Summary
El propósito de este método es generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco in vitro con el fin de estudiar la especificación de la célula progenitora y las propiedades funcionales, y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades del corazón.
Abstract
Las células madre pluripotentes ofrecen un gran potencial para entender el desarrollo del corazón y las enfermedades y para la medicina regenerativa. Si bien los recientes avances en la cardiología del desarrollo han llevado a generar células cardíacas a partir de células madre pluripotentes, no está claro si los dos campos cardíacos -el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)- se inducen en sistemas de células madre pluripotentes. Para abordar esto, generamos un protocolo para la especificación in vitro y el aislamiento de células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco. Utilizamos líneas de células madre embrionarias que llevan Hcn4-GFP y Tbx1-Cre; Los reporteros de Rosa-RFP de la FHF y la SHF, respectivamente, y la inmunomancha de células vivas de la proteína de membrana celular Cxcr4, un marcador de SHF. Con este enfoque, generamos células progenitoras que recapitulan las propiedades funcionales y el transcriptoma de sus contrapartes in vivo. Nuestro protocolo se puede utilizar para estudiar la especificación temprana y la segregación de los dos campos cardíacos y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades cardíacas. Dado que se trata de un sistema organoide in vitro, es posible que no proporcione información anatómica precisa. Sin embargo, este sistema supera la escasa accesibilidad de los embriones en etapa de gastrulación y se puede ampliar para pantallas de alto rendimiento.
Introduction
El uso de células madre pluripotentes (PSC) ha revolucionado el campo de la regeneración cardíaca y la medicina personalizada con miocitos específicos del paciente para el modelado de enfermedades y terapias farmacológicas1,2,3, 4. Más recientemente, se han desarrollado protocolos in vitro para la generación de cardiomiocitos derivados de la PSC auricular es adictivo y similares a marcapasos, 5,6. Sin embargo, aún no está claro si la cardiogénesis puede recrearse in vitro para estudiar el desarrollo cardíaco y, posteriormente, generar células cardíacas específicas de la cámara ventricular.
Durante el desarrollo embrionario temprano, las células mesodérmicas bajo la influencia de morógenos secretados como BMP4, Wnts y Activin A forman la racha primitiva7. Células mesodermales cardíacas marcadas por la expresión de Mesp1, migran antes y más bien para formar la media luna cardiaca y luego el tubo cardíaco primitivo7,8. Este grupo migratorio de células incluye dos poblaciones muy distintas de células progenitoras cardíacas (CPC), a saber, el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)9,10. Las células del SHF son altamente proliferativas y migratorias y son las principales responsables del alargamiento y bucle del tubo cardíaco. Además, las células SHF se diferencian a cardiomiocitos, fibroblastos, músculo liso y células endoteliales a medida queentran en el tubo cardíaco para formar el ventrículo derecho, tracto de salida ventricular derecha y gran parte de ambas aurículas 7,10. Por el contrario, las células FHF son menos proliferativas y migratorias y se diferencian principalmente a los cardiomiocitos, ya que dan lugar al ventrículo izquierdo y a una parte más pequeña de la aurícula11. Además, los progenitores SHF están marcados por la expresión de Tbx1, FGF8, FGF10 y Six2, mientras que las células FHF expresan Hcn4 y Tbx511,12,13,14,15.
Los PSC pueden diferenciarse a las tres capas germinales y posteriormente a cualquier tipo de célula en el cuerpo4,16. Por lo tanto, ofrecen un enorme potencial para entender el desarrollo del corazón y para modelar defectos específicos del desarrollo que resultan en enfermedades cardíacas congénitas, la causa más frecuente de defectos congénitos17. Un gran subgrupo de cardiopatía congénita incluye anomalías cardíacas específicas de la cámara18,19. Sin embargo, todavía no está claro si estos se originan en el desarrollo anómalo del campo del corazón. Además, dada la incapacidad de los cardiomiocitos para proliferar después del nacimiento, se han realizado grandes esfuerzos para crear tejido cardíaco para la regeneración cardíaca1,7,20. Teniendo en cuenta las diferencias fisiológicas y morfológicas entre las cámaras cardíacas, la generación de tejido cardíaco específico de la cámara utilizando PsCs es de importancia significativa. Si bien los recientes avances en cardiología del desarrollo han llevado a una generación robusta de células cardíacas a partir de PSC, todavía no está claro si los dos campos cardíacos pueden ser inducidos en los sistemas PSC.
Para recapitular la cardiogénesis in vitro y estudiar las especificaciones y propiedades de los CPC, anteriormente utilizamos un sistema basado en la diferenciación de esferoides cardíacos derivados de PSC21,22,23,24. Recientemente, generamos células madre embrionarias de ratón (mESC) con reporteros de GFP y RFP bajo el control del gen DeFHcn4 y el gen SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Los mESC diferenciados in vitro formaron esferoides cardíacos en los que las células GFP+ y RFP+ aparecieron de dos áreas distintas de células mesodeérmicas y se modelaron de manera complementaria. Las células GFP+ y RFP+ resultantes mostraron características de FHF y SHF, respectivamente, determinadas por la secuenciación del ARN y los análisis clonales. Es importante destacar que, utilizando mESC que transporta el reportero Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP),descubrimos que las células SHF estaban marcadas fielmente por la proteína de superficie celular CXCR4, y esto puede permitir el aislamiento de células específicas del campo cardíaco sin transgenes. El presente protocolo describirá la generación y el aislamiento de cPC específicos en el campo cardíaco de los mESC, que pueden servir como una herramienta valiosa para estudiar las cardiopatías específicas de la cámara.
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Protocol
NOTA: Generación in vitro de células progenitoras cardíacas de ratón específicas del campo cardíaco (Figura1).
1. Mantenimiento de esCs de ratón
- Cultivar mESCs (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 on 0.1% (w/v) frascos T25 recubiertos de gelatina en 2i medio (870 mL de medio esencial glascow (GMEM), 100 mL de suero bovino fetal (FBS), 10 mL de GlutaMAX, 10 mL de aminoácidos no esenciales, 10 mL de sodio piruvato, 3 l de beta-mercaptoetanol, 20 l de Lif (200 U/ml), 0,3 oM CHIR99021 y 0,1 m PD0325901).
- Cuando las células alcancen un 70-80% de confluencia, enjuague las células una vez con la solución tampón de fosfato (PBS) y luego disocie en células individuales agregando 1 ml de trippsina e incubando a 37 oC durante 3 minutos.
- Neutraliza la trippsina añadiendo 4 ml de 10% de FBS en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco. Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado.
- Centrifugar 3 x 105 células durante 3 min a 270 x g y temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante, resuspender las células en 5 ml de medio 2i y replacar en frascos T25 recubiertos con gelatina al 0,1% (p/v) para mantenimiento.
2. Generación de células progenitoras cardíacas con esferoides cardíacos
- Centrifugar 2,5 x 106 células del paso 1,3 durante 3 min a 270 x g y temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 25 ml de medio SFD (105 células/ml). Dependiendo de la escala del experimento, el número mESC se puede ajustar en consecuencia.
NOTA: El medio SFD contiene 715 ml del medio modificado Dulbecco de Iscove (IMDM), 250 ml de F12 de Jamón, 5 mL de N2-suplemento, 10 mL de B27 menos Vitamina A, 5 mL de 10% (p/v) BSA (en PBS), 7,5 mL de GlutaMAX y 7,5 mL de Penicilina-Streptomicina. Añadir ácido ascórbico (50 mg/ml) y 3,9 x 10-3% (v/v) de monotioglicerol antes de usar. - Placar la suspensión celular en una placa estéril de 150 mm x 25 mm e incubar a 37 oC en la incubadora de CO2 al 5% para 48 h. Los esferoides cardíacos deben formarse dentro de las 24 h.
- Recoger todos los esferoides cardíacos formados y centrifugar durante 3 minutos a 145 x g y la temperatura ambiente para aislar selectivamente los esferoides y evitar células individuales.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los esferoides en 25 ml de medio SFD con 1 ng/ml de Activin A y 1,5 ng/mL de BMP4 para la inducción de diferenciación. Placar los esferoides en la misma placa estéril de 150 mm x 25 mm e incubarlas a 37 oC en la incubadora de CO2 del 5% durante 40 h.
NOTA: Se pueden utilizar diferentes concentraciones de Activin A (0-3 ng/mL) y BMP4 (0,5-2 ng/mL) para la optimización de la diferenciación dependiendo de la línea mESC. - Recoger todos los esferoides cardíacos y centrífuga durante 3 min a 145 x g y temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los esferoides en 25 ml de medio SFD. Transfiera los EB resuspendidos en un matraz de fijación ultrabajo de 75 cm2 e incubarlos a 37oC en la incubadora de CO2 del 5% durante 48 h.
3. Aislamiento de células de progenitor cardíaco específicas del campo del corazón utilizando reporteros fluorescentes
- Centrífuga esferoides cardíacos a 145 x g y temperatura ambiente durante 3 minutos y aspirar al sobrenadante. Añadir 1 mL de trippsina e incubar a 37oC durante 3 min. Mezclar bien pipeteando para disociar las células.
- Añadir 4 mL de 10% FBS en DMEM para inactivar la trippsina y mezclar bien mediante pipeteo. Para eliminar los EB no disociados, filtre la mezcla con un colador de 70 mm y centrifugar las células filtradas durante 3 min a 270 x g y la temperatura ambiente.
- Ordenar los CPC que llevan reporteros fluorescentes (CPC derivados de mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de solución de clasificación FACS (1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES y 10 mM de EDTA en PBS) para resuspender.
- Para eliminar todos los racimos de celdas antes de ordenarlas, filtre las celdas de nuevo con un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con un colador de celdas de 40 m. Mantenga las células en hielo hasta la clasificación.
- Ordenar las celdas para aislar Tbx1-Cre; CPC positivos Rosa-RFP y HCN4-GFP utilizando un clasificador de células activado sin fluorescentes (FACS). Recoja las células ordenadas en 1 mL de FBS. Mantenga la muestra de celda y las células ordenadas a 4 oC.
4. Aislamiento de células de progenitor cardíaco específicas de campo cardíaco del corazón utilizando Cxcr4 como marcador de proteína de superficie celular
- Para aislar los CPC de primer a segundo campo cardíaco en función de la expresión del receptor de proteína superficial Cxcr4, utilice la línea mESCIsl1-RFP. Aspirar el sobrenadante del paso 3.3 y resuspender los CPC individuales en 300 s de 10% FBS en PBS que contengan 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 anticuerpo anti-Cxcr4 conjugado.
- Incubar a temperatura ambiente durante 5min y lavar añadiendo 1-2 ml de PBS frío. Centrifugar los CPC individuales durante 3 min a 270 x g y la temperatura ambiente y lavar dos veces más seguidas de centrifugación.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de solución de clasificación FACS para resuspender los CPC individuales y filtrar como en el paso 3.4.
- Aísle las celdas Cxcr4+ y Cxcr4 mediante FACS. Recoja las células ordenadas en 1 mL de FBS. Mantenga la muestra de celda y las células ordenadas a 4 oC.
5. Análisis de células progenitoras cardíacas específicas de campo cardíaco aislado
- CPC ordenados por centrífuga durante 3 min a 270 x g y temperatura ambiente. Las células clasificadas se pueden utilizar para análisis de expresión de genes y proteínas o pueden recultivarse para análisis en momentos posteriores.
- Para recultivar CPC aisladas, aspirar el sobrenadante, resuspender las células en medio SFD y replacar 3 x 104 células por pozo de una placa de 384 pocillos recubierta con 0.1% (p/v) gelatina. Si se observa un aumento de la muerte celular después de la clasificación, agregue 10 m de Y-27632 (inhibidor de ROCK) a la muestra. Dos días después de la recultura, se deben observar golpes espontáneos.
- Para analizar la capacidad de los CPC chapados para diferenciarse a los cardiomiocitos, recoger las células en el día 12 de la diferenciación. Utilice la trippsina como se describe en los pasos 1.2-1.5 para aislar los PRIMEROS individuales.
- Centrifugar las células durante 3 min a 895 x g, y a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en PBS para lavar el PFA. Repita este paso una vez más.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10% FBS en PBS. Incubar la mitad de la muestra celular con el anticuerpo t anti-troponina de ratón (1:500) y utilizar el resto de la muestra como un control negativo. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lave las células dos veces como se describe en el paso 5.4 con PBS. Aspirar el sobrenadante y resuspender ambas muestras celulares en 10% FBS en PBS con 1:500 burro anti-ratón IgG (H+L) anticuerpo secundario, Alexa Fluor 647 conjugado. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lávese dos veces con PBS como en el paso 5.6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 200 s de PBS. Utilice un catómetro de flujo para analizar las celdas.
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Representative Results
Después de aproximadamente 132 h de diferenciación, los CPC Tbx1-RFP y Hcn4-GFP se pueden detectar utilizando un microscopio fluorescente (Figura2). Generalmente, las células GFP y RFP aparecen aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente alrededor del mismo tiempo. Las dos poblaciones de CPC continúan expandiéndose en estrecha proximidad y comúnmente en un patrón complementario. El ajuste de las concentraciones de Activin A y BMP4 alterará los porcentajes de FHF vs CPC SHF (Figura 3). La especificación de CPC in vitro se determinó principalmente por la concentración de BMP4. Por lo tanto, nuestro sistema de esferoides cardíacos se puede utilizar para estudiar la especificación de CPC.
Del mismo modo utilizando la línea mESC del reportero Isl1-RFP, después de 132 h de diferenciación, aparecen los CPC Isl1-RFP+. Después de la inmunomanchación de CPC para CXCR4, Isl1-RFP+, Cxcr4+ vs Isl1-RFP+, Cxcr4- las células se pueden aislar (Figura4).
Para analizar la capacidad de los CPC derivados de mESC para diferenciarse a los cardiomiocitos, la inmunomancha para la troponina T cardíaca se puede realizar en el día 12 de la diferenciación. De acuerdo con el modelo de que las células FHF diferencian principalmente a los miocitos, las células derivadas de los CPC Hcn4-GFP+ son principalmente miogénicas (Figura5A,B). Del mismo modo, las células derivadas de Isl1+, CXCR4- CPC también dan lugar a cardiomiocitos en porcentajes mucho más altos en comparación con Isl1+, CXCR4- CPC (Figura5C).
Ocasionalmente, los mESC no pueden diferenciar eficientemente y formarnúmeros muy bajos de cPC específicos de campo cardíaco (Figura 6).
Figura 1 : Representación esquemática de la especificación in vitro de células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco. los mESC forman esferoides dentro de las 48 h. A continuación, la exposición a Activin A y BMP4 durante 40 h conducirá a la inducción mesodermica. Las células progenitoras cardíacas se desarrollan aproximadamente 36 h más tarde. Los progenitores del segundo o primer campo cardíaco se pueden clasificar utilizando la clasificación de células activadas fluorescentes. Las celdas de segundo campo cardíaco están marcadas por la expresión Tbx1-RFP frente al primer campo cardíaco marcado por Hcn4-GFP. Alternativamente, Isl1-RFP marca los CPC y el uso de inmunomanchas en vivo contra Cxcr4 se puede ordenar Isl1+, Cxcr4+ vs Isl1+, Cxcr4- CPC que representan segundas células de campo cardíaco, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imagen representativa de los esferoides cardíacos después de la especificación de CPC. Las marcas RFP Tbx1+ y GFP hcn4+ cPC. Las dos poblaciones celulares se forman muy cerca en un patrón complementario. Barras de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis citométrico de flujo de esferoides cardíacos después de la exposición a diferentes concentraciones de Activin A y BMP4. Ajustar las concentraciones de los dos morógenos conduce a diferentes porcentajes de CPC Tbx1+ y Hcn4+. Las dos poblaciones se vieron afectadas principalmente por el ajuste de la concentración de BMP4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis citométrico de flujo de células progenitoras cardíacas que expresan Isl1 y están inmunotintas para Cxcr4. Los progenitores cardíacos primero fueron cerrados en función de su expresión Isl1 y luego isl1+, Cxcr4+ vs Isl1+, Cxcr4- células fueron ordenadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Análisis citométrico de flujo de células derivadas de CPC específicos del campo cardíaco manchadas para troponina T cardíaca. (A) Consistente con el mayor potencial miogénico de las células FHF, un alto porcentaje de células Hcn4-GFP+ se diferencian a los miocitos. (B) Análisis de todos los cardiomiocitos derivados del mESC, donde la gran mayoría son Hcn4-GFP+. (C) Cxcr4- CPC diferencian a un mayor porcentaje de cardiomiocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Análisis citométricos representativos de diferenciaciones in vitro de eficiencia fallida/baja. (A) Análisis de citometría de flujo después de 132 h de diferenciación que no muestra la formación de células Hcn4-GFP y un porcentaje muy bajo de células Tbx1-RFP+. (B) Baja eficiencia de diferenciación de los mESC que expresan niveles muy bajos de Isl1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En nuestro protocolo, describimos una metodología para generar esferoides cardíacos y CPC específicos del campo cardíaco aislado. Estos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos de especificación de CPC y sus propiedades, así como para el modelado de enfermedades específicas de la cámara cardíaca. Un trabajo publicado anteriormente utilizó una línea mESC con dos reporteros fluorescentes (Mef2c/Nkx2.5) para estudiar cardiogénesis in vitro, sin embargo, ambos marcadores se expresan en el día embrionario 9.5-10 cuando los cardiomiocitos ya están formados26. Hasta donde sabemos, actualmente no existen métodos para el aislamiento de CPC específicas del campo cardíaco in vitro. Más importante aún, nuestro protocolo también se puede aplicar a las células madre humanas, donde CXCR4 se puede utilizar para aislar CPC SHF que expresan altos niveles de Isl125. Además, nuestra línea mESC de reportero doble y fluorescente se puede utilizar para examinar bibliotecas de compuestos y factores de transcripción que pueden afectar la especificación del campo cardíaco o la polaridad celular en los CPC.
Uno de los pasos críticos en el protocolo es el número inicial de mESC. El uso de números bajos o altos afectará significativamente el tamaño de los esferoides cardíacos y la eficiencia de diferenciación. Recomendamos probar diferentes números de celda (7.5-10 x 104 celdas/ml) para diferentes líneas mESC. Alternativamente, si el tamaño de los esferoides cardíacos sigue siendo significativamente variable, las placas con pozos que contienen micropocillos de tamaño especificado también se pueden utilizar para aumentar la reproducibilidad. Los investigadores también deben ser conscientes del momento específico y la duración de la inducción mesodermica, así como el momento de la clasificación celular. Además, para diferentes líneas de mESC, la optimización de las concentraciones de mortogeno stendrá realizarse antes de probar su capacidad para generar CPC en esferoides cardíacos. El uso de citoquinas más antiguas/caducadas o medio de cultivo celular, o concentraciones inconsistentes de morógenos afectará la eficiencia de diferenciación. Por último, las líneas de mESC que han sido pasajes por más de 15-20 veces, parecen perder su capacidad de diferenciarse de manera eficiente.
Nuestro sistema de diferenciación permite modificaciones específicas. Cxcr4 se puede utilizar como un único marcador de CPC SHF en líneas mESC sin un reportero fluorescente. Sin embargo, los investigadores todavía deben optimizar el protocolo de diferenciación para aumentar el porcentaje de CPC Isl1+ antes de clasificar Cxcr4+ vs Cxcr4- CPC25. Además, Activin A puede sustituirse por agonistas/activadores canónicos de Wnt como Wnt3a o CHIR99021 (inhibidor GSK3b) para aumentar aún más la especificación de los CPC SHF25.
Este protocolo permite el estudio de la especificación CPC utilizando condiciones bien definidas, monitoreo de lapso de tiempo y números sin restricciones de celdas. Por lo tanto, es más fácil, eficiente y menos costoso en comparación con el análisis de embriones. Sin embargo, sigue siendo un sistema in vitro en el que los valores absolutos de expresión génica de los CPC específicos del campo cardíaco pueden no estar estrechamente correlacionados con los niveles de expresión génica in vivo. Por lo tanto, en nuestro sistema, sólo BMP4 podría especificar CPC de ambos campos cardíacos y puede alterar significativamente sus respectivas proporciones. Además, puede existir variabilidad con respecto a las eficiencias de diferenciación.
En conclusión, utilizando líneas de reporteros fluorescentes mESC o inmunomanchación de proteínas de membrana celular, recapitulamos cardiogénesis in vitro y cPC específicas del campo cardíaco aislado. Esto permite el estudio de señales tempranas que median la especificación de CPC y las propiedades funcionales, así como el modelado de enfermedades cardíacas congénitas específicas del campo cardíaco/cámara.
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Disclosures
Los autores no tienen nada para las revelaciones.
Acknowledgments
E. T. fue apoyado por The Magic That Matters y AHA. C. K. fue apoyado por las concesiones de NICHD/NIH (R01HD086026), AHA y MSCRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
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