Summary
여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.
Abstract
단백질 핵산 상호 작용은 전사, 재조합 및 RNA 대사와 같은 생물학적 과정에 중요한 역할을 합니다. 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 실험 방법은 특정 표적 분자를 검출하고 분석하기 위해 형광 태그, 방사성 동위원소 또는 기타 라벨을 사용해야 합니다. 비방사성 핵산 라벨인 비오틴은 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)에 일반적으로 사용되지만 핵산 과정 중 단백질 활성을 모니터링하기 위해 정기적으로 사용되지는 않았습니다. 이 프로토콜은 시험관 내 효소 반응 동안 비오틴 라벨링의 유용성을 보여 주며, 이 라벨이 다양한 생화학 적 분석과 잘 작동한다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 방사성 동위원소 32P표지 기판을 이용한 이전 연구 결과와 일치하여, BIOTin 표지된 EMSA를 통해 MEIOB(특히 메오틱 재조합에 관여하는 단백질)가 DNA 결합 단백질인 MOV10( RNA 헬리콥터)는 비오틴 표지RNA 이중 구조를 해결하고, MEIOB는 바이오틴 표지된 단일 가닥 DNA를 절단한다. 이 연구는 비오틴이 시험관 내에서 다양한 핵산 관련 생화학 적 세포학적 인 세포학적 인 세포학적 인 분석을 32 P로 대체 할 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
단백질 핵산 상호 작용은 DNA 복구, 복제, 전사, RNA 처리 및 번역과 같은 많은 필수 세포 프로세스에서 관련시다. 염색질 내의 특정 DNA 서열과의 단백질 상호 작용은 전사 수준 1에서유전자 발현의 엄격한 제어를 위해 요구된다. 수많은 코딩 및 비코딩 RNA의 정확한 사후 상사 조절은 어떤 단백질과 RNA2사이 광범위하고 복잡한 상호 작용을 필요로 합니다. 유전자 발현 조절 메커니즘의 이 층은 그들의 핵산 표적을 가진 전사/후성 유전학 요인 또는 RNA 결합 단백질의 상호 작용에 의해 조정되는 동적 분자 간 사건의 폭포를 포함합니다, 뿐만 아니라 단백질-단백질 상호 작용. 생체 내 단백질이 핵산과 직간접적으로 연관되어 있는지, 그러한 연관성이 어떻게 발생하고 절정에 이르는지 에 대해 해부하기 위해, 시험관내 생화학적 세포학적 인 화학 적 분석을 실시하여 관심 있는 단백질의 결합 친화도 또는 효소 활성을 조사하기 위해 수행됩니다. DNA 및/또는 RNA의 설계 기판.
전기영동성이동분석법(EMSA)을 포함한 핵산-단백질 복합체를 검출하고 특성화하기 위해 많은 기술이 개발되었으며, 겔 지연 분석 또는밴드 시프트 분석법 3,4,5 . EMSA는 핵산과 단백질의 직접 결합을 연구하는 데 널리 사용되는 다재다능하고 민감한 생화학 적 방법입니다. EMSA는 비오틴 라벨6,7, 형광 표지8,9,또는 에 의해 검출하기 위해 화학 발광을 사용하여 일상적으로 시각화되는 밴드의 겔 전기 영동 변화에 의존합니다. 방사성 32P 라벨10,11의자가 방사선 사진 . 생화학적 연구의 다른 목적은 핵산 기질(12)으로부터 의 분열 생성물을 평가하기 위한 뉴클레아제 기반 반응과 같은단백질의 핵산 처리 활성의 식별 및 특성화이다. 13세 , 도 14 및 DNA/RNA 구조-풀림-풀림 검사-헬리콥터 활동을 평가 하는15,16,17.
이러한 효소 활성 검법에서, 방사성 동위원소 표지 또는 형광부 표지 핵산은 그들의 높은 감도로 인해 종종 기질로서 사용된다. 32P 표지된 방사선 추적기를 관련시키는 효소 반응의 방사선 사진의 분석은 민감하고 재현 가능한18인것을 발견되었습니다. 그러나 전 세계적으로 점점 더 많은 실험실에서 방사성 동위원소의 사용은 잠재적 노출과 관련된 건강 위험으로 인해 제한되거나 심지어 금지됩니다. 생체 안전 문제 외에도 방사성 동위원소, 필요한 방사능 허가, 32P의 짧은 반감기 (약 14 일), 프로브 품질의 점진적 저하로 인해 작업을 수행하는 데 필요한 장비가 필요합니다. 방사선 요법. 따라서, 대체 비동위원소 적 방법이 개발되었다(즉, 형광로 프로브에 라벨을 부착하면 형광이미징(19)에의한 검출이 가능하게 된다). 그러나 형광 표지 프로브를 사용할 때는 고해상도 이미징 시스템이 필요합니다. 일반적으로 사용되는 라벨인 비오틴은 단백질과 핵산과 같은 생물학적 거대분자에 쉽게 결합합니다. 비오틴-스트렙타비딘 시스템은 비특이적배경(20,21)을증가시키지 않고 효율적으로 작동하고 검출 감도를 향상시킨다. EMSA 외에, 비오틴은 단백질 정제 및 RNA 풀다운에 널리 사용되며, 그 중에서도22,23,24.
이 프로토콜은 성공적으로 BIOTIN이 일반적으로 사용되지 않은 효소 반응 이외에 EMSA를 포함하는 시험관 내 생화학 분석문을 위한 기질로 비오틴 표지된 핵산을 이용합니다. MEIOB OB 도메인은 생성되고 2개의 돌연변이체(잘림 및 점 돌연변이)는 GST 융합 단백질25,26,27뿐만아니라 마우스 MOV10 재조합 FLAG 융합 단백질16으로발현된다. 이 보고는 그잡다한 실험 목적을 위한 단백질 정제 및 비오틴 표지된 분석실험을 위한 이 결합된 프로토콜의 효과를 강조합니다.
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Protocol
1. 단백질 준비
- MEIOB 및 MOV10 식 구문
- cDNA 발현 구문 생성 마우스 MEIOB-A, C 및 E(도1A)및 MOV10을 인코딩한다.
- 각 단편에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응을 설정합니다. 마우스 cDNA 1 μL(C57BL/6 마우스 고환), dNTP 1 μL, 10 μM 포워드 프라이머 2 μL, 10 μM 리버스 프라이머 2 μL, DNA 폴리머라제 1μL, 2x PCR 완충제 25μL, 이중 증류H2O(ddH 2O) 18μL 50 μL의 볼륨.
참고: 메이옵 및 Mov10 유전자 단편의 증폭을 위한 프라이머는 표 1에 열거되어 있다. - 다음 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 수행하십시오 : 5 분 동안 95 °C, 15 s의 경우 95 °C에서 35 사이클, 15 s의 경우 64 °C에서 어닐링, 20 초 동안 72 °C에서 연장 (전체 길이 MOV10 연장을위한 2 분), 최종 연장은 7 분 동안 68 °C에서 수행하십시오.
참고: 프라이머 쌍 MEIOB-E(F1) 및 MEIOB-E-뮤트(R1) 및 MEIOB-E-뮤트(F2) 및 MEIOB-E-뮤트(R2)를 사용하여 각각 3' 및 5' 말단에서 중첩 된 서열 내에 돌연변이 서열을 포함하는 2개의 세그먼트를 증폭시키고, 돌연변이 PCR 템플릿을 생성한다.
- 각 단편에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응을 설정합니다. 마우스 cDNA 1 μL(C57BL/6 마우스 고환), dNTP 1 μL, 10 μM 포워드 프라이머 2 μL, 10 μM 리버스 프라이머 2 μL, DNA 폴리머라제 1μL, 2x PCR 완충제 25μL, 이중 증류H2O(ddH 2O) 18μL 50 μL의 볼륨.
- 겔 전기 동공에 의해 증폭 된 PCR DNA를 분석하고, UV 램프 아래에서 젤에서 필요한 크기의 밴드를 신속하게 절단하고 원심 분리튜브에 넣습니다.
참고: MEIOB-A의 아가로즈 겔에서 볼 수 있는 예상 제품 크기는 536bp, MEIOB-C는 296bp, MEIOB-E는 312bp 및 229bp, MOV10은 3015bp입니다. - 제조업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트로 PCR DNA를 정화합니다.
- 1.1.2 단계에서 원심 분리튜브에 동일한 부피의 용해 버퍼를 넣고 50-55 °C 의 수조에서 5-10 분 동안 젤을 녹여 젤 조각이 완전히 녹도록합니다. 잠시 원심분리기튜브의 벽에서 물방울을 수집합니다.
참고 : 겔의 질량 / 부피 농도와 용해 버퍼는 1 mg / μL입니다. - 수집 튜브에 흡착 컬럼을 놓고, 용해 된 겔 단편을 함유 한 용액을 흡착 컬럼으로 옮기고, 원심 분리기를 12,000 x g에서 2 분 동안 옮긴다.
- 수집 튜브 의 하단에 여과물을 폐기. 세척 버퍼의 600 μL을 열에 추가하고 1 분 동안 12,000 x g의 원심 분리기를 넣고 여과액을 폐기하십시오.
- 1.1.3.3 단계를 한 번 반복합니다.
- 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣고 원심분리기를 12,000 x g에서 2분 동안 사용하여 나머지 세척 버퍼를 모두 제거합니다.
- 흡착 컬럼을 1.5 mL 멸균 원심분리기 튜브에 넣고 흡착 컬럼의 중앙에 ddH2O 50 μL을 추가하고 1분 동안 12,000 x g에서 원심분리기를 추가합니다.
- 1.1.2 단계에서 원심 분리튜브에 동일한 부피의 용해 버퍼를 넣고 50-55 °C 의 수조에서 5-10 분 동안 젤을 녹여 젤 조각이 완전히 녹도록합니다. 잠시 원심분리기튜브의 벽에서 물방울을 수집합니다.
- 플라스미드의 제한 소화
- BamHI 및 NotI로 pGEX-4T-1 벡터를 다이제스트합니다. 이렇게 하려면, pGEX-4T-1 벡터 4 μg, 10x 다이제스트 버퍼의 5 μL, 1 μL의 BamHI, 및 1 μL의 NotI 및 ddH2O를 50 μL의 최종 반응 부피로 혼합한다. 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- pRK5 벡터를 BamHI 및 XhoI와 함께 4 μg의 pRK5 벡터, 5 μL의 10x 다이제스트 버퍼, 1 μL의 BamHI 및 1 μL의 XhoI 및 ddH2O를 50 μL의 최종 반응 부피로 혼합하여 다이제스트. 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 겔 전기동공에 의해 벡터 DNA를 분석하고, UV 램프 아래의 메스로 젤로부터 원하는 크기의 밴드를 빠르게 절단하고 원심분리관에 넣는다.
- 겔 추출 키트로 벡터 DNA를 제조자의 지시에 따라 1.1.3으로 정화합니다.
참고 : 선형 화 플라스미드의 길이 : pGEX-4T-1, 4.4 kb; pRK5, 4.7 kb. - 선형화된 벡터의 0.03 pmol, cDNA 단편의 0.06 pmol, 2 μL의 리가제, 및 5x 리가제 완충제 및 ddH2O의 최종 반응 부피를 10 μL의 최종 반응 부피에서 결합하여 표준 재조합 결찰 반응을 설정한다.
참고: MEIOB-A, C 및 E를 pGEX-4T-1 벡터로 복제하고 MOV10을 pRK5 벡터로 한다. - 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양한 다음, 즉시 5분간 얼음에 반응합니다. MEIOB 재조합 플라스미드를 BL21 박테리아와 MOV10 재조합 플라스미드를 DH5α 박테리아로 변환합니다.
참고: Sanger 시퀀싱으로 모든 재조합 구문 확인. - 액체 배양물에 50% 글리세롤의 동일한 부피를 추가하여 검증된 재조합 플라스미드를 함유한 박테리아 배양물의 글리세롤 스톡을 준비하고 -80°C에 보관합니다.
참고: 각 후속 실험에 대 한, 신선한 한천 접시에 글리세롤 주식에서 박테리아를 줄무늬 와 단계 1.2에 설명 된 대로 확장에 대 한 단일 식민지를 사용 하 여.
- cDNA 발현 구문 생성 마우스 MEIOB-A, C 및 E(도1A)및 MOV10을 인코딩한다.
- 박테리아에서 MEIOB 단백질 추출물
- 100 μg/mL ampicillin을 함유하는 3 mL LB에서 시퀀싱 및 접종에 의해 검증된 빈 또는 재조합 pGEX-4T-1 플라스미드로 형질감염된 각 BL21 균주의 1개의 콜로니를 선택한다. 220 rpm에서 흔들어 37 °C에서 하룻밤 성장.
- 3 mL 하룻밤 배양으로부터 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 300 mL LB를 접종합니다(1.2.1단계로부터). OD600이 0.5-1.0에 도달할 때까지 2시간 동안 37°C에서 흔들리면서 배양물을 성장시다.
- 이소프로필 베타-D-티오갈라코피라노사이드(IPTG)를 0.2 mM의 최종 농도에 첨가하여 단백질 발현을 유도한다. 180 rpm 및 18 °C에서 흔들림과 함께 추가로 3 시간 동안 배양한다.
- 20분 동안 3,500 x g 및 4°C에서 세균 배양을 원심분리한다.
- 얼음 차가운 덜베코의 인산완충식염수(DPBS) 완충재 20 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 25사이클 동안 얼음에 세균 현탁액을 10초 간 초음파 처리(출력 전력 20%) 2-3의 얼음 위에 쉬고 있습니다.
- 용해액을 12,000 x g 및 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리합니다.
- 사전 세척 구슬.
- 신선한 15 mL 튜브에 글루타티온 -세파로즈 구슬 300 μL을 추가하고 얼음 차가운 PBS 버퍼 10 mL로 구슬을 씻습니다.
- 750 x g 및 4 °C에서 1 분 동안 비드를 펠렛하고 세척 용액을 폐기하십시오.
- 세척된 비드에 용해액을 넣고 4°C에서 2시간 동안 배양하고, 750 x g에서 원심분리기를, 4°C에서 1분 동안 구슬을 펠렛한다. 얼음으로 차가운 PBS 8x의 10 mL에서 구슬을 헹구는다.
- 용출 완충제의 1 mL(pH 8.0에서 50 mM Tris-HCl에서 10 mM 글루타티온)으로 6x를 사용하여, 각 용출 단계 전에 10분 동안 4°C에서 배양한다. 750 x g 및 4°C에서 원심분리기를 1분 동안 구슬을 펠렛한다. 수집 및 6 분수를 풀.
- 용출된 단백질을 원심 필터로 옮기고 7,500 x g의 원심분리에 의해 농축하여 최종 부피를 100-200 μL로 얻습니다.
- HEK293T 세포에서 추출한 MOV10 단백질 추출물
- 배양된 HEK293T 세포에서 MOV10 단백질을 일시적으로 발현한다.
- MOV10-pRK5 플라스미드를 농도 >500 ng/μL로 준비합니다.
- 종자 HEK293T 세포에서 15cm 접시. 세포 밀도가 ~70%-90%에 도달하면, 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 신선한 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)로 세포 배양 배지를 대체하십시오.
- 한 번의 트랜스펙션을 위해, 감소된 혈청 배지의 3 mL에서 MOV10-pRK5 플라스미드 DNA 60 μg를 희석한 다음, 형질감염 증강제 시약의 120 μL을 첨가하고 잘 섞는다.
- 별도의 튜브에서 환전 시약의 90 μL을 감소 된 혈청 배지 (페니실린 - 스트렙토 마이신없이)와 잘 혼합합니다.
- 희석 된 형질 감염 시약의 각 튜브에 희석 된 DNA를 추가하십시오. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 형질감염 혼합물을 세포 배양에 첨가하고, 배양 세포를 ~36-48시간 동안 배양한다.
- 36-48 시간 후, 50 mL 튜브에서 각 플레이트로부터 세포를 수집합니다. 500 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 각 펠릿을 10 mL의 얼음 차가운 PBS로 세척하고 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
- 완전한 에릴렌디아민테트라아세트산(EDTA)-프리 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 3 mL의 세포 용해 완충제에서 펠릿을 다시 중단시입니다. 얼음에 30 분 동안 배양. 20,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 용해액을 원심분리한다.
- 1.5 mL 튜브에 세포 접시 당 100 μL의 안티 FLAG 자기 구슬을 추가합니다.
- K150 버퍼 (pH 7.5, 150 mM KoAc, 1mM DTT, 0.1 % NP-40에서 50 mM HEPES)로 자기 구슬 2 x를 씻으하십시오.
- 얼음으로 차가운 K150 버퍼 1mL에서 자기 구슬을 다시 일시 중단합니다.
- 자석의 도움으로 부드러운 회전과 펠렛 4 °C에서 2 분 동안 자기 구슬을 배양. 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 1.3.3단계에서 세포 용해상에 자기 비드를 넣고 2시간 동안 4°C에서 배양한다.
- 단백질 결합 자기 비드를 K150 버퍼로 3배 씻은 다음 250 mM NaCl을 포함하는 K150으로 2x, K150 버퍼를 1.3.5로 3배 씻습니다.
- 300 μL의 FLAG 용출 완충제(100 mM NaCl, pH 7.5, 5 mM MgCl 2,10% 글리세롤에서 20mM Tris-HCl)에서 비드를 다시 중단하고, 0.5 μg/μL의 최종 농도에 FLAG 펩타이드를 추가하고, 4°C에서 4°C에서 비드로 인큐베이팅합니다. , 자석의 도움으로 자기 구슬을 펠렛.
- 용출된 MOV10 단백질을 함유하는 상상체를 수집하고, 농도를 결정하고, 향후 사용을 위해 -80°C에서 보관한다.
- 배양된 HEK293T 세포에서 MOV10 단백질을 일시적으로 발현한다.
2. 핵산 제제
- 적절한 공급원으로부터 비오틴 라벨유무에 관계없이 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드(올리고)를 구입합니다. RNase-free ddH 2O~ 20 μM에서 각 올리고를 희석하고 향후 사용을 위해 -80 °C로 유지하십시오.
참고: 본 연구에 사용된 DNA/RNA 기판의 올리고 서열은 표2에 나열되어 있습니다. - MOV10 헬리콥터 활성 분석에 대한 이중 가닥 RNA (dsRNA) 어닐링 반응에 대해 다음 혼합물을 준비하십시오 : pH 7.5, 6 mM KCl, 0.2 mM MgCl2 및 RNase-freedH에서 60 mMN-2-하이드록스틸피라진-N-에탄-설포닉산(HEPES)을 혼합하십시오. O 20 μL의 최종 반응 부피에서.
- 어닐링 버퍼(step 2.2)에서 비오틴 표지 된 상부 가닥(2 μM, 최종 농도)과 1.5배의 라벨이 붙지 않은 상보적 바닥 가닥을 5분 동안 95°C에서 가열하여 RNA 이중을 형성한 다음, 천천히 방으로 냉각시 온도(RT)를 참조하십시오.
3. 체외 생화학 적 분석을
- EMSA 및 효소 반응
- MEIOB EMSA 분석의 경우, pH 7.5, 2 mM MgCl 2,50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% NP-40, 0.8 mM (또는 도 2 및 도3에 도시된 바와 같이 다른 관련 농도) MEOB에서 50 mM Tris HCl을 혼합합니다. 20 μL의 최종 반응 부피에서 바이오틴 표지 된 올리고뉴클레오티드 및 ddH2O. RT에서 30분 동안 배양하고, 5x 스톱 버퍼(125 mM EDTA, 50% 글리세롤)를 첨가하여 반응을 멈춥니다.
- 3.1.1단계에서 기재된 바와 같이 MEIOB 뉴클레아제 활성 반응을 설정하지만 10 mM EDTA를 첨가하지 않고.
- MOV10 헬리콥터 활성 분석의 경우, pH 7.5에서 50 mM Tris-HCl을 혼합하고, 20mM KoAc, 2 mM MgCl 2, 0.01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL RNase 억제제, 10 nM 바이오틴 표지 RNA 기판, 2 mM 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 100 nM RNA 트랩, 100 nM RNA 트랩 및 20 ng의 MOV10 단백질 및 dH >2O의 최종 반응 부피에서 20 μL. 반응 혼합물을 37°C에서 10분, 30분 및 60분 동안 배양하고, 반응을 멈추도록 5x 스톱 버퍼를 추가한다.
참고 : RNA 트랩, 서열과 비오틴 - 라벨되지 않은 올리고, 다시 어닐링에서 풀린 dsRNA를 방지 라벨 올리고에 상보성.
- 폴리아크릴아미드 젤
- 젤 플레이트 (16cm x 16cm)와 1.5mm 빗을 씻으소서. 겔 전기 동동 단위를 조립합니다.
- 10% 네이티브 폴리아크릴아미드 젤을 준비하려면, 혼합 14 mL 의 ddH2O, 10x 트리스 - 붕산 -EDTA (TBE), 8.3 mL의 30 % 아크릴아미드, 1.25 mL의 50 % 글리세롤, 187.5 μL의 10 % 갓 제조 된 암모늄 퍼황페이트 (APS), 및 12.5L의 테트라메틸레틸렌디아민 (TEMED).
- 20% 네이티브 폴리아크릴아미드 젤을 준비하려면 ddH2O 5.5 mL, 10x TBE 1.25 mL, 50% 글리세롤 1.25 mL, 30% 아크릴아미드 16.7 mL, 10% APS 187.5 μL, 12.5 μL을 혼합합니다.
- 아크릴아미드 용액을 즉시 젤에 붓고 빗을 삽입합니다. 혼합물을 약 30분 동안 중합시켰다.
- 젤 러닝
- 빗을 제거하고 전기 동공 실행 버퍼 (0.5x TBE)로 탱크를 채웁니다.
- 샘플 우물을 0.5x TBE 버퍼로 헹구고 30 분 동안 얼음에 100V에서 젤을 미리 실행합니다.
- 20-25 μL 샘플을 각 우물에 적재하십시오.
- EMSA 분석에 10% 네이티브 아크릴아미드 젤과 효소 분석용 20% 네이티브 아크릴아미드 젤을 사용하십시오. 브로모페놀 블루 마커가 젤의 하단 분기로 이동 될 때까지 얼음 욕조에서 100V에서 전기 동아를 실행합니다.
- 젤 플레이트를 분해하고 로딩 웰과 사용하지 않은 차선을 제거하여 젤을 다듬습니다. 젤을 0.5x TBE 버퍼에 놓습니다.
- 필터 용지와 나일론 멤브레인을 젤 크기로 자른다. 깨끗한 필터 용지와 나일론 멤브레인을 미리 적시킵니다.
- 전송을 위해 스택을 어셈블합니다.
- 젖은 미리 젖은 멤브레인을 젖은 예열 된 필터 용지에 놓습니다.
- 막에 젤을 놓습니다.
- 젤을 젖은 필터 용지의 또 다른 층으로 덮습니다.
- 깨끗한 파이펫을 중앙에서 가장자리로 압연하여 모든 기포를 제거합니다.
- 90 mA에서 반건조 전기 영동 장치에서 겔에서 멤브레인으로 샘플을 20 분 동안 옮김을 옮김.
- 전사를 중지한 다음 새 필터 용지에 멤브레인을 1분 동안 건조시킵니다.
- 254 nm 전구 (자동 크로스 링크 기능)가 장착 된 UV 광 크로스 링커에서 45-60 s에 대해 120 mJ / cm2에서 멤브레인을 조사하여 샘플을 교차 연결합니다. RT에서 멤브레인을 30분 동안 건조시킵니다.
- 케밀발광 검출
- 프로토콜 1: 상용 화학 발광 핵산 검출 키트의 표준 부피를 사용한다.
- 막에 블로킹 버퍼 20 mL를 추가하고 20-25 rpm에서 회전자에서 부드럽게 흔들면서 15-30 분 동안 배양하십시오.
- 블로킹 버퍼의 20 mL에 66.7 μl 안정화 스트렙타비딘 고추냉이 퍼옥시다아제 컨쥬게이트를 추가하여 컨쥬게이트/블로킹 완충액을 준비합니다.
- 블로킹 버퍼를 부드럽게 제거하고 컨쥬게이트/블로킹 버퍼로 교체합니다. 20-25 rpm에서 회전자에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 멤브레인을 4x로 40-45 rpm에서 5 분 동안 흔들어 주세요.
- 멤브레인에 30 mL의 기판 평형 버퍼를 추가합니다. 20-25 rpm에서 흔들어 5 분 동안 멤브레인을 배양하십시오.
- 6mL의 안정적인 과산화물 용액에 6mL의 루미놀/인핸서 용액을 추가하여 기판 작동 솔루션을 준비합니다. 빛을 피하십시오.
- 기판 작업 용액으로 멤브레인의 전체 표면을 덮고 5 분 동안 배양하십시오.
- 1-3 s에 대 한 화학 발광 이미징 시스템에서 막을 스캔.
- 프로토콜 2: 2x 희석된 상업용 화학발광 핵산 검출 키트를 사용하고 3.10.1.1-3.10.1.8 단계를 따릅니다.
- 프로토콜 3: 자체 제작 시약사용6.
- 차단 버퍼 준비: pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 mM MgCl2,및 3% 소 혈청 알부민 분수 V. AP 7.5 버퍼에서 0.1 M Tris-HCl을 pH 7.5, 0.1 M NaCl 및 2 mM MgCl에서 혼합합니다. AP 9.5 버퍼: pH 9.5, 0.1 M NaCl 및 50 mM MgCl2에서 0.1 M Tris-HCl을 혼합합니다. TE 버퍼: pH 8.0에서 10 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 1 mM EDTA를 혼합합니다.
- 1 시간 동안 30 °C에서 차단 버퍼에 멤브레인을 담그십시오.
- 8.5 μL의 스트렙타비딘 알칼리성 인산염을 AP 7.5 완충액의 10 mL에 첨가합니다. RT에서 이 용액에서 멤브레인을 10분 동안 부드럽게 흔들어 주세요. 이어서, 멤브레인을 10분 동안 AP 7.5 완충액의 15 mL에서 2x 로 세척한다.
- 10 분 동안 AP 9.5 버퍼의 20 mL에서 멤브레인을 한 번 더 씻어 반응을 중지하는 TE 버퍼의 20 mL를 추가합니다.
- 멤브레인에 7.5 mL의 개발 솔루션을 추가하고 1-3 초 동안 화학 발광 이미징 시스템에서 멤브레인을 스캔합니다.
- 프로토콜 1: 상용 화학 발광 핵산 검출 키트의 표준 부피를 사용한다.
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Representative Results
본 연구에서 사용되는 MEIOB및 발현 구조의 단백질 구조는 도 1A에예시되어 있다. MEIOB의 OB 접기는 단일 가닥 핵산을 인식하고 상호 작용할 수 있는 소형 배럴형 구조입니다. OB 도메인 중 하나(aa 136-307, 구성 A)는 단일 가닥 DNA(ssDNA), 잘린 단백질(aa 136-178 잘림, 구성 C) 및 MEIOB의 점 돌연변이 형태(R235A 돌연변이, 구성 E)를 결합하여 DNA 결합 활성26을갖지 않는다. GST-MEIOB 융합 단백질은 BL21 박테리아에서 과발현되었고, 후속 분리 단계는 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 정제 단백질의 결과로 나타났다 (그림1B). 상이한 농도에서의 핵산 기질은 1-3s에 대한 비교적 짧은 노출 시간 후에 1 nM 올리고의 검출 가능한 신호와 함께 비오틴 신호의 높은 감도를 도시한다(도2A). 야생형 MEIOB-A 단백질은 돌연변이MEIOB-E 및 MEIOB-C 단백질이 아니지만, 36nt 비오틴 표지 된 ssDNA 기질(이전에 사용된 것과동일한 길이 및 서열)에 강하게 결합하고 (도2B) 기판을 절단하여 사다리 (그림2C).
도 2B,C에 사용된 ssDNA 기질과 동일한 서열의 RNA 올리고를 가진 MEIOB 단백질의 시험관내 분석법은 36 nt 단일 가닥 RNA(ssRNA)에 MEIOB의 결합 용량 및 외핵활성을 도시한다(그림3A,B ). DNA 및 RNA를 가진 MEIOB의 결합 활성은 추가로 정량적으로 분석하였다(도3C). 추가적으로, FLAG 태그된 MOV10 단백질은 HEK293T 세포로부터 정제되었다(도4A). MOV10의 헬리케이스 활성을 측정하기 위해, 듀플렉스 RNA는 18 nt 5' 오버행을 베어링(이전16보다동일한 길이이지만 다른 서열)을 설계하였다(도4B). 비오틴 표지된 RNA 이중이 ATP의 존재에서 MOV10으로 배양되었을 때, 방출된 단일 가닥 비오틴 표지 RNA에 대응하는 하부 대역은 RNA 헬리콥터로서의 MOV10의 기능을 반영하는 증가된 시간으로 나타났다. 마지막으로, 비용을 절감하기 위해, 비오틴 라벨의 화학발광 검출을 위한 시약의 사용을 최적화하기 위해 시도되었다. 화학발광 핵산 검출 키트의 2배 희석이 비오틴 스트렙타비딘 시스템의 발색성 민감도에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 흥미롭게도, 자가 만든 시약이 거의 동등하게 잘 작동한다는 것을 알 수 있었다(도5) ).
그림 1 : 정화 MEIOB 단백질. (a) 본 연구에 사용된 MEIOB 구문의 개략적 표현(26). MEIOB에는 OB 도메인이 포함되어 있습니다. 모든 MEIOB 컨스트럭트(A, C, E)를 GST 융합 단백질로 발현하였다. (B) GST-박테리아 시스템을 사용하여 정제된 MEIOB 단백질의 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블롯 분석. 빨간색 화살표는 정제된 MEIOB 단백질의 위치를 나타냅니다. 약 26 KDa의 밴드는 글루타티온에 해당합니다. 서쪽 얼룩의 경우, 항-GST 항체는 1:6000 희석과 함께 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : MEIOB-ssDNA 상호 작용의 시험관 내 검사 . (A) 36 nt 비오틴 표지 ssDNA의 상이한 농도의 신호 강도 테스트. (B) EMSA 결과 바이오틴 5' 최종 표지 된 DNA 기질에 결합MEIOB 단백질 (10% 네이티브 젤). (C) MEIOB 매개 로 바이오틴 5' 최종 표지 DNA 기질(20% 네이티브 겔)의 절단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : MEIOB-ssRNA 상호 작용의 시험관 내 세포내 세포. (A) EMSA 결과 바이오틴 5' 최종 표지 RNA 기질에 결합하는 MEIOB 단백질 (10% 네이티브 겔). (B) MEIOB 매개 로 바이오틴 5' 최종 표지 RNA 기질(20% 네이티브 겔)의 절단. (C) MEIOB-A 농도 대 DNA/RNA 결합 비율의 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 정제된 MOV10 단백질과 시험관 내 5' 꼬리 dsRNA의 풀림. (A) FLAG-HEK293T 시스템을 사용하여 정제된 MOV10 단백질의 쿠마시 블루 염색. 빨간색 화살표는 정제된 MOV10 단백질의 위치를 나타냅니다. 약 55 kDa의 분자량을 가진 쿠마시 겔상 밴드는 FLAG 항체로부터의 중한 면역글로불린 사슬(IgG)에 해당한다. (B) MOV10은 37 °C에서 증가 시간 (10, 30, 60 분)와 5 '꼬리 dsRNA를 해제합니다. ssRNA = 18 nt 단일 가닥 RNA, dsRNA = 18 nt 5' 꼬리를 가진 54 nt 이중 가닥 RNA (20% 네이티브 겔). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 대안 메서드 의 비오틴 사용 염색체 성 시약 s MEIOB 분석에. 상업적 표준 부피: 화학발광 핵산 검출 키트에 의해 지시; 2x 희석 된 상업적 볼륨 : 화학 발광 핵산 검출 키트에서 각 완충액의 2 배 희석, 자체 제작 시약 : 단계 3.7.3의 세부 사항을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: PCR에 사용되는 프라이머는 유전자를 증폭시 메이옵과 Mov10의 조각. 전진 및 역방향 프라이머의 굵은 글자는 BamHI 및 NotI 절단 사이트입니다. 역프라이머의 기울임꼴 굵은 글자는 XhoI 절단 사이트입니다. 상자에 있는 굵은 글자 들은 점 돌연변이 R235A에 대응하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
표 2: 이 작용에 사용된 DNA/RNA 기판의 서열.
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Discussion
단백질-핵산 상호 작용을 조사하는 것은 다양한 생물학적 과정의 근본적인 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에 매우 중요합니다. 예를 들어, MEIOB는 포유류25,26,27에서만이기와 불임에 필수적인 고환 특이적 단백질이다. MEIOB는 단일 가닥 DNA에 결합하고 meiotic 재결합 동안 의 생리적 관련성에 직접적으로 관련되는 3' 5' 외핵활성26을전시하는 OB 도메인을 포함합니다. 또 다른 예로서, MOV10은 RNA 이차구조(16)와연관될 수 있는 유비쿼터스 기능을 가진 RNA 헬리콥터이다. 이에 따라, MOV10은 광범위한 RNA 결합 특성 및 5' to 3' RNA 이중 해제 활성16을표시한다. 이 단백질의 위에서 언급한 생화확적인 활동을 보고하는 연구 결과는 시험관 내 분석을 위한 핵산을 표시하기 위하여 32P 동위원소의 사용에 의지했습니다. 본 연구에서, 우리는 MEIOB 및 MOV10 기능의 생체 외 내 실험에서 일련의 비오틴 표지에 대한 프로토콜을 확립했습니다. 이 프로토콜은 활성 단백질의 준비로 시작하고 비오틴 신호의 화상 진찰로 끝났습니다.
구체적으로, 이전 연구25,26에따라, MEIOB 단백질은 겔 전기 동동 후 강한 쿠마시 염색 신호를 가진 단일 밴드를 생성하고 정제와 함께 박테리아에서 과발현하였다. 그러나, 전신 MOV10 단백질의 정제는 HEK293T 세포에서 FLAG 태그 융합 단백질로 과발현될 때 박테리아에서 GST 융합 단백질보다 더 효과적이었다(데이터는 도시되지 않음). 후속 반응에 대한 적절한 순도에서 충분한 양의 단백질을 얻으려면 이 두 가지 단백질 정제 시스템을 비교하여 다양한 크기 및/또는 특성을 가진 단백질에 가장 적합한 방법을 결정해야 합니다. 핵산은 32P 대신 비오틴을 기질로 사용하여 표지되었고 두 단백질의 핵산 결합 친화도 또는 핵산 처리 활동을 조사할 때 강력한 신호를 얻었다. 그러나, 박테리아로부터 정제된 단백질이 RNase로 자주 오염되기 때문에, 시험관내 반응 중에 보이는 절단 활성이 부분적으로 RNase를 오염시키는 결과로 나타날 가능성을 배제하기는 어렵다. 감소된 촉매 활성을 가진 MEIOB 돌연변이체를 가진 시험관내 분석 (잘린 점 돌연변이) RNA 기질 처리의 상당한 손상을 보였지만, 가능한 RNase 오염은 배제될 수 없다. ssDNA 및 MOV10 풀림 dsRNA에 작용하는 각각의 MEIOB 컨스트럭트와 함께 얻은 결과는 이전 연구16,26에서수득된 것과 유사하다. 그러나, MEIOB는 DNA를 처리하여 얼룩을 생성하고, 실험 결과에 따라 RNA로 더 이산된 밴드가 보이는 반면(도2C 및 도 3B). 아마도, MEIOB는 DNA 및 RNA 기질에 대한 차동 결합 능력을 가지고 있다(도2B, 도 3A,C),이는 그들의 분열 제품의 차이로 이끈다. 또한 MEIOB가 DNA와 RNA를 뚜렷한 방식으로 절단할 수도 있습니다. RNA 처리에서 MEIOB의 정확한 역할은 더 조사되어야 한다(예를 들어, HEK293T 세포에서 발현되는 FLAG 태그 융합 MEIOB 단백질사용).
비오틴 라벨이 부착된 핵산 프로브는 특정 보호 및 폐기물 처리가 필요하지 않다는 점에서 32개의P 라벨 프로브보다 유리합니다. 둘째, 비오틴 라벨 프로브는 -20°C에서 최소 1년 동안 안정적으로 보존될 수 있는 반면, 32개의P-라벨 프로브는 2주 동안만 지속됩니다. 따라서, 비오틴 표지된 핵산의 동일한 배치는 장기간에 걸쳐 사용될 수 있으며, 실험의 재현성을 유지한다. 마지막으로, 방사성 프로브의 신속한 자기 방사선 촬영은 인광 체막과 같은 고가의 기기에 의존 할 수 있습니다. 대조적으로, 여기에 기술된 모든 비오틴 표지 된 측정법은 하루 안에 수행 될 수 있으며 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 비오틴 라벨링의 단점은 주로 바이오틴 표지기 검출에 필요한 겔 전달 및 케미발광을 포함한 추가적인 실험 단계를 포함하지만 최적화 또는 트러블슈팅이 추가로 필요할 수 있습니다. 또 다른 일반적인 약점은 방사성 동위원소 라벨링에 비해 비오틴 라벨링의 상대적으로 낮은 민감도입니다. 이러한 검문에서, 그럼에도 불구하고, 핵산의 매우 낮은 농도의 잘 보이는 검출이 달성되었다(도2A).
또한, 반건조 겔 전사 장치는 일반 겔보다 긴 겔을 멤브레인으로 전달하는 데 적합하다. 습식 전달에 비해, 반건 전달은 특히 핵산의 경우 더 빠르며 낮은 배경 신호를 산출합니다. 더욱이, 비오틴-스트렙타비딘 시스템의 발색성 반응의 비용은 상업적인 시약을 희석시키거나 우리 자신의 것으로 만들어서 절단되었으며, 둘 다 유사한 신호를 달성했다. 자수성약의 검출 감도는 본원에서 충분히 높음에도 불구하고 그다지 높지 않은 것처럼 보일 수 있지만(도5C),차단 시간(미공개 데이터)을 연장함으로써 향상될 수 있다. 또한, 신호는 세포에 사용되는 핵산 프로브의 증가된 농도로 강화될 수 있다. 상기 실험적 증거를 감안할 때, 비오틴 라벨은 다중 체외 생화학 적 실험에서 32P에 대한 유리한 대용품일 수 있다.
총체적으로, 이 프로토콜은 견고하고, 믿을 수 있고, 효율적이고, 적당한 것으로 입증되는 단백질 핵산 상호 작용의 연구를 위한 비오틴 표지된 플랫폼을 제공합니다.
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Disclosures
이해 상충은 선언되지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 도움이 편집 및 토론에 대한 P. 제레미 왕 (펜실베니아 대학)에 감사드립니다. 우리는 또한 언어 편집시그리드 에카르트에게 감사드립니다. K. Z.는 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2016YFA0500902, 2018YFC1003500)과 중국 국립자연과학재단(31771653)의 지원을 받았습니다. L. Y.는 중국 국립 자연 과학 재단 (81471502, 31871503)과 장쑤성의 혁신및 기업가 프로그램에 의해 지원되었습니다. J. N. 절강 의료 과학 기술 프로젝트 (2019KY499)에 의해 지원되었다. M. L.은 중국 국립 자연과학 재단(31771588)과 1000청소년 인재 계획의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
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