitro, men begge disse markørene uttrykkes på embryonale dag 9.5-10 når cardiomyocytes er allerede dannet26. Til vår kunnskap er det for tiden ingen metoder for isolering av hjerte Feltspesifikke CPC in vitro. Enda viktigere er det at protokollen også kan brukes på humane stamceller, der CXCR4 kan brukes til å isolere SHF CPC-er som uttrykker høye nivåer av Isl125. I tillegg kan våre doble, fluorescerende reporter mESC linje brukes til skjermen biblioteker av forbindelser og transkripsjon faktorer som kan påvirke hjertet feltet spesifikasjon eller celle polaritet i CPC.
Et av de kritiske trinnene i protokollen er startnummeret til mESCs. Ved hjelp av lave eller høye tall vil betydelig påvirke størrelsen på CARDIAC spheroids og differensiering effektivitet. Vi anbefaler å teste forskjellige celle tall (7,5-10 x 104 celler/ml) for ulike mESC linjer. Alternativt, Hvis størrelsen av CARDIAC spheroids fortsatt betydelig variabel, plater med brønner som inneholder microwells av spesifisert størrelse kan også brukes til å øke reproduserbarhet. Etterforskere bør også være oppmerksomme på den spesifikke timing og varighet av mesodermal induksjon samt tidspunktet for celle sortering. Videre, for ulike mESC linjer, vil optimalisering av de morphogen konsentrasjonene må utføres før testing deres evne til å generere CPC i CARDIAC spheroids. Bruk av eldre/utløpte cytokiner eller cellekultur medium, eller inkonsekvente konsentrasjoner av morphogens vil påvirke differensiering effektivitet. Til slutt, mESC linjer som har blitt passert for mer enn ~ 15-20 ganger, synes å miste sin evne til å differensiere effektivt.
Vårt differensiering system tillater spesifikke modifikasjoner. Cxcr4 kan brukes som en eneste markør av SHF CPC i mESC linjer uten fluorescerende reporter. Imidlertid bør etterforskerne fortsatt optimalisere differensiering protokollen for å øke prosentandelen av Isl1 + CPC før sortering Cxcr4 + vs Cxcr4-CPC25. I tillegg kan Activin A erstattes med kanonisk wnt agonister/aktivator som Wnt3a eller CHIR99021 (GSK3b-inhibitor) for å øke spesifikasjonen av SHF CPC25.
Denne protokollen gjør det mulig å studere CPC-spesifikasjonen ved hjelp av veldefinerte betingelser, overvåking av tidsforløp og ubegrenset antall celler. Dermed er det mer facile, effektiv og mindre kostbare i forhold til å analysere embryo. Likevel er det fortsatt et in vitro-system hvor de absolutte gen uttrykks verdiene til et bestemt CPC-uttrykk i hjerte feltet ikke kan være tett forbundet med in vivo gen uttrykks nivåer. Således, i vårt system, bare BMP4 kunne angi CPC fra både hjerte felt og kan betydelig endre sine respektive prosenter. I tillegg kan variasjon eksistere når det gjelder differensiering effektivitet.
Som en konklusjon, ved hjelp av mESC fluorescerende reporter linjer eller immunostaining av celle membran proteiner, sammenfattet vi cardiogenesis in vitro og isolerte hjerte Feltspesifikke CPC. Dette gjør at studiet av tidlige signaler som megle CPC-spesifikasjonen og funksjonelle egenskaper samt modellering hjerte felt/kammer-spesifikke medfødte hjertesykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting for avsløringer.
Acknowledgments
E. T. ble støttet av The Magic som teller og AHA. C. K. ble støttet av tilskudd fra NICHD/NIH (R01HD086026), AHA, og MSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
