Summary
ここに示すビオチン標識を用いてインビトロ生化学アッセイを用い、タンパク質-核酸相互作用の研究に広く適用可能なプロトコルを示す。
Abstract
タンパク質と核酸の相互作用は、転写、組み換え、RNA代謝などの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。タンパク質と核酸の相互作用を研究する実験的方法では、蛍光タグ、放射性同位体、またはその他の標識を使用して特定の標的分子を検出して分析する必要があります。非放射性核酸標識であるビオチンは、電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)で一般的に使用されていますが、核酸プロセス中のタンパク質活性を監視するために定期的に使用されていません。このプロトコルは、インビトロ酵素反応中のビオチン標識の有用性を示し、このラベルがさまざまな生化学アッセイの範囲でうまく機能することを実証する。具体的には、放射性同位体32P標識基質を用いたこれまでの知見と整合して、MEIOB(特異的にマイオティック組換えに関与するタンパク質)がDNA結合タンパク質であるビオチン標識EMSAを介して確認され、そのMOV10(RNAヘリケース)は、ビオチン標識RNA二重構造を解決し、MEIOBがビオチン標識された一本鎖DNAを切断します。本研究は、ビオチンが様々な核酸関連生化学アッセイで32Pをインビトロで置換できることを示している。
Introduction
タンパク質-核酸相互作用は、DNA修復、複製、転写、RNA処理、翻訳などの多くの必須細胞プロセスに関与しています。クロマチン内の特定のDNA配列とのタンパク質相互作用は、転写レベル1における遺伝子発現の厳密な制御のために必要とされる。多数のコードおよび非コードRNAの正確な転写後調節は、任意のタンパク質とRNA2との間の広範で複雑な相互作用を必要とする。遺伝子発現調節機構のこれらの層は、転写/エピジェネティック因子またはRNA結合タンパク質の相互作用によって調整される動的分子間イベントのカスケードを含み、ならびにその核酸標的とのRNA結合タンパク質とタンパク質とタンパク質の相互作用。生体内のタンパク質が直接または間接的に核酸と関連しているかどうかを調べるために、そのような関連がどのように起こり、終わるかを調べるために、インビトロ生化学アッセイを行い、目的のタンパク質の結合親和性または酵素活性を調べるために実施される。DNAおよび/またはRNAの設計された基板。
電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)を含む核酸タンパク質複合体を検出し、特徴付けるために多くの技術が開発され、ゲル遅滞アッセイまたはバンドシフトアッセイ3、4、5とも呼ばれる.EMSAは、核酸とのタンパク質の直接結合を研究するために広く使用されている汎用性と敏感な生化学的方法です。EMSAは、ビオチン標識6、7、蛍光標識8、9、またはによって検出するために化学発光を使用して日常的に視覚化されるバンドのゲル電気泳動シフトに依存しています。放射性32Pラベルの自動無線撮影10,11.生化学的研究の他の目的は、核酸基質からの切断産物を評価するヌクレアーゼベースの反応などのタンパク質の核酸処理活性の同定と特徴付けである12、13歳,14およびDNA/RNA構造アンワインディングアッセイは、ヘリケース活性を評価する15、16、17.
このような酵素活性アッセイでは、放射性同位体標識または蛍光色素標識核酸は、その高感度のために基質として使用されることが多い。32P標識放射トレッサーを含む酵素反応の放射線写真の分析は、敏感で再現可能であることが判明した18.しかし、世界で増加する研究室では、放射性同位体の使用は、潜在的な暴露に関連する健康上のリスクのために制限または禁止されています。バイオセーフティの懸念に加えて、放射性同位体、必要な放射能ライセンス、32Pの短い半減期(約14日間)、およびプローブ品質の徐々な劣化を行うために必要な機器が他に必要です。放射線を通して従って、代替の非同位体法が開発されている(すなわち、蛍光球でプローブを標識することで蛍光イメージング19による検出を可能にする)。しかし、蛍光標識プローブを使用する場合は、高解像度のイメージングシステムが必要です。一般的に使用される標識であるビオチンは、タンパク質や核酸などの生体高分子に容易に結合します。ビオチン連鎖生物ビンシステムは効率的に動作し、非特異的な背景20、21を増加させることなく検出感度を向上させます。EMSAに加えて、ビオチンはタンパク質精製およびRNAプルダウンに広く使用され、その中で22、23、24である。
このプロトコルは、ビオチンが一般的に使用されていない酵素反応に加えて、EMSAを含むインビトロ生化学アッセイの基質としてビオチン標識核酸を使用することに成功しました。MEIOB OBドメインが構築され、2つの変異体(切り捨ておよび点突然変異)は、GST融合タンパク質25、26、27、ならびにマウスMOV10組換えFLAG融合タンパク質16として発現される。本報告では、タンパク質精製およびビオチン標識アッセイに対するこの組み合わせプロトコルの有効性を強調する。
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Protocol
1. タンパク質製剤
- MEIOB および MOV10 式コンストラクト
- cDNA発現を生成し、マウスMEIOB-A、C、およびE(図1A)およびMOV10を符号化する。
- 各フラグメントに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定する。マウスcDNAの1 μL(C57BL/6マウス試験から)、dNTPの1μL、10μM前方プライマーの2μL、10μMの逆プライマーの2μL、DNAポリメラーゼの1μL、2x PCRバッファーの25 μL、および18 μLの二重蒸留H2 O(ddH2O)を混合する50 μLの容積。
注:MeiobおよびMov10遺伝子断片の増幅のためのプライマーは、表1にリストされている。 - 以下のプログラムを使用してPCR反応を行います:95°Cを5分間、15sの95°Cで35サイクルの加熱、15sの64°Cでのアニーリング、20sの72°Cでの延長(全長MOV10を延長するための2分)、および7分間の68°Cでの最終延長を行います。
注: プライマー ペア MEIOB-E (F1) と MEIOB-E-mut (R1) と MEIOB-E-mutット (F2) と MEIOB-E(R2) を使用して、3' と 5' の両端で重なり合うシーケンス内の変異シーケンスを含む 2 つのセグメントを増幅し、それぞれ変異型 PCR テンプレートを生成します。
- 各フラグメントに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定する。マウスcDNAの1 μL(C57BL/6マウス試験から)、dNTPの1μL、10μM前方プライマーの2μL、10μMの逆プライマーの2μL、DNAポリメラーゼの1μL、2x PCRバッファーの25 μL、および18 μLの二重蒸留H2 O(ddH2O)を混合する50 μLの容積。
- ゲル電気泳動によって増幅されたPCR DNAを分析し、必要なサイズのバンドをUVランプの下で素早くゲルから切断し、遠心管に入れます。
注:MEIOB-Aのアガロースゲルに表示される期待される製品サイズは536bp、MEIOB-Cは296bp、MEIOB-Eは312 bpおよび229 bp、MOV10は3015 bpです。 - 製造元のプロトコルに従ってゲル抽出キットでPCR DNAを精製します。
- ステップ1.1.2から遠心管に同量の溶解バッファーを追加し、50-55°Cの水浴でゲルを5〜10分間溶かし、ゲル片が完全に溶けるようにします。チューブの壁から任意の液滴を収集するために簡単に遠心分離機。
注:ゲルおよび溶解バッファーの質量/体積濃度は1mg/μLです。 - 吸着カラムを回収管に入れ、溶解したゲル断片を含む溶液を吸着カラムに移し、遠心分離機を12,000×gで2分間回す。
- 回収管の下部にある濾過を破棄します。カラムに600μLの洗浄バッファーを追加し、1分間12,000 x gで遠心分離機を加え、濾液を廃棄します。
- 手順 1.1.3.3 を 1 回繰り返します。
- カラムを回収管に戻し、遠心分離機を12,000 x gで2分間取り除き、残りの洗浄バッファーをすべて取り除きます。
- 吸着カラムを1.5mLの殺菌遠心管に入れ、吸着カラムの中心に50μLのddH2Oを加え、遠心分離機を1分間12,000xgで測定します。
- ステップ1.1.2から遠心管に同量の溶解バッファーを追加し、50-55°Cの水浴でゲルを5〜10分間溶かし、ゲル片が完全に溶けるようにします。チューブの壁から任意の液滴を収集するために簡単に遠心分離機。
- プラスミドの消化制限
- BamHIおよびNotIを使用してpGEX-4T-1ベクターをダイジェストする。これを行うには、pGEX-4T-1ベクターの4 μg、10倍のダイジェストバッファーの5μL、BamHIの1μL、およびNotIとddH2Oの1 μLを50μLの最終反応量に混合します。37 °Cで2時間インキュベートします。
- pRK5ベクターの4μg、10倍ダイジェストバッファーの5μL、BamHIの1μL、およびXhoIおよびddH2Oの1μLを50μLの最終反応体積に混合することにより、BamHIおよびXhoIを使用したダイジェストpRK5ベクトルを消化する。37 °Cで2時間インキュベートします。
- ゲル電気泳動によってベクターDNAを分析し、UVランプの下のメスでゲルから所望のサイズのバンドを素早く切断し、遠心管に入れます。
- 製造元の指示に従って、ゲル抽出キットを 1.1.3 としてベクター DNA を精製します。
注:線形プラスミドの長さ:pGEX-4T-1、4.4 kb;pRK5、4.7 kb。 - 線形化ベクターの0.03 pmol、cDNA断片の0.06 pmol、2 μLのリガーゼ、5xリガーゼバッファーの4μL、およびddH2 Oを10μLの最終反応量で組み合わせて標準的な組換えライゲーション反応を設定します。
注: MEIOB-A、C、および E を pGEX-4T-1 ベクトルにクローンし、MOV10 を pRK5 ベクトルにします。 - 37°Cで30分間インキュベートし、その後、氷上で5分間反応を直ちに冷却します。MEIOB組換えプラスミドをBL21細菌およびMOV10組換えプラスミドをDH5α細菌に変換する。
注: サンガー シーケンスによってすべての組み換えコンストラクトを確認します。 - 液体培養物に50%のグリセロールを同量添加して確認済みの組換えプラスミドを含む細菌培養物のグリセロールストックを調製し、-80°Cで保存する。
注:その後の実験のたびに、グリセロールストックから新鮮な寒天プレートに細菌を取り出し、ステップ1.2で説明するように、単一のコロニーを使用して拡張を行います。
- cDNA発現を生成し、マウスMEIOB-A、C、およびE(図1A)およびMOV10を符号化する。
- 細菌からのMEIOBタンパク質抽出物
- 100 μg/mLアンピシリンを含む3mL LBでシーケンシングおよび接種により検証された空または組換えpGEX-4T-1プラスミドでトランスフェクトされた各BL21株の1つのコロニーを選択します。220 rpmで振りながら37°Cで一晩成長します。
- 3 mL の一晩培養から 100 μg/mL アンピシリンを含む 300 mL LB を接種します (ステップ 1.2.1 から)。OD600が0.5-1.0に達するまで2時間37 °Cで揺れで培養物を成長させる。
- イソプロピルβ-D-チオガラクピラノシド(IPTG)を0.2mMの最終濃度に添加してタンパク質発現を誘導する。180 rpmおよび18 °Cで振盪と付加的な3時間の培養物をインキュベートする。
- 細菌培養を3,500xg、4°Cで20分間遠心分離します。
- 冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理食生(DPBS)バッファーの20 mLでペレットを再中断します。短い10sのバースト(出力電力20%)の25サイクルのための氷の上の細菌の懸濁液を超音波処理続いて2-3で氷の上に置く。
- 12,000 x gと4 °Cで15分間、ライサテを遠心分離し、すべての上清を新鮮なチューブに移します。
- ビーズを洗浄する前に。
- 新鮮な15 mLチューブにグルタチオンセファローズビーズを300μL加え、10mLの氷冷PBSバッファーでビーズを洗浄します。
- 750 x gおよび4 °Cで遠心分離機はビーズをペレットし、洗浄液を捨てる1分間。
- 洗浄したビーズにライサートを加え、ビーズをペレットに1分間750xgと4°Cで2°C4°Cでインキュベートします。 ビーズを10mLの氷冷PBS 8xですすいでください。
- 溶出バッファーの1mL(pH 8.0で50mMトリス-HClで10mMグルタチオン)6xでビーズを溶出し、各溶出工程の前に10分間4°Cでインキュベートする。750 x gおよび4 °Cで遠心分離機を1分間ビーズをペレットする。6分の1を収集し、プールします。
- elutedタンパク質を遠心フィルターに移し、7,500 x gの遠心分離によって濃縮し、100-200 μLの最終体積を得る。
- HEK293T細胞からのMOV10タンパク質抽出物
- 培養HEK293T細胞におけるMOV10タンパク質を一過性に発現させる。
- MOV10-pRK5プラスミドを濃度>500 ng/μLで調製します。
- 15 cm皿の種子HEK293T細胞。細胞密度が〜70%〜90%に達すると、細胞培養培地を10%の胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン連鎖筋ミンを含む新鮮なダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に置き換える。
- 1回のトランスフェクションでは、減らされた血清培地の3mLでMOV10-pRK5プラスミドDNAの60μgを希釈し、次いでトランスフェクションエンハンサー試薬の120μLを加え、よく混合する。
- 別のチューブで減らされた血清媒の3 mLを持つトランスフェクション試薬の90 μLを希釈し(ペニシリン-ストレプトマイシンなし)とよく混合する。
- 希釈されたトランスフェクション試薬の各チューブに希釈DNAを添加する。室温で15分間インキュベートします。
- トランスフェクション混合物を細胞培養に加え、〜36〜48時間培養した。
- 36-48 hの後、50 mLチューブで各プレートから細胞を集集める。4 °Cで5分間500 x gの遠心分離機。各ペレットを10mLの氷冷PBSで洗浄し、500 x gで遠心分離して4°Cで5分間細胞を集めます。
- 完全なエヒレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)フリープロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解バッファーの3 mLでペレットを再中断する。氷の上で30分間インキュベートします。20,000 x gおよび 4 °C で 20 分間のリサートを遠心分離します。
- 1.5 mLチューブに細胞の皿あたり100 μLの抗FLAG磁気ビーズを追加します。
- 磁気ビーズをK150バッファで2倍に洗浄します(pH 7.5、150 mM KoAc、1mM DTT、0.1%NP-40)。
- 磁気ビーズを1mLの氷冷K150バッファーに再サスペンドします。
- 穏やかな回転で4°Cで2分間磁気ビーズをインキュベートし、磁石の助けを借りて磁気ビーズをペレットします。上清を取り除いて捨てます。
- ステップ1.3.3から細胞に磁気ビーズを加え、4°Cで2時間インキュベートします。
- タンパク質結合磁気ビーズを K150 バッファーで 3 倍洗い、次に 250 mM NaCl を含む K150 で 2x、K150 バッファーを 1.3.5 として 3x 洗浄します。
- FLAG溶出バッファーの300 μL(100 mM NaCl、pH 7.5で20mMトリス-HCl、5mM MgCl 2、10%グリセロール)でビーズを再中断し、0.5 μg/μLの最終濃度にFLAGペプチドを加え、4°Cのローターにビーズをインキュベートします。磁石の助けを借りて、磁気ビーズをペレットします。
- ELUSE MOV10タンパク質を含む上清を回収し、濃度を決定し、将来の使用のために-80°Cで保存します。
- 培養HEK293T細胞におけるMOV10タンパク質を一過性に発現させる。
2. 核酸製剤
- 適切な供給源からビオチン標識の有無にかかわらずDNAおよびRNAオリゴヌクレオチド(オリゴレオチド)を購入する。RNaseフリーddH2O~20 μMで各オリゴを希釈し、将来の使用のために-80°Cに保ちます。
注:本研究で使用されるDNA/RNA基板のオリゴ配列は表2に記載されています。 - MOV10ヘリケース活性アッセイに対する二本鎖RNA(dsRNA)アニール反応に対して以下の混合物を調製する:pH 7.5、6 mM KCl、0.2mM MgCl2およびRNas-Free ddHで60mM N-2-ヒドロキシチルピペラジン-N-エタンスルホニック酸(HEPES)を混合するOは20μLの最終反応量で。
- アニールRNAオリゴは、ビオチン標識されたトップストランド(2μM、最終濃度)とアニールバッファー内のその標識されていない相補的な底鎖の1.5倍の混合物を5分間95°Cで加熱し、ゆっくりと部屋に冷却することによってRNA二重を形成する。温度(RT)。
3. インビトロ生化学アッセイ
- EMSAと酵素反応
- MEIOB EMSAアッセイの場合、pH 7.5、2 mM MgCl 2、50mM NaCl、10 mM EDTA、2 mMジチオスレイトール(DTT)、0.01%NP-40、0.8mM(または図2図2図およびMEM3に示すように他の関連濃度)で50mMトリスHClを混合する。20μLの最終反応体積におけるビオチン標識オリゴヌクレオチドおよびddH2O。RTで30分間インキュベートし、反応を停止するために5xストップバッファ(125 mM EDTA、50%グリセロール)を追加します。
- ステップ 3.1.1 に記載されているように MEIOB ヌクレアーゼ活性反応をセットアップしますが、10 mM EDTA を添加せずに設定します。
- MOV10ヘリケース活性アッセイの場合は、pH 7.5で50mMトリス-HClを混合し、 20 mM KoAc,2 mM MgCl 2, 0.01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL RNase 阻害剤, 10 nM ビオチン標識 RNA 基質, 2 mM アデノシン 三リン酸 (ATP), 100 nM RNA トラップ, MOV10 タンパク質および ddH6 の 20 ng>2Oの最終反応量20μL。反応混合物を37°Cで10分、30分、60分間インキュベートし、5倍のストップバッファーを追加して反応を停止します。
注:RNAトラップは、ビオチン標識されていないオリゴを配列し、標識されたオリゴに相補性を有し、巻き戻されたdsRNAが再びアニーリングするのを防ぎます。
- ポリアクリルアミドゲル
- ゲルプレート(16 cm x 16 cm)と1.5mmの櫛を洗います。ゲル電気泳動ユニットを組み立てます。
- 10%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、 ddH2Oの14 mL、10xトリスボリン酸EDTA(TBE)の1.25 mL、30%アクリルアミドの8.3mL、グリセロール50%の1.25 mL、10%の187.5 μLの10%の新たに調製されたペルスルフェートアンモニウム(APS)、および12μLを混合するテトラメチルチレンジアミン(TEMED)。
- 20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、ddH2Oの5.5mL、10x TBEの1.25 mL、50%グリセロールの1.25 mL、30%アクリルアミドの16.7 mL、10%APSの187.5 μL、およびTEMEDの12.5 μLを混合します。
- すぐにゲルにアクリルアミド溶液を注ぎ、櫛を挿入します。混合物を約30分間重合させます。
- ゲルランニング
- 櫛を取り外し、電気泳動実行バッファ(0.5x TBE)でタンクを満たします。
- 0.5x TBEバッファーでサンプルウェルをすすいでから、氷の上で100Vでゲルを30分間事前に実行します。
- 各ウェルに20~25μLサンプルをロードします。
- EMSAアッセイには10%の天然アクリルアミドゲルを使用し、酵素アッセイには20%の天然アクリルアミドゲルを使用します。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの底分に移行するまで、氷浴で100Vで電気泳動を実行します。
- ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用のレーンを除去してゲルをトリミングします。ゲルを 0.5x TBE バッファーに入します。
- フィルターペーパーとナイロン膜をゲルの大きさに切ります。クリーンフィルターペーパーとナイロン膜をあらかじめ濡らします。
- 転送用にスタックを組み立てます。
- プレウェット膜をウェット前のフィルターペーパーの上に置きます。
- ゲルを膜の上に置きます。
- ゲルを別のウェルトフィルターペーパーで覆います。
- クリーンなピペットを中心から端まで転がして、すべての気泡を取り除きます。
- 90 mAで半乾燥電気泳動装置でゲルから膜にサンプルを20分間移します。
- 転写を停止し、新しいフィルターペーパーで膜を1分間乾燥させます。
- 254 nm電球(自動架リンク機能)を装備したUV光架リンカーで45-60sの120 mJ/cm2で膜を照射することにより、サンプルを架光します。RTで膜を30分間乾燥させます。
- 化学発光検出
- プロトコル1:市販の化学発光核酸検出キットの標準体積を使用する。
- 膜に20 mLのブロッキングバッファーを追加し、20-25 rpmで回転子に穏やかな揺れで15〜30分間インキュベートします。
- 66.7 μL安定化ストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼコンジュゲートを20mLのブロッキングバッファーに加えてコンジュゲート/ブロッキングバッファー溶液を調製する。
- ブロッキング バッファをゆっくりと取り外し、コンジュゲート/ブロッキング バッファに置き換えます。20-25 rpmで回転子で15分間インキュベートします。
- 40-45 rpmで5分間振って膜を4倍洗います。
- 膜に基板平衡バッファーの30 mLを追加します。20-25 rpmで振って5分間膜をインキュベートします。
- 安定な過酸化物溶液の6 mLにルミノール/エンハンサー溶液の6 mLを添加することにより、基板作業溶液を調付します。光を避けてください。
- 基板加工液で膜の表面全体を覆い、5分間インキュベートします。
- 化学発光イメージングシステムで膜を1-3sでスキャンします。
- プロトコル2:2倍希釈市販の化学発光核酸検出キットを使用し、手順3.10.1.1-3.10.1.8に従ってください。
- プロトコル 3: 自作試薬6を使用します。
- ブロッキング バッファーを準備する: pH 7.5、0.1 M NaCl、2 mM MgCl2、および 3% ウシ血清アルブミンフラクション V. AP 7.5 バッファー: pH 7.5、0.1 M NaCl、および 2 mM MgCl2で 0.1 M Tris-HCl を混合します。AP 9.5 バッファ: pH 9.5、0.1 M NaCl、および 50 mM MgCl2で 0.1 M トリス-HCl を混在させます。TE バッファ: pH 8.0 で 10 mM トリス-HCl を混合し、pH 8.0 で 1 mM EDTA を混在かします。
- 1時間30°Cでブロッキングバッファーに膜を浸します。
- AP 7.5 バッファーの 10 mL にストレプトアビジンアルカリホスファターゼの 8.5 μL を追加します。この溶液中の膜をRTで10分間ゆっくり振ります。次いで、AP 7.5バッファーの15mLで膜2xを10分間洗浄する。
- AP 9.5バッファーの20 mLで膜をもう一度10分間洗い、反応を止めるためにTEバッファーの20 mLを追加します。
- 7.5 mLの開発溶液を膜上に加え、1-3sの化学発光イメージングシステムで膜をスキャンします。
- プロトコル1:市販の化学発光核酸検出キットの標準体積を使用する。
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Representative Results
MEIOBのタンパク質構造と本研究で用いられる発現構造体を図1Aに示す。MEIOBのOBフォールドは、一本鎖核酸を認識し、相互作用することができるコンパクトなバレルのような構造です。OBドメインの1つ(aa 136-307、構築A)は、一本鎖DNA(ssDNA)、切り捨てられたタンパク質(aa 136-178切り捨て、構築C)およびMEIOBの点変異形態(R235A突然変異、構築E)を結合するDNA結合活性26を有しない。GST-MEIOB融合タンパク質はBL21細菌で過剰発現し、その後の単離工程により、クーマッシーブルー染色およびウェスタンブロット解析によって示される精製タンパク質が得られた(図1B)。異なる濃度の核酸基質は、ビオチンシグナルの高感度を示し、1〜3s(図2A)に対する比較的短い露光時間の後に1nMオリゴの検出可能なシグナルを有する。野生型MEIOB-Aタンパク質は、変異型MEIOB-EおよびMEIOB-Cタンパク質ではないが、36ntビオチン標識ssDNA基質(以前に使用したのと同じ長さと配列)に強く結合し(図2B)、基質を切断するはしご (図 2C)
図2B,Cで使用されるssDNA基質と同じ配列のRNAオリゴを有するMEIOBタンパク質のインビトロアッセイは、36 nt一本鎖RNA(ssRNA)上のMEIOBの結合能力およびエキソクレアーゼ活性を示す(図3A,B)).DNAおよびRNAとのMEIOBの結合活性をさらに定量的に分析した(図3C)。さらに、FLAGタグ付きMOV10タンパク質をHEK293T細胞から精製した(図4A)。MOV10のヘリケース活性を測定するために、二重RNA(以前に使用された16と同じ長さであるが、異なる配列)を18 nt 5'オーバーハング(図4B)を有するように設計した。ビオチン標識RNAデュプレックスをATPの存在下でMOV10でインキュベートすると、放出された一本鎖ビオチン標識RNAに対応する低帯域が、RNAヘリケースとしてのMOV10の機能を反映して、時間の増加とともに現れた。最後に、コストを削減するために、ビオチン標識の化学発光検出のための試薬の使用を最適化しようと試みた。化学発光核酸検出キットの二重希釈は、ビオチン連鎖性ビジン系の発色感受性に悪影響を及ぼさなかったことが判明し、自作試薬はほぼ同様に機能した(図5)。).
図 1: 精製MEIOBタンパク質。(A) 本研究26で用いたMEIOB構造の概略図表。MEIOB には OB ドメインが含まれています。全てのMEIOB構築物(A,C,E)をGST融合タンパク質として発現した。(B)GST-細菌系を用いて精製したMEIOBタンパク質のクオマッシーブルー染色およびウェスタンブロット分析。赤い矢印は精製されたMEIOBタンパク質の位置を示す。約26 KDaのバンドはグルタチオンに相当する。ウェスタンブロットについては、抗GST抗体を1:6000希釈で使用した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: MEIOB-ssDNA相互作用のインビトロアッセイ.(A) 36 ntビオチン標識ssDNAの異なる濃度のシグナル強度試験。(B) BIOTin 5'末端標識DNA基質(10%天然ゲル)に結合するMEIOBタンパク質のEMSA結果。(C) BIOOB媒介切断ビオチン5'末端標識DNA基板(20%天然ゲル)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: MEIOB-ssRNA相互作用のインビトロアッセイ。(A) BIOTin 5'末端標識RNA基質(10%ネイティブゲル)に結合するMEIOBタンパク質のEMSA結果。(B)BIOOB媒介切断ビオチン5'末端標識RNA基板(20%天然ゲル)。(C) DNA/RNA結合率対MEIOB-A濃度の割合のプロット。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 精製MOV10タンパク質およびその5'尾翼dsRNAのインワインドイントロ。(A) FLAG-HEK293T系を用いて精製したMOV10タンパク質のクーマッシーブルー染色。赤い矢印は、精製されたMOV10タンパク質の位置を示す。約55kDaの分子量を有するクマシーゲル上のバンドは、FLAG抗体からの重い免疫グロブリン鎖(IgG)に相当する。(B) MOV10は37°Cで増加時間(10、30、60分)と5'尾のdsRNAを巻き取る。ssRNA = 18 nt一本鎖RNA、dsRNA= 54 nt二本鎖RNAと18 nt 5'末尾(20%ネイティブゲル)を持つ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 代替メソッドのビオチンを使用する発色性試薬sMEIOBアッセイに関する。市販の標準的な容積:化学発光核酸検出キットによって指示される;2x希釈された商業体積:化学発光核酸検出キットにおける各バッファーの2倍希釈、自作試薬:ステップ3.7.3の詳細を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:PCRに使用されるプライマーが遺伝子を増幅するメイオブとMov10の断片。前方と逆のプライマーの太字はBamHIとNotI切断部位です。逆プライマーの斜体の太字はXhoI切断部位です。箱内の太字は、点突然変異R235Aに対応するヌクレオチドを示す。
表2:本研究で用いられるDNA/RNA基板の配列。
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Discussion
タンパク質と核酸の相互作用を調べると、多様な生物学的プロセスの基礎となる分子メカニズムを理解するうえで重要です。例えば、MEIOBは、哺乳類25、26、27におけるマイオシスおよび不妊に不可欠な精巣特異的タンパク質である。MEIOBは、一本鎖DNAに結合するOBドメインを含み、3'〜5'エキソヌクレアーゼ活性26を示し、これは、メオティック再組換え時の生理的関連性に直接関連する。別の例として、MOV10は、RNA二次構造16と関連しきうるユビキタス機能を有するRNAヘリケースである。したがって、MOV10は広範なRNA結合特性と5'〜3'RNA二重巻き戻し活性16を表示する。これらのタンパク質の上記の生化学的活性を報告する研究は、インビトロアッセイ用の核酸を標識する32P同位体の使用に依存した。本研究では、MEIOBおよびMOV10機能のインビトロ実験における一連のビオチン標識に対するプロトコルを確立した。これらのプロトコルは、活性タンパク質の調製から始まり、ビオチンシグナルのイメージングで終わりました。
具体的には、以前の研究25、26に沿って、MEIOBタンパク質は細菌で過剰発現し、精製はゲル電気泳動後に強いクーマッシー染色シグナルを有する単一バンドを得た。しかし、全長MOV10タンパク質の精製は、細菌中のGST融合タンパク質としてよりもHEK293T細胞においてFLAGタグ融合タンパク質として過剰発現した場合に有効であった(データは示されていない)。その後の反応に十分な純度で十分な量のタンパク質を得るためには、これらの2つのタンパク質精製システムを比較して、異なるサイズおよび/または特性を有するタンパク質に最適な方法を決定する必要があります。次いで、32Pの代わりにビオチンを基質として標識し、両タンパク質の核酸結合親和性または核酸処理活性を調べる際に強いシグナルを得た。しかし、細菌から精製されたタンパク質はRNaseで汚染される頻度が高いため、インビトロ反応中に見られる切断活性が一部RNaseを汚染した結果として生じる可能性を排除することは困難である。触媒活性の低下(切り捨ておよびポイント変異体)を有するMEIOB変異体を有するインビトロアッセイは、RNA基質処理の実質的な障害を示したが、RNase汚染の可能性は排除できない。ssDNAおよびMOV10巻き戻しdsRNAに作用するMEIOBの各々で得られた結果は、以前の研究16、26で得られたものと類似している。しかし、MEIOBはDNAを処理してスミアを生成し、実験結果に従ってRNAでより離散的なバンドが見られる(図2Cおよび図3B)。おそらく、MEIOBはDNAおよびRNA基板(図2B、図3A、C)に対する微分結合能力を有し、切断産物の差をもたらす。MEIOBがDNAとRNAを明確な方法で切断することも考えられます。RNA処理におけるMEIOBの正確な役割は、さらに調査されるべきである(例えば、HEK293T細胞で発現されるFLAGタグ融合MEIOBタンパク質を用いた)。
ビオチン標識核酸プローブは、特定の保護および廃棄物処理を必要としないというという理由で、32個のP標識プローブよりも有利です。第二に、ビオチン標識プローブは-20°Cで少なくとも1年間安定して保存できますが、32のP標識プローブは2週間しか持続しません。したがって、ビオチン標識核酸の同じバッチを長期間にわたって使用することができ、実験の再現性を維持する。最後に、放射性プローブの急速な自動無線撮影は、蛍光体スクリーンなどの高価な機器に依存する可能性があります。対照的に、ここで説明するすべてのビオチン標識アッセイは1日以内に行うことができ、特別な装置を必要としません。ビオチン標識の欠点は、主に、ビオチン標識基板を検出するために必要であるが、さらに最適化またはトラブルシューティングを必要とするゲル転写および化学発光を含む追加の実験ステップを包含する。もう一つの一般的な弱点は、放射性同位体標識のそれと比較してビオチン標識の比較的低い感度です。これらのアッセイでは、それにもかかわらず、非常に低濃度の核酸の目に見える検出が達成された(図2A)。
さらに、半乾燥ゲル転写装置は、通常より長いゲルを膜に移すのに適している。湿式移動と比較して、半乾燥転写は特に核酸に対して速く、低いバックグラウンド信号を生み出す。さらに、ビオチン連鎖性ビジン系の発色反応のコストは、市販試薬を希釈するか、または独自に作ることによって削減され、どちらも同様のシグナルを達成した。自作試薬の検出感度は高くないように見えるかもしれないが、本明細では十分であるが(図5C)、ブロッキング時間(未発表データ)を延長することによって増強することができる。また、シグナルは、アッセイに使用される核酸プローブの濃度の上昇により増強することができる。上記の実験的証拠を考えると、ビオチン標識は、複数のインビトロ生化学アッセイにおける32Pに有利な代替品であってもよい。
まとめると、このプロトコルは、堅牢で信頼性が高く、効率的で、手頃な価格であることを証明するタンパク質-核酸相互作用の研究のためのビオチン標識プラットフォームを提供します。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
私たちは、P.ジェレミー・ワン(ペンシルバニア大学)に役立つ編集と議論に感謝します。また、言語編集のためのシグリッド・エッカートに感謝します。K.Z.は、中国国家主要研究開発プログラム(2016YFA0500902、2018YFC1003500)と中国国家自然科学財団(31771653)の支援を受けました。L.Y.は、中国国立自然科学財団(81471502、31871503)と江蘇省の革新的および起業家プログラムによって支援されました。浙江医科学技術プロジェクト(2019KY499)の支援を受けました。M.L.は、中国国立自然科学財団(31771588)と1000青少年人材計画の助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
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