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Genetics

इन विट्रो बायोकेमिकल परख का उपयोग कर के लिए Biotin लेबल का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरेक्शन

doi: 10.3791/59830 Published: July 17, 2019
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ प्रस्तुत इन विट्रो जैव रासायनिक assays में biotin लेबल है कि व्यापक रूप से प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू हो सकता है का उपयोग कर के लिए प्रोटोकॉल हैं.

Abstract

प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन जैविक प्रक्रियाओं जैसे प्रतिलेखन, पुनर्संयोजन, और आरएनए चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रायोगिक तरीकों का पता लगाने और विशिष्ट लक्ष्य अणुओं का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरोसेंट टैग, रेडियोधर्मी आइसोटोप, या अन्य लेबल के उपयोग की आवश्यकता होती है। बायोटिन, एक गैर-रेडियोएक्टिव न्यूक्लिक एसिड लेबल, आमतौर पर इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता पारी परख (ईएमएसए) में प्रयोग किया जाता है, लेकिन न्यूक्लिक एसिड प्रक्रियाओं के दौरान प्रोटीन गतिविधि की निगरानी के लिए नियमित रूप से नियोजित नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के दौरान बायोटिन लेबलिंग की उपयोगिता दिखाता है, प्रदर्शन है कि इस लेबल विभिन्न जैव रासायनिक assays की एक श्रृंखला के साथ अच्छी तरह से काम करता है. विशेष रूप से, radioisotope 32पी लेबल substrates का उपयोग कर पिछले निष्कर्षों के साथ संरेखण में, यह biotin लेबल EMSA के माध्यम से पुष्टि की है कि MEIOB (एक प्रोटीन विशेष रूप से meiotic पुनर्संयोजन में शामिल) एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन है, कि MOV10 (एक आरएनए हेलीकेस) बायोटिन-लेबल आरएनए डुप्लेक्स संरचनाओं का समाधान करता है, और यह कि एमईओबी क्लीव्स बायोटिन-लेबल एकल-स्ट्रेंड डीएनए। यह अध्ययन दर्शाता है कि बायोटिन विट्रो में विभिन्न न्यूक्लिक एसिड से संबंधित जैव रासायनिक परख में 32पी प्रतिस्थापन करने में सक्षम है।

Introduction

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प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत डीएनए की मरम्मत, प्रतिकृति, प्रतिलेखन, आरएनए प्रसंस्करण, और अनुवाद के रूप में कई आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल हैं। क्रोमैटिन के भीतर विशिष्ट डीएनए दृश्यों के साथ प्रोटीन बातचीत ट्रांसक्रिप्शनल स्तर1पर जीन अभिव्यक्ति के तंग नियंत्रण के लिए आवश्यक है । अनेक कोडन और नॉनकोडिंग आरएनए के सटीक पोस्टट्राप्टेशनल विनियमन के लिए किसी भी प्रोटीन और आरएनए2के बीच व्यापक और जटिल बातचीत आवश्यक होती है . जीन अभिव्यक्ति नियामक तंत्र की इन परतों में गतिशील अंतर-अणुक घटनाओं का एक झरना शामिल है, जो प्रतिलेखन/एपिजेनेटिक कारकों या आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के अन्योन्यक्रिया द्वारा उनके न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों के साथ-साथ समन्वित किया जाता है। प्रोटीन प्रोटीन बातचीत. विवो में प्रोटीन प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से न्यूक्लिक एसिड के साथ जुड़े रहे हैं कि क्या विच्छेदन करने के लिए और कैसे इस तरह के संघों होते हैं और समापन, इन विट्रो जैव रासायनिक परख में बाध्यकारी संबंध या ब्याज के प्रोटीन की एंजाइमी गतिविधि की जांच करने के लिए आयोजित की जाती हैं पर डीएनए और / या आरएनए के डिजाइन substrates.

कई तकनीकों का पता लगाने और न्यूक्लिक एसिड प्रोटीन परिसरों की विशेषता विकसित किया गया है, electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) सहित, यह भी जेल मंदता परख या बैंड पारी परख3कहाजाता है ,4,5 . EMSA एक बहुमुखी और संवेदनशील जैव रासायनिक विधि है कि व्यापक रूप से न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन के प्रत्यक्ष बंधन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. EMSA बैंड में जेल इलेक्ट्रोफोरेटिक बदलाव पर निर्भर करता है, जो नियमित रूप से biotin लेबल का पता लगाने के लिए chemiluminscence का उपयोग कर कल्पना कर रहे हैं6,7, फ्लोरोफोर लेबल के फ्लोरोसेंट लेबल8,9, या द्वारा रेडियोग्राफी 32पी लेबल10,11. जैव रासायनिक अध्ययन के अन्य प्रयोजनों की पहचान और प्रोटीन के न्यूक्लिक एसिड प्रसंस्करण गतिविधि की विशेषता है, इस तरह के न्यूक्लिज आधारित प्रतिक्रियाओं के रूप में न्यूक्लिक एसिड substrates से दरार उत्पादों का आकलन करने के लिए12, 13 , 14 और डी.एन.ए./ संरचना-अनवान् पराख ों को हेलीकेस गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए15,16,17.

इस तरह के एंजाइमी गतिविधि परख में, रेडियोआइसोटोप लेबल या फ्लोरोफोर लेबल न्यूक्लिक एसिड अक्सर उनके उच्च संवेदनशीलता के कारण substrates के रूप में उपयोग किया जाता है। एंजाइमी अभिक्रियाओं के रेडियोग्राफों का विश्लेषण जिसमें 32पी लेबल वाले रेडियोट्रेसर शामिल हैं , संवेदनशील और पुनरुत्पाद्य18पाए गए हैं . फिर भी, दुनिया में प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या में, रेडियोआइसोटोप का उपयोग प्रतिबंधित है या यहां तक कि संभावित जोखिम के साथ जुड़े स्वास्थ्य जोखिम के कारण निषिद्ध है. जैव सुरक्षा चिंताओं के अलावा, अन्य कमियां रेडियोआइसोटोप, आवश्यक रेडियोधर्मिता लाइसेंस, 32पी (लगभग 14 दिनों) के छोटे आधे जीवन के साथ काम करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं, और जांच की गुणवत्ता में क्रमिक गिरावट के कारण रेडियो लिलासिस। इस प्रकार, वैकल्पिक गैर-समस्थानिक विधियों को विकसित किया गया है (अर्थात, फ्लोरोफोर के साथ जांच लेबलिंग फ्लोरोसेंट इमेजिंग19द्वारा पता लगाने में सक्षम बनाता है)। हालांकि, एक उच्च संकल्प इमेजिंग प्रणाली की जरूरत है जब फ्लोरोसेंट लेबल जांच का उपयोग कर. बायोटिन, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला लेबल है, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड जैसे जैविक मैक्रो अणुओं को आसानी से बांधता है। बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन प्रणाली कुशलतापूर्वक संचालित होती है और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि20,21में वृद्धि किए बिना पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करती है। ईएमएसए के अलावा, बायोटिन का व्यापक रूप से प्रोटीन शोधन और आरएनए पुल-डाउन के लिए प्रयोग किया जाता है, अन्य22,23,24के अलावा ।

इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इन विट्रो जैव रासायनिक परख है कि EMSA शामिल के लिए substrates के रूप में biotin लेबल न्यूक्लिक एसिड का उपयोग करता है, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं जिसमें बायोटिन आमतौर पर इस्तेमाल नहीं किया गया है के अलावा. एमआईओबी ओबी डोमेन का निर्माण किया गया है और दो म्यूटेंट (तरुण और बिंदु उत्परिवर्तन ) को जीएसटी संलयन प्रोटीन25,26,27के साथ - साथ माउस MOV10 रिकॉमबिनेंट FLAG संलयन प्रोटीन16के रूप में व्यक्त किया जाता है . इस रिपोर्ट में प्रोटीन शुद्धिकरण और विविध प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए बायोटिन लेबल पराख के लिए इस संयुक्त प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता पर प्रकाश डाला गया.

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Protocol

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1. प्रोटीन की तैयारी

  1. MEIOB और MOV10 अभिव्यक्ति निर्माण
    1. cDNA व्यंजक जनरेट करें एन्कोडिंग माउस MEIOB-A, C, और E (चित्र 1A) और MOV10 का निर्माण करता है.
      1. प्रत्येक खंड के लिए पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) प्रतिक्रियाओं को सेट करें। मिश्रण 1 $L माउस cDNA के (C57BL/6 माउस वृषण से), dNTP के 1 $L, 10 डिग्री एम आगे प्राइमर के 2 $L, 10 डिग्री एम रिवर्स प्राइमर के 2 $L, डीएनए पॉलिमरेज के 1 $L, 2x पीसीआर बफर के 25 डिग्री एल, और डबल आसुत एच2ओ (डीएच2ओ) के 18 डिग्री एल 50 डिग्री सेल्सियस की मात्रा।
        नोट: Meiob और Mov10 जीन टुकड़े के प्रवर्धन के लिए प्राइमर तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं.
      2. निम्नलिखित कार्यक्रमों का उपयोग करपीसी प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करें: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग के 35 चक्र, 15 s के लिए 64 डिग्री सेल्सियस पर annealing, 20 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार (2 मिनट पूर्ण लंबाई MOV10 का विस्तार करने के लिए), और 7 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
        नोट: प्राइमर जोड़ी MEIOB-E (F1) और MEIOB-E-mut (R1) और MEIOB-E-mut (F2) और MEIOB-E (R2) का उपयोग करें दो खंडों कि एक ओवरलैपिंग अनुक्रम के भीतर एक ओवरलैपिंग अनुक्रम में शामिल बढ़ाना करने के लिए 3' और 5' समाप्त होता है, क्रमशः, एक उत्परिवर्ती PCR टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए।
    2. जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा प्रवर्धित पीसीआर डीएनए का विश्लेषण करें, एक यूवी लैंप के तहत जल्दी से जेल से आवश्यक आकार के बैंड में कटौती करें, और एक अपकेंद्रण ट्यूब में रखें।
      नोट: MEIOB-A के लिए agarose जेल पर दिखाई अपेक्षित उत्पाद आकार 536 बीपी है, MEIOB-सी 296 बीपी है, MEIOB-E 312 बीपी और 229 बीपी हैं, और MOV10 3015 बीपी है।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन एक जेल निष्कर्षण किट के साथ पीसीआर डीएनए को शुद्ध करें।
      1. कदम 1.1.2 से अपकेंद्रित्र ट्यूब में बफर भंग की एक समान मात्रा जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए एक 50-55 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जेल पिघल, यह सुनिश्चित करना है कि जेल टुकड़े पूरी तरह से पिघल. ट्यूब की दीवार से किसी भी बूंद को एकत्र करने के लिए सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में।
        नोट: जेल की द्रव्यमान/मात्रा सांद्रता और भंग बफर 1 मिलीग्राम/जेडएल है।
      2. संग्रह ट्यूब में अधिशोषण स्तंभ रखें, भंग जेल टुकड़ा युक्त घोल को अधिशोषण स्तंभ में स्थानांतरित करें, और 2 मिनट के लिए 12,000 x g पर अपकेंद्रण करें।
      3. संग्रह ट्यूबों के तल पर छानना छोड़ दें। 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण, स्तंभ में धोने बफर के 600 $L जोड़ें, और छानना छोड़ दें।
      4. चरण 1.1.3.3 एक बार दोहराएँ.
      5. कॉलम को संग्रह ट्यूब में वापस रखें, और सभी शेष धोने बफर को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
      6. अधिशोषण स्तंभ को 1.5 एमएल बंध्याकृत अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें, अधिशोषण स्तंभ के केंद्र में 50 डिग्री सेल्सियस डीएच2व् जोड़ें और 1 मिनट के लिए 12,000 x g पर अपकेंद्रित्र जोड़ें. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एल्यूएट की डीएनए सांद्रता को मापें।
    4. प्लाज्मिड के प्रतिबंध पाचन
      1. BamHI और NotI के साथ डाइजेस्ट PGEX-4T-1 वेक्टर। ऐसा करने के लिए, 50 डिग्री सेल्सियस की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में 4 डिग्री पीजीईएक्स-4टी-1 सदिश, 10x डाइजेस्ट बफर का 5 डिग्री एल, और 1 डिग्री एल, नोटI का और डीडीएच2ओ का मिश्रण करें। 2 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      2. Digest pRK5 वेक्टर के साथ BamHI और XhoI के साथ pRK5 वेक्टर pRK5 वेक्टर के 4 डिग्री ग्राम, 10x डाइजेस्ट बफर के 5 डिग्री एल, BamHI के 1 $L, और XhoI के 1 $L और डीडीएच2हे 50 डिग्री सेल्सियस की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए। 2 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा वेक्टर डीएनए का विश्लेषण करें, एक यूवी लैंप के नीचे स्केलपेल के साथ जल्दी से जेल से वांछित आकार बैंड में कटौती करें और इसे एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
    6. निर्माता के निर्देश के बाद 1.1.3 के रूप में एक जेल निष्कर्षण किट के साथ वेक्टर डीएनए को शुद्ध करें।
      नोट: linearized प्लाज्मिड की लंबाई: pGEX-4T-1, 4.4 kb; pRK5, 4.7 kb.
    7. रैखिकीकृत वेक्टर के 0.03 पीमोल, सी डीएनए खंड के 0.06 पी मोल, लिगाज़ के 2 डिग्री एल, और 5x लिगेस बफर और डीडीएच2ओ के संयोजन से एक मानक पुनः संयोजक लिगेशन अभिक्रिया की स्थापना करें।
      नोट: क्लोन MEIOB-A, C, और E में एक pGEX-4T-1 वेक्टर और MOV10 एक pRK5 वेक्टर में.
    8. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण इनक्यूबेट, और फिर बर्फ पर 5 मिनट के लिए तुरंत प्रतिक्रिया ठंडा। एमआईओबी रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड को BL21 बैक्टीरिया और MOV10 रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड्स को DH5 बैक्टीरिया में बदलें।
      नोट: Sanger अनुक्रमण द्वारा सभी पुनः संयोजक constructs सत्यापित करें।
    9. जीवाणु संस्कृतियों के ग्लिसरोल स्टॉक तैयार करें जिसमें सत्यापित रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड होते हैं, तरल संस्कृतियों में 50% ग्लिसरोल की समान मात्रा जोड़कर, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रत्येक बाद के प्रयोग के लिए, एक ताजा agar प्लेट पर ग्लिसरोल स्टॉक से बैक्टीरिया बाहर लकीर और चरण 1.2 में वर्णित के रूप में विस्तार के लिए एक एकल कॉलोनी का उपयोग करें.
  2. बैक्टीरिया से MEIOB प्रोटीन अर्क
    1. प्रत्येक BL21 तनाव खाली या पुनः संयोजक pGEX-4T-1 प्लाज्मिड अनुक्रमण द्वारा सत्यापित और 3 एमएल एलबी जिसमें 100 ग्राम / एमएल एम्पिसिलिन युक्त के साथ transfected की एक कॉलोनी उठाओ। 220 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ो।
    2. 3 एमएल रात भर की संस्कृति से 100 ग्राम/एमएल एम्पसिलिन युक्त 300 एमएल एलबी (चरण 1.2.1 से)। OD600 0.5-1.0 तक पहुँच जाता है जब तक 2 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के साथ संस्कृतियों को बढ़ाएँ।
    3. आइसोप्रोपिल बीटा-डी-थायोगालैक्टोपाइरानोसाइड (IPTG) को 0.2 एम एम की अंतिम सांद्रता में जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें। 180 आरपीएम और 18 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के साथ एक अतिरिक्त 3 एच के लिए संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
    4. 20 मिनट के लिए 3,500 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. बर्फ ठंडा Dulbecco के फॉस्फेट बफर नमकीन (DPBS) बफर के 20 एमएल में गोली resuspend. कम 10 s फटने में 25 चक्र के लिए बर्फ पर जीवाणु निलंबन Sonicate (आउटपुट बिजली 20%) 2-3 s बर्फ पर आराम के बाद.
    6. 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर lysate सेंट्रीफ्यूज। सभी सुपरनेंट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. पूर्व धोने मोती.
      1. एक ताजा 15 एमएल ट्यूब में glutathione-sepharose मोती के 300 डिग्री एल जोड़ें और बर्फ ठंडा पीबीएस बफर के 10 एमएल के साथ मोती धो लें।
      2. मोती गोली और धोने के समाधान को छोड़ने के लिए 1 मिनट के लिए 750 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज।
    8. धोया मोती के लिए lysate जोड़ें और 2 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 750 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए गोली मोती के लिए। बर्फ ठंडा पीबीएस 8x के 10 एमएल में मोती कुल्ला.
    9. एल्यूशन बफर के 1 एमएल (10 एमएम ग्लूटाथियोन में 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल में पीएच 8.0) 6x, प्रत्येक elution चरण से पहले 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग। मोती गोली के लिए 750 x g और 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज। लीजिए और 6 भागों पूल.
    10. एल्यूटेड प्रोटीन को एक केन्द्रापसारक फिल्टर में स्थानांतरित करें और 100-200 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए 7,500 x g पर केन्द्रित करें।
  3. HEK293T कोशिकाओं से MOV10 प्रोटीन अर्क
    1. क्षणिक रूप से सुसंस्कृत HEK293T कोशिकाओं में MOV10 प्रोटीन व्यक्त करते हैं.
      1. एक एकाग्रता पर MOV10-pRK5 प्लाज़्मिड तैयार करें ।
      2. 15 सेमी व्यंजन में बीज HEK293T कोशिकाओं. जब सेल घनत्व तक पहुँच ता है $70%-90%, ताजा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ सेल संस्कृति माध्यम की जगह.
      3. एक transfection के लिए, कम सीरम मध्यम के 3 एमएल में MOV10-pRK5 प्लाज्मिड डीएनए के 60 डिग्री ग्राम पतला, तो transfection बढ़ाने अभिकर्मक के 120 डिग्री एल जोड़ें, और अच्छी तरह से मिश्रण.
      4. एक अलग ट्यूब में कम सीरम माध्यम के 3 एमएल के साथ transfection अभिकर्मक के 90 डिग्री सेल्सियस पतला (पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के बिना) और अच्छी तरह से मिश्रण.
      5. पतला transfection अभिकर्मक के प्रत्येक ट्यूब के लिए पतला डीएनए जोड़ें. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
      6. सेल संस्कृति के लिए transfection मिश्रण जोड़ें, और $ 36-48 एच के लिए संस्कृति कोशिकाओं.
    2. 36-48 ज के बाद, एक 50 एमएल ट्यूब में प्रत्येक प्लेट से कोशिकाओं को इकट्ठा. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर। बर्फ ठंडा पीबीएस के 10 एमएल के साथ प्रत्येक गोली धो लें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा।
    3. सेल lysis बफर के 3 एमएल में गोली resuspend पूर्ण ehylenediaminetacetic एसिड (EDTA) मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल युक्त. बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। 20 मिनट के लिए 20,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर lysate सेंट्रीफ्यूज।
    4. एक 1.5 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं के पकवान प्रति विरोधी FLAG चुंबकीय मोती के 100 $L जोड़ें.
    5. K150 बफर (50 एमएम HEPES पर pH 7.5, 150 mM KoAc, 1 MM DTT, 0.1% एनपी-40) के साथ चुंबकीय मोती 2x धो लें।
      1. 1 एमएल बर्फ-ठंडा K150 बफर में चुंबकीय मोती को पुन: निलंबित करें।
      2. कोमल रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए चुंबकीय मोती इनक्यूबेट और एक चुंबक की मदद से चुंबकीय मोती गोली। अति-निकालिए को हटा दें और छोड़ दें।
    6. सेल lysate supernatant करने के लिए कदम 1.3.3 से चुंबकीय मोती जोड़ें और 2 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    7. K150 बफर के साथ प्रोटीन बाध्य चुंबकीय मोती 3x धो लें, फिर 2x के साथ K150 युक्त 2x 250 mM NaCl, तो 1.3.5 के रूप में K150 बफर के साथ 3x.
    8. FLAG elution बफर के 300 डिग्री एल में मोती को पुन: निलंबित करें (100 एमएम NaCl, 20 एम एम Tris-HCl पर पीएच 7.5, 5 एम एम एमजीसीएल2, 10% ग्लिसरॉल), 0.5 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता के लिए FLAG पेप्टाइड जोड़ें, और एक रोटेटर पर मोती के साथ 1 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटर पर इनक्यूबेटर के साथ इनक्यूबेट करें। , तो एक चुंबक की मदद से चुंबकीय मोती गोली.
    9. supernatant जो eluted MOV10 प्रोटीन शामिल ले लीजिए, एकाग्रता का निर्धारण, और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

2. न्यूक्लिक एसिड तैयारी

  1. खरीद डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स (ओलिगोस) के साथ या एक उपयुक्त स्रोत से बायोटिन लेबल के बिना। RNase-मुक्त डीडीएच2ओ से 20 डिग्री सेल्सियस में प्रत्येक ओलिगो को दूर करें और इसे भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त डी एन ए/आरएनए सब्स्ट्ररेट्स के अल्पक्रम अनुक्रम सारणी 2में सूचीबद्ध हैं।
  2. दो-स्ट्रेंड आरएनए (dsRNA) MOV10 हेलिकस गतिविधि परख के लिए annealing प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित मिश्रण तैयार करें: मिश्रण 60 m N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonic एसिड (HEPES) pH 7.5, 6 MM KCl, 0.2 mM MgCl2 और RNase-freeH2 20 डिग्री सेल्सियस की अंतिम अभिक्रिया आयतन में हे।
  3. Anneal आरएनए oligos biotin लेबल शीर्ष किनारा का एक मिश्रण गर्म करके आरएनए डुप्लेक्स बनाने के लिए (2 डिग्री सेल्सियस, अंतिम एकाग्रता) और annealing बफर में अपने unlabeled पूरक नीचे किनारा के एक 1.5 गुना (चरण 2.2) 95 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर, और फिर धीरे धीरे यह कमरे में शांत करने के लिए तापमान (आरटी)।

3. इन विट्रो बायोकेमिकल परख

  1. EMSA और एंजाइमी प्रतिक्रियाओं
    1. MEIOB EMSA परख के लिए, पीएच 7.5 पर 50 एमएम Tris HCl मिश्रण, 2 एमएम MgCl2, 50 एमएम NaCl, 10 m EDTA, 2 M dithiothreitol (DTT), 0.01% एनपी-40, 0.8 mM (या अन्य प्रासंगिक सांद्रता चित्रा 2 और चित्रा 3) में दिखाया गया है, 10 M EDTA, 2 M dithiothreitol (DTT), 0.01% एनपी-40, 0.8 mM (या अन्य प्रासंगिक सांद्रता चित्रा 2 और चित्रा 3) में दिखाया गया है, 10 M EDTA, 2 M dithiothreitol (DTT), 0.01% एनपी-40, 0.8 mM (या अन्य प्रासंगिक सांद्रता चित्रा 2 और चित्रा 3) में दिखाया गया है, 10 M EDTA, 2 M dithiothreitol (DTT), 0.01% एनपी-40, 0.8 m (या अन्य प्रासंगिक सांद्रता चित्रा 2 और चित्रा3) में दिखाया गया है। 20 डिग्री सेल्सियस की अंतिम अभिक्रिया आयतन में बायोटिन-लेबल ओलिगोन्यूक्लिओटाइड तथा डी डी एच2हे। 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट, और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 5x स्टॉप बफर (125 एमएम EDTA, 50% ग्लिसरोल) जोड़ें।
    2. चरण 3.1.1 में वर्णित के रूप में MEIOB nuclease गतिविधि प्रतिक्रियाओं सेट करें, लेकिन 10 m EDTA के अलावा के बिना.
    3. MOV10 हेलीकेस गतिविधि परख के लिए, पीएच 7.5 पर 50 एमएम Tris-HCl मिश्रण 20 एमएम कोएक, 2 एमएम एमजीसीएल2,0.01% एनपी-40, 1 एमएम डीटीटी, 2 यू/जेडएल आरएनएसई अवरोधक, 10 एनएम बायोटिन-लेबल आरएनए सबस्ट्रेट, 2 एमएम एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), 100 एनएम आरएनए ट्रैप, और 20 एनजी MOV10 और डीडीएच जेडसी6 20ल् की अंतिम अभिक्रिया आयतन में 2 उ. 10 मिनट, 30 मिनट और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 5x स्टॉप बफर जोड़ें।
      नोट: आरएनए जाल, अनुक्रम के साथ एक biotin-unlabeled ओलिगो, लेबल ओलिगो के लिए पूरकता, जो unwound dsRNA फिर से annealing से रोकता है.
  2. पॉलीऐक्रिलमाइड जैल
    1. जेल प्लेटें (16 सेमी x 16 सेमी) और 1.5 मिमी कंघी धो लें। जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस इकाइयों को इकट्ठा करें।
    2. एक 10% देशी polyacrylamide जेल तैयार करने के लिए, मिश्रण 14 एमएल डीएच2ओ, 10x ट्रास-बोरिक एसिड-एड्टा (टीबीई) के 1.25 एमएल, 30% ऐक्रिलमाइड के 8.3 एमएल, 50% ग्लिसरोल के 1.25 एमएल, 10% ताजा तैयार एममोनियम पर्सुलफेट (एपीएस) के 12.5 एमएल टेट्रामेथिलेथिलीनडिमिन (टीईएमईडी)।
    3. एक 20% देशी polyacrylamide जेल तैयार करने के लिए, डीडीएच2ओ के 5.5 एमएल, 10x TBE के 1.25 एमएल, 50% ग्लिसरोल के 1.25 एमएल, 30% ऐक्रिलमाइड के 16.7 एमएल, 187.5 एमएल 10% एपीएस के, और 12.5 एल टीईएमईईडी के मिश्रण।
    4. जेल के लिए तुरंत acrylamide समाधान डालो और कंघी डालें. मिश्रण लगभग 30 मिनट के लिए बहुलक चलो.
  3. जेल चल रहा है
    1. कंघी निकालें, इलेक्ट्रोफोरोसिस चल बफर (0.5x TBE) के साथ टैंक को भरने।
    2. 0.5x TBE बफर के साथ नमूना कुओं कुल्ला, तो 30 मिनट के लिए बर्फ पर 100 वी पर जेल पूर्व चलाने. ताजा 0.5x TBE के साथ चल रहे बफर बदलें.
    3. प्रत्येक कुएं में 20-25 डिग्री सेल्सियस के नमूने लोड करें।
    4. EMSA परख और एंजाइमी परख के लिए एक 20% देशी acrylamide जेल के लिए एक 10% देशी acrylamide जेल का प्रयोग करें. ब्रोमोफेनोल नीले मार्कर जेल के नीचे तिमाही के लिए चले गए हैं जब तक बर्फ स्नान पर 100 वी पर इलेक्ट्रोफोरोसिस चलाते हैं।
  4. जेल प्लेटों को अलग करें, लोडिंग कुओं और अप्रयुक्त गलियों को हटाकर जेल को ट्रिम करें। 0.5x TBE बफर में जेल प्लेस.
  5. फिल्टर पेपर और नायलॉन झिल्ली को जेल के आकार में काटें। साफ फिल्टर कागज और नायलॉन झिल्ली पूर्व गीला.
  6. स्थानांतरण के लिए स्टैक को इकट्ठा करें.
    1. प्री-वेट झिल्ली को प्री-वेट फिल्टर पेपर पर रखें।
    2. जेल को झिल्ली पर रखें।
    3. पूर्व गीला फिल्टर कागज की एक और परत के साथ जेल कवर.
    4. केंद्र से किनारे करने के लिए एक साफ पिपेट रोलिंग द्वारा सभी हवा बुलबुले निकालें।
  7. 20 मिनट के लिए 90 लेकिन पर एक अर्द्ध सूखी इलेक्ट्रोफोरेटिक उपकरण में झिल्ली के लिए जेल से नमूने स्थानांतरण।
  8. स्थानांतरण बंद करो, और फिर 1 मिनट के लिए एक नया फिल्टर कागज पर झिल्ली सूखी.
  9. 254 एनएम बल्ब (ऑटो क्रॉसलिंक समारोह) से सुसज्जित यूवी-लाइट क्रॉसलिंकर में 45-60 एस के लिए 120 mJ/cm2 पर झिल्ली विकिरण द्वारा नमूनों को क्रॉसलिंक करें। एयर 30 मिनट के लिए आरटी में झिल्ली सूखी.
  10. केमियुमिनेसन का पता लगाने
    1. प्रोटोकॉल 1: वाणिज्यिक chemiluminescent न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने किट के एक मानक मात्रा का उपयोग करें.
      1. झिल्ली के लिए बफर अवरुद्ध के 20 एमएल जोड़ें और 20-25 आरपीएम पर एक रोटेटर पर कोमल मिलाते हुए के साथ 15-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      2. 66.7 डिग्री सेल्सियस स्थिर स्ट्रेप्टाविडिन-हॉर्सराडिश पेरोक्सिडस संयुग्मी को 20 एमएल ब्लॉक करने के बफर को जोड़कर संयुग्मी/ब्लॉकिंग बफर समाधान तैयार करें।
      3. धीरे से अवरुद्ध बफर निकालें और यह संयुग्मी / अवरुद्ध बफर के साथ बदलें। 20-25 आरपीएम पर एक रोटेटर पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      4. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 40-45 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ झिल्ली 4x धो लें।
      5. झिल्ली के लिए सब्सट्रेट संतुलन बफर के 30 एमएल जोड़ें। 20-25 आरपीएम पर मिलाते हुए 5 मिनट के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
      6. स्थिर पेरोक्साइड विलयन के 6 एमएल luminol/enhancer समाधान को जोड़कर सब्सट्रेट कार्य समाधान तैयार की। प्रकाश से बचें।
      7. झिल्ली की पूरी सतह को सब्सट्रेट कार्य समाधान के साथ कवर करें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      8. 1-3 एस के लिए एक chemiluminescent इमेजिंग प्रणाली में झिल्ली स्कैन.
    2. प्रोटोकॉल 2: 2x पतला वाणिज्यिक chemilumincent न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने किट का प्रयोग करें और चरणों का पालन करें 3.10.1.1.3.10.1.8.
    3. प्रोटोकॉल 3: स्वयं निर्मित अभिकर्मकों का उपयोग करें6|
      1. बफर अवरुद्ध तैयार करें: पीएच 7.5, 0.1 एम एनसीएल, 2 एम एम एमजीसीएल2,और 3% गोवंश सीरम एल्बुमिन अंश वी एपी 7.5 बफर: पीएच 7.5, 0.1 एम एन सीएलपर 0.1 एम ट्रास-एचसीएल मिश्रण। एपी 9.5 बफर: पीएच 9.5, 0.1 एम NaCl, और 50 एम एमजीसीएल2पर 0.1 एम Tris-HCl मिश्रण। ते बफर: पीएच 8.0 पर 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.0 पर 1 एमएम एड्टा मिलाएं।
      2. 1 ज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बफर को अवरुद्ध करने में झिल्ली को भिगो दें।
      3. ए.पी. 7.5 बफर के 10 एमएल में स्ट्रेप्टाविडिन क्षारीय फॉस्फेटस का 8.5 डिग्री सेल्सिया जोड़ें। 10 मिनट के लिए आरटी पर इस समाधान में धीरे से झिल्ली हिलाओ. फिर, 10 मिनट के लिए एपी 7.5 बफर के 15 एमएल में झिल्ली 2x धो लें।
      4. 10 मिनट के लिए एपी 9.5 बफर के 20 एमएल में एक बार झिल्ली को एक बार धो लें। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ते बफर के 20 एमएल जोड़ें।
      5. झिल्ली पर विकास समाधान के 7.5 एमएल जोड़ें, और 1-3 एस के लिए एक chemiluminescent इमेजिंग प्रणाली में झिल्ली को स्कैन.

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Representative Results

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इस अध्ययन में प्रयुक्त एमईओबी की प्रोटीन संरचना और अभिव्यक्ति निर्माण चित्र 1में दर्शाए गए हैं. MEIOB में ओबी परतों कॉम्पैक्ट बैरल की तरह संरचनाओं है कि पहचान और एकल फैला न्यूक्लिक एसिड के साथ बातचीत कर सकते हैं. ओबी डोमेन में से एक (a 136-307, निर्माण ए) एकल फंसे डीएनए (ssDNA), छोटा प्रोटीन (aa 136-178 truncations, निर्माण सी) और बिंदु उत्परिवर्ती रूप (R235A उत्परिवर्तन, निर्माण ई) MEIOB के डीएनए बाध्यकारी गतिविधि26नहीं है बांधता है. जीएसटी-एमईओबी संलयन प्रोटीन BL21 बैक्टीरिया में overexpressed थे, बाद में अलगाव कदम Coomassi नीले दाग और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा दिखाए गए शुद्ध प्रोटीन में जिसके परिणामस्वरूप के साथ (चित्र 1बी) . विभिन्न सांद्रताओं पर न्यूक्लिक अम्ल बायोटिन सिग्नल की उच्च संवेदनशीलता को दर्शाता है, 1 एन एम ओलिगो के एक डिटेक्टेबल सिग्नल के साथ 1-3 s के लिए अपेक्षाकृत कम जोखिम समय के बाद (चित्र 2)। जंगली प्रकार MEIOB-एक प्रोटीन, लेकिन उत्परिवर्ती MEIOB-ई और MEIOB-सी प्रोटीन नहीं, दृढ़ता से 36 nt biotin-labeled ssDNA substrates के लिए बाध्य (एक ही लंबाई और अनुक्रम के रूप में पहले इस्तेमाल किया26) (चित्रा 2बी) और में substrates छोड़ सीढ़ी (चित्र 2)

चित्र 2 में प्रयुक्त एसएसडीएनए सब्स्स्ट्रेट्स के रूप में एक ही अनुक्रम के आरएनए ओलिगो के साथ एमईओबी प्रोटीन्स की इनविट्रो परख 36 एन टी एकल-स्ट्रेस्ड आरएनए (एसआरएनए) पर एमईओबी की बाध्यकारी क्षमता और एक्सोक्यूलेस गतिविधि को दर्शाती है (चित्र 3ए,बी ). डीएनए और आरएनए के साथ एमईओबी की बंधन गतिविधि का और अधिक मात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया गया (चित्र 3ब्) इसके अतिरिक्त, FLAG-tagged MOV10 प्रोटीन HEK293T कोशिकाओं से शुद्ध किए गए थे (चित्र 4) . MOV10 की हेलीकेस गतिविधि को मापने के लिए, एक डुप्लेक्स आरएनए को डिजाइन किया गया था (एक ही लंबाई लेकिन पहले से उपयोग किए गए16से भिन्न अनुक्रम ) जिसमें 18 nt 5' ओवरहैंग होता है (चित्र 4) . जब BIOtin लेबल आरएनए डुप्लेक्स ATP की उपस्थिति में MOV10 के साथ incubated किया गया था, एक कम बैंड जारी एकल फैला biotin लेबल आरएनए के लिए इसी समय में वृद्धि के साथ दिखाई दिया, एक आरएनए हेलीकेस के रूप में MOV10 के समारोह के चिंतनशील. अंत में, लागत को कम करने के लिए, यह बायोटिन लेबल के chemiluminescence का पता लगाने के लिए अभिकर्मकों के उपयोग का अनुकूलन करने का प्रयास किया गया था. यह पाया गया कि कीमिलुमिनेंट न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन किट के दो गुना कमजोर पड़ने से बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन सिस्टम की क्रोमोजेनिक संवेदनशीलता को नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं किया गया, और रोमांचक रूप से, स्वयं निर्मित अभिकर्मकों ने लगभग समान रूप से अच्छी तरह से काम किया (चित्र 5 ).

Figure 1
चित्र 1 : की शुद्धि MEIOB प्रोटीन. () इस अध्ययन में प्रयुक्त एमईओबी के निर्माणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व26. MEIOB एक ओबी डोमेन शामिल हैं। सभी MEIOB constructs (ए, सी, ई) जीएसटी संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किए गए थे। (बी) जी एस टी-बैक्टीरिया प्रणाली का उपयोग करके शुद्ध एमईओबी प्रोटीनों का कोमासी नीला दाग और पश्चिमी दाग विश्लेषण। लाल तीर शुद्ध MEIOB प्रोटीन की स्थिति से संकेत मिलता है. लगभग 26 केडीए पर बैंड glutathione के अनुरूप हैं. पश्चिमी दाग के लिए, विरोधी जीएसटी एंटीबॉडी 1:6000 कमजोर पड़ने के साथ इस्तेमाल किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : इन विट्रो परख के MEIOB-ssDNA बातचीत . (क) 36 nt बायोटिन-लेबल ssDNA के विभिन्न सांद्रता का सिग्नल शक्ति परीक्षण. (बी) एमईओबी प्रोटीन का ईएमएसए परिणाम बायोटिन 5' अंत लेबल वाले डीएनए सबस्ट्राट्स (10% देशी जेल) के लिए बाध्यकारी है। (सी) बायोटिन 5 के एमईओबी-मध्यस्थ क्लीवेज 5' अंत लेबल वाले डीएनए सबस्ट्राट्स (20% देशी जेल)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : इन विट्रो परख के MEIOB-ssRNA बातचीत. (ए) एमईओबी प्रोटीन का ईएमएसए परिणाम बायोटिन 5' अंत-लेबल आरएनए सबस्ट्राट्स (10% देशी जेल) के लिए बाध्यकारी है। (बी) बायोटिन 5' एंड-लेबल आरएनए सबस्ट्राट्स (20% नेटिव जेल) के एमईओबी-मध्यस्थ क्लीवेज। (ग) DNA/RNA-बाउंड बनाम MEIOB-A एकाग्रता के प्रतिशत का प्लॉट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : शुद्ध MOV10 प्रोटीन और इसके vitro में 5' पूंछ dsRNA के unwinding. (ए) फ्लैग-HEK293T प्रणाली का उपयोग करके शुद्ध MOV10 प्रोटीन का Coomasie नीला धुंधला। लाल तीर शुद्ध MOV10 प्रोटीन की स्थिति से संकेत मिलता है. लगभग 55 केडीए के आणविक वजन के साथ Coomasie जेल पर बैंड FLAG एंटीबॉडी से भारी इम्यूनोग्लोबुलिन श्रृंखला (आईजीजी) के अनुरूप हैं। (ब) MOV10 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते समय (10, 30, 60 मिनट) के साथ 5' पूंछ dsRNA unwinds. ssRNA - 18 nt एकल-stranded आरएनए, dsRNA - 54 nt डबल-stranded आरएनए के साथ एक 18 nt 5' पूंछ (20% देशी जेल). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : वैकल्पिक पद् ध ति के बायोटिन का उपयोग करते हुए क्रोमोजेनिक अभिकर्मक एस MEIOB परख. वाणिज्यिक मानक मात्रा: chemiluminescent न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने किट द्वारा निर्देश; 2x पतला वाणिज्यिक मात्रा: दो गुना chemiluminescent न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने किट में प्रत्येक बफर के कमजोर पड़ने, स्वयं बनाया अभिकर्मकों: चरण 3.7.3 में विवरण देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: प्राइमर पीसीआर जीन बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया Meiob और Mov10 के टुकड़े. आगे और रिवर्स प्राइमर में बोल्ड पत्र BamHI और NotI काटने साइटों रहे हैं; एक रिवर्स प्राइमर में इटेलिक बोल्ड पत्र XhoI काटने साइटों रहे हैं; बक्से में बोल्ड अक्षर बिंदु उत्परिवर्तन R235A करने के लिए इसी न्यूक्लिओटाइड से संकेत मिलता है।

Table 2
सारणी 2: इस कार्य में प्रयुक्त डीएनए/आरएनए सब्स्ट्ररेट्स के अनुक्रम।

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Discussion

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प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत की जांच विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं अंतर्निहित आणविक तंत्र की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, एमईओबी एक वृषण-विशिष्ट प्रोटीन है जो स्तनधारियों में अर्धसूत्रीता और प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यकहै 25,26,27. MEIOB एक ओबी डोमेन है कि एकल-संक्षिप्त डीएनए के लिए बांधता है और प्रदर्शित करता है 3' करने के लिए 5' exonuclease गतिविधि26,जो सीधे meiotic पुनर्संयोजन के दौरान अपनी शारीरिक प्रासंगिकता से संबंधित है. एक अन्य उदाहरण के रूप में, MOV10 सर्वव्यापी समारोह है कि आरएनए माध्यमिक संरचनाओं16के साथ संबद्ध कर सकते हैं के साथ एक आरएनए हेलीकेस है। तदनुसार, MOV10 व्यापक आरएनए बाध्यकारी गुण और 5 ' 3' आरएनए डुप्लेक्स unwinding गतिविधि16प्रदर्शित करता है. इन प्रोटीनों की उपर्युक्त जैव रासायनिक गतिविधियों की रिपोर्टिंग करने वाले अध्ययनों में इन विट्रो परखों के लिए न्यूक्लिक अम्लों को लेबल करने के लिए 32पी आइसोटोप के उपयोग पर भरोसा किया गया है। वर्तमान अध्ययन में, हमने एमईओबी और MOV10 फ़ंक्शन के विट्रो प्रयोगों में बायोटिन-लेबल की एक श्रृंखला के लिए प्रोटोकॉल स्थापित किए हैं। इन प्रोटोकॉल सक्रिय प्रोटीन की तैयारी के साथ शुरू और बायोटिन संकेतों की इमेजिंग के साथ समाप्त हो गया.

विशेष रूप से, पिछले अध्ययनों के साथ लाइन में25,26, MEIOB प्रोटीन के साथ बैक्टीरिया में overexpressed थे और शुद्धि जेल electrophoresis के बाद मजबूत Coomasie धुंधला संकेत के साथ एक एकल बैंड मिले. हालांकि, पूर्ण लंबाई MOV10 प्रोटीन की शुद्धि अधिक प्रभावी था जब HEK293T कोशिकाओं में FLAG-टैग-फ्यूज प्रोटीन के रूप में बैक्टीरिया (डेटा नहीं दिखाया गया) के रूप में एक जीएसटी-जुड़े प्रोटीन के रूप में overexpressed. बाद में प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त शुद्धता पर प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन शुद्धि के इन दो प्रणालियों के लिए विभिन्न आकारों और / न्यूक्लिक एसिड तो सब्सट्रेट के रूप में 32पी के बजाय biotin का उपयोग कर लेबल और मजबूत संकेत प्राप्त जब दोनों प्रोटीन के न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी संबंध या न्यूक्लिक एसिड प्रसंस्करण गतिविधियों की जांच कर रहे थे. हालांकि, के रूप में बैक्टीरिया से शुद्ध प्रोटीन अक्सर RNase के साथ दूषित कर रहे हैं, यह संभावना है कि इन विट्रो प्रतिक्रिया के दौरान देखा दरार गतिविधि भाग में RNase contaminating से परिणाम हो सकता है बाहर शासन करने के लिए मुश्किल है. कम उत्प्रेरक गतिविधि के साथ MEIOB म्यूटेंट के साथ इन विट्रो परख में (truncated और बिंदु उत्परिवर्ती) आरएनए सब्सट्रेट प्रसंस्करण की पर्याप्त हानि से पता चला है, लेकिन संभव RNase संदूषण बाहर नहीं किया जा सकता है. एमआईओबी के प्रत्येक निर्माण के साथ प्राप्त परिणाम एसडीएनए और MOV10 unwinding dsRNA पर कार्य करते हैं , पिछले अध्ययन16,26में प्राप्त किए गए परिणामों के समान हैं . तथापि, एमईओबी डीएनए को स्मियर उत्पन्न करने के लिए संसाधित करता है, जबकि प्रायोगिक परिणामों के अनुसार आरएनए के साथ अधिक असतत बैंड देखा जाता है (चित्र2ब् तथा चित्र 3ठ)। संभवत: एमईओबी में डीएनए और आरएनए सब्सट्रेट के लिए अंतरबंधन क्षमता होती है (चित्र2ठ, चित्र 3ए,ब्), जो उनके क्लीवेज उत्पादों में अंतर की ओर जाता है। यह भी संभव हो सकता है कि MEIOB डीएनए और आरएनए को एक अलग तरीके से छोड़ देता है। आरएनए प्रसंस्करण में MEIOB की सटीक भूमिका आगे की जांच की जा करने के लिए रहता है (उदाहरण के लिए, FLAG-टैग का उपयोग कर,FFLAG-fused MEIOB प्रोटीन HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त).

बायोटिन लेबल न्यूक्लिक एसिड जांच में 32पी लेबल जांच है कि वे विशिष्ट सुरक्षा और अपशिष्ट निपटान की आवश्यकता नहीं है पर फायदेमंद होते हैं. दूसरे, बायोटिन-लेबल जांच को -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 वर्ष के लिए सुरक्षित रखा जा सकता है, जबकि 32पी-लेबल जांच केवल 2 सप्ताह तक रहती है। इसलिए, बायोटिन लेबल न्यूक्लिक एसिड का एक ही बैच समय की एक लंबी अवधि में इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रयोगों की प्रजनन क्षमता को बनाए रखने. अंत में, रेडियोधर्मी जांच की तेजी से autoradiography ऐसे फॉस्फोर स्क्रीन के रूप में महंगा उपकरणों पर निर्भर हो सकता है. इसके विपरीत, सभी biotin लेबल परख यहाँ वर्णित एक दिन के भीतर किया जा सकता है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है. बायोटिन लेबलिंग की कमियां जेल हस्तांतरण और केमियुमिनेसन सहित मुख्य रूप से अतिरिक्त प्रयोगात्मक कदम शामिल हैं जो बायोटिन-लेबल substrates का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन इसके अलावा अनुकूलन या समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। एक अन्य सामान्य कमजोरी रेडियोआइसोटोप-लेबलिंग की तुलना में बायोटिन-लेबलिंग की अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता है। इन परखों में, फिर भी न्यूक्लिक अम्लों की बहुत कम सांद्रता का अच्छी तरह से दृश्य संसूचन प्राप्त किया गया (चित्र2क)।

इसके अलावा, अर्द्ध सूखी जेल हस्तांतरण उपकरण झिल्ली के लिए लंबे समय से अधिक नियमित जैल स्थानांतरित करने के लिए उपयुक्त है। गीला हस्तांतरण के साथ तुलना में, अर्द्ध सूखी हस्तांतरण विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड के लिए तेजी से है, और एक कम पृष्ठभूमि संकेत पैदावार. इसके अलावा, बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन प्रणाली के क्रोमोजेनिक प्रतिक्रिया की लागत या तो वाणिज्यिक अभिकर्मकों को कम करके या हमारे अपने बनाने से कट गई थी, दोनों ने समान संकेत प्राप्त किए थे। आत्म-निर्मित अभिकर्मकों की पहचान संवेदनशीलता है कि उच्च नहीं लग सकता है, हालांकि पर्याप्त यहाँ (चित्र 5सी),लेकिन यह अवरुद्ध समय (अप्रकाशित डेटा) का विस्तार करके बढ़ाया जा सकता है. इसके अलावा, संकेतों पराख के लिए इस्तेमाल न्यूक्लिक एसिड जांच की वृद्धि की एकाग्रता के साथ बढ़ाया जा सकता है. उपरोक्त प्रयोगात्मक साक्ष्य को देखते हुए, बायोटिन लेबल इन विट्रो बायोकेमिकल परख में कई में 32पी के लिए एक लाभप्रद विकल्प हो सकता है।

सामूहिक रूप से, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत है कि मजबूत, विश्वसनीय, कुशल, और सस्ती साबित होता है के अध्ययन के लिए एक biotin लेबल मंच प्रदान करता है.

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Disclosures

हितों के कोई टकराव घोषित नहीं किए जाते हैं।

Acknowledgments

हम उपयोगी संपादन और विचार विमर्श के लिए पी जेरेमी वांग (पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय) धन्यवाद. हम भी भाषा संपादन के लिए Sigrid Eckardt धन्यवाद. के.जेड. चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31771653) द्वारा समर्थित किया गया था। एल वाई चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81471502, 31871503) और जियांग्सू प्रांत के अभिनव और उद्यमी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। जे एन झेजियांग चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (2019KY499) द्वारा समर्थित किया गया था। एम एल चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31771588) और 1000 युवा प्रतिभा योजना के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Germany 5242R
Chemiluminescent Imaging System Tanon, China 5200
Digital sonifer Branson, USA BBV12081048A 450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotter Hoefer, USA TE77XP
Tube Revolver  Crystal, USA 3406051
UV-light cross-linker UVP, USA CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter  Milipore, USA UFC801096 4 ml/10 K
Nylon membrane Thermo Scientific, USA TG263940A
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430167 100 mm 
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430597 150 mm 
Microtubes tubes AXYGEN, USA MCT-150-C 1.5 mL 
Tubes Corning, USA 430791 15 mL
Reagents 
Ampicillin SunShine Bio, China 8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beads Sigma, USA M8823
ATP Thermo Scientific, USA 591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime, China C3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent  Sigma, USA 107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit  Vazyme, China C112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit Thermo Scientific, USA T1269950
dNTP Sigma-Aldrich, USA DNTP100-1KT
DMEM Gibco, USA 10569044
DPBS buffer Gibco, USA 14190-136
EDTA Invitrogen, USA AM9260G 0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktail Roche, USA 04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit  Vazyme, China  
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit Vazyme, China DC301-01
FBS Gibco, USA 10437028
FLAG peptide Sigma, USA F4799
Glycerol Sigma, USA SHBK3676
GST Bulk Kit GE Healthcare, USA 27-4570-01
HEPES buffer Sigma, USA SLBZ2837 1 M 
IPTG Thermo Scientific, USA 34060
KoAc Sangon Biotech, China 127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent Thermo Scientific, USA L3000001
MgCl2 Invitrogen, USA AM9530G 1 M
NaCl Invitrogen, USA AM9759
 
5 M 
NP-40 Amresco, USA M158-500ML
Opti-MEM medium Gibco, USA 31985062
PBS Gibco, USA 10010023 PH 7.4
RNase Inhibitor Promega, USA N251B
Streptavidin alkaline phosphatase Promega, USA V5591
TBE Invitrogen, USA 15581044
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15567027 1 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15568025 1 M, PH 8.0
Tween-20 Sangon Biotech, China A600560

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References

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145, (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56, (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43, (8), 52 (2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43, (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60, (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35, (21), 143 (2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35, (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555, (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157, (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29, (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54, (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292, (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318, (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57, (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103, (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8, (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277, (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6, (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373, (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9, (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96, (5), 1096-1104 (2017).
इन विट्रो बायोकेमिकल परख का उपयोग कर के लिए Biotin लेबल का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरेक्शन
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Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).More

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