Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

I vitro biokjemiske analyser ved hjelp av biotin etiketter for å studere protein-nukleinsyre acid interaksjoner

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59830
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 4, 3, 1, 1
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University, 2The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, 3School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 4Department of Tissue and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease, Wuhan University
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er protokoller for in vitro biokjemiske analyser ved hjelp av biotin etiketter som kan være allment anvendelig for å studere protein-nukleinsyre acid interaksjoner.

Abstract

Protein-nukleinsyre acid interaksjoner spille viktige roller i biologiske prosesser som transkripsjon, rekombinasjon, og RNA metabolisme. Eksperimentelle metoder for å studere protein-nukleinsyre acid interaksjoner krever bruk av fluorescerende koder, radioaktive isotoper, eller andre etiketter for å oppdage og analysere spesifikke målmolekyler. Biotin, en ikke-radioaktiv nukleinsyre yre etikett, brukes ofte i Elektroforetiske mobilitets Skift analyser (EMSA), men har ikke vært regelmessig ansatt for å overvåke protein aktivitet under nukleinsyre yre prosesser. Denne protokollen illustrerer nytten av biotin merking under in vitro enzymatisk reaksjoner, viser at denne etiketten fungerer godt med en rekke ulike biokjemiske analyser. Nærmere bestemt, i tråd med tidligere funn ved hjelp av radioisotop 32P-merket underlag, er det bekreftet via biotin-merket EMSA at MEIOB (et protein spesielt involvert i meiotic rekombinasjon) er et DNA-bindende protein, som MOV10 (en RNA-helicase) løser biotin-merkede RNA dupleks strukturer, og at MEIOB kløyver biotin-merket enkelt-strandet DNA. Denne studien viser at biotin er i stand til å erstatte 32P i ulike nukleinsyre acid-relaterte biokjemiske analyser in vitro.

Introduction

Protein-nukleinsyre acid interaksjoner er involvert i mange viktige cellulære prosesser som DNA reparasjon, replikering, transkripsjon, RNA prosessering, og oversettelse. Protein interaksjoner med spesifikke DNA-sekvenser innenfor kromatin er nødvendig for stram kontroll av genuttrykk på transcriptional nivå1. Presis posttranscriptional regulering av mange koding og Noncoding RNAs nødvendiggjør omfattende og kompliserte interaksjoner mellom noe protein og RNA2. Disse lag av genet uttrykk regulatoriske mekanismen består av en kaskade av dynamiske Intermoleylære hendelser, som koordineres av interaksjoner av transkripsjon/epigenetic faktorer eller RNA-binding proteiner med sine nukleinsyre yre mål, samt Protein-protein interaksjoner. Å analysere om proteiner in vivo er direkte eller indirekte forbundet med nukleinsyre syrer og hvordan slike assosiasjoner oppstår og kulminere, in vitro biokjemiske analyser er utført for å undersøke bindende affinitet eller enzymatisk aktivitet av proteiner av interesse på design underlag av DNA og/eller RNA.

Mange teknikker har blitt utviklet for å oppdage og karakterisere nukleinsyre acid-protein komplekser, inkludert Elektroforetiske mobilitet Shift-analysen (EMSA), også kalt gel retardasjon analysen eller bandet Shift-analysen3,4,5 . EMSA er en allsidig og følsom biokjemiske metode som er mye brukt for å studere direkte binding av proteiner med nukleinsyre syrer. EMSA baserer på gel Elektroforetiske Shift i band, som er rutinemessig visualisere bruke kjemiluminescens å oppdage biotin etiketter6,7, fluorescens av fluoroforen etiketter8,9, eller ved autoradiografi av radioaktivt 32P etiketter10,11. Andre formål med biokjemiske studier er identifisering og karakterisering av nukleinsyre syre-prosessering aktivitet av proteiner, slik som nuklease-baserte reaksjoner for å vurdere kløften produkter fra nukleinsyre syre underlag12, 13 på alle , 14 og DNA/RNA struktur-slappe av analyser for å evaluere helicase aktiviteter15,16,17.

I slike enzymatisk aktivitet analyser, radioisotop-merket eller fluoroforen-merket nukleinsyre syrer er ofte brukt som underlag på grunn av sin høye følsomhet. Analyse av røntgenbilder av enzymatisk reaksjoner som involverer 32P merket radiotracers har blitt funnet å være følsom og reproduserbar18. Likevel, i et økende antall laboratorier i verden, er bruken av radioisotopes begrenset eller til og med forbudt på grunn av helserisikoen forbundet med potensiell eksponering. I tillegg til biosafety bekymringer, andre ulemper er nødvendig nødvendig utstyr for å gjennomføre arbeid med radioisotopes, nødvendig radioaktivitet lisens, kort halveringstid på 32P (ca 14 dager), og gradvis forverring av sonde kvalitet på grunn av radiolysis. Dermed har alternative ikke-isotopanrikning metoder blitt utviklet (dvs. merking sonden med fluorophores muliggjør påvisning av fluorescerende Imaging19). Et bildesystem med høy oppløsning er imidlertid nødvendig når du bruker fluorescensmerkete merket sonder. Biotin, en vanlig brukt etikett, binder seg lett til biologiske makromolekyler som proteiner og nukleinsyre syrer. Biotin-streptavidin systemet fungerer effektivt og forbedrer deteksjonsfølsomhet uten å øke ikke-spesifikk bakgrunn20,21. Foruten EMSA, biotin er mye brukt for protein rensing og RNA pull-ned, blant annet22,23,24.

Denne protokollen bruker biotin-merket nukleinsyre syrer som underlag for in vitro biokjemiske analyser som inkluderer EMSA, i tillegg til enzymatisk reaksjoner der biotin ikke har blitt vanlig brukt. MEIOB OB domenet er konstruert og to mutanter (avkorting og punkt mutasjon) er uttrykt som GST Fusion proteiner25,26,27, samt mus MOV10 rekombinant Flag Fusion protein16. Denne rapporten fremhever effektiviteten av denne kombinerte protokollen for protein rensing og biotin-merket analyser for diverse eksperimentelle formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. protein forberedelse

  1. MEIOB og MOV10 uttrykks konstruksjoner
    1. Generer cDNA uttrykket konstruerer koding musen MEIOB-A, C og E (figur 1A) og MOV10.
      1. Definer polymerase kjedereaksjoner (PCR) for hvert fragment. Bland 1 μL av musen cDNA (fra C57BL/6 mus testikkel), 1 μL av dNTP, 2 μL av 10 μM fremover primer, 2 μL 10 μM omvendt primer, 1 μL av DNA-polymerase, 25 μL av 2x PCR buffer, og 18 μL av dobbel destillert H2o (ddH2o) i en endelig volum på 50 μL.
        Merk: primere for forsterkning av Meiob og Mov10 gen fragmenter er listet opp i tabell 1.
      2. Utfør PCR-reaksjoner ved hjelp av følgende programmer: 95 ° c i 5 min, 35 sykluser med oppvarming ved 95 ° c for 15 s, annealing ved 64 ° c for 15 s, utvidelse ved 72 ° c i 20 s (2 min for å forlenge MOV10) og endelig utvidelse ved 68 ° c i 7 min.
        Merk: Bruk primer par MEIOB-E (F1) og MEIOB-E-mut (R1) og MEIOB-E-mut (F2) og MEIOB-E (R2) for å forsterke to segmenter som inneholder mutant sekvensen i en overlappende sekvens på henholdsvis 3 ' og 5 ' ender, for å generere en mutant PCR mal.
    2. Analyser forsterket PCR-DNA ved gel-elektroforese, klipp båndet av ønsket størrelse fra gelen raskt under en UV-lampe, og plasser den i et sentrifugerør.
      Merk: forventet produkt størrelser synlig på agarose gel for MEIOB-A er 536 BP, MEIOB-C er 296 BP, MEIOB-E er 312 BP og 229 BP, og MOV10 er 3015 BP.
    3. Rens PCR-DNA med et gel avsugs sett etter produsentens protokoll.
      1. Tilsett et likt volum av oppløsnings buffer i sentrifuge røret fra trinn 1.1.2 og smelte gel i et vannbad på 50-55 ° c i 5-10 min., slik at gel-bitene smelter helt. Sentrifuger kort for å samle eventuelle dråper fra veggen av røret.
        Merk: massen/volum konsentrasjonen av gelen og oppløsnings bufferen er 1 mg/μL.
      2. Plasser absorpsjons søylen i prøvetakingsrøret, Overfør løsningen som inneholder det oppløste gel-fragmentet til absorpsjons søylen, og sentrifuger på 12 000 x g i 2 min.
      3. Kast Filtrer i bunnen av oppsamlings rørene. Tilsett 600 μL av vaskebuffer til søylen, sentrifuger ved 12 000 x g for 1 min, og kast Filtrer.
      4. Gjenta trinn 1.1.3.3 én gang.
      5. Plasser kolonnen tilbake i oppsamlings røret, og sentrifuger på 12 000 x g for 2 min for å fjerne alle gjenværende vaskebuffer.
      6. Plasser absorpsjons søylen i et 1,5 mL sterilisert sentrifugerør, tilsett 50 μL av ddH2O til midten av absorpsjons Kol onnen og sentrifuge ved 12 000 x g i 1 min. måler DNA-konsentrasjonen til eluatet ved hjelp av spektrofotometer.
    4. Begrensning fordøyelse av plasmider
      1. Digest pGEX-4T-1 vektor med BamHI og NotI. For å gjøre dette, bland 4 μg av pGEX-4T-1 vektor, 5 μL av 10x Digest buffer, 1 μL av BamHI, og 1 μL av NotI og ddH2O til et endelig reaksjons volum på 50 μL. Ruge ved 37 ° c for 2 h.
      2. Digest pRK5 vektor med BamHI og XhoI ved å blande 4 mikrogram pRK5 vektor, 5 μL av 10x Digest buffer, 1 μL av BamHI, og 1 μL av XhoI og ddH2O til et endelig reaksjons volum på 50 μL. Ruge ved 37 ° c for 2 h.
    5. Analyser vektoren DNA ved gel elektroforese, kutt ønsket størrelse bandet fra gel raskt med en skalpell under en UV-lampe og plassere den i en sentrifuge tube.
    6. Rens vektoren DNA med et gel Extraction kit som 1.1.3 etter produsentens instruksjon.
      Merk: lengden på linearized plasmider: pGEX-4T-1, 4,4 KB; pRK5, 4,7 kB.
    7. Sett opp en standard rekombinant ligation reaksjon ved å kombinere 0,03 pmol av linearized vektor, 0,06 pmol av cDNA fragment, 2 μL av ligase, og 4 μL av 5x ligase buffer og ddH2O i et endelig reaksjons volum på 10 μL.
      Merk: Clone MEIOB-A, C og E inn i en pGEX-4T-1 vektor og MOV10 til en pRK5 vektor.
    8. Ruge blandingen ved 37 ° c i 30 min, og deretter avkjøles reaksjonen umiddelbart i 5 min på isen. Transform MEIOB rekombinant plasmider til BL21 bakterier og MOV10 rekombinant plasmider inn DH5α bakterier.
      Merk: Kontroller alle rekombinant konstruksjoner av sanger sekvensering.
    9. Forbered glyserol bestander av bakterielle kulturer som inneholder verifisert rekombinant plasmider ved å legge til et lik volum på 50% glyserol til flytende kulturer, og lagre ved-80 ° c.
      Merk: for hvert etterfølgende eksperiment, stripe ut bakterier fra glyserol aksjer på en frisk agar plate og bruke en enkelt koloni for utvidelsen som beskrevet i trinn 1,2.
  2. MEIOB protein ekstrakter fra bakterier
    1. Plukk en koloni av hver BL21 stamme transfekterte med den tomme eller rekombinant pGEX-4T-1 plasmider verifisert av sekvensering og vaksinere i 3 mL LB inneholdende 100 μg/mL Ampicillin. Vokser over natten ved 37 ° c med risting ved 220 RPM.
    2. Vaksinere 300 mL LB inneholdende 100 μg/mL Ampicillin fra 3 mL over natten kultur (fra trinn 1.2.1). Vokse kulturer med risting ved 37 ° c for 2 t til OD600 når 0,5-1,0.
    3. Indusere protein uttrykk ved å legge isopropylalkohol beta-D-thiogalactopyranoside (IPTH) til en endelig konsentrasjon på 0,2 mM. Ruge kulturene for ytterligere 3 timer med risting ved 180 RPM og 18 ° c.
    4. Sentrifuger bakterie kulturen ved 3 500 x g og 4 ° c i 20 min.
    5. Resuspend pellet i 20 mL iskald Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann (DPBS) buffer. Sonikere av bakteriell suspensjon på isen for 25 sykluser i korte 10 s serieopptak (utgangseffekt 20%) etterfulgt av 2-3 s hviler på isen.
    6. Sentrifuger lysat ved 12 000 x g og 4 ° c i 15 min. Overfør alle supernatanten til et friskt rør.
    7. Pre-Wash perler.
      1. Tilsett 300 μL av glutation-sepharose perler til en frisk 15 mL rør og vask perlene med 10 mL iskald PBS buffer.
      2. Sentrifuger på 750 x g og 4 ° c i 1 min til pellet perlene og kast vaskeløsningen.
    8. Tilsett lysat til de vasket perlene og ruge ved 4 ° c for 2 h. sentrifuger ved 750 x g og 4 ° c i 1 min til pellet perlene. Skyll perlene i 10 mL iskald PBS 8x.
    9. Eluere perlene med 1 mL eluering buffer (10 mM glutation i 50 mM Tris-HCl ved pH 8,0) 6 ganger, incubating ved 4 ° c i 10 minutter før hvert eluering trinn. Sentrifuger på 750 x g og 4 ° c i 1 min til pellets perlene. Samle og pool de 6 fraksjoner.
    10. Overfør eluert proteiner til et sentrifugal filter og Konsentrer ved sentrifugering ved 7 500 x g for å oppnå et endelig volum på 100-200 μL.
  3. MOV10 protein ekstrakter fra HEK293T celler
    1. Midlertidig uttrykker MOV10 proteiner i kultivert HEK293T celler.
      1. Forbered MOV10-pRK5 plasmider ved en konsentrasjon > 500 ng/μL.
      2. Seed HEK293T celler i 15 cm retter. Når celle tettheten når ~ 70%-90%, erstatte celle kulturen medium med friske Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) inneholder 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin-Streptomycin.
      3. For en transfeksjoner, fortynne 60 μg av MOV10-pRK5 plasmider DNA i 3 mL av det reduserte serum mediet, legg deretter til 120 μL av transfeksjoner Enhancer reagens, og bland godt.
      4. I et separat rør fortynne 90 μL av transfeksjoner reagens med 3 mL redusert serum medium (uten penicillin-Streptomycin) og bland godt.
      5. Tilsett fortynnet DNA i hvert rør med fortynnet transfeksjoner reagens. Ruge ved romtemperatur i 15 min.
      6. Legg til transfeksjoner blandingen til celle kulturen, og kultur celler for ~ 36-48 h.
    2. Etter 36-48 h, samle celler fra hver plate i et 50 mL rør. Sentrifuger ved 500 x g for 5 min ved 4 ° c. Vask hver pellet med 10 mL iskald PBS, og samle celler ved sentrifugering ved 500 x g i 5 min ved 4 ° c.
    3. Resuspend pellet i 3 mL cellelyse Rings buffer som inneholder komplett ehylenediaminetetraacetic acid (EDTA)-fri protease inhibitor cocktail. Ruge i 30 minutter på is. Sentrifuger lysat ved 20 000 x g og 4 ° c i 20 min.
    4. Tilsett 100 μL av anti-FLAG magnetiske perler per tallerken med celler i et 1,5 mL rør.
    5. Vask de magnetiske perlene 2x med K150-buffer (50 mM HEPES ved pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Resuspend de magnetiske perlene i 1 mL iskald K150 buffer.
      2. Ruge de magnetiske perlene i 2 minutter ved 4 ° c med lett rotasjon og pellet de magnetiske perlene ved hjelp av en magnet. Fjern og kast supernatanten.
    6. Legg de magnetiske perlene til cellen lysat supernatanten fra trinn 1.3.3 og ruge ved 4 ° c for 2 t.
    7. Vask protein bundet magnetiske perler 3x med K150 buffer, deretter 2x med K150 som inneholder 250 mM NaCl, deretter 3x med K150 buffer som 1.3.5.
    8. Resuspend perler i 300 μL av flagg eluering buffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl ved pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glyserol), Legg Flag peptid til en endelig konsentrasjon av 0,5 μg/μL, og ruge med perler på en Rotator ved 4 ° c for 1 t , deretter pellet den magnetiske perler ved hjelp av en magnet.
    9. Samle supernatanten som inneholder eluert MOV10 proteiner, Bestem konsentrasjonen og oppbevar ved-80 ° c for fremtidig bruk.

2. forberedelse av nukleinsyre yre

  1. Kjøp DNA og RNA oligonukleotider (oligos) med eller uten biotin etiketter fra en egnet kilde. Fortynne hver oligo inne RNase-ledig ddH2O å 20 μM og oppbevare den for-80 ° c for fremtiden bruk.
    Merk: de oligo sekvensene av DNA/RNA-underlag som brukes i denne studien, er listet opp i tabell 2.
  2. Forbered følgende blanding for dobbel-strandet RNA (dsRNA) annealing reaksjon for MOV10 helicase aktivitet analysen: Mix 60 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-etan-sulphonic acid (HEPES) ved pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 og RNase-fri ddH2 O i et endelig reaksjons volum på 20 μL.
  3. Anneal RNA-oligos danner RNA dupleks ved å varme en blanding av biotin-merket topp strand (2 μM, endelig konsentrasjon) og en 1,5-fold av dens umerkede komplementære bunn strand i annealing buffer (trinn 2,2) ved 95 ° c i 5 min, og deretter langsomt avkjøles den til rom temperatur (RT).

3. biokjemiske analyser i vitro

  1. EMSA og enzymatisk reaksjoner
    1. For MEIOB EMSA-analysen, bland 50 mM Tris HCl ved pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 2 mm DITHIOTREITOL (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mm (eller andre relevante konsentrasjoner som vist i figur 2 og Figur 3) MEIOB protein, og 10 nM biotin-merket oligonukleotider og ddH2O i et endelig reaksjons volum på 20 μL. Ruge ved RT for 30 min, og legge til 5x stopp buffer (125 mM EDTA, 50% glyserol) for å stoppe reaksjonen.
    2. Definer MEIOB nuklease aktivitet reaksjoner som beskrevet i trinn 3.1.1, men uten tillegg av 10 mM EDTA.
    3. For den MOV10 helicase aktivitet analysen, bland 50 mM Tris-HCl ved pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mm DTT, 2 U/μL RNase inhibitor, 10 nM biotin-merket RNA substrat, 2 mm adenosin TRIFOSFAT (ATP), 100 nM RNA-felle, og 20 ng av MOV10 protein og ddH < C6 > 2O i et endelig reaksjons volum på 20 μL. Ruge reaksjonsblandingen ved 37 ° c i 10 min, 30 min og 60 min. Legg til 5x Stop-bufferen for å stoppe reaksjonen.
      Merk: RNA felle, en biotin-umerkede oligo med sekvens, komplementaritet til den merkede oligo, som hindrer nøstes dsRNA fra annealing igjen.
  2. Polyakrylamid gels
    1. Vask gel platene (16 cm x 16 cm) og 1,5 mm kammer. Monter gel elektroforese enheter.
    2. For å forberede en 10% innfødt polyakrylamid gel, bland 14 mL av ddH2O, 1,25 ml av 10x Tris-borsyre acid-EDTA (TBE), 8,3 ml 30% akrylamid, 1,25 ml av 50% glyserol, 187,5 μL av 10% nylagde ammonium PERSULFATE (APS), og 12,5 μL av tetrametyletylendiamin (TEMED).
    3. For å forberede en 20% innfødt polyakrylamid gel, bland 5,5 mL ddH2O, 1,25 ml med 10x TBE, 1,25 ml av 50% glyserol, 16,7 ml 30% akrylamid, 187,5 μL av 10% APS, og 12,5 ΜL av TEMED.
    4. Hell akrylamid-oppløsningen umiddelbart på gelen og sett inn kammen. La blandingen polymeres i ca 30 min.
  3. Gel kjører
    1. Fjern kammen, fyll tankene med elektroforese som kjører buffer (0,5 x TBE).
    2. Skyll prøve brønnene med 0,5 x TBE buffer, deretter pre-Run gelen på 100 V på isen i 30 min. Bytt ut løpe bufferen med friskt 0,5 x TBE.
    3. Last 20-25 μL prøver inn i hver brønn.
    4. Bruk en opprinnelig akrylamid på 10% for EMSA-analysen og en 20% innfødt akrylamid for enzymatisk analyser. Kjør elektroforese på 100 V på isen bad til bromophenol blå markør har migrert til bunnen kvartal av gel.
  4. Demonter gel platene, trim gelen ved å fjerne lasting brønner og ubrukte kjørefelt. Plasser gelen i 0,5 x TBE buffer.
  5. Skjær filteret papir og nylon membranen til størrelsen på gelen. Pre-Wet rent filter papir og nylon membran.
  6. Sett sammen stakken for overføring.
    1. Plasser den pre-våte membranen på det pre-våte filter papiret.
    2. Plasser gelen på membranen.
    3. Dekk gelen med et annet lag av pre-vått filter papir.
    4. Fjern alle luftbobler ved å rulle en ren pipette fra midten til kanten.
  7. Overfør prøvene fra gel til membranen i en semi-tørt Elektroforetiske apparat på 90 mA i 20 min.
  8. Stopp overføringen, og tørk deretter membranen på et nytt filter papir i 1 min.
  9. Krysskobling prøvene ved å irradiirujushhaja membranen ved 120 mJ/cm2 for 45-60 s i en UV-lys tverrbinder utstyrt med 254 NM pærer (Auto krysskobling funksjon). Lufttørke membranen ved RT i 30 min.
  10. Kjemiluminescens deteksjon
    1. Protokoll 1: Bruk et standardvolum av kommersielt chemiluminiscerende nukleinsyre syre deteksjons sett.
      1. Tilsett 20 mL blokkerings buffer til membranen og ruge for 15-30 min med skånsom risting på en Rotator ved 20-25 RPM.
      2. Klargjør løsning for bøye/blokkerende buffer ved å legge til 66,7 μL-stabilisert streptavidin-pepperrot peroksidase bøye til 20 mL blokkerings buffer.
      3. Fjern forsiktig blokkerings bufferen og erstatt den med en bøye/blokkerende buffer. Ruge i 15 minutter på en Rotator ved 20-25 RPM.
      4. Vask membranen 4X med risting ved 40-45 RPM i 5 minutter hver.
      5. Tilsett 30 mL substrat likevekts buffer til membranen. Ruge membranen i 5 minutter med risting ved 20-25 RPM.
      6. Klargjør substrat arbeids løsning ved å tilsette 6 mL luminol/Enhancer løsning til 6 mL stabil peroxide løsning. Unngå lys.
      7. Dekk hele overflaten av membranen med substrat arbeids løsning og ruge i 5 min.
      8. Skann membranen i et chemiluminiscerende bildesystem for 1-3 s.
    2. Protokoll 2: Bruk 2x utvannet kommersielt chemiluminiscerende nukleinsyre acid Detection Kit og følg trinnene 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. Protokoll 3: Bruk selv laget reagenser6.
      1. Klargjør blokkerings buffer: Bland 0,1 M Tris-HCl ved pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2, og 3% storfe serum albumin brøk V. Ap 7,5 buffer: Bland 0,1 m Tris-HCL ved pH 7,5, 0,1 m NaCl, og 2 mm MgCl2. AP 9,5 buffer: Bland 0,1 M Tris-HCl ved pH 9,5, 0,1 M NaCl, og 50 mM MgCl2. TE buffer: Bland 10 mM Tris-HCl ved pH 8,0, 1 mM EDTA ved pH 8,0.
      2. Sug membranen i blokkerings buffer ved 30 ° c for 1 time.
      3. Tilsett 8,5 μL av streptavidin alkalisk fosfatase til 10 mL AP 7,5 buffer. Rist membranen forsiktig i denne løsningen på RT i 10 min. Deretter vaskes membranen 2x i 15 mL av AP 7,5 buffer i 10 min.
      4. Vask membranen en gang til i 20 mL AP 9,5-buffer i 10 min. Tilsett 20 mL TE-buffer for å stanse reaksjonen.
      5. Tilsett 7,5 mL utviklingsløsning på membranen, og Skann membranen i et chemiluminiscerende bildesystem for 1-3 s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein strukturen i MEIOB og uttrykks konstruksjoner brukt i denne studien er illustrert i figur 1A. OB folder i MEIOB er kompakte tønne-lignende strukturer som kan gjenkjenne og samhandle med single-strandet nukleinsyre syrer. En av OB domener (AA 136-307, konstruere A) binder enkelt strandet DNA (ssDNA), avkortet protein (AA 136-178 truncations, konstruere C) og punktet mutant form (R235A mutasjon, konstruere E) av MEIOB ikke har DNA-bindende aktivitet26. Den GST-MEIOB Fusion proteiner ble overexpressed i BL21 bakterier, med påfølgende isolasjons trinn som resulterer i renset proteiner vist av Coomassie blå farging og Western Blot analyse (figur 1B). Nukleinsyre yre underlag i ulike konsentrasjoner illustrerer den høye følsomheten til biotin signalet, med et synlig signal på 1 nM oligo etter en relativt kort eksponeringstid for 1-3 s (figur 2a). Det ville-type MEIOB-et protein, men ikke mutant MEIOB-E og MEIOB-C proteiner, bind sterkt til 36 NT biotin-merket ssDNA underlag (samme lengde og sekvens som brukt tidligere26) (figur 2B) og Cleave underlaget inn stiger (figur 2C).

In vitro-analysen av MEIOB proteiner med RNA oligos av samme sekvens som ssDNA underlag som brukes i figur 2B, C illustrerer bindende kapasitet og exonuclease aktivitet av MEIOB på 36 NT single-strandet RNA (ssRNA) (Figur 3A, B ). Bindings aktiviteten til MEIOB med DNA og RNA ble ytterligere kvantitativt analysert (Figur 3C). I tillegg ble FLAG-Tagged MOV10 proteiner renset fra HEK293T celler (Figur 4A). For å måle den helicase aktiviteten til MOV10, ble en tosidig RNA utformet (samme lengde, men ulik sekvens enn brukt tidligere16) med en 18 NT 5 ' overheng (Figur 4B). Når biotin-merket RNA duplex ble inkubert med MOV10 i nærvær av ATP, et lavere band som tilsvarer den utgitte enkelt-strandet biotin-merket RNA dukket opp med økende tid, reflekterende av MOV10's funksjon som en RNA helicase. Til slutt, for å redusere kostnadene, ble det forsøkt å optimalisere bruken av reagenser for kjemiluminescens deteksjon av biotin etiketten. Det ble funnet at en todelt fortynning av chemiluminiscerende nukleinsyre acid Detection Kit ikke negativt påvirke kromogen følsomhet av biotin-streptavidin system, og spennende, arbeidet selv-laget reagenser nesten like godt (figur 5 ).

Figure 1
Figur 1 : Rensing av MEIOB proteiner. (A) skjematisk fremstilling av MEIOB konstruerer brukt i denne studien26. MEIOB inneholder et OB-domene. Alle MEIOB konstruerer (A, C, E) ble uttrykt som GST Fusion proteiner. (B) Coomassie blå farging og Western Blot analyse av MEIOB proteiner renset ved hjelp av gst-bakterier system. De røde pilene viser plasseringen av renset MEIOB proteiner. Band på ca 26 KDa tilsvarer glutation. For Western Blot ble anti-GST antistoff brukt med 1:6000 fortynning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : In vitro-analyser av MEIOB-ssDNA interaksjoner . (A) signal styrke test av ulike konsentrasjoner av 36 NT biotin-merket ssDNA. (B) EMSA resultat av MEIOB proteinbinding til biotin 5 ' ende-merket DNA-underlag (10% ukomprimert gel). (C) MEIOB-mediert kløft av biotin 5 ' end-merket DNA underlag (20% native gel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : In vitro analyser av MEIOB-ssRNA interaksjoner. (A) EMSA resultat av MEIOB proteinbinding til biotin 5 ' end-merket RNA underlag (10% ukomprimert gel). (B) MEIOB-mediert kløft av biotin 5 ' end-merket RNA underlag (20% native gel). (C) plott av prosent av DNA/RNA-bundet versus MEIOB-A-konsentrasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : RENSET MOV10 protein og dens slappe av 5 ' hale dsRNA in vitro. (A) Coomassie blå FARGING av MOV10 protein renset ved hjelp av Flag-HEK293T systemet. De røde pilene viser plasseringen av renset MOV10 protein. Band på Coomassie gel med en molekylvekt på ca. 55 kDa tilsvarer den tunge immunglobulin kjeden (IgG) fra FLAG-antistoff. (B) MOV10 avspoler 5 ' hale dsRNA med økende tid (10, 30, 60 min) ved 37 ° c. ssRNA = 18 NT single-strandet RNA, dsRNA = 54 NT dobbel-strandet RNA med en 18 NT 5 ' hale (20% native gel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Alternativ metoder over bruke biotin kromogen reagens s på MEIOB analysen. Kommersiell standardvolum: instruert av chemiluminiscerende nukleinsyre acid Detection Kit; 2x utvannet kommersielt volum: to-fold fortynning av hver buffer i chemiluminiscerende nukleinsyre syre deteksjon Kit, Self-laget reagenser: se detaljer i trinn 3.7.3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: primere som brukes til PCR forsterke genet fragmenter av Meiob og Mov10. Den dristige bokstaver i fremover og omvendt primere er BamHI og NotI kutte nettsteder; kursiv fet bokstaver i en omvendt primer er XhoI kutte steder; de dristige bokstavene i boksene indikerer nukleotider tilsvarende punkt mutasjon R235A.

Table 2
Tabell 2: sekvenser av DNA/RNA underlag som brukes i dette arbeidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gransker protein-nukleinsyre acid interaksjoner er avgjørende for vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende ulike biologiske prosesser. For eksempel, MEIOB er et testikkel-spesifikt protein viktig for meiose og fruktbarhet i pattedyr25,26,27. MEIOB inneholder en OB domene som binder seg til enkelt-strandet DNA og utstillinger 3 ' til 5 ' exonuclease aktivitet26, som direkte knyttet til sin fysiologiske relevans under meiotic rekombinasjon. Som et annet eksempel, er MOV10 en RNA-helicase med allestedsnærværende funksjoner som kan knyttes til RNA sekundære strukturer16. Følgelig MOV10 viser brede RNA-binding egenskaper og 5 ' til 3 ' RNA dupleks slappe aktivitet16. Studiene som rapporterte de nevnte biokjemiske aktivitetene til disse proteinene var avhengig av bruken av 32P isotop for å merke nukleinsyre syrer for in vitro-analyser. I denne studien har vi etablert protokoller for en rekke biotin-merket in vitro eksperimenter av MEIOB og MOV10 funksjon. Disse protokollene begynner med utarbeidelse av aktive proteiner og endte med avbildning av biotin signaler.

Nærmere bestemt, i tråd med tidligere studier25,26, var MEIOB proteiner overexpressed i bakterier med og rensing gitt en enkelt bånd med sterke Coomassie farging signal etter gel elektroforese. Imidlertid var rensing av full-lengde MOV10 protein mer effektiv når overexpressed som FLAG-tag-smeltet protein i HEK293T celler enn som en GST-smeltet protein i bakterier (data ikke vist). For å oppnå tilstrekkelige mengder protein ved tilstrekkelig renhet for påfølgende reaksjoner, disse to systemene av protein rensing må sammenlignes for å finne den mest egnede metoden for proteiner med forskjellige størrelser og/eller egenskaper. Nukleinsyre syrer ble deretter merket med biotin i stedet for 32P som substrat og innhentet robust signal ved behandling av nukleinsyre syre-binding affinitet eller nukleinsyre syre-prosessering aktiviteter av begge proteiner. Men, som proteiner renset fra bakterier er ofte forurenset med RNase, er det vanskelig å utelukke muligheten for at kløften aktiviteten sett under in vitro reaksjonen kan delvis skyldes forurensende RNase. In vitro-analyser med MEIOB mutanter med redusert katalysator (avkortet og punkt mutant) viste betydelig svekkelse av RNA substrat prosessering, men mulig RNase-forurensning kan ikke utelukkes. Resultatene oppnås med hver av MEIOB konstruksjoner opptrer på ssDNA og MOV10 slappe dsRNA er lik de som er innhentet i forrige studie16,26. Men MEIOB prosesser DNA for å generere en smøre, mens en mer diskret band er sett med RNA i henhold til eksperimentelle resultater (figur 2C og Figur 3B). Muligens har MEIOB differensial bindende evner til DNA og RNA substrat (figur 2B, Figur 3A, C), som fører til forskjellen i deres kløft produkter. Det kan også være mulig at MEIOB kløyver DNA og RNA på en særegen måte. Den eksakte rolle MEIOB i RNA prosessering gjenstår å bli videre undersøkt (for eksempel ved hjelp av FLAG-tag-smeltet MEIOB protein uttrykt i HEK293T celler).

Biotin-merket nukleinsyre yre sonder er fordelaktig over 32P-merket sonder i at de ikke krever spesifikk beskyttelse og avfallshåndtering. For det andre kan biotin-merkede sonder bli stabilt bevart i minst 1 år ved-20 ° c, mens 32P-merkede sonder bare varer i 2 uker. Derfor kan det samme parti av biotin-merket nukleinsyre syrer brukes over en lang periode, opprettholde reproduserbarhet av eksperimenter. Til slutt kan hurtig autoradiografi av radioaktive sonder avhenge av kostbare instrumenter som fosfor skjerm. I kontrast, alle biotin-merket analysene beskrevet her kan utføres i løpet av en dag og ikke krever spesialutstyr. Ulempene med biotin merking omfatter hovedsakelig flere eksperimentelle trinn inkludert gel overføring og kjemiluminescens som er nødvendige for å oppdage biotin-merket underlag, men kan i tillegg krever optimalisering eller feilsøking. En annen generell svakhet er den relativt lave følsomheten til biotin-merkingen sammenlignet med radioisotop-merkingen. I disse analysene, likevel, godt synlig påvisning av svært lav konsentrasjon av nukleinsyre syrer ble oppnådd (figur 2A).

I tillegg er semi-tørt gel overførings apparat egnet for overføring av lengre enn vanlig gels til membraner. Sammenlignet med våt overføring, er semi-tørr overføring raskere spesielt for nukleinsyre syrer, og gir en lav bakgrunn signal. Videre ble kostnadene ved den kromogen reaksjonen til biotin-streptavidin systemet kuttet ved enten å fortynne de kommersielle reagensene eller lage våre egne, som begge oppnådde lignende signaler. Deteksjons følsomheten til de selvbetjente reagensene er kanskje ikke så høye, om enn tilstrekkelig her (figur 5C), men den kan forbedres ved å forlenge blokkerings tiden (upubliserte data). Signalene kan også forbedres med en økt konsentrasjon av den nukleinsyre syre proben som brukes til analysene. Gitt ovenfor eksperimentelle bevis, kan biotin etiketten være en fordelaktig erstatning for 32P i flere in vitro biokjemiske analyser.

Kollektivt, denne protokollen tilbyr en biotin-merket plattform for studiet av protein-nukleinsyre syre interaksjoner som viser seg å være robust, pålitelig, effektiv og rimelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæres.

Acknowledgments

Vi takker P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) for nyttige redigeringer og diskusjoner. Vi takker også Sigrid Eckardt for språk redigering. K. Z. ble støttet av National Key R & D-programmet i Kina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) og National Natural Science Foundation i Kina (31771653). L. Y. ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81471502, 31871503) og nyskapende og gründer program av Jiangsu Province. J. N. ble støttet av Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. ble støttet av tilskudd av National Natural Science Foundation i Kina (31771588) og 1000 Youth talent plan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Germany 5242R
Chemiluminescent Imaging System Tanon, China 5200
Digital sonifer Branson, USA BBV12081048A 450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotter Hoefer, USA TE77XP
Tube Revolver  Crystal, USA 3406051
UV-light cross-linker UVP, USA CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter  Milipore, USA UFC801096 4 ml/10 K
Nylon membrane Thermo Scientific, USA TG263940A
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430167 100 mm 
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430597 150 mm 
Microtubes tubes AXYGEN, USA MCT-150-C 1.5 mL 
Tubes Corning, USA 430791 15 mL
Reagents 
Ampicillin SunShine Bio, China 8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beads Sigma, USA M8823
ATP Thermo Scientific, USA 591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime, China C3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent  Sigma, USA 107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit  Vazyme, China C112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit Thermo Scientific, USA T1269950
dNTP Sigma-Aldrich, USA DNTP100-1KT
DMEM Gibco, USA 10569044
DPBS buffer Gibco, USA 14190-136
EDTA Invitrogen, USA AM9260G 0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktail Roche, USA 04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit  Vazyme, China  
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit Vazyme, China DC301-01
FBS Gibco, USA 10437028
FLAG peptide Sigma, USA F4799
Glycerol Sigma, USA SHBK3676
GST Bulk Kit GE Healthcare, USA 27-4570-01
HEPES buffer Sigma, USA SLBZ2837 1 M 
IPTG Thermo Scientific, USA 34060
KoAc Sangon Biotech, China 127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent Thermo Scientific, USA L3000001
MgCl2 Invitrogen, USA AM9530G 1 M
NaCl Invitrogen, USA AM9759
 		 5 M 
NP-40 Amresco, USA M158-500ML
Opti-MEM medium Gibco, USA 31985062
PBS Gibco, USA 10010023 PH 7.4
RNase Inhibitor Promega, USA N251B
Streptavidin alkaline phosphatase Promega, USA V5591
TBE Invitrogen, USA 15581044
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15567027 1 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15568025 1 M, PH 8.0
Tween-20 Sangon Biotech, China A600560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).

Tags

Genetikk in vitro biokjemiske analysen EMSA biotin protein rensing nuklease helicase, RNA-bindende protein nukleinsyre yre
I vitro biokjemiske analyser ved hjelp av biotin etiketter for å studere protein-nukleinsyre acid interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R.,… More

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter