Summary
Hier zijn de protocollen voor in vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten die algemeen toepasbaar voor het bestuderen van eiwit-nucleïnezuur interacties.
Abstract
Eiwit-nucleïnezuur interacties spelen belangrijke rollen in biologische processen zoals transcriptie, recombinatie, en RNA metabolisme. Experimentele methoden om eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen vereisen het gebruik van fluorescerende Tags, radioactieve isotopen of andere etiketten om specifieke doel moleculen te detecteren en te analyseren. Biotine, een niet-radioactieve nucleïnezuur label, wordt vaak gebruikt in elektroforetisch mobiliteits verschuiving assays (EMSA) maar is niet regelmatig toegepast om te controleren van de eiwit activiteit tijdens nucleïnezuur processen. Dit protocol illustreert het nut van biotine labeling tijdens in vitro enzymatische reacties, waaruit blijkt dat dit label goed werkt met een scala aan verschillende biochemische assays. Specifiek, in afstemming met eerdere bevindingen met behulp van radio-isotopen 32P-gelabelde substraten, wordt bevestigd via Biotine-gelabeld EMSA dat MEIOB (een eiwit dat specifiek bij de Meiotische recombinatie betrokken is) een DNA-bindend eiwit is, dat MOV10 (een RNA Helicase) lost biotin-gelabelde RNA-duplex structuren op, en dat MEIOB het Biotine-gelabelde enkel-streng DNA. Deze studie toont aan dat Biotine in staat is om 32P in verschillende biochemische assays in nucleïnezuur in vitro te vervangen.
Introduction
Eiwit-nucleïnezuur interacties zijn betrokken bij vele essentiële cellulaire processen zoals DNA-herstel, replicatie, transcriptie, RNA-verwerking, en vertaling. Eiwit interacties met specifieke DNA-sequenties binnen de chromatine zijn nodig voor de strakke controle van genexpressie op het transcriptionele niveau1. Precieze posttranscriptionele regulering van talrijke Codeer-en niet-Codeer Rna's vereist uitgebreide en gecompliceerde interacties tussen elk eiwit en RNA2. Deze lagen van genexpressie regelgevingsmechanisme omvatten een cascade van dynamische intermoleculaire gebeurtenissen, die worden gecoördineerd door interacties van transcriptie/epigenetische factoren of RNA-bindende eiwitten met hun nucleïnezuur doelen, evenals eiwit-eiwit interacties. Om te ontleden of eiwitten in vivo direct of indirect geassocieerd zijn met nucleïnezuren en hoe dergelijke associaties zich voordoen en culmineren, worden in vitro biochemische assays uitgevoerd om de bindende affiniteit of enzymatische activiteit van eiwitten van belang te onderzoeken op ontworpen substraten van DNA en/of RNA.
Er zijn veel technieken ontwikkeld om nucleïnezuur-eiwitcomplexen op te sporen en te karakteriseren, waaronder de elektroforetisch mobiliteits verschuiving test (EMSA), ook wel gel retardatie assay of band Shift assay3,4,5 . EMSA is een veelzijdige en gevoelige biochemische methode die op grote schaal wordt gebruikt voor het bestuderen van de directe binding van eiwitten met nucleïnezuren. EMSA vertrouwt op gel elektrofortische verschuiving in banden, die routinematig worden gevisualiseerd met behulp van chemiluminescentie om Biotine-etiketten op te sporen6,7, de fluorescentie van de-etiketten8,9, of door autoradiografie van radioactieve 32P-etiketten10,11. Andere doeleinden van biochemische studies zijn de identificatie en karakterisering van de nucleïnezuur-verwerkingsactiviteit van eiwitten, zoals Nuclease-gebaseerde reacties om de splijting producten te beoordelen uit nucleïnezuur substraten12, 13 , 14 en DNA/RNA structuur-ontwikkeling assays om Helicase activiteiten te evalueren15,16,17.
In dergelijke enzymatische activiteit testen, de radioisotope-gelabelde of fluorophore-gelabelde nucleïnezuren worden vaak gebruikt als substraten vanwege hun hoge gevoeligheid. Analyse van radiografen van enzymatische reacties met betrekking tot 32P gelabelde radiotracers bleken gevoelig en reproduceerbaar18. Maar in een toenemend aantal laboratoria in de wereld, het gebruik van radio-isotopen is beperkt of zelfs verboden als gevolg van de gezondheidsrisico's die gepaard gaan met potentiële blootstelling. Naast bioveiligheid zorgen, andere nadelen zijn de vereiste noodzakelijke apparatuur om te werken met radio-isotopen, vereiste radioactiviteit licentie, korte halfwaardetijd van 32P (over 14 dagen), en geleidelijke verslechtering van de kwaliteit van de sonde als gevolg van Radiolyse. Er zijn dus alternatieve niet-isotopic methoden ontwikkeld (d.w.z. het labelen van de sonde met fluoroforen maakt detectie mogelijk door fluorescerende beeldvorming19). Een beeldvormings systeem met hoge resolutie is echter nodig bij het gebruik van fluorescently gelabelde sondes. Biotine, een veelgebruikt etiket, bindt gemakkelijk aan biologische macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren. Het biotin-streptavidin-systeem werkt efficiënt en verbetert de detectiegevoeligheid zonder de niet-specifieke achtergrond20,21te verhogen. Naast EMSA wordt Biotine veel gebruikt voor de eiwit zuivering en de pull-down van RNA, onder andere22,23,24.
Dit protocol gebruikt met succes Biotine gelabelde nucleïnezuren als substraten voor in vitro biochemische testen, waaronder EMSA, naast enzymatische reacties waarin Biotine niet vaak is gebruikt. De meiob ob domein is geconstrueerd en twee mutanten (truncation en Point mutatie) worden uitgedrukt als gst Fusion eiwitten25,26,27, evenals muis MOV10 recombinant Flag Fusion proteïne16. Dit verslag belicht de effectiviteit van dit gecombineerde protocol voor eiwit zuivering en biotine gelabelde assays voor diverse experimentele doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. eiwit preparaat
- MEIOB en MOV10 expressie constructies
- Genereren van cDNA Expression constructies codering muis MEIOB-A, C, en E (afbeelding 1A) en MOV10.
- Stel de polymerase-kettingreactie (PCR)-Reacties voor elk fragment in. Meng 1 μL muis-cDNA (van C57BL/6-muis testis), 1 μL dNTP, 2 μL van 10 μM voorwaartse primer, 2 μL van 10 μM omgekeerde primer, 1 μL van DNA-polymerase, 25 μL van 2x PCR-buffer en 18 μL dubbel gedistilleerd H2o (DDH2o) in een eind volume van 50 μL.
Opmerking: de primers voor de amplificatie van Meiob -en Mov10 -genfragmenten staan vermeld in tabel 1. - PCR-reacties uitvoeren met behulp van de volgende Programma's: 95 °C gedurende 5 minuten, 35 cycli verwarming bij 95 °C gedurende 15 sec., gloeien bij 64 °C gedurende 15 sec., uitbreiding bij 72 °C gedurende 20 sec. (2 min voor verlenging van de volledige lengte MOV10) en eind verlenging bij 68 °C gedurende 7 minuten.
Opmerking: gebruik de primer pair MEIOB-E (F1) en MEIOB-E-Mut (R1) en meiob-E-Mut (F2) en MEIOB-e (R2) om twee segmenten te versterken die de Mutante sequentie binnen een overlappende sequentie op respectievelijk de 3 ' en 5 ' uiteinden bevatten om een mutant PCR template te genereren.
- Stel de polymerase-kettingreactie (PCR)-Reacties voor elk fragment in. Meng 1 μL muis-cDNA (van C57BL/6-muis testis), 1 μL dNTP, 2 μL van 10 μM voorwaartse primer, 2 μL van 10 μM omgekeerde primer, 1 μL van DNA-polymerase, 25 μL van 2x PCR-buffer en 18 μL dubbel gedistilleerd H2o (DDH2o) in een eind volume van 50 μL.
- Analyseer het versterkte PCR-DNA door middel van gel elektroforese, snijd de band van de benodigde maat uit de gel snel onder een UV-lamp en plaats ze in een centrifugebuis.
Opmerking: de verwachte productgrootten die zichtbaar zijn op de agarose-gel voor MEIOB-A is 536 BP, MEIOB-C is 296 BP, MEIOB-E zijn 312 BP en 229 BP, en MOV10 is 3015 BP. - Reinig het PCR-DNA met een gel-extractie Kit volgens het Protocol van de fabrikant.
- Voeg een gelijk volume oplossende buffer toe aan de centrifugebuis van stap 1.1.2 en smelt gel in een waterbad van 50-55 °C gedurende 5-10 min, zodat de gelstukken volledig smelten. Centrifugeer kort om druppels van de wand van de buis te verzamelen.
Opmerking: de massa/volume concentratie van de gel en de oplossende buffer is 1 mg/μL. - Plaats de adsorptie kolom in de opvang buis, breng de oplossing met het opgeloste-gelfragment over naar de adsorptie kolom en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 12.000 x g .
- Gooi het filtraat aan de onderzijde van de opvang buizen weg. Voeg 600 μL van de reinigings buffer toe aan de kolom, centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 1 minuut en gooi het filtraat weg.
- Herhaal stap 1.1.3.3 eenmaal.
- Plaats de kolom terug in het opvang buisje en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 12.000 x g om alle resterende wasbuffer te verwijderen.
- Plaats de adsorptie kolom in een gesteriliseerde centrifugebuis van 1,5 mL, voeg 50 μL ddH2O toe aan het midden van de adsorptie kolom en Centrifugeer gedurende 1 min bij 12.000 x g . meet de DNA-concentratie van het eluaat met behulp van spectrofotometer.
- Voeg een gelijk volume oplossende buffer toe aan de centrifugebuis van stap 1.1.2 en smelt gel in een waterbad van 50-55 °C gedurende 5-10 min, zodat de gelstukken volledig smelten. Centrifugeer kort om druppels van de wand van de buis te verzamelen.
- Beperking van de vertering van plasmiden
- Digest pGEX-4T-1 vector met BamHI en NotI. Meng hiervoor 4 μg pGEX-4T-1 vector, 5 μL van 10x Digest buffer, 1 μL BamHI en 1 μL NotI en ddH2O tot een laatste reactievolume van 50 μL. Inincuberen bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Digest pRK5 vector met BamHI en XhoI door het mengen van 4 μg pRK5 vector, 5 μL van 10x Digest buffer, 1 μL BamHI, en 1 μL XhoI en ddH2O tot een laatste reactievolume van 50 μL. Inincuberen bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Analyseer het vector-DNA door gel elektroforese, snijd de gewenste maat band snel uit de gel met een scalpel onder een UV-lamp en plaats deze in een centrifugebuis.
- Reinig het vector-DNA met een gel-extractie Kit als 1.1.3 volgens de instructies van de fabrikant.
Let op: de lengte van gelineariseerde plasmiden: pGEX-4T-1, 4,4 KB; pRK5, 4,7 KB. - Stel een standaard recombinant ligatie reactie samen door 0,03 pmol van gelineariseerde vector, 0,06 pmol van het cDNA-fragment, 2 μl ligase en 4 μl 5x ligase-buffer en DDH2O te combineren in een laatste reactievolume van 10 μL.
Opmerking: kloon MEIOB-A, C en E in een pGEX-4T-1 vector en MOV10 in een pRK5 vector. - Inbroed het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 °C en koel vervolgens de reactie onmiddellijk af gedurende 5 minuten op ijs. Transformeer MEIOB recombinant plasmiden in BL21 bacteriën en MOV10 recombinante plasmiden in DH5α bacteriën.
Opmerking: Controleer alle recombinant constructies door Sanger-sequencing. - Bereid glycerolvoorraden van bacteriële culturen met geverifieerde recombinant plasmiden door een gelijk volume van 50% glycerol toe te voegen aan vloeibare culturen en op-80 °C te bewaren.
Let op: voor elk volgende experiment, streak uit bacteriën uit glycerol voorraden op een verse agar plaat en gebruik een enkele kolonie voor de uitbreiding zoals beschreven in stap 1,2.
- Genereren van cDNA Expression constructies codering muis MEIOB-A, C, en E (afbeelding 1A) en MOV10.
- MEIOB-eiwitextracten van bacteriën
- Kies een kolonie van elke BL21 stam die met het lege of recombinant pGEX-4T-1 plasmide wordt geverifieerd door sequencing en inoculeren in 3 mL LB bevattende 100 μg/mL ampiciline. Groei 's nachts bij 37 °C met schudden bij 220 rpm.
- Inoculeren 300 mL LB bevattende 100 μg/mL ampicileen uit 3 mL nacht cultuur (vanaf stap 1.2.1). Kweek de culturen met schudden bij 37 °C gedurende 2 uur tot OD600 bereikt 0,5-1,0.
- Induceren van de eiwit expressie door het toevoegen van Isopropyl Beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een eindconcentratie van 0,2 mM. Inbroed de culturen voor een extra 3 h met schudden bij 180 rpm en 18 °C.
- Centrifugeer de bacteriecultuur bij 3.500 x g en 4 °c gedurende 20 minuten.
- Rebreng de pellet in 20 mL ijskoude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) buffer. Sonicate de bacteriële suspensie op ijs gedurende 25 cycli in korte 10 s-uitbarstingen (uitgangsvermogen 20%) gevolgd door 2-3 s rusten op ijs.
- Centrifugeer het lysaat bij 12.000 x g en 4 °c gedurende 15 min. Breng alle supernatant over naar een frisse buis.
- Pre-wash kralen.
- Voeg 300 μL glutathion-sepharose-kralen toe aan een nieuwe tube van 15 mL en was de kralen met 10 mL ijskoude PBS-buffer.
- Centrifugeer bij 750 x g en 4 °c gedurende 1 minuut om de kralen te pellet en gooi de wasoplossing weg.
- Voeg het lysaat toe aan de gewassen kralen en inincuberen bij 4 °c gedurende 2 uur. Centrifugeer bij 750 x g en 4 °c gedurende 1 minuut om de kralen te pellet. Spoel de parels in 10 mL ijskoude PBS 8x.
- Elute de kralen met 1 ml van de elutie buffer (10 mm glutathion in 50 mm tris-HCl bij pH 8,0) 6x, inbroed bij 4 °c gedurende 10 minuten voorafgaand aan elke elutie-stap. Centrifugeer bij 750 x g en 4 °C gedurende 1 minuut om de kralen te pellet. Verzamel en pool de 6 fracties.
- Breng de geelerede eiwitten over in een centrifugale filter en concentreer u door centrifugeren op 7.500 x g om een eindvolume van 100-200 μL te verkrijgen.
- MOV10 eiwitextracten uit HEK293T cellen
- De MOV10 eiwitten transitief uitdrukken in gekweekte HEK293T cellen.
- Bereid MOV10-pRK5 plasmide in een concentratie > 500 ng/μL.
- Zaad HEK293T cellen in 15 cm gerechten. Wanneer de celdichtheid ~ 70%-90% bereikt, vervangt u het celkweekmedium door vers Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicileen-streptomycine.
- Voor één transfectie, Verdun 60 μg MOV10-pRK5 plasmide DNA in 3 ml van het verlaagde serum medium, voeg vervolgens 120 μL van het transfectie Enhancer-reagens toe en meng goed.
- Verdun in een aparte buis 90 μL van het transfectiereagens met 3 mL verlaagd serum medium (zonder penicillaire-streptomycine) en meng goed.
- Voeg het verdunde DNA toe aan elke buis van het verdunde transfectie reagens. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg het transfectie mengsel toe aan de celkweek en kweekcellen voor ~ 36-48 h.
- Na 36-48 h, verzamel cellen van elke plaat in een buis van 50 mL. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Was elke pellet met 10 mL ijskoude PBS, en verzamel cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Rebreng de pellet in 3 mL cel lysisbuffer met volledige ehylenediaminetetraazijnzuur (EDTA)-vrije cocktail van proteaseremmers. Inbroed voor 30 min op ijs. Centrifugeer het lysaat bij 20.000 x g en 4 °c gedurende 20 minuten.
- Voeg 100 μL van de anti-vlag magnetische kralen per schotel van cellen in een buis van 1,5 mL.
- Was de magnetische parels 2x met K150 buffer (50 mM HEPES bij pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
- Respendeer de magnetische kralen in 1 mL ijskoude K150 buffer.
- Inbroed de magnetische kralen voor 2 min bij 4 ° c met zachte rotatie en pellet de magnetische kralen met behulp van een magneet. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Voeg de magnetische kralen toe aan de cel lysaat supernatant uit stap 1.3.3 en inincuberen bij 4 °c gedurende 2 uur.
- Was de eiwit gebonden magnetische kralen 3x met K150 buffer, dan 2x met K150 met 250 mM NaCl, dan 3x met K150 buffer als 1.3.5.
- Breng de parels in 300 μL van de elutie buffer (100 mM NaCl, 20 mM tris-HCl bij pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glycerol), voeg de vlag peptide toe aan een eindconcentratie van 0,5 μg/μL en inbroed met parels op een Rotator bij 4 °c gedurende 1 uur. , dan pellet de magnetische kralen met behulp van een magneet.
- Verzamel het supernatant dat de eluteerde MOV10 eiwitten bevat, bepaal de concentratie en bewaar bij-80 °C voor toekomstig gebruik.
- De MOV10 eiwitten transitief uitdrukken in gekweekte HEK293T cellen.
2. preparaat van nucleïnezuur
- Koop DNA en RNA oligonucleotiden (oligos) met of zonder Biotine etiketten uit een geschikte bron. Verdun elke oligo in RNase-vrij ddH2O tot 20 μM en houd deze bij-80 °c voor toekomstig gebruik.
Opmerking: de oligo-sequenties van DNA/RNA-substraten die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in tabel 2. - Bereid het volgende mengsel voor het dubbel-streng RNA (dsRNA) gloeien reactie voor MOV10 Helicase activity assay: Meng 60 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethaan-sulfonzuur (HEPES) bij pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 en RNase-gratis DDH2 O in een laatste reactievolume van 20 μL.
- Anneal RNA oligos te vormen RNA duplex door het verwarmen van een mengsel van de Biotine-gelabelde bovenste streng (2 μM, uiteindelijke concentratie) en een 1,5-fold van zijn niet-gelabelde complementaire bodem streng in de gloei buffer (stap 2,2) bij 95 °C gedurende 5 minuten, en dan langzaam te koelen naar kamer temperatuur (RT).
3. biochemische assays in vitro
- EMSA en enzymatische reacties
- Meng voor de meiob EMSA-test 50 mm tris HCl bij pH 7,5, 2 mm MgCl2, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 2 mm dithiotreïtol (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mm (of andere relevante concentraties zoals weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3) meiob-eiwit, en 10 nm biotin-gelabelde oligonucleotiden en ddH2O in een laatste reactievolume van 20 μL. Incuberen bij RT gedurende 30 minuten en voeg 5x stop buffer (125 mM EDTA, 50% glycerol) toe om de reactie te stoppen.
- Instellen van MEIOB Nuclease activiteit reacties zoals beschreven in stap 3.1.1 maar zonder toevoeging van 10 mM EDTA.
- Voor de MOV10 Helicase activity Assay, Meng 50 mM tris-HCl bij pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mm DTT, 2 U/ΜL RNase-remmer, 10 nm Biotine-gelabeld RNA-substraat, 2 mm adenosinetrifosfaat (ATP), 100 nm RNA-val en 20 ng van MOV10 proteïne en DDH < C6 > 2O in een laatste reactievolume van 20 μL. Inbroed het reactiemengsel bij 37 °C gedurende 10 min, 30 min en 60 min. Voeg de 5x stop buffer toe om de reactie te stoppen.
Opmerking: RNA-val, een Biotine-ongegelabelde oligo met sequentie, complementariteit met het gelabelde oligo, die voorkomt dat het ongewikkelde dsRNA weer gloeien.
- Polyacrylamidegels
- Was de gelplaten (16 cm x 16 cm) en 1,5 mm kammen. Monteer de elektroforese-eenheden van de gel.
- Om een 10% inheemse polyacrylamidegel te bereiden, meng u 14 mL ddH2O, 1,25 ml 10x tris-boorzuur-EDTA (TBE), 8,3 ml 30% acrylamide, 1,25 ml 50% glycerol, 187,5 μl 10% vers bereide ammonium persulfaat (APS) en 12,5 μl tetramethylethyleendiamine (TEMED).
- Om een 20% inheemse polyacrylamidegel te bereiden, meng u 5,5 mL ddH2O, 1,25 ml 10X tbe, 1,25 ml 50% glycerol, 16,7 ml 30% acrylamide, 187,5 μl 10% APS en 12,5 ΜL TEMED.
- Giet de acrylamide oplossing onmiddellijk in de gel en steek de kam in. Laat het mengsel ongeveer 30 min polymeriseren.
- Gel running
- Verwijder de kam, vul de tanks met de elektroforese Running buffer (0.5 x TBE).
- Spoel de monster putten uit met 0,5 x TBE buffer en voer de gel vervolgens voor 30 min op 100 V op ijs. Vervang de lopende buffer door verse 0,5 x TBE.
- Laad 20-25 μL monsters in elk goed.
- Gebruik een 10% inheemse acrylamidegel voor de EMSA-assay en een 20% inheemse acrylamidegel voor de enzymatische assays. Voer elektroforese uit op 100 V op het ijsbad tot de Broom fenol Blue marker is gemigreerd naar het onderste kwart van de gel.
- Demonteer de gelplaten, trim de gel door het verwijderen van laad putten en ongebruikte rijstroken. Plaats de gel in 0,5 x TBE-buffer.
- Snijd het filtreerpapier en het nylon membraan op de maat van de gel. Bevochtig het schone filtreerpapier en het nylon membraan.
- Monteer de stapel voor overdracht.
- Plaats het pre-natte membraan op het voornatte filtreerpapier.
- Plaats de gel op het membraan.
- Bedek de gel met een andere laag voornat filtreerpapier.
- Verwijder alle luchtbellen door een schone Pipet van het midden naar de rand te rollen.
- Breng de monsters van de gel naar het membraan in een semi-droog elektroforetisch apparaat bij 90 mA gedurende 20 minuten.
- Stop de overdracht en droog het membraan gedurende 1 minuut op een nieuw filtreerpapier.
- Cross link de monsters door het membraan te bestreren op 120 MJ/cm2 voor 45-60 s in een UV-licht als uitgerust met 254 nm lampen (Autocross link-functie). Lucht droog het membraan bij RT gedurende 30 minuten.
- Detectie van chemiluminescentie
- Protocol 1: gebruik een standaardvolume van commerciële chemiluminescerende nucleïnezuur detectiekit.
- Voeg 20 mL blokkerende buffer toe aan het membraan en inincuberen gedurende 15-30 min met zacht schudden op een Rotator bij 20-25 rpm.
- Bereid geconjugeerde/blokkerende bufferoplossing door toevoeging van 66,7 μL gestabiliseerde streptavidine-mierikswortelperoxidase conjugaat tot 20 mL blokkerende buffer.
- Verwijder voorzichtig de blokkerende buffer en vervang deze door conjugaat/blokkerende buffer. Incuberen gedurende 15 minuten op een Rotator bij 20-25 rpm.
- Was het membraan 4x met schudden bij 40-45 rpm gedurende 5 minuten per stuk.
- Voeg 30 mL substraat equilibratie buffer toe aan het membraan. Inbroed het membraan gedurende 5 minuten met schudden bij 20-25 rpm.
- Bereid substraat werkoplossing door 6 mL Luminol/Enhancer oplossing toe te voegen aan 6 mL stabiele peroxide oplossing. Vermijd licht.
- Bedek het gehele oppervlak van het membraan met substraat werkoplossing en inincuberen gedurende 5 minuten.
- Scan het membraan in een chemiluminescentie beeldvormings systeem voor 1-3 s.
- Protocol 2: gebruik 2x verdunde commerciële chemiluminescerende nucleïnezuur detectiekit en volg de stappen 3.10.1.1-3.10.1.8.
- Protocol 3: gebruik zelfgemaakte reagentia6.
- Buffer voorbereiden: Meng 0,1 M Tris-HCl bij pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2en 3% boviene serumalbumine breuk V. AP 7,5 buffer: Meng 0,1 m tris-HCl bij pH 7,5, 0,1 m NaCl en 2 mm MgCl2. AP 9,5 buffer: Meng 0,1 M Tris-HCl bij pH 9,5, 0,1 M NaCl en 50 mM MgCl2. TE buffer: Meng 10 mM tris-HCl bij pH 8,0, 1 mM EDTA bij pH 8,0.
- Week het membraan in blokkerende buffer bij 30 °C gedurende 1 uur.
- Voeg 8,5 μL streptavidine alkalische fosfatase toe aan 10 mL AP 7,5-buffer. Schud het membraan zachtjes in deze oplossing bij RT gedurende 10 min. Was vervolgens het membraan 2x in 15 mL AP 7,5 buffer gedurende 10 min.
- Was het membraan nog één keer in 20 mL AP 9,5 buffer gedurende 10 min. Voeg 20 mL TE buffer toe om de reactie te stoppen.
- Voeg 7,5 mL ontwikkelings oplossing op het membraan toe en scan het membraan in een chemiluminescentie beeldvormings systeem voor 1-3 s.
- Protocol 1: gebruik een standaardvolume van commerciële chemiluminescerende nucleïnezuur detectiekit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eiwitstructuur van MEIOB en de uitdrukkings constructies die in deze studie worden gebruikt, worden geïllustreerd in Figuur 1A. OB plooien in MEIOB zijn compacte vat-achtige structuren die kunnen herkennen en interactie met enkel-streng nucleïnezuren. Een van de OB-domeinen (AA 136-307, construct A) bindt één streng DNA (ssDNA), het afgeknotte eiwit (AA 136-178 truncations, construct C) en de punt Mutant vorm (R235A mutatie, construct E) van MEIOB hebben geen DNA-bindende activiteit26. De GST-MEIOB-fusie eiwitten werden overgedruct in BL21 bacteriën, met daaropvolgende isolatie stappen resulterend in gezuiverde eiwitten getoond door Coomassie Blue kleuring en Western Blot analyse (Figuur 1B). Nucleïnezuur substraten in verschillende concentraties illustreren de hoge gevoeligheid van het Biotine signaal, met een detecteerbaar signaal van 1 nM oligo na een relatief korte blootstellingstijd voor 1-3 s (Figuur 2a). Het wild-type meiob-A-eiwit, maar niet de Mutante meiob-E en meiob-C-eiwitten, binden sterk aan 36 NT Biotine-gelabelde ssdna-substraten (dezelfde lengte en volgorde als voorheen26) (Figuur 2B) en klieven de substraten in Ladders (Figuur 2C).
De in vitro assay van MEIOB-eiwitten met RNA oligo's van dezelfde sequentie als ssDNA-substraten in Figuur 2B, C illustreert de bindingscapaciteit en de exonuclease activiteit van meiob op 36 NT enkelvoudig-streng RNA (Ssrna) (Figuur 3A, B ). De bindende activiteit van MEIOB met DNA en RNA werd verder kwantitatief geanalyseerd (Figuur 3C). Daarnaast werden MOV10 eiwitten met vlag-Tags gezuiverd uit HEK293T cellen (Figuur 4A). Om de Helicase-activiteit van MOV10 te meten, werd een duplex-RNA ontworpen (dezelfde lengte maar een andere sequentie dan voorheen16) met een 18 NT 5 ' uitsteeklengte (Figuur 4B). Toen de Biotine-gelabelde RNA-duplex werd geïnfundeerd met MOV10 in de aanwezigheid van ATP, verscheen een lagere band die overeenkomt met het vrijgekomen enkel-streng Biotine-gelabelde RNA met toenemende tijd, reflecterende van de MOV10's functie als een RNA-Helicase. Tot slot, om de kosten te verlagen, werd getracht het gebruik van reagentia voor de detectie van chemiluminescentie van het Biotine-etiket te optimaliseren. Bleek dat een twee-voudige verdunning van de chemiluminescerende nucleïnezuur detectiekit geen negatieve invloed had op de chromogene gevoeligheid van het biotin-streptavidin-systeem, en opwindend, de zelfgemaakte reagentia werkten bijna even goed (Figuur 5 ).
Figuur 1 : Zuivering van Meiob-eiwitten. A) Schematische weergave van de in dit onderzoek gebruikte MEIOB-constructies26. MEIOB bevat een OB-domein. Alle MEIOB constructies (A, C, E) werden uitgedrukt als GST Fusion eiwitten. B) Coomassie Blue kleuring en Western Blot analyse van de MEIOB-eiwitten gezuiverd met behulp van gst-bacteriën systeem. De rode pijlen geven de posities van gezuiverde MEIOB-eiwitten aan. Bands op ongeveer 26 KDa corresponderen met glutathion. Voor Western Blot werd anti-GST antilichaam gebruikt met 1:6000 verdunning. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : In vitro assays van MEIOB-ssDNA-interacties . A) test van de signaalsterkte van verschillende concentraties van 36 NT Biotine-gelabelde ssdna. B) EMSA-resultaat van MEIOB-eiwitbinding aan biotine 5 ' end-GELABELDE DNA-substraten (10% inheemse gel). C) meiob-gemedieerde splijting van biotine 5 ' end-GELABELDE DNA-substraten (20% inheemse gel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : In vitro assays van MEIOB-ssRNA interacties. A) EMSA-resultaat van MEIOB-eiwitbinding aan biotine 5 ' end-GELABELDE RNA-substraten (10% inheemse gel). B) meiob-gemedieerde splijting van biotine 5 ' end-gelabelde RNA-substraten (20% inheemse gel). C) plot van het percentage DNA/RNA-gebonden versus MEIOB-A-concentratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Gezuiverde MOV10 proteïne en de ontwikkeling van 5 ' tailed dsRNA in vitro. A) Coomassie blauwe KLEURING van MOV10 eiwit gezuiverd met behulp van het Flag-HEK293T systeem. De rode pijlen geven de posities van gezuiverd MOV10 eiwit aan. De banden op de Coomassie gel met een molecuulgewicht van ongeveer 55 kDa komen overeen met de zware immunoglobulinketen (IgG) van het antilichaam van de vlag. B) MOV10 unwinds 5 ' tailed dsRNA met toenemende tijd (10, 30, 60 min) bij 37 °c. ssRNA = 18 NT enkel-streng RNA, dsRNA = 54 NT dubbel-streng RNA met een 18 NT 5 ' tail (20% native gel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Alternatieve methodes van de met behulp van biotine chromogene reagens s op de MEIOB-test. Commercieel standaardvolume: geïnstrueerd door chemiluminescentie nucleïnezuur detectiekit; 2x verdund commercieel volume: twee-voudige verdunning van elke buffer in chemiluminescerende nucleïnezuur detectieset, zelfgemaakte reagentia: Zie de details in stap 3.7.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: primers gebruikt voor PCR versterken het gen fragmenten van Meiob en Mov10. De gedurfde letters in voorwaartse en omgekeerde primers zijn BamHI en NotI snij locaties; de cursief vette letters in een omgekeerde primer zijn XhoI snij plekken; de Vette letters in dozen geven de nucleotiden aan die corresponderen met de puntmutatie R235A.
Tabel 2: sequenties van DNA/RNA-substraten die in dit werk worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoek naar eiwit-nucleïnezuur interacties is van cruciaal belang voor ons begrip van moleculaire mechanismen onderliggende diverse biologische processen. Meiob is bijvoorbeeld een testis-specifiek eiwit dat essentieel is voor meiose en vruchtbaarheid bij zoogdieren25,26,27. MEIOB bevat een OB-domein dat bindt aan single-streng DNA en vertoont 3 ' tot 5 ' exonuclease activiteit26, die rechtstreeks betrekking heeft op de fysiologische relevantie ervan tijdens de Meiotische recombinatie. Als een ander voorbeeld, MOV10 is een RNA-Helicase met alomtegenwoordige functie die kan associëren met RNA secundaire structuren16. Dienovereenkomstig toont MOV10 brede RNA-bindings eigenschappen en 5 ' tot 3 ' RNA duplex om te ontspannen activiteit16. De studies die de bovengenoemde biochemische activiteiten van deze eiwitten melden, vertrouwden op het gebruik van 32P-isotopen om nucleïnezuren te labelen voor in vitro assays. In de huidige studie hebben we protocollen vastgesteld voor een reeks Biotine-gelabelde in vitro -experimenten met MEIOB-en MOV10-functie. Deze protocollen beginnen met de voorbereiding van actieve eiwitten en eindigde met beeldvorming van biotine signalen.
Specifiek, in overeenstemming met eerdere studies25,26, meiob eiwitten werden overexpressie in bacteriën met en zuivering leverde een enkele band met sterke Coomassie kleuring signaal na gel elektroforese. Echter, zuivering van de volledige lengte MOV10 eiwit was effectiever wanneer overuitgedrukt als FLAG-tag-gesmolten eiwit in HEK293T cellen dan als een GST-gesmolten eiwit in bacteriën (gegevens niet weergegeven). Om voldoende eiwitten te verkrijgen met voldoende zuiverheid voor daaropvolgende reacties, moeten deze twee systemen voor eiwit zuivering worden vergeleken om de meest geschikte methode voor eiwitten met verschillende groottes en/of eigenschappen te bepalen. Nucleïnezuren werden vervolgens gelabeld met behulp van Biotine in plaats van 32P als substraat en verkregen robuust signaal bij het onderzoeken van de nucleïnezuur-bindende affiniteit of nucleïnezuur-verwerkingsactiviteiten van beide eiwitten. Aangezien eiwitten die gezuiverd zijn van bacteriën vaak verontreinigd zijn met RNase, is het echter moeilijk om uit te maken dat de decolleté activiteit die tijdens de in vitro reactie wordt gezien, deels het gevolg kan zijn van contaminerende RNase. In vitro assays met MEIOB mutanten met een verminderde katalytische activiteit (afgeknotte en punt Mutant) toonde een aanzienlijke aantasting van RNA substraat verwerking, maar mogelijke RNase besmetting kan niet worden uitgesloten. De resultaten verkregen met elk van meiob constructies op ssdna en MOV10 om te ontspannen dsRNA zijn vergelijkbaar met die verkregen in vorige studie16,26. Echter, MEIOB verwerkt DNA om een uitstrijkje te genereren, terwijl een meer discrete band wordt gezien met RNA volgens de experimentele resultaten (Figuur 2C en Figuur 3B). Mogelijk heeft MEIOB differentieel bindende capaciteiten aan DNA-en RNA-substraat (Figuur 2B, Figuur 3A, C), wat leidt tot het verschil in hun splijting producten. Het kan ook mogelijk zijn dat meiob DNA en RNA op een aparte manier Slaid. De precieze rol van MEIOB in RNA-verwerking blijft verder worden onderzocht (bijvoorbeeld met behulp van FLAG-tag-gesmolten MEIOB-eiwit, uitgedrukt in HEK293T cellen).
Biotine-gelabelde nucleïnezuur sondes zijn voordelig boven 32P-gelabelde sondes omdat ze geen specifieke bescherming en afvalverwijdering nodig hebben. Ten tweede kunnen biotin-gelabelde voelers stabiel worden bewaard gedurende ten minste 1 jaar bij-20 °C, terwijl 32P-gelabelde sondes slechts 2 weken meegaan. Vandaar, dezelfde partij van de Biotine gelabelde nucleïnezuren kan worden gebruikt gedurende een lange periode van tijd, behoud van reproduceerbaarheid van experimenten. Tot slot, snelle autoradiografie van radioactieve sondes kan afhangen van dure instrumenten zoals fosfor scherm. Alle biotin-gelabelde assays die hier worden beschreven, kunnen daarentegen binnen een dag worden uitgevoerd en vereisen geen speciale apparatuur. De nadelen van biotine labeling omvatten voornamelijk extra experimentele stappen, waaronder gel-overdracht en chemiluminescentie die nodig zijn om Biotine gelabelde substraten te detecteren, maar kunnen bovendien optimalisatie of probleemoplossing vereisen. Een andere algemene zwakte is de relatief lage gevoeligheid van biotine-labeling in vergelijking met die van radio-isotoop-labeling. In deze assays werd niettemin een goed zichtbare detectie van een zeer lage concentratie van nucleïnezuren bereikt (Figuur 2A).
Daarnaast is semi-Dry gel Transfer apparatuur geschikt voor het overbrengen van langere-dan-reguliere gels naar membranen. Vergeleken met natte overdracht, is semi-droge overdracht sneller, vooral voor nucleïnezuren, en levert een laag achtergrond signaal. Bovendien werden de kosten van de chromogene reactie van het Biotine-streptavidin-systeem geknipt door ofwel de commerciële reagentia te verdunden of onze eigen te maken, die beide vergelijkbare signalen bereikten. De detectiegevoeligheid van de zelfgemaakte reagentia lijkt misschien niet zo hoog, zij het hierin voldoende (Figuur 5C), maar kan worden verbeterd door de blokkeertijd (niet-gepubliceerde gegevens) uit te breiden. Ook kunnen de signalen worden versterkt met een verhoogde concentratie van de nucleïnezuur sonde die wordt gebruikt voor de assays. Gezien het bovengenoemde experimentele bewijs kan het Biotine-etiket een voordelige vervanger zijn voor 32P in meervoudige biochemische testen in vitro.
Collectief, dit protocol biedt een Biotine gelabelde platform voor de studie van eiwit-nucleïnezuur interacties die robuust, betrouwbaar, efficiënt en betaalbaar blijkt te zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er worden geen belangenconflicten gedeclareerd.
Acknowledgments
Wij danken P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) voor nuttige bewerkingen en discussies. We danken ook Sigrid Eckardt voor taal bewerking. K. Z. werd ondersteund door National key R & D programma van China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) en National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) en het innovatieve en ondernemende programma van de provincie Jiangsu. J. N. werd gesteund door het Zhejiang Medical Science and Technology project (2019KY499). M. L. werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31771588) en het 1000 Youth talent plan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
- Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
- Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
- Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
- Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
- Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
- Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
- Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
- Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
- Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
- Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
- Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
- Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
- Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
- Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
- Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
- Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).
