Summary
Bu yöntemin amacı, progenitör hücre spesifikasyonu ve fonksiyonel özelliklerini incelemek ve kalp hastalığı modelleme için oda spesifik kardiyak hücreler oluşturmak için, in vitro kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücreleri oluşturmadır.
Abstract
Pluripotent kök hücreleri kalp gelişimi ve hastalık ve rejeneratif tıp anlamak için büyük bir potansiyel sunuyor. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, pluripotent kök hücrelerinden kardiyak hücreler üretmeye yol açtı, Eğer iki kardiyak alan-ilk ve ikinci kalp alanları (FHF ve SHF) — pluripotent kök hücreler sistemlerinde indüklenir. Bunu ele almak için, In vitro spesifikasyon ve kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir protokol oluşturacağız. Hcn4-GFP ve Tbx1-CRE taşıyan embriyonik kök hücre hatları kullandık; FHF ve SHF 'nin Rosa-RFP gazetecileri, sırasıyla ve hücre membranı protein Cxcr4, bir SHF Marker canlı hücre immün boyama. Bu yaklaşım ile, biz fonksiyonel özellikleri ve onların in vivo karşı transkriptom özetlemek progenitör hücreler oluşturuldu. Protokollerimiz, iki kalp alanlarının erken spesifikasyonları ve ayrım çalışması için ve kalp hastalığı modelleme için odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için kullanılabilir. Bu bir in vitro nevuslardır sistemi olduğundan, hassas anatomik bilgiler sağlayamayabilir. Ancak, bu sistem gastrülasyon-aşama embriyoları kötü erişilebilirlik üstesinden gelir ve yüksek verim ekranlar için ölçeklendirilebilir.
Introduction
Pluripotent kök hücrelerinin kullanımı (PSC 'ler) kardiyak rejenerasyon ve kişisel tıp alanında hastalık modelleme ve ilaç terapileri için hasta spesifik miyositlerle devrim yarattı1,2,3, 4. daha yakın zamanda, atriyal vs ventriküler üretimi için in vitro protokoller ve pacemaker gibi PSC türevi kardiyomiyositler geliştirilmiştir5,6. Bununla birlikte, kardiyogenezinin kardiyak gelişimi incelemek ve daha sonra ventriküler odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için yeniden oluşturulabilir olup olmadığı hala belirsiz.
Erken embriyonik gelişim sırasında, BMP4 gibi salgılanmış morfojenlerin etkisi altında Mezodermal hücreler, Wnts ve Activin A form ilkel çizgi7. Mesp1 ifadesi ile işaretlenmiş kardiyak Mezodermal hücreler, kalp hilal ve sonra ilkel kalp tüpü7,8oluşturmak için anteriora ve latterly göç. Bu göç grubu hücre kalp progenitör hücrelerin iki çok farklı nüfus içerir (TBM), yani ilk ve ikinci kalp alanı (FHF ve SHF)9,10. SHF hücreleri yüksek proliferatif ve göç ve öncelikle uzama ve kalp tüpü döngü sorumludur. Ayrıca, SHF hücreleri kardiyomiyositler ayırt, fibroblastlar, düz kas ve endotel hücreler onlar sağ ventrikül oluşturmak için kalp tüpü girerken, sağ ventriküler çıkış yolu ve hem Atria büyük parçası7,10. Buna karşılık, FHF hücreleri daha az proliferatif ve göç ve onlar sol ventrikül ve Atria11daha küçük bir kısmı yükselmesine gibi kardiyomiyositler çoğunlukla ayırt. Ayrıca, SHF ataları Tbx1, FGF8, FGF10 ve Six2 ifadesiyle işaretlenmiş iken FHF hücreleri Express Hcn4 ve Tbx511, 12,13,14,15.
PSC 'ler üç germ katmanını ve daha sonra vücudun4,16' daki herhangi bir hücre tipine ayırt edebilir. Bu nedenle, kalp gelişimini anlamak ve konjenital kalp hastalığı ile sonuçlanan spesifik gelişimsel kusurları modelleme için muazzam bir potansiyel sunuyoruz, Doğum kusurlarının en sık nedeni17. Konjenital kalp hastalığının büyük bir alt grubu, Odaya özgü kardiyak anormallikleri içerir18,19. Ancak, hala bu anormalli kalp alanı gelişimi kaynaklanan olup olmadığını belirsiz. Buna ek olarak, kardiyomiyositlerin doğumdan sonra proliferasyon yetersizlik göz önüne alındığında, kalp rejenerasyonu için kardiyak doku oluşturmak için geniş çaba olmuştur1,7,20. Kardiyak Odalar arasındaki fizyolojik ve morfolojik farklılıkları göz önünde bulundurarak, PSC 'leri kullanarak odaya özgü kalp dokusu üretme önemli bir öneme sahiptir. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, PSC 'lerde iki kalp alanlarının indüklenmiş olması durumunda, hala belirsizdir.
İn vitro kardiyogenezi ve TBM 'lerin spesifikasyonunu ve özelliklerini incelemek için, daha önce PSC 'den türeyen kardiyak küre21,22,23,24farklılaşmasına dayanan bir sistem kullandık. Son zamanlarda, FHF geni Hcn4 ve SHF geni Tbx1 kontrolü altında GFP ve RFP muhabirleri ile fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) ürettik (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro farklılaşmış mescs, Gfp + ve RFP + hücrelerinin iki farklı mezodermal hücre alanlarından ortaya çıktığı ve tamamlayıcı bir şekilde desenli kardiyak kürler oluşturdu. Elde edilen GFP + ve RFP + hücreleri, sırasıyla RNA sıralaması ve klonal analizler ile belirlenen FHF ve SHF özelliklerini sergiledi. Önemlisi, Isl1-RFP muhabiri (mESCIsl1-RFP) taşıyan mescs kullanarak, BIZ SHF hücrelerinin sadakatle hücre yüzeyı protein CXCR4 tarafından işaretlenmiş olduğunu keşfetti ve bu transgenes olmadan kalp alanına özgü hücrelerin yalıtım etkinleştirebilirsiniz. Mevcut protokol, odağa özel kalp hastalığının incelenmesi için değerli bir araç olarak hizmet veren mESCs 'den kalp alanına özgü TBM 'lerin oluşumunu ve yalıtımını tarif edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: In vitro nesil kalp alanına özgü fare kardiyak progenitör hücreler (Şekil 1).
1. fare ESCs Bakımı
- MESCs büyümeye (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-Gfp, mescIsl1-RFP)25 üzerinde 0,1% (w/v) jelatin kaplı T25 flsorlar 2i Orta (870 ml toplarlar asgari temel Orta (gmem), 100 ml fetal sığır serumu (FBS), 10 ml glutamax, 10 ml olmayan esansiyel amino asitler, 10 ml sodyum pyruvate, 3 μL Beta-mercaptoetanol, 20 μL lif (200 U/mL), 0,3 μM CHIR99021 ve 0,1 μM PD0325901).
- Hücreler% 70-80 konfluence ulaştığında, hücreleri fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile bir kez durulayın ve 1 mL tripsin ekleyerek tek hücrelere ayrılır ve 37 °C ' de 3 dak.
- Dulbecco 'nun modifiye kartal medyası 'nda (DMEM) 4 mL% 10 FBS ekleyerek tripsin nötralize edilir. Otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.
- Santrifüjler ~ 3 x 105 hücreler 270 x g ve oda sıcaklığında 3 dk.
- Supernatant aspirate, 2i orta 5 ml hücreleri pelletini ve replate üzerinde 0,1% (w/v) jelatin kaplı T25 şişeler bakım için.
2. kardiyak kürler kullanarak kardiyak progenitor hücrelerin üretimi
- Santrifüjler 2,5 x 106 hücre adım 1,3 için 3 dk, 270 x g ve oda sıcaklığında.
- Süpernatant aspirate ve sfd Orta (105 hücreler/ml) 25 ml hücreleri pelletini. Denemenin ölçeğine bağlı olarak, mESC numarası buna göre ayarlanabilir.
Not: SFD Medium, Iscove 'un değiştirilmiş Dulbecco 'nun Orta (ıMDM) 715 mL 'yi içerir. 250 mL ham 's F12, 5 mL N2-Supplement, 10 mL B27 eksi A vitamini, 5 mL% 10 (w/v) BSA (PBS), 7,5 mL GlutaMAX ve 7,5 mL penisilin-streptomisin. Kullanmadan önce askorbik asit (50 mg/mL) ve 3,9 x 10-3% (v/v) monothioglycerol ekleyin. - Hücre süspansiyonunu 1 150 mm x 25 mm Steril plakaya yerleştirin ve 48 h için% 5 CO2 kuluçk Içinde 37 °c ' de Inkük. kardiyak kürler 24 saat içinde oluşturulmalıdır.
- Tüm oluşturulan kardiyak kürleri toplayın ve 145 x g ve oda sıcaklığında seçici olarak küroidler izole ve tek hücrelerden kaçınmak için 3 dakika santrifüjler.
- Süpernatant aspirate ve reuspend, 25 ml sfd orta ile 1 ng/ml activin A ve 1,5 ng/ml BMP4 farklılaşma indüksiyon için. Aynı 150 mm x 25mm steril plakalı kürleri plakaya koyun ve 40 h için% 5 CO2 kuluçk Içinde 37 °c ' de onları inkük.
Not: Farklı aktif Aktiin A (0-3 ng/mL) ve BMP4 (0.5-2 ng/mL), mESC hattına bağlı olarak farklılaşma optimizasyonu için kullanılabilir. - 145 x g ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca tüm kardiyak kürler ve santrifüjleri toplayın.
- Süpernatant aspirate ve sfd orta 25 ml içinde kürler pelletini. Son derece düşük bir ek 75 cm2 Flask içinde resuspended EBs aktarın ve 48 h için% 5 Co2 Kuluçk 37 °c ' de onları inkük.
3. floresan muhabirleri kullanarak kalp alanı spesifik kardiyak progenitor hücrelerin yalıtım
- 145 x g 'de santrifüjli kardiyak kürler ve 3DK için oda sıcaklığı ve supernatant Aspire. 1 mL tripsin ekleyin ve 37 °C ' de 3 dakika boyunca kuluçk yapın. hücreleri ayırmak için pipetleme ile iyi karıştırın.
- Trypsin inaktive ve pipetleme ile iyi karıştırın DMEM içinde% 10 FBS 4 mL ekleyin. Kesilmeyen EBs kaldırmak için, 70 mm süzgeç kullanarak karışımı filtre ve 270 x g ve oda sıcaklığında 3 dakika için filtrelenmiş hücreleri Santrifüjü.
- Floresan muhabirleri taşıyan TBM 'Leri sıralamak için (TBM 'lerinTbx1-CRE ' d e r; Rosa-RFP; HCN4-Gfp), süpernatant Aspire ve eklemek 500 μL FACS sıralama çözeltisi (1% (v/v) FBS, 200 mm HEPES ve 10 mm EDTA içinde PBS) yeniden resuspend için.
- Sıralamadan önce tüm hücre kümelerini kaldırmak için, 40 μm hücreli süzgeç ile 5 mL polistiren yuvarlak alt tüpü kullanarak hücreleri tekrar filtreleyin. Hücreleri sıralamaya kadar buzda tutun.
- Tbx1-CRE yalıtmak için hücreleri Sırala; Floralı aktif hücre sıralayıcısı (FACS) kullanarak Rosa-RFP ve HCN4-GFP pozitif TBM 'Ler. Sıralanmış hücreleri 1 mL FBS 'de toplayın. Hücre örneğini ve sıralı hücreleri 4 °C ' de tutun.
4. hücre yüzeyi protein Marker olarak Cxcr4 kullanarak kalp alanı spesifik kardiyak progenitor hücrelerin yalıtım
- İlk vs ikinci kalp alanı TBM 'Leri yüzey proteini reseptörü Cxcr4 ifadesine göre izole etmek için mESCIsl1-RFPhattını kullanın. Adım 3,3 süpernatant aspirate ve 1:200 (Vol/Vol) percp-efluor 710 konjuate Anti-Cxcr4 antikor içeren PBS içinde 300 μL% 10 FBS tek TBM 'leri pelletini.
- 5dk için oda sıcaklığında inküye ve 1-2 mL soğuk PBS ekleyerek yıkayın. 270 x g ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca tek TBM 'leri santrifüjler ve santrifüj sonrasında iki kez daha yıkayın.
- Süpernatant aspirate ve eklemek 500 μL FACS sıralama çözüm tek TBM ve filtre olarak adım 3,4 yeniden pelletini için.
- FACS kullanarak Cxcr4 + ve Cxcr4-hücrelerini yalıtın. Sıralanmış hücreleri 1 mL FBS 'de toplayın. Hücre örneğini ve sıralı hücreleri 4 °C ' de tutun.
5. Izole kalp alanı spesifik kardiyak progenitor hücrelerinin Analizi
- Santrifüjler 270 x g ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca TBM sıralanmış. Sıralı hücreler gen ve protein ifadesi analizleri için kullanılabilir ya da daha sonra analiz için geri alınabilir.
- Yeniden kültür yalıtılmış TBM 'ler için, supernatant Aspire, SFD orta ve replate hücreleri pelletini ~ 3 x 104 hücreleri iyi başına bir 384-iyi plaka ile kaplı 0,1% (w/v) jelatin. Artan hücre ölümü sıralamadan sonra belirtildiği takdirde, örneğe 10 μM Y-27632 (kaya inhibitörü) ekleyin. Retarım sonrası iki gün, spontan dayak unutulmamalıdır.
- Kaplama TBM 'lerin kardiyomiyositlere ayırt edilmesini analiz etmek için, hücreleri ayırt etmek için 12 gün içinde toplayın. Tek CMS yalıtmak için 1,2-1.5 adımda açıklandığı gibi tripsin kullanın. hücreleri% 4 (w/v) civarında formaldehite (PFA) olarak resuspend ve hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kulvarın.
- Hücreleri 3 dk 895 x gve oda sıcaklığında santrifüjler. PFA yıkamak için süpernatant aspirate ve PBS hücreleri pelletini. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Süpernatant aspirate ve PBS içinde% 10 FBS hücreleri pelletini. Fare Anti-Troponin T antikor (1:500) ile hücre örneğinin yarısını Inkük ve numunenin geri kalanını negatif kontrol olarak kullanın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
- PBS kullanarak 5,4 adımda açıklandığı gibi hücreleri iki kez yıkayın. 1:500 eşek Anti-fare IgG (H + L) ikincil antikor, Alexa Fluor 647 Conjugate ile PBS 'de% 10 FBS içinde süpernatant ve pelletini her iki hücre örnekleri aspirate. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
- 5,6 adımda PBS ile iki kez yıkayın. Süpernatant aspirate ve PBS 200 μL hücreleri pelletini. Hücreleri analiz etmek için bir akış sitometresi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yaklaşık 132 farklılaşma sonrasında Tbx1-RFP ve Hcn4-GFP TBM 'Ler floresan mikroskop kullanılarak tespit edilebilir (Şekil 2). Genellikle, GFP ve RFP hücreleri yaklaşık olarak aynı anda görünür. TBM 'lerin iki nüfusu yakın ve yaygın olarak tamamlayıcı bir desen genişletmek için devam ediyor. Activin A ve BMP4 konsantrasyonlarını ayarlamak FHF vs SHF TBM 'lerin yüzdeleri değiştirir (Şekil 3). TBM belirtimi içinde vitro öncelikle BMP4 konsantrasyonu tarafından belirlenir. Bu nedenle, kardiyak küroid sistemimiz CPC spesifikasyonunu incelemek için kullanılabilir.
Benzer şekilde Isl1-RFP Reporter mESC satırını kullanarak, 132 sonra farklılaşma, Isl1-RFP + TBM 'Ler görünür. CXCR4, Isl1-RFP +, Cxcr4 + vs Isl1-RFP + için TBM 'lerin immünosterinden sonra Cxcr4-hücreler izole edilebilir (Şekil 4).
MESC türevi TBM 'lerin kardiyomiyositlere ayırt edilmesi yeteneğini analiz etmek için, kardiyak troponin T için immünostasyon 12 gün içerisinde farklılaşma yapılabilir. FHF hücrelerinin ağırlıklı olarak miyositlere ayırt edilen model ile anlaşmada, Hcn4-GFP + TBM 'den elde edilen hücreler ağırlıklı olarak myogenik (Şekil 5A, B). Benzer şekilde, Isl1 + ' dan türetilen hücreler, CXCR4-TBM 'Ler Ayrıca Isl1 +, CXCR4-TBM (Şekil 5C) ile karşılaştırıldığında çok daha yüksek yüzdeler kardiyomiyositlere yol verir.
Bazen, mESCs verimli bir şekilde ayırt etmek ve çok düşük sayılar kalp alana özgü TBM 'Leri oluşturmak için başarısız (Şekil 6).
Şekil 1 : Kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücrelerinin in vitro spesifikasyonunun şematik gösterimi. 48 h içinde mESCs formu kürler. Sonra activin A ve 40 için BMP4 h Mezodermal indüksiyon yol açacaktır. Kardiyak progenitör hücreler yaklaşık 36 h daha sonra gelişir. İkinci veya ilk kalp alanı progenitors floresan aktif hücre sıralama kullanılarak sıralanabilir. İkinci kalp alanı hücreleri Hcn4-GFP tarafından işaretlenmiş Tbx1-RFP ifadesi vs ilk kalp alanı ile işaretlenir. Alternatif olarak, Isl1-RFP, TBM 'Leri işaretler ve Cxcr4 bir karşı canlı immünostaneyi kullanarak Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-TBM 'Lerini ikinci vs ilk kalp alanı hücrelerini temsil eden sırasıyla sıralayabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : TBM belirtiminden sonra kardiyak kürlerin temsili görüntüsü. RFP işaretleri Tbx1 + ve GFP Hcn4 + TBM işaretleri. İki hücre nüfusu, ücretsiz bir desenle yakın bir konumda kurulmuştur. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Farklı aktiin konsantrasyonlarına maruz kaldıktan sonra kardiyak kürlerin akış cytometrik Analizi ve BMP4. İki morfojenlerin konsantrasyonlarını ayarlamak, Tbx1 + ve Hcn4 + TBM 'lerin farklı yüzdeleri için yol açar. İki nüfus özellikle BMP4 konsantrasyonu ayarlayarak etkilenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Isl1 ifade eden kardiyak progenitör hücrelerin akış cytometrik Analizi ve Cxcr4 için immünostülleşmiş. Kardiyak projenler ilk olarak Isl1 ifadesine dayanarak ve sonra Isl1 +, Cxcr4 + vs Isl1 +, Cxcr4-hücreler sıralanmış. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Kardiyak troponin T için lekelenmiş kalp tarlası spesifik TBM 'lerden elde edilen hücrelerin akış cytometrik analizi. (A) FHF hücrelerinin yüksek miyojenik potansiyeli ile tutarlı, HCN4-Gfp + hücrelerin yüksek bir yüzdesi miyositlere ayırt. (B) büyük çoğunluğun HCN4-Gfp + olduğu tüm mesc türevi kardiyomiyositlerin analizi. (C) Cxcr4-TBM 'ler kardiyomiyositlerin daha yüksek bir yüzdesini ayırt eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Başarısız/düşük verimlilik in vitro farklılaşmaların temsilcilik cytometrik analizleri. (A) HCN4-Gfp hücrelerinin hiçbir oluşumu ve TBX1-RFP + hücrelerinin çok düşük bir yüzdesi gösteren farklılaşma 132 h sonra akış cytometri analizi. (B) Isl1 çok düşük seviyeleri Ifade eden mescs düşük farklılaşma verimliliği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolimizde, kalp kürleri ve izole kalp alanına özgü TBM 'Ler oluşturmak için bir metodoloji tarif ediyoruz. Bunlar, TBM spesifikasyonlarının mekanizmaları ve özelliklerinin yanı sıra kardiyak odasına özel hastalık modelleme için de kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir çalışma, iki floresan muhabiriyle (Mef2c/nkx 2.5) bir mESC hattı kullanmış ve kardiyogenezi in vitro olarak incelemek için, her iki işaretçinin de kardiyomiyositler zaten26meydana geldiğinde embriyonik gün 9.5-10 olarak ifade edilir. Bizim bilginiz için, şu anda kalp tarlası özel TBM 'Ler in vitro yalıtım için hiçbir yöntem vardır. Daha da önemlisi, bizim protokol de insan kök hücrelerine uygulanabilir, burada CXCR4 Isl125yüksek seviyeleri ifade SHF TBM yalıtmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, bizim çift, floresan muhabir mESC hattı bileşikleri ve kalp alanı spesifikasyonları veya TBM Hücre polaritesi etkileyebilir transkripsiyon faktörleri kütüphaneleri ekran için kullanılabilir.
Protokoldeki kritik adımlardan biri, mESCs başlangıç sayısıdır. Düşük veya yüksek sayılar kullanarak kalp kürleri ve farklılaşma verimliliği boyutunu önemli ölçüde etkileyecektir. Farklı mESC hatları için farklı hücre numaralarını (7.5-10 x 104 hücreler/ml) test etmenizi öneririz. Alternatif olarak, kalp küreleri boyutu önemli ölçüde değişken kalırsa, belirtilen boyutta mikro kuyular içeren plakalar da yeniden üretilebilirliğini artırmak için kullanılabilir. Müfettişlerin de belirli zamanlama ve Mezodermal indüksiyon süresi yanı sıra hücre sıralama zamanlaması dikkatli olmalıdır. Dahası, farklı mESC hatları için, morphogen konsantrasyonlarının optimizasyonu kardiyak küreler içinde TBM üretmek için yeteneklerini test etmeden önce gerçekleştirilmesi gerekir. Eski/süresi dolmuş sitokinlerin veya hücre kültürü ortamının veya tutarsız konsantrasyonlarda morfojenlerin kullanımı farklılaşma verimliliğini etkileyecektir. Son olarak, fazla ~ 15-20 kez paslanmış olan mESC hatları, verimli bir şekilde ayırt etme yeteneğini kaybetmek gibi görünüyor.
Farklılaşma sistemimiz belirli değişikliklere izin verir. Cxcr4, floresan muhabiri olmadan mESC satırlarında SHF TBM 'lerin tek Marker olarak kullanılabilir. Ancak, müfettişlerin Cxcr4 + vs Cxcr4-CPCs25sıralamadan önce Isl1 + TBM yüzdesini artırmak için farklılaşma protokolünü iyileştirmesi gerekir. Buna ek olarak, Activin A, Wnt3a veya CHIR99021 (GSK3b inhibitörü) gibi kurallı WNT agonistleri/aktibeyleri ile yerine olabilir SHF CPCs25spesifikasyonunu artırmak için.
Bu protokol, iyi tanımlanmış koşullar, zaman atlamalı izleme ve sınırsız sayıda hücre kullanarak TBM belirtiminin incelenmesi sağlar. Bu nedenle, embriyoları analiz etmek için daha etkili, verimli ve daha az pahalıdır. Yine de, kalp alanı spesifik TBM 'lerin mutlak gen ifade değerlerinin, in vivo gen ifade düzeyleriyle sıkıca ilişkilendiremediği bir in vitro sistemdir. Böylece, bizim sistemde, sadece BMP4 her iki kalp alanlarından TBM belirtebilir ve önemli ölçüde ilgili oranlarını değiştirebilir. Ayrıca, farklılaşma verimlilikleri ile ilgili değişkenlik de bulunabilir.
Sonuç olarak, mESC floresan muhabiri hatları veya hücre membranı proteinlerinin immunostasyon kullanarak, kardiyogenezi in vitro ve izole kalp alana özgü TBM 'Leri reapitüle. Bu, TBM Şartnamesi ve fonksiyonel özelliklerin yanı sıra kalp alanı/odaya özgü konjenital kardiyak hastalıkların modellenmesi için erken sinyallerin incelenmesi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, açıklamalar için hiçbir şey yok.
Acknowledgments
E. T. Magic this Matters ve AHA tarafından desteklenmektedir. C. K. NICHD/NıH (R01HD086026), AHA ve MSCRF tarafından hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100x Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1x PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25 mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
