Summary
这里介绍的是使用生物素标签的体外生化测定方案,可广泛用于研究蛋白质-核酸相互作用。
Abstract
蛋白质-核酸相互作用在生物过程(如转录、重组和RNA代谢)中起着重要作用。研究蛋白质-核酸相互作用的实验方法需要使用荧光标记、放射性同位素或其他标签来检测和分析特定的目标分子。Biotin 是一种非放射性核酸标签,通常用于电泳移动转移测定 (EMSA),但一直没有定期用于监测核酸过程中的蛋白质活性。该协议说明了生物锡标签在体外酶反应过程中的效用,证明该标签与一系列不同的生化测定有效。具体来说,根据之前使用放射性同位素32P标记基质的发现,通过生物素标记EMSA确认MEIOB(一种专门参与美智重组的蛋白质)是一种DNA结合蛋白,即MOV10(一种RNA合壳)可解析生物素标记的RNA双工结构,而MEIOB可使生物素标记的单链DNA。研究表明,生物素能够在体外各种核酸相关生化检测中替代32P。
Introduction
蛋白质-核酸相互作用涉及许多重要的细胞过程,如DNA修复、复制、转录、RNA处理和翻译。蛋白质与染色质内特定DNA序列的相互作用是严格控制转录级别1的基因表达所必需的。对大量编码和非编码RNA的精确转录后调节需要任何蛋白质和RNA2之间广泛而复杂的相互作用。这些基因表达调控机制层包括一系列动态的分子间事件,通过转录/表观遗传因子或RNA结合蛋白与其核酸靶点的相互作用以及核酸靶点进行协调。蛋白质-蛋白质相互作用。为了解剖体内的蛋白质是否与核酸直接或间接相关,以及这种关联是如何发生和达到高潮的,进行体外生化测定,以检查相关蛋白质的结合亲和力或酶活性。设计DNA和/或RNA的基质。
已经开发了许多技术来检测和表征核酸-蛋白质复合物,包括电泳移动移位测定(EMSA),也称为凝胶缓动测定或带移检测3、4、5.EMSA 是一种多功能、灵敏的生化方法,广泛用于研究蛋白质与核酸的直接结合。EMSA依靠凝胶电泳带的变化,通常使用化学发光来检测生物素标签6,7,荧光素标签8,9的荧光,或通过放射性32P标签的自动辐射标签10,11。生化研究的其他用途是鉴定和表征蛋白质的核酸处理活性,如核酸反应,以评估核酸基质的裂解产物12,13,14和DNA/RNA结构展开测定,以评估赫利箱活性15,16,17。
在这种酶活性测定中,放射性同位素标记或荧光素标记的核酸由于其高灵敏度,经常被用作基质。对涉及32个P标记放射性追踪器的酶反应的放射图分析发现是敏感和可重复的18。然而,在世界上越来越多的实验室中,放射性同位素的使用受到限制甚至被禁止,因为与潜在接触相关的健康风险。除了生物安全问题外,其他缺点是使用放射性同位素工作所需的设备、所需的放射性许可证、32 P 的短半寿命(约 14天),以及探测器质量因无线电辐射。因此,开发了替代非同位素方法(即用荧光光对探针标记探头,通过荧光成像19进行检测)。但是,使用荧光标记的探头时,需要高分辨率成像系统。生物素是一种常用的标签,很容易与蛋白质和核酸等生物大分子结合。生物链球菌系统高效运行,提高了检测灵敏度,同时不增加非特异性背景20,21。除EMSA外,生物锡还广泛用于蛋白质纯化和RNA下拉,包括22、23、24。
该协议成功地使用生物素标记的核酸作为包括EMSA的体外生化检测的基质,此外还有未普遍使用的酶反应。MEIOB OB域被构造,两个突变体(截流和点突变)表示为GST融合蛋白25,26,27,以及小鼠MOV10重组FLAG融合蛋白16。本报告强调了这种用于蛋白质纯化和生物锡标记检测的合并方案的有效性,用于其他实验目的。
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Protocol
1. 蛋白质制备
- MEIOB 和 MOV10 表达式构造
- 生成 cDNA 表达式构造编码小鼠 MEIOB-A、C 和 E (图 1A) 和 MOV10。
- 设置每个片段的聚合酶链反应 (PCR) 反应。在最终组合 1 μL 小鼠 cDNA(来自 C57BL/6 小鼠睾注)、1 μL dNTP、2 μL 10 μM 正向底漆、2 μL 10 μM 反向底漆、1 μL DNA 聚合酶、25 μL 2x PCR 缓冲液和 18 μL 双蒸馏 H2O (ddH2O)体积为 50 μL。
注:表1列出了梅奥布和Mov10基因片段扩增的引物。 - 使用以下程序执行 PCR 反应:95 °C 为 5 分钟,35 循环在 95°C 加热 15 秒,在 64°C 下退火 15 秒,在 72°C 下延长 20 秒(2 分钟用于延长全长 MOV10),在 68°C 下进行最终扩展 7 分钟。
注: 使用引物对 MEIOB-E (F1) 和 MEIOB-E-mut (R1) 和 MEIOB-E-Mut (F2) 和 MEIOB-E (R2) 放大两个段,分别放大 3' 和 5' 末端重叠序列中的突变序列,以生成突变 PCR 模板。
- 设置每个片段的聚合酶链反应 (PCR) 反应。在最终组合 1 μL 小鼠 cDNA(来自 C57BL/6 小鼠睾注)、1 μL dNTP、2 μL 10 μM 正向底漆、2 μL 10 μM 反向底漆、1 μL DNA 聚合酶、25 μL 2x PCR 缓冲液和 18 μL 双蒸馏 H2O (ddH2O)体积为 50 μL。
- 通过凝胶电泳分析扩增的PCR DNA,在紫外线灯下快速切断凝胶所需尺寸的带状物,并放入离心管中。
注:在MEIOB-A的角胶凝胶上可见的预期产品尺寸为536 bp,MEIOB-C为296 bp,MEIOB-E为312 bp和229 bp,MOV10为3015 bp。 - 按照制造商的协议,使用凝胶提取试剂盒纯化 PCR DNA。
- 从步骤1.1.2向离心管中加入同等体积的溶解缓冲液,在50-55°C水浴中熔化凝胶5-10分钟,确保凝胶片完全熔化。离心短暂,从管壁收集任何液滴。
注:凝胶和溶解缓冲液的质量/体积浓度为1mg/μL。 - 将吸附柱放入收集管中,将含有溶解凝胶片段的溶液转移到吸附柱,并在12,000 x g下离心2分钟。
- 丢弃收集管底部的滤液。将600 μL的洗涤缓冲液加入柱子,在12,000 x g下离心1分钟,然后丢弃滤液。
- 重复步骤 1.1.3.3 一次。
- 将柱子放回收集管中,在 12,000 x g下离心 2 分钟,以去除所有剩余的洗涤缓冲液。
- 将吸附柱放入1.5 mL灭菌的离心管中,在吸附柱中心加入50μL的ddH2O,并在12,000 x g下离心1分钟。使用分光光度计测量洗脱液的DNA浓度。
- 从步骤1.1.2向离心管中加入同等体积的溶解缓冲液,在50-55°C水浴中熔化凝胶5-10分钟,确保凝胶片完全熔化。离心短暂,从管壁收集任何液滴。
- 限制质粒消化
- 文摘 pGEX-4T-1 载体与 BamHI 和 NotI。为此,将 4 μg pGEX-4T-1 载体、5 μL 10x 消化缓冲液、1 μL BamHI 和 1 μL NotI 和 ddH2O 混合到 50 μL 的最终反应体积。在37°C孵育2小时。
- 将4μg的pRK5载体、5μL的10x消化缓冲液、1μL的BamHI和1μL的XhoI和dH2O混合到50μL的最终反应体积,用BamHI和XhoI消化pRK5载体。在37°C孵育2小时。
- 通过凝胶电泳分析载体DNA,用外光灯下的手术刀快速从凝胶中切割所需尺寸带,并将其放入离心管中。
- 按照制造商的指示,使用凝胶提取试剂盒将载体 DNA 纯化为 1.1.3。
注:线性质粒的长度:pGEX-4T-1,4.4 kb;pRK5, 4.7 kb. - 在10μL的最终反应体积中,结合线性化载体的0.03pmol、cDNA片段的0.06pmol、2μL的利带和4μL的5倍加带酶缓冲液和ddH2O,建立标准重组结扎反应。
注:将MEIOB-A、C和E克隆成pGEX-4T-1矢量,将MOV10克隆成pRK5矢量。 - 在37°C下孵育混合物30分钟,然后在冰上立即冷却反应5分钟。将MEIOB重组质粒转化为BL21细菌,将MOV10重组质粒转化为DH5+细菌。
注:通过桑格排序验证所有重组构造。 - 通过在液体培养物中加入相等体积的50%甘油,制备含有经验证重组质粒的细菌培养物的甘油,并储存在-80°C。
注:对于随后的每个实验,将甘油库存中的细菌分到新鲜的琼脂板上,并使用单个菌群进行扩展,如步骤 1.2 中所述。
- 生成 cDNA 表达式构造编码小鼠 MEIOB-A、C 和 E (图 1A) 和 MOV10。
- 来自细菌的MEIOB蛋白提取物
- 选择每个BL21菌株的一个菌群,用空或重组的pGEX-4T-1质粒转染,通过测序验证,在含有100μg/mL氨基青霉素的3mL LB中接种。在 37°C 下生长过夜,在 220 rpm 下摇动。
- 从 3 mL 隔夜培养基(从步骤 1.2.1 起)接种含有 100 μg/mL 的阿霉素的 300 mL LB。在 37°C 下摇动 2 小时,直到 OD600达到 0.5-1.0,在 37°C 下生长培养物。
- 通过在0.2 mM的最终浓度中加入等丙基β-D-硫丙酮(IPTG)来诱导蛋白质表达。在 180 rpm 和 18°C 下摇动,再孵育培养物 3 小时。
- 在3,500 x g和4°C下将细菌培养物离心20分钟。
- 在20 mL的冰冷的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)缓冲液中重新悬浮颗粒。在短时间10s的爆裂中,在冰上将细菌悬浮液悬浮25次(输出功率20%)然后是2-3在冰上休息。
- 在12,000 x g和4°C下将液管离心15分钟。将所有上清液转移到新鲜管中。
- 预洗珠。
- 将300 μL的谷胱甘肽-塞帕松珠加入新鲜的15 mL管中,用10 mL的冰冷的PBS缓冲液清洗珠子。
- 在 750 x g和 4 °C 下离心 1 分钟,将珠子颗粒掉并丢弃洗涤液。
- 将解毒剂加入洗涤的珠子中,在4°C下孵育2小时,在750 x g和4°C下离心1分钟,将珠子颗粒化。在 10 mL 的冷冷 PBS 8x 中冲洗珠子。
- 用1 mL的洗脱缓冲液(pH 8.0 时在50 mM Tris-HCl中加入10 mM谷胱甘肽)6倍,在每个洗脱步骤前在4°C孵育10分钟。在 750 x g 和 4 °C 下离心 1 分钟,以颗粒珠子。收集并汇集 6 个分数。
- 将洗脱的蛋白质转移到离心过滤器中,并在7,500 x g下通过离心浓缩,以获得100-200 μL的最终体积。
- 来自HEK293T细胞的MOV10蛋白质提取物
- 在培养的HEK293T细胞中瞬时表达MOV10蛋白。
- 以浓度 >500 纳克/μL为单位制备 MOV10-pRK5 质粒。
- 种子 HEK293T 细胞在 15 厘米菜。当细胞密度达到+70%-90%时,用含有10%胎儿牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素的新鲜Dulbeco的改性鹰培养基(DMEM)取代细胞培养基。
- 对于一个转染,在减少的血清介质的3 mL中稀释60μg的MOV10-pRK5质粒DNA,然后加入120μL的转染增强剂试剂,并混合均匀。
- 在单独的管中稀释90μL的转染试剂与3mL的减少血清介质(不含青霉素-链霉素),并混合良好。
- 将稀释后的DNA加入稀释转染试剂的每个管中。在室温下孵育15分钟。
- 将转染混合物添加到细胞培养中,将培养细胞加入+36-48 h。
- 36-48小时后,在50 mL管中从每个板中收集细胞。在 500 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。用10 mL的冰冷的PBS清洗每粒细胞,并在4°C下以500 x g离心收集细胞5分钟。
- 在含有完全乙二胺四乙酸(EDTA)的无蛋白酶抑制剂鸡尾酒的3 mL细胞裂解缓冲液中重新悬浮颗粒。在冰上孵育30分钟。在20,000 x g和4°C下离心20分钟。
- 在1.5 mL管中每盘细胞加入100μL的抗FLAG磁珠。
- 用 K150 缓冲液清洗磁珠 2 倍(pH 7.5,150 mM KoAc,1 mM DTT,0.1% NP-40 时为 50 mM HEPES)。
- 在 1 mL 的冷冷 K150 缓冲液中重新悬浮磁珠。
- 在 4°C 下孵育磁珠 2 分钟,轻轻旋转,借助磁铁对磁珠进行颗粒。拆下并丢弃上清液。
- 从步骤1.3.3将磁珠加入细胞解液上清液中,在4°C孵育2小时。
- 用K150缓冲液清洗蛋白质结合磁珠3倍,然后用含有250 mM NaCl的K150清洗2倍,然后用K150缓冲液清洗3倍,为1.3.5。
- 在 FLAG 洗脱缓冲液的 300 μL 中重新悬浮珠子(100 mM NaCl,20 mM Tris-HCl,pH 7.5,5 mM MgCl2, 10% 甘油),将 FLAG 肽添加到 0.5 μg/μL 的最终浓度中,并在 4 °C 的旋转器上用珠子孵育 1 小时,然后用磁铁来颗粒磁珠。
- 收集含有洗脱MOV10蛋白的上清液,确定浓度,并储存在-80°C供将来使用。
- 在培养的HEK293T细胞中瞬时表达MOV10蛋白。
2. 核酸制备
- 从合适的来源购买DNA和RNA寡核苷酸(寡核苷酸),带或不带生物锡标签。稀释无RNase ddH2O至20 μM中的每个寡聚物,并将其保持在-80°C,以供将来使用。
注:本研究中使用的DNA/RNA基质的寡核糖核酸序列列于表2。 - 为MOV10氦壳活性测定制备以下混合物,用于MOV10氦壳活性测定:在pH 7.5、6 mM KCl、0.2 mM MgCl2和无RNase ddH 2处混合60mM N-2-羟乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酸-乙苯酸(HEPES)O 在 20 μL 的最终反应体积中 O。
- 抗性RNA寡聚物通过加热生物素标记的上链(2 μM,最终浓度)的混合物和在退火缓冲液中的1.5倍未标记互补底链(步骤2.2)在95°C下形成RNA双工,然后慢慢冷却至房间温度 (RT)。
3. 体外生化检测
- EMSA 和酶反应
- 对于 MEIOB EMSA 测定,在 pH 7.5、2 mM MgCl 2、50 mM NaCl、10 mM EDTA、2 mM 二硫二醇 (DTT)、0.01% NP-40、0.8 mM(或图 2和图3所示所示的其他相关浓度)下混合 50 mM Tris HCl,以及 10 nM生物锡标记寡核苷酸和ddH2O在20μL的最终反应体积。在RT孵育30分钟,并加入5x停止缓冲液(125 mM EDTA,50%甘油)以停止反应。
- 如步骤 3.1.1 所述,设置 MEIOB 核酸酶活性反应,但不添加 10 mM EDTA。
- 对于MOV10赫利箱活性测定, 在 pH 7.5、 20 mM KoAc、 2 mM MgCl2、 0.01% NP-40、 1 mM DTT、 2 U/μL RNase 抑制剂、 10 nM 生物素标记 RNA 基质、2 mM 腺苷三磷酸酯 (ATP)、 100 nM RNA 陷阱和 20 ng MOV10 蛋白质和 ddH c6±2O 的最终反应体积为 20 μL。在37°C下孵育反应混合物10分钟、30分钟和60分钟。加入5x停止缓冲液以停止反应。
注:RNA陷阱,一种生物锡无标记的寡聚物,与标记的寡果互补,防止未解开的dsRNA再次退火。
- 聚丙烯酰胺凝胶
- 清洗凝胶板(16 厘米 x 16 厘米)和 1.5 毫米梳子。组装凝胶电泳单元。
- 要制备10%原生聚丙烯酰胺凝胶, 混合 14 mL ddH2O,1.25 mL 10x 三氧化二甲酸-EDTA (TBE),8.3 mL 30% 丙烯酰胺,1.25 mL 50% 甘油,187.5 μL 10% 新制备的耐硫酸铵 (APS), 和 12.5 μL 的四甲基二胺(TEMED)。
- 要制备20%原生聚丙烯酰胺凝胶,混合5.5 mL的ddH2O,1.25 mL的10x TBE,1.25 mL的50%甘油,16.7 mL的30%丙烯酰胺,187.5 μL的10%APS和12.5 μL的TEMED。
- 立即将丙烯酰胺溶液倒入凝胶中,然后插入梳子。让混合物聚合约30分钟。
- 凝胶运行
- 拆下梳子,用电泳运行缓冲液(0.5x TBE)填充油箱。
- 用0.5x TBE缓冲液冲洗样品孔,然后在冰上以100V预运行凝胶30分钟。用新鲜的0.5x TBE替换正在运行的缓冲液。
- 将 20-25 μL 样品装入每个井中。
- 使用 10% 原生丙烯酰胺凝胶进行 EMSA 测定,使用 20% 原生丙烯酰胺凝胶进行酶测定。在冰浴上以100V运行电泳,直到溴酚蓝色标记物迁移到凝胶的底部。
- 拆卸凝胶板,通过移除装井和未使用的通道来修剪凝胶。将凝胶放入 0.5x TBE 缓冲液中。
- 将滤纸和尼龙膜切成凝胶大小。预湿清洁滤纸和尼龙膜。
- 组装堆栈进行传输。
- 将预湿膜放在预湿滤纸上。
- 将凝胶放在膜上。
- 用另一层预湿滤纸盖住凝胶。
- 将干净的移液器从中心滚动到边缘,清除所有气泡。
- 将样品从凝胶转移到膜在90mA的半干电泳装置中,为期20分钟。
- 停止转移,然后在新的滤纸上干燥膜 1 分钟。
- 在配备 254 nm 灯泡的紫外光交联器中,在 120 mJ/cm2的 45-60 s 下照射膜,从而将样品交叉链接(自动交联功能)。在 RT 处将膜空气干燥 30 分钟。
- 化学发光检测
- 协议1:使用标准体积的商业化学发光核酸检测试剂盒。
- 向膜中加入20 mL的阻塞缓冲液,在 20-25 rpm 的转速下在旋转器上轻轻摇动,孵育 15-30 分钟。
- 通过加入66.7 μL稳定链球菌-马萝卜过氧化物酶结合到20 mL的阻断缓冲液,制备偶联/阻断缓冲液。
- 轻轻取出阻塞缓冲器,并将其替换为偶联/阻塞缓冲器。在 20-25 rpm 转速的旋转器上孵育 15 分钟。
- 以 40-45 rpm 的转速将膜 4 倍洗涤,每次 5 分钟。
- 在膜中加入30 mL的基板平衡缓冲液。在 20-25 rpm 转速下孵育膜 5 分钟。"
- 在6 mL的稳定过氧化物溶液中加入6 mL的明醇/增强剂溶液,制备基板工作溶液。避免光线。
- 用基板工作溶液覆盖整个膜表面,孵育5分钟。
- 在化学发光成像系统中扫描膜 1-3 s。
- 协议2:使用2x稀释的商业化学发光核酸检测试剂盒,按照步骤3.10.1.1-3.10.1.8操作。
- 协议3:使用自制试剂6。
- 准备阻塞缓冲液:在pH 7.5、0.1 M M NaCl、2 mM MgCl2和 3% 牛血清白蛋白分数 V. AP 7.5 缓冲液时混合 0.1 M Tris-HCl,在 pH 7.5、0.1 M NaCl 和 2 mM MgCl2。AP 9.5 缓冲液:在 pH 9.5、0.1 M NaCl 和 50 mM MgCl2时混合 0.1 M Tris-HCl 。TE 缓冲液:在 pH 8.0 时混合 10 mM Tris-HCl,在 pH 8.0 时混合 1 mM EDTA。
- 将膜浸泡在30°C的阻滞缓冲液中1小时。
- 将8.5 μL的链球菌碱性磷酸酶加入AP 7.5缓冲液的10 mL。在RT处轻轻摇动此溶液中的膜10分钟。然后,在 AP 7.5 缓冲液的 15 mL 中清洗膜 2x 10 分钟。
- 在AP 9.5缓冲液的20 mL中再清洗膜10分钟。加入20 mL的TE缓冲液以停止反应。
- 将7.5 mL的开发溶液添加到膜上,并在化学发光成像系统中扫描膜1-3s。
- 协议1:使用标准体积的商业化学发光核酸检测试剂盒。
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Representative Results
MEIOB的蛋白质结构和本研究中使用的表达结构如图1A所示。 MEIOB 中的 OB 折叠是紧凑的桶状结构,可以识别和与单链核酸相互作用。其中一个OB域(aa 136-307,构造A)结合单绞合DNA(sSDNA),截断蛋白(aa 136-178截断,构造C)和点突变形式(R235A突变,构造E)的MEIOB没有DNA结合活性26。GST-MEIOB融合蛋白在BL21细菌中被过度表达,随后的分离步骤导致通过Coomassie蓝色染色和西方印迹分析显示的纯化蛋白(图1B)。不同浓度的核酸基板说明了生物素信号的高灵敏度,在相对较短的1-3s暴露时间后,可检测信号为1 nM寡聚糖(图2A)。野生型MEIOB-A蛋白,但不是突变的MEIOB-E和MEIOB-C蛋白,与36nt生物素标记的sSDNA基质(与先前使用的长度和序列相同)强结合(图2B),并将基质切成梯子 (图 2C)。
与图2B、C中使用的SSDNA基质相同序列的MEIOB蛋白的体外测定说明了MEIOB在36nt单链RNA(ssRNA)上的结合能力和外糖酶分活性(图3A,B).进一步定量分析MEIOB与DNA和RNA的结合活性(图3C)。此外,FLAG标记的MOV10蛋白从HEK293T细胞中纯化(图4A)。为了测量MOV10的合壳活性,设计了双工RNA(长度相同,但序列与之前使用的16相同),具有18 nt 5'悬垂(图4B)。当生物锡标记RNA双工在ATP存在的情况下用MOV10孵育时,与释放的单链生物锡标记RNA对应的下带出现,时间越来越增大,反映了MOV10作为RNA合壳的功能。最后,为了降低成本,试图优化试剂的使用,用于生物素标签的化学发光检测。结果发现,化学发光核酸检测试剂盒的两倍稀释不会对生物素-链球蛋白系统的致色敏感性产生负面影响,令人振奋的是,自制试剂几乎同样有效(图5)).
图 1: 纯化MEIOB蛋白质。(A) 本研究中使用的 MEIOB 构造的原理图表示形式 26。MEIOB 包含 OB 域。所有MEIOB结构(A、C、E)均表示为GST融合蛋白。(B) 用GST-细菌系统纯化的MEIOB蛋白的Coomassie蓝色染色和西方印迹分析。红色箭头表示纯化 MEIOB 蛋白质的位置。大约 26 KDa 的波段对应于谷胱甘肽。对于西斑点,使用抗GST抗体,稀释1:6000。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2: MEIOB-sSDNA相互作用的体外测定.(A) 不同浓度的36 nt生物锡标记sDNA的信号强度测试.(B) MEOB蛋白与生物素5'最终标记DNA基质(10%原生凝胶)结合的EMSA结果。(C) MEOB 介导的生物素 5' 最终标记 DNA 基质 (20% 原生凝胶) 的裂解。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:MEIOB-ssRNA相互作用的体外测定。(A) MEOB蛋白与生物素5'最终标记RNA基质(10%原生凝胶)结合的EMSA结果。(B) MEOB介导的生物素5'最终标记RNA基质(20%原生凝胶)的裂解。(C) DNA/RNA结合与MEIOB-A浓度的百分比的图。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:纯化MOV10蛋白及其在体外5'尾dsRNA的展开。(A) 使用FLAG-HEK293T系统纯化的MOV10蛋白的库马西蓝色染色。红色箭头表示纯化MOV10蛋白的位置。分子量约为 55 kDa 的 Coomassie 凝胶上的带对应于 FLAG 抗体中的重免疫球蛋白链 (IgG)。(B) MOV10 在 37°C 下释放 5' 尾 dsRNA,增加时间 (10, 30, 60 分钟).ssRNA = 18 nt 单链RNA,dsRNA = 54 nt 双链RNA,带 18 nt 5' 尾巴(20% 原生凝胶)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5: 替代方法的使用生物锡色原试剂s在MEIOB测定。商业标准体积:由化学发光核酸检测试剂盒指导;2 倍稀释商业体积:化学发光核酸检测试剂盒中每个缓冲液的两倍稀释,自制试剂:参见步骤3.7.3中的详细信息。请点击此处查看此图的较大版本。
表1:用于PCR扩增基因的引源梅约布和莫夫10的碎片。前引和反向引体的粗体字母是 BamHI 和 NotI 切割站点;反向底漆中的斜体粗体字母是 XhoI 切割位点;框中的粗体字母表示与点突变R235A对应的核苷酸。
表2:本工作中使用的DNA/RNA基质序列。
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Discussion
研究蛋白质-核酸相互作用对于我们理解不同生物过程背后的分子机制至关重要。例如,MEIOB是哺乳动物25、26、27中梅氏症和生育力所必需的睾度特异性蛋白质。MEIOB包含一个OB域,它与单链DNA结合,并表现出3'至5'外源酶活性26,这与其在美质重组过程中的生理相关性直接相关。作为另一个例子,MOV10是一种具有无处不在的功能的RNA型Helicase,可能与RNA二级结构16相关联。因此,MOV10显示广泛的RNA结合特性和5'至3'RNA双工展开活性16。报告上述这些蛋白质的生化活性的研究依赖于使用32P同位素来标记核酸进行体外测定。在本研究中,我们为MEIOB和MOV10函数的一系列生物素标记体外实验建立了方案。这些协议从活性蛋白的制备开始,最后以生物蛋白信号成像结束。
具体来说,根据以前的研究25,26,MEIOB蛋白在细菌中过度表达,在凝胶电泳后产生一个带有强烈Coomassie染色信号的单带。然而,当HEK293T细胞中作为FLAG标记融合蛋白过度表达时,全长度MOV10蛋白的纯化比细菌中的GST融合蛋白更有效(未显示数据)。为了获得足够纯度的蛋白质,需要比较这两个蛋白质纯化系统,以确定不同尺寸和/或特性的蛋白质最合适的方法。然后,核酸用生物素代替32P作为基质进行标记,并在检查两种蛋白质的核酸结合亲和力或核酸处理活性时获得强健的信号。然而,由于从细菌中纯化的蛋白质经常受到RNase的污染,因此很难排除在体外反应期间看到的裂解活性可能部分由污染RNase引起的可能性。具有催化活性降低(截断和点突变体)的MEIOB突变体体体检测显示RNA基质处理有重大损伤,但不能排除可能的RNase污染。在ssDNA和MOV10展开dsRNA上分别作用的MEIOB构造得到的结果与之前研究16、26中得到的结果相似。然而,MEIOB处理DNA以产生涂片,而根据实验结果,用RNA看到更离散的带状(图2C和图3B)。可能,MEIOB对DNA和RNA基质具有微分结合能力(图2B,图3A,C),导致其裂解产物的差异。MEIOB也可能以不同的方式将DNA和RNA分片。MEIOB在RNA处理中的确切作用仍有待进一步研究(例如,使用在HEK293T细胞中表达的FLAG标记融合MEIOB蛋白)。
生物素标记的核酸探针优于32个P标记探针,因为它们不需要特定的保护和废物处理。其次,生物素标记探针可在-20°C下稳定保存至少1年,而32个P标记探头只能持续2周。因此,同一批生物素标记的核酸可以长期使用,保持实验的可重复性。最后,放射性探测器的快速自辐射可能依赖于昂贵的仪器,如磷屏。相比之下,此处描述的所有生物锡标签检测可在一天内进行,无需特殊设备。生物素标签的缺点主要包括额外的实验步骤,包括凝胶转移和化学发光,这是检测生物素标记基质所必需的,但可能还需要优化或故障排除。另一个普遍的弱点是生物锡标签与放射性同位素标签相比灵敏度相对较低。然而,在这些测定中,核酸浓度非常低,其可见度得到了检测(图2A)。
此外,半干凝胶转移装置适用于将比常规凝胶长的凝胶转移到膜上。与湿转转移相比,半干转液更快,尤其是核酸,并产生低背景信号。此外,通过稀释商业试剂或自行生产,降低了生物链球菌系统的致色反应成本,这两种试剂都取得了类似的信号。自制试剂的检测灵敏度可能看起来并不高,尽管此处足够(图5C),但可以通过延长阻断时间(未公布的数据)来增强。此外,通过增加用于测定的核酸探针的浓度,可以增强信号。鉴于上述实验证据,生物锡标签可能是32P在多体外生化测定中有利的替代品。
总体而言,该协议为蛋白质-核酸相互作用的研究提供了一个生物素标记平台,证明其坚固、可靠、高效且经济实惠。
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Disclosures
不声明任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢P.Jeremy Wang(宾夕法尼亚大学)所做的有益的编辑和讨论。我们还感谢西格丽德·埃卡德特的语言编辑。K. Z. 获得中国国家重点研发项目(2016YFA0500902,2018YFC1003500)和国家自然科学基金(31771653)的支持。L. Y. 得到了国家自然科学基金(81471502,31871503)和江苏省创新创业项目的支持。J.N.得到了浙江省医学科技项目(2019KY499)的支持。M.L.得到了国家自然科学基金(31771588)和"千名青年人才计划"的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
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