Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

doi: 10.3791/59830 Published: July 17, 2019
* These authors contributed equally

Summary

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

Abstract

אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה לשחק תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים כגון תמלול, שילוב מחדש, ו-RNA חילוף החומרים. שיטות נסיוניות ללמוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצות דורשות שימוש בתגי פלורסנט, איזוטופים רדיואקטיביים, או תוויות אחרות כדי לזהות ולנתח מולקולות היעד הספציפי. Biotin, שאינה רדיואקטיבית חומצת גרעין התווית, משמש בדרך כלל בתנועה חשמלית אלקטרופואורית משמרת (EMSA) אבל לא היה מועסק באופן סדיר כדי לפקח על פעילות החלבון במהלך תהליכי חומצות גרעין. פרוטוקול זה ממחיש את כלי השירות של ביוטין תיוג במהלך התגובות אנזימטיות מבחנה, הוכחת כי תווית זו פועלת היטב עם מגוון של ביוכימיים שונים. באופן ספציפי, ביישור עם ממצאים קודמים באמצעות רדיואיזוטופ 32P-התווית מצעים, הוא אישר באמצעות biotin מתויג emsa כי meiob (חלבון מעורב במיוחד בשילוב meiob) הוא חלבון מחייב DNA, כי MOV10 (מ RNA הליקאז) פותר את מבני ה-RNA המסומנים בביוטין, והוא משאיר את התווית ביוטין. מחקר זה מדגים כי ביוטין מסוגל להחליף 32P ב שונים חומצות גרעין הקשורות ביוכימיה ביוכימית הקשורים בתחום החוץ.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה מעורבים בתהליכים סלולריים חיוניים רבים כגון תיקון DNA, שכפול, תמלול, עיבוד RNA, ותרגום. אינטראקציות חלבונים עם רצפי DNA ספציפיים בתוך כרומטוטין נדרשים לשליטה הדוקה של ביטוי הגנים ברמה הטרנסספית1. התקנה מדויקת של הפוסטסקריפט של קידוד רבים והתקנת RNAs שאינה מחייבת אינטראקציות נרחבות ומסובכות בין כל חלבון ו-RNA2. שכבות אלה של ביטוי גנטי מנגנון הרגולציה מהווים מפל של אירועים מולקולריים דינמיים, אשר מתואמים על ידי אינטראקציות של שעתוק/אפיגנטי גורמים או RNA-מחייב חלבונים עם מטרות חומצות גרעין שלהם, כמו גם אינטראקציות חלבונים בחלבון. כדי לנתח אם חלבונים בvivo משויכים במישרין או בעקיפין לחומצות גרעין וכיצד מתרחשות שיוכים ומתקרבים, באופן ביוכימיים מתורבת מתנהלים כדי לבחון את הזיקה הקשירה או הפעילות האנזימטית של חלבונים המעניינים ב עוצב מצעים של DNA ו/או RNA.

טכניקות רבות פותחו כדי לזהות ולאפיין חומצות גרעין מתחמי חלבון, כולל משמרת הניידות electrophoretic (emsa), הנקרא גם שיטת לפיגור ג'ל או משמרת הלהקה שיטת3,4,5 . EMSA היא שיטה מגוונת ורגישה ביוכימית המשמשת רבות ללימוד הכריכה הישירה של חלבונים עם חומצות גרעין. Emsa מסתמך על משמרת ג'ל אלקטרופסטי בלהקות, אשר באופן שגרתי דמיינו באמצעות chemiluminescence כדי לזהות תוויות ביוטין6,7, את הזריחה של תוויות fluorophore8,9, או על ידי האדיגרפיה של רדיואקטיבי 32P מדבקות10,11. מטרות אחרות של מחקרים ביוכימיים הם זיהוי ואפיון של פעילות עיבוד חומצות גרעין של חלבונים, כגון תגובות nuclease מבוסס להעריך את מוצרי מחשוף מתוך חומצות גרעין מצעים12, מיכל בן 13 , 14 ו-DNA/RNA מבנה-הרגיעה בחני להעריך את פעילות הליקאז15,16,17.

במסגרת הפעילות האנזימטית הזאת, חומצות הגרעין המסומנות ברדיואיזוטופ או fluorophore המסומנות בדרך כלל כסובסטרטיות בשל רגישותם הגבוהה. ניתוח רדיוגרפים של תגובות אנזימטיות הכרוכות ב- 32P המסומן באמצעות רדיומשדרים שנמצאו רגישים לבין18. עם זאת, במספר גדל והולך של מעבדות בעולם, השימוש ברדיואיזוטופים מוגבל או אסור אפילו בשל הסיכונים הבריאותיים הקשורים לחשיפה פוטנציאלית. בנוסף לחששות ביולוגיים, החסרונות האחרים הם הציוד הנדרש הדרוש כדי לנהל את העבודה עם רדיואיזוטופים, נדרש רדיואקטיביות רישיון, קצר מחצית חיים של 32P (כ 14 ימים), הידרדרות הדרגתית של איכות החללית בשל . בדיקת רדיופוליזיס Thus, שיטות חלופיות שאינן איזונושא פותחו (כלומר, תיוג הגשוש עם fluorophores מאפשר זיהוי על ידי הדמיה פלורסנט19). עם זאת, מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה יש צורך בעת שימוש בבדיקות מתויג פלואורוסקופים. Biotin, תווית בשימוש נפוץ, נקשר בקלות קרו ביולוגיים כגון חלבונים וחומצות גרעין. Biotin-streptavidin מערכת פועלת ביעילות ומשפרת את רגישות הזיהוי מבלי להגדיל את הרקע שאינו ספציפי20,21. מלבד emsa, ביוטין משמש רבות עבור טיהור חלבון ו-RNA למשוך למטה, בין השאר22,23,24.

פרוטוקול זה משתמש בהצלחה בחומצות גרעין ביוטין המסומנות כסובסטרטיות לשימוש בלתי-מתורבת ביולוגי הכולל EMSA, בנוסף לתגובות אנזימטית בהן לא נעשה שימוש נפוץ בביוטין. מתחם meiob OB הוא בנוי ושני מוטציות (מוטציה חיתוך נקודה) מבוטאים כמו gt היתוך חלבונים25,26,27, כמו גם עכבר MOV10 רקומביננטי דגל היתוך חלבון16. דו ח זה מדגיש את האפקטיביות של פרוטוקול משולב זה לטיהור חלבונים ולצורך ביוטין מתויג במטרות נסיוניות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת חלבון

  1. מבני ביטוי של MEIOB ו-MOV10
    1. ליצור cDNA ביטוי בונה קידוד העכבר באמצעות MEIOB-A, C, ו-E (איור 1א) ו MOV10.
      1. הגדר את תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) לכל רסיס. מערבבים 1 μL של העכבר cDNA (מ C57BL/6 בדיקת העכבר), 1 μL של dNTP, 2 μL של 10 μM קדימה פריימר, 2 μL של 10 הפוך להילוך אחורי, 1 μL של DNA פולימראז, 25 μL של מאגר ה-PCR 2x, ו 18 μL של כפול מזוקקים H2o (ddh2o) בגמר נפח של 50 μL.
        הערה: התחל של הגברה של שברי הגנים הMov10 מפורטים בטבלה 1.
      2. לבצע תגובות PCR באמצעות התוכניות הבאות: 95 ° c עבור 5 דקות, 35 מחזורים של חימום ב 95 ° c עבור 15 s, ריפוי בשעה 64 ° צ' עבור 15 s, הארכה ב 72 ° c עבור 20 s (2 דקות להרחבת אורך מלא MOV10), ואת הסיומת הסופית ב 68 ° c עבור 7 דקות.
        הערה: השתמש פריימר זוג MEIOB-E (F1) ו MEIOB-E-mut (R1) ו MEIOB-E-mut (F2) ו-MEIOB-E (R2) כדי להגביר שני מקטעים המכילים את רצף המוטציות בתוך רצף חופף ב 3 ' ו-5 ' הקצוות, בהתאמה, כדי ליצור תבנית
    2. לנתח את ה-DNA המוגבר על ידי ג'ל אלקטרופורזה, לחתוך את הלהקה בגודל הנדרש מן הג במהירות תחת מנורת UV, ומניחים לתוך צינור צנטריפוגה.
      הערה: גודלי המוצרים הצפויים נראים על ג'ל הצמח עבור MEIOB-A הוא 536 bp, MEIOB-C הוא 296 bp, MEIOB-E הם 312 bp ו 229 bp, ו MOV10 הוא ב3015 bp.
    3. לטהר את ה-DNA של ה-PCR עם ערכת חילוץ ג'ל בעקבות פרוטוקול היצרן.
      1. הוסף כמות שווה של מאגר המסת לתוך צינור הצנטריפוגה משלב 1.1.2 ולהמיס ג'ל באמבט מים 50-55 ° c עבור 5-10 דקות, להבטיח כי חתיכות ג'ל להמיס לחלוטין. צנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף כל טיפות מהקיר של הצינור.
        הערה: ריכוז מסה/נפח של ג'ל ומאגר המסת הוא 1 מ"ג/μL.
      2. מקם את העמודה ספיחה בצינור האוסף, להעביר את הפתרון המכיל את קטע ג'ל מומס לעמודה ספיחה ו צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 2 דקות.
      3. למחוק את פילטרט בחלק התחתון של צינורות האוסף. הוסף 600 μL של מאגר הכביסה לעמודה, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות, ולמחוק את filtrate.
      4. חזור על שלב 1.1.3.3 פעם אחת.
      5. מניחים את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף, ואת צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 2 דקות כדי להסיר את כל מאגר הכביסה הנותרים.
      6. מניחים את העמודה ספיחה בצינור הצנטריפוגה 1.5 mL מעוקר, להוסיף 50 μl של ddh2O למרכז של עמודה ספיחה צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות. למדוד את ריכוז ה-DNA של להתחמק באמצעות ספקטרוסקופיה.
    4. הגבלת העיכול של פלמידים
      1. תקציר pGEX-4T-1 וקטור עם BamHI ו NotI. כדי לעשות זאת, לערבב 4 μg של pGEX-4T-1 וקטור, 5 μL של מאגר תקציר 10x, 1 μL של BamHI, ו 1 μL של NotI ו ddH2O לנפח התגובה הסופי של 50 μl. מודטה ב 37 ° c עבור 2 h.
      2. לעכל pRK5 וקטור עם BamHI ו-XhoI על ידי ערבוב 4 μg של pRK5 וקטור, 5 μL של מאגר תקציר 10x, 1 μL של BamHI, ו 1 μL של XhoI ו ddH2O לנפח התגובה הסופי של 50 μl. מודטה ב 37 ° c עבור 2 h.
    5. לנתח את ה-DNA וקטור על ידי ג'ל אלקטרופורזה, לחתוך את הלהקה בגודל הרצוי מן הג במהירות עם אזמל מתחת למנורה UV ולמקם אותו שפופרת צנטריפוגה.
    6. לטהר את ה-DNA וקטורי עם ערכת החילוץ ג'ל כמו 1.1.3 בעקבות ההוראה של היצרן.
      הערה: אורך הפלמידים: pGEX-4T-1, 4.4 kb; . pRK5, 4.7 kb
    7. הגדרת תגובת רקומביננטי לתקן סטנדרטי על ידי שילוב 0.03 pmol של וקטור לינסיאן, 0.06 pmol של רסיס cdna, 2 μl של ליגאז, ו 4 μl של מאגר ליגאז 5x ו ddh2O בנפח התגובה הסופי של 10 μl.
      הערה: שיבוט MEIOB-A, C, ו-E לתוך וקטור pGEX-4T-1 ו MOV10 לתוך וקטור pRK5.
    8. מודקון את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן לצנן את התגובה מיד 5 דקות על הקרח. שינוי צורה של MEIOB רקומביננטי מפלסטיק לתוך BL21 חיידקים MOV10 רקומביננטי פלמידים לתוך DH5α חיידקים.
      הערה: בדוק את כל המבנים הרקומביננטי על-ידי רצפי הרצף של Sanger.
    9. הכן מניות גליצרול של תרבויות חיידקית המכילה רקומביננטי פלמידים מאומת על ידי הוספת נפח שווה של 50% גליצרול לתרבויות נוזלי, ולאחסן ב-80 ° c.
      הערה: עבור כל ניסוי שלאחר מכן, רצף את החיידקים מן גליצרול מניות לתוך צלחת אגר טרי ולהשתמש במושבה אחת להרחבת כמתואר בשלב 1.2.
  2. תמציות חלבון MEIOB מחיידקים
    1. בחר מושבה אחת של כל מאמץ BL21 מנוכר עם הריק או רקומביננטי pGEX-4T-1 פלסטלינה מאומת על ידי רצף ואיחסן ב 3 mL LB המכיל 100 μg/mL אמפיצילין. לגדול בלילה ב 37 ° c עם טלטול ב 220 סל ד.
    2. אינוחישוב 300 mL LB המכיל 100 μg/mL אמפיצילין מ 3 ל לילה תרבות (משלב 1.2.1). לגדל את התרבויות עם טלטול ב 37 ° צ' עבור 2 h עד OD600 מגיע 0.5-1.0.
    3. הגבר את ביטוי החלבון על-ידי הוספת איזופרופילי ביתא-D-thiooside (IPTG) לריכוז הסופי של 0.2 מ"מ. מודאת התרבויות לתוספת 3 h עם טלטול ב 180 סל ד ו 18 ° c.
    4. צנטריפוגה את התרבות החיידקית ב-3,500 x g ו -4 ° c עבור 20 דקות.
    5. השהה מחדש את הגלולה ב -20 מ ל של מאגר הפוספט הממלוחים (DPBS) של הקרח הקר. Sonicate הבולם החיידקי על קרח עבור 25 מחזורים קצרים 10 s התפרצויות (כוח פלט 20%) ואחריו 2-3 s נח על הקרח.
    6. צנטריפוגה את הליפוסט ב 12,000 x g ו 4 ° צ' עבור 15 דקות. העבירו את כל הסופראנט. לשפופרת חדשה
    7. . חרוזי טרום-שטיפה
      1. הוסף 300 μL של חרוזים מספרד לצינור מחדש של 15 מ ל ולשטוף את החרוזים עם 10 מ ל של מאגר ה-PBS קר קרח.
      2. צנטריפוגה ב 750 x g ו 4 ° צ' עבור 1 דקות כדי גלולה החרוזים ולמחוק את הפתרון לשטוף.
    8. מוסיפים את הליפוסט לחרוזים שנשטפו ב-4 ° c עבור 2 h. צנטריפוגה ב 750 x g ו 4 ° c עבור 1 דקות כדי הגלולה החרוזים. לשטוף את החרוזים ב 10 מ ל של הקרח קר PBS 8x.
    9. Elute החרוזים עם 1 מ ל של מאגר להתחמק (10 מ"מ גלוטתיון 50 mM טריס-HCl ב-pH 8.0) 6x, הדגירה ב 4 ° צ' עבור 10 דקות לפני כל צעד הימנעות. צנטריפוגה ב 750 x g ו 4 ° צ' עבור 1 דקות כדי לגלולה את החרוזים. לאסוף ולבריכה את 6 שברים.
    10. להעביר את החלבונים לתוך מסנן צנטריפוגלי ולהתרכז על ידי צנטריפוגה ב 7,500 x g כדי לקבל את הנפח הסופי של 100-200 μl.
  3. תמציות חלבון MOV10 מתאי HEK293T
    1. מאוד מבטאים את החלבונים הMOV10 בתאי HEK293T מתורבתים.
      1. הכן MOV10-pRK5 פלמיד בריכוז > 500 ng/μL.
      2. הזרע HEK293T תאים ב 15 ס מ מנות. כאשר צפיפות התא מגיע ~ 70%-90%, להחליף את מדיום התרבות התא עם מדיום משתנה הנשר החדש של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% סרום עוברי העובר (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      3. עבור מעבר אחד, לדלל 60 μg של ה-DNA MOV10-pRK5 פלמיד ב 3 מ ל של מדיום סרום מופחת, לאחר מכן להוסיף 120 μL של הזיהום משפר את מגיב, ומערבבים היטב.
      4. בצינור נפרד לדלל 90 μL של הזיהום מגיב עם 3 מ ל של בינוני סרום מופחת (ללא פניצילין-סטרפטומיצין) ומערבבים היטב.
      5. הוסיפו את הדנ א המדולל לכל שפופרת של מגיב מדולל בזיהום. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
      6. הוסיפו את תערובת התרגום לתרבות התא ותאי תרבות עבור ~ 36-48 h.
    2. לאחר 36-48 h, לאסוף תאים מכל צלחת בצינור 50 mL. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לשטוף כל גלולה עם 10 מ ל של הקרח קר PBS, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    3. השהה מחדש את הגלולה ב 3 מ ל של מאגר פירוק תאים המכיל חומצה מעכב פרוטאז חינם. מודקון למשך 30 דקות על הקרח. צנטריפוגה את הליפוסט ב 20,000 x g ו 4 ° צ' עבור 20 דקות.
    4. הוסף 100 μL של חרוזים נגד דגלים מגנטיים לכל מנה של תאים בצינור 1.5 mL.
    5. לשטוף את החרוזים המגנטיים 2x עם K150 מאגר (50 mM HEPES ב-pH 7.5, 150 mM KoAc, 1 מ"מ DTT, 0.1% NP-40).
      1. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים 1 מ ל של מאגר K150 קר קרח.
      2. מודאת החרוזים מגנטי עבור 2 דקות ב 4 ° צ' עם סיבוב עדין ואת הגלולה המגנטי חרוזים בעזרת מגנט. הסר והשמט את הסופרנטאנט.
    6. הוסיפו את החרוזים המגנטיים לתא הליפוסט-סופרנט משלב 1.3.3 ו-דגירה ב -4 ° c עבור 2 h.
    7. לשטוף את החלבון מאוגד חרוזים מגנטיים 3x עם K150 מאגר, אז 2x עם K150 המכיל 250 מ"מ הנאל, אז 3x עם מאגר K150 כמו 1.3.5.
    8. השהה את החרוזים ב-300 μL של מאגר הדגל (100 מ"מ מילימטר, 20 מ"מ Tris-HCl ב-pH 7.5, 5 מ"מ MgCl2, 10% גליצרול), להוסיף פפטיד הדגל לריכוז הסופי של ה0.5 μg/μl, ו דגירה עם חרוזים על מסובבי ב 4 ° צ' עבור 1 h , ולאחר מכן הגלולה חרוזים מגנטיים בעזרת מגנט.
    9. לאסוף את סופרנטאנט המכיל את החלבונים MOV10, לקבוע את הריכוז, ולאחסן ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.

2. הכנה לחומצות גרעין

  1. רכישת ה-DNA ו-RNA פורוזימטר (oligos) עם או בלי תוויות ביוטין ממקור מתאים. לדלל כל oligo ב RNase-חינם ddH2O כדי 20 μm ולשמור אותו ב-80 ° c לשימוש עתידי.
    הערה: רצפי oligo של DNA/RNA מצעים המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה 2.
  2. הכינו את התערובת הבאה עבור רנ א כפולה (dsRNA) התגובה ריפוי MOV10 האליאז הפעילות שיטה: לערבב 60 mM N-2-הידרופרמיאזין-N-ethane-חומצה גופרתית (HEPES) ב-pH 7.5, 6 מ"מ KCl, 0.2 mM MgCl2 ו RNase-חינם ddh2 O בנפח התגובה הסופי של 20 μL.
  3. אל RNA אוליגוס ליצור דופלקס ה-RNA על ידי חימום תערובת של סטרנד ביוטין המסומן העליון (2 μM, הריכוז הסופי) ו 1.5-קיפול של סטרנד התחתון משלימה ללא תווית במאגר הריפוי (שלב 2.2) ב 95 ° צ' עבור 5 דקות, ולאחר מכן לצנן אותו לחדר טמפרטורה (RT).

3. מחוץ למבחנה ביוכימית

  1. תגובות EMSA ו-אנזימטיות
    1. עבור שיטת emiob אמסה, לערבב 50 mM Tris HCl ב-pH 7.5, 2 מ"מ MgCl2, 50 Mm הנאקל, 10 מ"מ edta, 2 מ"מ dithioitol (dtt), 0.01% NP-40, 0.8 מ"מ (או ריכוזים רלוונטיים אחרים כפי שמוצג באיור 2 ואיור 3) חלבון מיובי, ו 10 ביוטין-מתויג מאוליונודיאודות ו-ddH2O בנפח התגובה הסופי של 20 μl. דגירה ב RT עבור 30 דקות, ולהוסיף 5x מאגר לעצור (125 mM EDTA, 50% גליצרול) כדי לעצור את התגובה.
    2. הגדרת תגובות הפעילות של MEIOB כמתואר בשלב 3.1.1 אך ללא תוספת של 10 מ"מ EDTA.
    3. עבור הMOV10 של הפעילות הליקאז, לערבב 50 mM טריס-HCl ב-pH 7.5, 20 מ"מ koac, 2 מ"מ mgcl2, 0.01% NP-40, 1 מ"מ dtt, 2 U/μl rnase מעכב, 10 ננומטר ביוטין התווית רנ א, 2 מ"מ-אדנוזין טריפוספט (ATP), 100 nm מלכודת ה-rna, ו 20 ng של חלבון MOV10 > 2O בנפח התגובה הסופי של 20 μL. מודיית את תערובת התגובה ב 37 ° c עבור 10 דקות, 30 דקות, ו 60 דקות. להוסיף את מאגר העצירה 5x כדי לעצור את התגובה.
      הערה: מלכודת RNA, ביוטין-ללא תווית oligo עם רצף, משלימה את התווית oligo, אשר מונע את dsRNA הסרת הפצע מפני ריפוי שוב.
  2. ג'לים פוליאקרילאמיד
    1. לשטוף את צלחות ג'ל (16 ס"מ x 16 ס מ) ו 1.5 מ"מ מסרקים. להרכיב יחידות אלקטרופורזה ג'ל.
    2. כדי להכין 10% פוליאקרילאמיד ג'ל, מערבבים 14 מ ל של ddH2O, 1.25 מ ל של 10X טריס-חומצה BORIC (tbe), 8.3 ml של 30% אקרילאמיד, 1.25 ml של 50% גליצרול, 187.5 μl של 10% אמוניום (APS) המוכן טרי, ו-12.5 μl של טטרמתתילילאדיאמין (טמאד).
    3. כדי להכין למעלה מ -20% מקורי, מערבבים 5.5 mL של ddH2O, 1.25 ml של 10X tbe, 1.25 ml של 50% גליצרול, 16.7 ml של 30% אקרילאמיד, 187.5 μl של 10% APS, ו 12.5 ΜL של temed.
    4. יוצקים את התמיסה אקרילמיד לג ומכניסים את המסרק. תנו לתערובת לעבור במשך כ -30 דקות.
  3. ג'ל ריצה
    1. להסיר את המסרק, למלא את הטנקים עם האלקטרופורזה פועל מאגר (0.5 x TBE).
    2. לשטוף את הבארות לדוגמה עם מאגר של 0.5 x TBE, ולאחר מכן להפעיל מראש את הג ב 100 V על הקרח עבור 30 דקות. החלף את המאגר הפועל באמצעות האפשרות החדשה של 0.5 x TBE.
    3. טען 20-25 μL דגימות לכל טוב.
    4. השתמש בג'ל אקרילי מקורי של 10% לצורך השימוש ב-EMSA ובג'ל אקרילי טבעי של 20% לצורך האנזימטי. הפעל אלקטרופורזה ב 100 V על אמבט הקרח עד הסמן הכחול ברומרופנול הועבר לרבע התחתון של הג.
  4. פרק את לוחיות הג'ל, חתוך את הג על-ידי הסרת בארות טעינה ונתיבים שאינם בשימוש. הניחו את הג במאגר של 0.5 x TBE.
  5. חותכים את נייר הסינון ואת קרום ניילון לגודל של ג'ל. הרטבת מוקדם את נייר הסינון הנקי וקרום הניילון.
  6. אסוף את המחסנית להעברה.
    1. הניחו את הקרום הרטוב מראש על נייר הסינון הטרום-רטוב.
    2. הניחו את הג'ל על הקרום.
    3. כסו את הג בשכבה נוספת של נייר סינון טרום-רטוב.
    4. להסיר את כל בועות האוויר על ידי גלגול צינורות נקי מהמרכז לקצה.
  7. להעביר את הדגימות מן הג אל הקרום במנגנון electrophoretic חצי יבש ב 90 mA עבור 20 דקות.
  8. הפסק את ההעברה ולאחר מכן ייבש את הקרום על נייר סינון חדש עבור 1 דקות.
  9. Crosslink את הדגימות על ידי הקרנת הממברנה ב 120 mJ/cm2 עבור 45-60 s ב-UV-light הקשר מצויד עם 254 ננומטר (הפונקציה crosslink אוטומטית). האוויר יבש את קרום ב RT עבור 30 דקות.
  10. גילוי כימומימיננסאואלי
    1. פרוטוקול 1: השתמש בנפח סטנדרטי של ערכת זיהוי הגרעין של הכלמימיננטהמסחרי.
      1. הוסף 20 מ ל של מאגר חוסם את הקרום ו-דגירה עבור 15-30 דקות עם טלטול עדין על מסובבי ב 20-25 rpm.
      2. הכנת פתרון מאגר המשלים/חוסם על ידי הוספת 66.7 μL התייצב streptavidin-חזרת peroxidase המשלים ל 20 מ ל של חסימה מאגר.
      3. הסר בעדינות את המאגר החוסם והחלף אותו במאגר מתואם/חסום. דגירה עבור 15 דקות על מסובבי ב 20-25 סל ד.
      4. לשטוף את הממברנה 4x עם טלטול ב 40-45 סל ד עבור 5 דקות כל אחד.
      5. הוסף 30 מ ל של מאגר המצע בסיס לקרום. דגירה הקרום עבור 5 דקות עם טלטול ב 20-25 סל ד.
      6. הכנת פתרון עבודה מצע על-ידי הוספת 6 מ ל של לומירול/פתרון שיפור 6 מ ל של פתרון תחמוצת יציבה. . הימנע מהאור
      7. לכסות את כל המשטח של הקרום עם פתרון עבודה מצע ו מודטה עבור 5 דקות.
      8. לסרוק את קרום במערכת הדמיה כימית עבור 1-3 s.
    2. פרוטוקול 2: השתמש 2x מדולל כמקמינטהגרעין לזיהוי חומצה מערכת ובצע את השלבים 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. פרוטוקול 3: שימוש בריאגנטים מתוצרת עצמית6.
      1. הכנת מאגר חוסם: לערבב 0.1 M טריס-HCl ב-pH 7.5, 0.1 M הנאל, 2 מ ר MgCl2, ו-3% בסרום פרה השבר V. AP 7.5 מאגר: לערבב 0.1 M-HCl ב-pH 7.5, 0.1 m הנאל, ו 2 מ"מ MgCl2. AP 9.5 מאגר: mix 0.1 M Tris-HCl ב-pH 9.5, 0.1 M הנאל, ו 50 mM MgCl2. מאגר TE: לערבב 10 mM טריס-HCl ב-pH 8.0, 1 מ"מ EDTA ב-pH 8.0.
      2. להשרות את הקרום בתוך חסימת מאגר ב 30 ° צ' עבור 1 h.
      3. הוסף 8.5 μL של streptavidin בסיסי פוספספטאז כדי 10 מ ל של AP 7.5 מאגר. טלטל את הקרום בעדינות בפתרון זה ב-RT למשך 10 דקות. אז, לשטוף את הממברנה 2x ב 15 מ ל של AP 7.5 מאגר עבור 10 דקות.
      4. לשטוף את הקרום עוד פעם אחת 20 מ ל של AP 9.5 מאגר עבור 10 דקות. הוסף 20 מ ל של מאגר TE כדי לעצור את התגובה.
      5. להוסיף 7.5 mL של פתרון הפיתוח על הקרום, ולסרוק את קרום במערכת הדמיה כימית עבור 1-3 s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מבנה החלבון של MEIOB ובניית הביטויים המשמשים במחקר זה מומחשים באיור 1א. OB קפלים ב MEIOB הם קומפקטי כמו חבית מבנים שיכולים לזהות ולתקשר עם אחד תקוע חומצות גרעין. אחד מתחומי OB (aa 136-307, לבנות A) נקשר DNA אחד תקוע (ssDNA), החלבון נחתך (aa 136-178 הגישות, לבנות C) ואת הטופס מוטציה הנקודה (R235A מוטציה, לבנות E) של MEIOB אין הפעילות איגוד ה-DNA26. החלבונים של הפיוז GT-MEIOB הביעו מוגזם בחיידקים BL21, עם שלבי הבידוד הבאים וכתוצאה מכך חלבונים מטוהרים המוצג על ידי כתמי כחול Coomassie ניתוח כתמים מערבי (איור 1B). חומצות גרעין מצעים בריכוזים שונים להמחיש את הרגישות הגבוהה של האות ביוטין, עם אות לזיהוי של 1 ננומטר oligo אחרי זמן חשיפה קצר יחסית עבור 1-3 s (איור 2א). The פראי מסוג MEIOB-חלבון, אבל לא מוטציה MEIOB-E וחלבונים MEIOB-C, לאגד בחוזקה כדי 36 nt biotin המסומן בביוטין מצעים (באותו אורך ורצף כמו בשימוש בעבר26) (איור 2ב) ו קליב את מצעים לתוך סולמות (איור 2ג).

שיטת החוץ הגופית של חלבונים MEIOB עם RNA oligos באותו רצף כמו ssDNA המשמשים באיור 2B, C ממחיש את קיבולת הכריכה ואת הפעילות באמצעות התוספת של meiob על 36 nt יחיד תקוע RNA (Ssdna) (איור 3A, B ). הפעילות איגוד של MEIOB עם DNA ו-RNA היה מנותח עוד יותר (איור 3ג). בנוסף, דגל-מתויג MOV10 חלבונים היו מטוהרים מתאי HEK293T (איור 4א). כדי למדוד את הפעילות הליקאז של MOV10, רנ א דופלקס תוכנן (באותו אורך אך רצף שונה מאשר בשימוש קודם לכן16) הנושאת 18 nt 5 ' לתלות (איור 4ב). כאשר ביוטין המכונה דופלקס RNA היה מודלת עם MOV10 בנוכחות של ATP, להקה נמוכה יותר המתאימה לאחד שוחרר ביולוגית ביוטין שכותרתו-RNA הופיע עם הגדלת זמן, רפלקטיבית של הפונקציה MOV10's כמו RNA האליאז. לבסוף, כדי להפחית את העלויות, זה היה ניסיון לייעל את השימוש של ריאגנטים לאיתור כימובסנס של תווית ביוטין. התגלה כי הדילול שני קיפול של ערכת זיהוי גרעין כמקלאומינטאת החומצות לא השפיעו לרעה על הרגישות כרומוגנית של מערכת biotin-streptavidin, ובהתרגשות, הריאגנטים בתוצרת עצמית עבד כמעט באותה מידה (איור 5 ).

Figure 1
איור 1 : טיהור של חלבונים Meiob. (א) ייצוג סכמטי של המבנים של MEIOB המשמשים במחקר זה26. MEIOB מכיל תחום OB. כל מבנים MEIOB (A, C, E) הביעו כחלבונים היתוך GT. (ב) מכתים כחול וניתוח כתמים מערביים של חלבונים MEIOB מטוהרים באמצעות מערכת gt-בקטריה. החיצים האדומים מציינים את מיקומן של חלבונים MEIOB מטוהרים. להקות בערך 26 KDa מתאימות לגלוטתיון. לכתם המערבי, נוגדנים נגד מGT שימש עם דילול 1:6000. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : בתוך מחוץ לספר האינטראקציות של MEIOB-ssDNA . (A) מבחן כוח האות של ריכוזים שונים של 36 nt biotin התווית הנושאת ssdna. (ב) התוצאה של כריכת חלבון meiob כדי ביוטין 5 ' מצעים DNA קצה התווית (10% ג'ל מקורי). (ג) מואיוב-תיווך מחשוף של ביוטין 5 מצעים DNA (20% ג'ל מקורי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : בתוך מבחנה מחוץ לתקשורת (א) תוצאה emsa של כריכת חלבון meiob כדי ביוטין 5 ' התווית הקצה מצעים RNA (10% ג'ל מקורי). (ב) מואיוב בתיווך מחשוף של ביוטין 5 ' מצעים RNA (20% ג'ל מקורי). (ג) העלילה של אחוז ה-DNA/RNA-מאוגד לעומת הריכוז MEIOB-A. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : מטוהרים MOV10 חלבון הרגיעה שלה של 5 ' זנב dsRNA ב מבחנה. (A) כתמים כחולים COOMASSIE MOV10 חלבון מטוהרים באמצעות מערכת דגל HEK293T. החיצים האדומים מציינים את מיקומי החלבון MOV10 מטוהרים. להקות על הג של Coomassie עם משקל מולקולרי של כ 55 kDa מתאים לשרשרת חיסונית כבדה (IgG) מתוך נוגדן הדגל. (ב) MOV10 נרגע 5 ' זנב dsrna עם הגדלת זמן (10, 30, 60 דקות) ב 37 ° c. ssRNA = 18 nt יחיד שנתקע RNA, dsRNA = 54 nt כפול נתקע RNA עם 18 nt 5 ' זנב (20% ג'ל מקורי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : אלטרנטיבי שיטות מתוך באמצעות ביוטין כרומוגניים מגיב של על שיטת הפונקציה MEIOB. נפח מסחרי סטנדרטי: הנחה על ידי ערכת זיהוי של חומצות גרעין כימית; 2x אמצעי אחסון מסחרי מדולל: שני קיפול לדילול של כל מאגר במערכת זיהוי חומצות גרעין כימובמינטאואת ערכת האיתור, מריאגנטים בתוצרת עצמית: ראה פרטים בשלב 3.7.3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
טבלה 1: התחל בשימוש ב-PCR כדי להגביר את הגן קטעים של מאיוב וMov10. האותיות הנועזות קדימה והתחל הפוך הם BamHI ו-NotI לחתוך אתרים; אותיות נטויות מודגשות בהילוך הפוך הם אתרי גזירה של XhoI; האותיות הנועזות בתיבות מציינות את הנוקלאוטידים המתאימים לR235A מוטציה בנקודה.

Table 2
שולחן 2: רצפים של DNA/RNA מצעים המשמשים בעבודה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חקירת אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצות הוא קריטי להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים ביולוגיים מגוונים. לדוגמה, meiob הוא חלבון ספציפי להעיד חיוני עבור meiob ופריון ביונקים25,26,27. MEIOB מכיל תחום OB הנקשר ל-DNA בודד נטוש ומוצגים 3 ' כדי 5 ' הפעילות של אקסאוחכירה26, אשר מתייחס ישירות הרלוונטיות הפיזיולוגית שלה במהלך reiotic שילוב. דוגמה נוספת, MOV10 הוא RNA הליקאז עם פונקציה בכל מקום שעשוי לקשר עם מבנים משניים RNA16. לפיכך, MOV10 מציג מאפיינים רחבים של כריכת RNA ו 5 ' עד 3 ' רנ א דופלקס פעילות מרגיעה16. המחקרים המדווחים על הפעילות הנ ל הביוכימי של חלבונים אלה הסתמך על השימוש 32P איזוטופ לתווית חומצות גרעין עבור בעלי מבחנה. במחקר הנוכחי, הקמנו פרוטוקולים עבור סדרה של biotin שכותרתו ניסויים מבחנה של MEIOB ו MOV10 פונקציה. פרוטוקולים אלה מתחילים עם הכנת חלבונים פעילים הסתיים עם הדמיה של אותות ביוטין.

במיוחד, בתור עם המחקרים הקודמים25,26, חלבונים meiob הביעו overexpressed חיידקים עם טיהור הניב להקה אחת עם אות coomassie חזק סימן מכתים לאחר האלקטרופורזה ג'ל. עם זאת, טיהור של חלבון MOV10 באורך מלא היה יעיל יותר כאשר התבטא באופן מוגזם כחלבון דגל מותך בתאי HEK293T מאשר חלבון GT-התמזגו בחיידקים (נתונים לא מוצגים). כדי להשיג כמויות מספיקות של חלבון בטוהר הולם עבור התגובות העוקבות, שתי מערכות אלה של טיהור חלבון צריך להיות מושווה כדי לקבוע את השיטה המתאימה ביותר עבור חלבונים עם גדלים שונים ו/או מאפיינים. חומצות גרעין היו לאחר מכן התווית באמצעות ביוטין במקום 32P כמו מצע והשיג אות חזק בעת בחינת מחייב של חומצות גרעין זיקה או חומצות גרעין פעולות עיבוד של שני החלבונים. עם זאת, כמו חלבונים מטוהרים מחיידקים הם מזוהמים לעתים קרובות עם RNase, קשה לשלול את האפשרות כי פעילות המחשוף נראה במהלך תגובת חוץ גופית עשוי לנבוע מזיהום RNase. בתוך מחוץ לפרט עם מוטציות MEIOB עם פעילות קטליטי מופחת (מאוטום נקודה מוטציה) הראה ליקוי משמעותי של עיבוד המצע RNA, אבל זיהום RNase אפשרי לא ניתן לכלול. התוצאות שהתקבלו עם כל אחד בונה meiob משחק על ssdna ו MOV10 להירגע dsrna דומים לאלה שהתקבלו במחקר הקודם16,26. עם זאת, MEIOB תהליכים DNA כדי ליצור מכתם, בעוד להקה דיסקרטית יותר נראה עם RNA לפי התוצאות הנסיוניות (איור 2C ואיור 3ב). יכול להיות, MEIOB יש יכולות כריכה דיפרנציאלית ל-DNA ו-RNA מצע (איור 2B, איור 3A, C), אשר מוביל את ההבדל במוצרי מחשוף שלהם. זה יכול להיות גם אפשרי כי meiob דבק DNA ו-RNA באופן נפרד. התפקיד המדויק של MEIOB בעיבוד RNA נשאר להיחקר נוסף (למשל, באמצעות הדגל-tag-תג-התמזגו מחלבון MEIOB הביע בתאי HEK293T).

Biotin התווית בדיקה חומצות גרעין הם יתרון על 32P-התוויות בדיקה בכך שהם אינם דורשים הגנה ספציפית סילוק פסולת. שנית, ביוטין התווית בדיקה ניתן לשמור באופן בלתי נשכח עבור לפחות 1 שנה ב-20 ° c, ואילו 32P בדיקה התווית האחרונה רק עבור 2 שבועות. מכאן, את אותה אצווה של חומצות גרעין ביוטין התווית ניתן להשתמש במשך תקופה ארוכה של זמן, שמירה על האפשרות של ניסויים. לבסוף, האדיגרפיה האוטומטית של הבדיקות הרדיואקטיביות עשויה להיות תלויה במכשירים יקרים כגון מסך זרחן. לעומת זאת, כל הנאמר בביוטין המתויג כאן ניתן לביצוע בתוך יום ואין צורך בציוד מיוחד. החסרונות של תיוג ביוטין להקיף בעיקר צעדים ניסיוניים נוספים כולל העברת ג'ל ו chemiluminescence כי הם נחוצים כדי לזהות ביוטין התווית מצעים, אך עשוי בנוסף לדרוש אופטימיזציה או פתרון בעיות. חולשה כללית נוספת היא רגישות נמוכה יחסית של biotin-תיוג לעומת זה של רדיואיזוטופ-תיוג. באותם מאמר, בכל זאת, גילוי היטב לעין של ריכוז נמוך מאוד של חומצות גרעין הושגה (איור 2א).

בנוסף, מנגנון העברת ג'ל למחצה יבש מתאים להעברת ג'לים ארוכים מאשר לקרומים. לעומת העברה רטובה, העברה חצי יבשה היא מהירה במיוחד עבור חומצות גרעין, ומניב אות רקע נמוך. יתר על כן, העלויות של התגובה כרומוגניים של מערכת biotin-streptavidin נחתכו על ידי לדלל את ריאגנטים מסחרי או לעשות שלנו, שניהם השיגו אותות דומים. הרגישות לזיהוי של הריאגנטים העצמי עשוי לא נראה כי גבוה, אם כי מספיק בזאת (איור 5ג), אבל זה יכול להיות משופר על ידי הרחבת הזמן חוסם (נתונים שלא פורסמו). גם, האותות יכולים להיות משופרים עם ריכוז מוגבר של החללית חומצת גרעין המשמש את assays. לאור הראיות הנסיוניות הנ ל, תווית ביוטין עשוי להיות תחליף יתרון עבור 32P במספר רב של מבחנה ביוכימית.

באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מציע פלטפורמה biotin התווית למחקר של אינטראקציות חלבון גרעין חומצות שמוכיח להיות חסון, אמין, יעיל, ובמחיר סביר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Acknowledgments

אנו מודים P. ג'רמי וואנג (אוניברסיטת פנסילבניה) עבור עריכות ודיונים מועילים. אנחנו גם מודים Sigrid Eckardt לעריכת שפה. ק. ז. היה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771653). ל. י. הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81471502, 31871503) ותוכנית חדשנית ויזמית של מחוז ג'יאנגסו. J. N. נתמך על ידי ג'ה-ג'יאנג מדע הרפואה והטכנולוגיה פרויקט (2019KY499). מ. ל. הייתה נתמכת על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31771588) ו-1000 תוכנית כישרון הנוער.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Germany 5242R
Chemiluminescent Imaging System Tanon, China 5200
Digital sonifer Branson, USA BBV12081048A 450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotter Hoefer, USA TE77XP
Tube Revolver  Crystal, USA 3406051
UV-light cross-linker UVP, USA CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter  Milipore, USA UFC801096 4 ml/10 K
Nylon membrane Thermo Scientific, USA TG263940A
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430167 100 mm 
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430597 150 mm 
Microtubes tubes AXYGEN, USA MCT-150-C 1.5 mL 
Tubes Corning, USA 430791 15 mL
Reagents 
Ampicillin SunShine Bio, China 8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beads Sigma, USA M8823
ATP Thermo Scientific, USA 591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime, China C3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent  Sigma, USA 107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit  Vazyme, China C112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit Thermo Scientific, USA T1269950
dNTP Sigma-Aldrich, USA DNTP100-1KT
DMEM Gibco, USA 10569044
DPBS buffer Gibco, USA 14190-136
EDTA Invitrogen, USA AM9260G 0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktail Roche, USA 04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit  Vazyme, China  
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit Vazyme, China DC301-01
FBS Gibco, USA 10437028
FLAG peptide Sigma, USA F4799
Glycerol Sigma, USA SHBK3676
GST Bulk Kit GE Healthcare, USA 27-4570-01
HEPES buffer Sigma, USA SLBZ2837 1 M 
IPTG Thermo Scientific, USA 34060
KoAc Sangon Biotech, China 127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent Thermo Scientific, USA L3000001
MgCl2 Invitrogen, USA AM9530G 1 M
NaCl Invitrogen, USA AM9759
 
5 M 
NP-40 Amresco, USA M158-500ML
Opti-MEM medium Gibco, USA 31985062
PBS Gibco, USA 10010023 PH 7.4
RNase Inhibitor Promega, USA N251B
Streptavidin alkaline phosphatase Promega, USA V5591
TBE Invitrogen, USA 15581044
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15567027 1 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15568025 1 M, PH 8.0
Tween-20 Sangon Biotech, China A600560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145, (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56, (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43, (8), 52 (2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43, (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60, (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35, (21), 143 (2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35, (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555, (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157, (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29, (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54, (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292, (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318, (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57, (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103, (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8, (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277, (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6, (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373, (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9, (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96, (5), 1096-1104 (2017).
בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).More

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter