Summary
São apresentados aqui protocolos para ensaios bioquímicos in vitro usando rótulos de biotina que podem ser amplamente aplicáveis para o estudo de interações ácido proteína-nucleico.
Abstract
As interações ácido proteína-nucleico desempenham papéis importantes em processos biológicos como transcrição, recombinação e metabolismo do RNA. Métodos experimentais para estudar interações ácido proteína-nucleico requerem o uso de etiquetas fluorescentes, isótopos radioativos, ou outros rótulos para detectar e analisar moléculas alvo específicas. A biotina, uma etiqueta de ácido nucleico não radioativo, é comumente usada em ensaios de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA), mas não tem sido empregada regularmente para monitorar a atividade protéica durante os processos de ácido nucleico. Este protocolo ilustra a utilidade da rotulagem da biotina durante reações enzimáticas in vitro, demonstrando que esta etiqueta trabalha bem com uma escala de ensaios bioquímicos diferentes. Especificamente, em alinhamento com os achados anteriores usando radioisótopos 32P-rotulados substratos, é confirmado via biotina-rotulada EMSA que MEIOB (uma proteína especificamente envolvida na recombinação meiótica) é uma proteína de ligação de DNA, que MOV10 (um O RNA helicase) resolve biotina-etiquetou estruturas do duplex do RNA, e isso MEIOB Cleaves biotina-etiquetou o ADN single-encalhado. Este estudo demonstra que a biotina é capaz de substituir 32P em vários ensaios bioquímicos relacionados ao ácido nucleico in vitro.
Introduction
As interações ácido proteína-nucleico estão envolvidas em muitos processos celulares essenciais, como reparo de DNA, replicação, transcrição, processamento de RNA e tradução. Interações protéicas com seqüências de DNA específicas dentro da cromatina são necessárias para o controle apertado da expressão gênica no nível transcricional1. A regulamentação pós-transcripcional precisa de inúmeras codificadores e RNAs não codificantes requer interações extensas e complicadas entre qualquer proteína e RNA2. Essas camadas de mecanismo regulador de expressão gênica compreendem uma cascata de eventos intermoleculares dinâmicos, que são coordenados por interações de fatores de transcrição/epigenética ou proteínas de ligação de RNA com seus alvos de ácido nucleico, bem como interações proteína-proteína. Para dissecar se proteínas in vivo estão direta ou indiretamente associadas a ácidos nucleicos e como tais associações ocorrem e culminam, ensaios bioquímicos in vitro são conduzidos para examinar a afinidade vinculativa ou atividade enzimática de proteínas de interesse em substratos projetados de DNA e/ou RNA.
Muitas técnicas foram desenvolvidas para detectar e caracterizar complexos ácidos-proteicos nucleicos, incluindo o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA), também denominado ensaio de retardação de gel ou ensaio de desvio de banda3,4,5 . EMSA é um método bioquímico versátil e sensível que seja amplamente utilizado estudando o emperramento direto das proteínas com ácidos nucleico. A EMSA conta com a mudança eletroforética em gel em bandas, que são rotineiramente visualizadas usando quimioluminescência para detectar rótulos de biotina6,7, a fluorescência das etiquetas de fluoróforo8,9, ou por autoradiografia das etiquetas radioactivas 32P10,11. Outros fins de estudos bioquímicos são a identificação e caracterização da atividade de processamento de ácido nucleico de proteínas, tais como reações à base de nuclease para avaliar os produtos de clivagem de substratos de ácido nucleico12, 13 anos de , 14 e ensaios de desenrolamento de estrutura de DNA/RNA para avaliação das atividades de helicase15,16,17.
Em tais ensaios de atividade enzimática, os ácidos nucleicos com rótulo radioisótopo ou fluoróforo são freqüentemente usados como substratos devido à sua alta sensibilidade. A análise de radiografias de reações enzimáticas que envolvem os radiofármacos 32P etiquetados foi encontrada para ser sensível e reprodutível18. No entanto, em um número crescente de laboratórios no mundo, o uso de radioisótopos é restrito ou mesmo proibido devido aos riscos de saúde associados à exposição potencial. Além das preocupações com biossegurança, outras desvantagens são o necessário equipamento necessário para conduzir o trabalho com radioisótopos, necessária licença de radioatividade, meia-vida curta de 32P (cerca de 14 dias), e deterioração gradual da qualidade da sonda devido a Radiolise. Assim, métodos não-isotópicas alternativos foram desenvolvidos (ou seja, a rotulagem da sonda com fluoróforos possibilita a detecção por imagens fluorescentes19). No entanto, um sistema de imagem de alta resolução é necessário ao usar sondas com rótulo cDNAs. A biotina, uma etiqueta comumente usada, se liga prontamente a macromoléculas biológicas, como proteínas e ácidos nucleicos. O sistema de biotina-streptavidin Opera eficientemente e melhora a sensibilidade da deteção sem aumentar o fundo não-específico20,21. Além da EMSA, a biotina é amplamente utilizada para a purificação de proteínas e o RNA pull-down, entre outros22,23,24.
Este protocolo utiliza com sucesso os ácidos nucleicos rotulados com biotina como substratos para ensaios bioquímicos in vitro que incluem a EMSA, além de reações enzimáticas em que a biotina não foi comumente utilizada. O domínio MeioB OB é construído e dois mutantes (truncamento e mutação de ponto) são expressos como proteínas de fusão GST25,26,27, bem como a proteína de fusão de bandeira recombinante do mouse MOV1016. Este relatório destaca a eficácia deste protocolo combinado para a purificação da proteína e ensaios biotina-etiquetados para finalidades experimentais variadas.
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Protocol
1. preparação de proteínas
- Construções de expressão MEIOB e MOV10
- Gerar expressão de cDNA constrói mouse de codificação MEIOB-A, C e e (Figura 1A) e MOV10.
- Ajuste as reações da reacção em cadeia do polymerase (PCR) para cada fragmento. Misture 1 μL de cDNA do rato (a partir de C57BL/6 mouse testis), 1 μL de dNTP, 2 μL de 10 μM de primer para a frente, 2 μL de primer reverso de 10 μM, 1 μL de DNA polimerase, 25 μL de tampão 2x PCR e 18 μL de H2o duplo destilado (DDH2o) em a final volume de 50 μL.
Nota: os primers para a amplificação dos fragmentos do gene MeioB e Mov10 estão listados na tabela 1. - Realize reações de PCR utilizando os seguintes programas: 95 ° c por 5 min, 35 ciclos de aquecimento a 95 ° c por 15 s, recozimento a 64 ° c para 15 s, extensão a 72 ° c por 20 s (2 min para extensão total de comprimento MOV10) e prolongamento final a 68 ° c por 7 min.
Nota: Use o par da primeira demão MEIOB-E (F1) e MEIOB-E-MUT (R1) e MEIOB-E-MUT (F2) e MEIOB-E (R2) para amplificar dois segmentos que contêm a seqüência do mutante dentro de uma seqüência de sobreposição nos 3 ' e 5 ' extremidades, respectivamente, para gerar um molde do
- Ajuste as reações da reacção em cadeia do polymerase (PCR) para cada fragmento. Misture 1 μL de cDNA do rato (a partir de C57BL/6 mouse testis), 1 μL de dNTP, 2 μL de 10 μM de primer para a frente, 2 μL de primer reverso de 10 μM, 1 μL de DNA polimerase, 25 μL de tampão 2x PCR e 18 μL de H2o duplo destilado (DDH2o) em a final volume de 50 μL.
- Analise o ADN amplificado do PCR pela electroforese do gel, corte a faixa do tamanho exigido do gel rapidamente uma lâmpada UV, e coloc em um tubo de centrifugação.
Nota: os tamanhos de produto esperados visíveis no gel de agarose para MEIOB-A é 536 BP, MEIOB-C é 296 BP, MEIOB-E são 312 BP e 229 BP, e MOV10 é 3015 BP. - Purify o ADN do PCR com um jogo da extração do gel que segue o protocolo do fabricante.
- Adicione um volume igual de dissolver o amortecedor no tubo de centrifugação da etapa 1.1.2 e derreta o gel em um banho de água de 50-55 ° c por 5-10 minutos, assegurando-se de que as partes do gel derretem completamente. Centrifugue brevemente para recolher todas as gotas da parede do tubo.
Nota: a concentração de massa/volume do gel e o tampão de dissolução é de 1 mg/μL. - Coloque a coluna de adsorção no tubo de coleta, transfira a solução contendo o fragmento de gel dissolvido para a coluna de adsorção e centrifugue a 12.000 x g por 2 min.
- Descarte o filtrado na parte inferior dos tubos de coleta. Adicionar 600 μL do tampão de lavagem à coluna, centrifugar a 12.000 x g durante 1 min e descartar o filtrado.
- Repita a etapa 1.1.3.3 uma vez.
- Coloque a coluna de volta no tubo de recolha e centrifugue a 12.000 x g durante 2 min para remover todo o tampão de lavagem restante.
- Coloque a coluna de adsorção em um tubo de centrífuga 1,5 mL esterilizado, adicione 50 μL de ddH2o ao centro da coluna de adsorção e centrifugue a 12.000 x g durante 1 min. Meça a concentração de ADN do eluato utilizando Espectrofotômetro.
- Adicione um volume igual de dissolver o amortecedor no tubo de centrifugação da etapa 1.1.2 e derreta o gel em um banho de água de 50-55 ° c por 5-10 minutos, assegurando-se de que as partes do gel derretem completamente. Centrifugue brevemente para recolher todas as gotas da parede do tubo.
- Digestão da limitação dos plasmídeos
- Digest pGEX-4T-1 vetor com BamHI e NotI. Para tal, misturar 4 μg de pGEX-4T-1, 5 μL de tampão de síntese 10x, 1 μL de BamHI e 1 μL de NotI e ddH2o para um volume de reacção final de 50 μL. Incubar a 37 ° c por 2 h.
- Vetor pRK5 Digest com BamHI e XhoI misturando 4 μg de vetor pRK5, 5 μL de buffer Digest 10x, 1 μL de BamHI e 1 μL de XhoI e ddH2o para um volume de reação final de 50 μL. Incubar a 37 ° c por 2 h.
- Analise o ADN do vetor pela electroforese do gel, corte a faixa desejada do tamanho do gel rapidamente com um bisturi uma lâmpada UV e coloc o em um tubo de centrifugação.
- Purify o ADN do vetor com um jogo da extração do gel como 1.1.3 que seguem a instrução do fabricante.
Nota: o comprimento dos plasmís linearizados: pGEX-4T-1, 4,4 KB; pRK5, 4,7 KB. - Configure uma reação de ligadura recombinante padrão combinando 0, 3 pmol de vetor linearizado, 0, 6 pmol de fragmento de cDNA, 2 μL de ligase e 4 μL de tampão de ligase 5x e ddH2O em um volume de reação final de 10 μL.
Observação: clone MEIOB-A, C e e em um vetor pGEX-4T-1 e MOV10 em um vetor pRK5. - Incubar a mistura a 37 ° c durante 30 min, e depois resfrie a reacção imediatamente durante 5 min no gelo. Transforme os plasmídos recombinantes MEIOB em bactérias BL21 e MOV10 plasmídos recombinantes em bactérias DH5α.
Observação: Verifique todas as construções recombinantes por sequenciamento Sanger. - Prepare estoques de glicerol de culturas bacterianas contendo plasmíos recombinantes verificados adicionando um volume igual de 50% de glicerol a culturas líquidas e armazene a-80 ° c.
Nota: para cada experimento subsequente, a sequência de bactérias de estoques de glicerol em uma placa de agar fresco e usar uma única colônia para a expansão, conforme descrito na etapa 1,2.
- Gerar expressão de cDNA constrói mouse de codificação MEIOB-A, C e e (Figura 1A) e MOV10.
- Extratos de proteínas MEIOB de bactérias
- Escolha uma colônia de cada cepa BL21 transfected com o plasmídeo vazio ou recombinante pGEX-4T-1 verificado por sequenciamento e inoculado em 3 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Cresça durante a noite em 37 ° c com agitação em 220 rpm.
- Inocular 300 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina a partir de 3 mL de cultura durante a noite (a partir do passo 1.2.1). Cresça as culturas com agitação em 37 ° c para 2 h até que o OD600 alcangue 0.5-1.0.
- Induzir a expressão protéica pela adição de isopropílico beta-D-tiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 0,2 mM. Incubar as culturas para um adicional de 3 h com agitação em 180 rpm e 18 ° c.
- Centrifugue a cultura bacteriana a 3.500 x g e 4 ° c durante 20 min.
- Ressuscita o pellet em 20 mL de tampão de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco gelado (DPBS). SONICATE a suspensão bacteriana no gelo por 25 ciclos em curto 10 s rajadas (potência de saída 20%) seguido por 2-3 s descansando no gelo.
- Centrifugar o lisado a 12.000 x g e 4 ° c durante 15 min. Transfira todo o sobrenadante para um tubo fresco.
- Pré-lavagem de contas.
- Adicione 300 μL de grânulos de glutationa-Sepharose a um tubo de 15 mL fresco e lave os grânulos com 10 mL de tampão PBS gelado.
- Centrifugador em 750 x g e 4 ° c por 1 minuto para pellet as contas e descartar a solução de lavagem.
- Adicione o lisado aos grânulos lavados e incubar a 4 ° c por 2 h. centrifugador em 750 x g e 4 ° c por 1 minuto para pelota os grânulos. Enxágüe os grânulos em 10 mL de PBS frio-gelado 8x.
- Elute os grânulos com 1 mL do amortecedor da eluição (glutationa de 10 milímetros no Tris-HCl de 50 milímetros em pH 8,0) 6x, incubando em 4 ° c por 10 minutos antes de cada etapa da eluição. Centrifugador em 750 x g e 4 ° c por 1 minuto para pelota os grânulos. Colete e pool as 6 frações.
- Transfira as proteínas eluída para um filtro centrífugo e concentre-se por centrifugação a 7.500 x g para obter um volume final de 100-200 μl.
- MOV10 extratos proteicos de células HEK293T
- Expressar transientemente as proteínas MOV10 em células HEK293T cultivadas.
- Prepare o plasmídeo MOV10-pRK5 em uma concentração > 500 ng/μL.
- Sementes HEK293T células em pratos de 15 cm. Quando a densidade celular atinge ~ 70%-90%, substitua o meio de cultura celular com o meio de águia modificada de Dulbecco fresco (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Para um transfection, diluir 60 μg do ADN do plasmídeo MOV10-pRK5 em 3 mL do meio de soro reduzido, a seguir adiciona 120 μL do reagente do potenciador do transfection, e mistura-se bem.
- Em um tubo separado diluir 90 μL do reagente do transfection com 3 mL do meio de soro reduzido (sem penicilina-Streptomycin) e misture bem.
- Adicione o DNA diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
- Adicione a mistura de transfecção para a cultura da célula e células de cultura para ~ 36-48 h.
- Após 36-48 h, colete células de cada placa em um tubo de 50 mL. Centrifugador a 500 x g durante 5 min a 4 ° c. Lave cada pellet com 10 mL de PBS gelada e colete células por centrifugação a 500 x g por 5 min a 4 ° c.
- Ressuscitem o pellet em 3 mL de tampão de lise celular contendo um coquetel de inibidor de protease livre de ácido ehylenediaminetetraacético (EDTA). Incubar por 30 min no gelo. Centrifugar o lisado a 20.000 x g e 4 ° c durante 20 min.
- Adicionar 100 μL de esferas magnéticas antibandeira por prato de células num tubo de 1,5 mL.
- Lave as esferas magnéticas 2x com tampão K150 (50 mM HEPES em pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
- Ressuscita os grânulos magnéticos em 1 mL de tampão K150 Ice-Cold.
- Incubar os grânulos magnéticos por 2 minutos a 4 ° c com rotação suave e pellet os grânulos magnéticos com a ajuda de um ímã. Retire e descarte o sobrenadante.
- Adicione os grânulos magnéticos ao sobrenadante do lisado da pilha da etapa 1.3.3 e incubar em 4 ° c para 2 h.
- Lave a proteína ligada contas magnéticas 3x com K150 buffer, em seguida, 2x com K150 contendo 250 mM NaCl, em seguida, 3x com K150 buffer como 1.3.5.
- Ressuscita os grânulos em 300 μL de tampão de eluição de FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerol), adicione o PEPTÍDEO de Flag a uma concentração final de 0,5 μg/μl, e incubar com grânulos em um rotador a 4 ° c por 1 h , em seguida, pellet os grânulos magnéticos com a ajuda de um ímã.
- Colete o sobrenadante que contém as proteínas MOV10 eluidas, determine a concentração e armazene em-80 ° c para uso futuro.
- Expressar transientemente as proteínas MOV10 em células HEK293T cultivadas.
2. preparação de ácido nucleico
- Comprar DNA e RNA oligonucleotídeos (oligos) com ou sem rótulos de biotina de uma fonte adequada. Diluir cada oligo em ddH RNase-livre2o a 20 μm e mantê-lo em-80 ° c para o uso futuro.
Nota: as sequências de oligo de substratos de DNA/RNA utilizadas neste estudo estão listadas na tabela 2. - Prepare a seguinte mistura para a reação de recozimento de RNA duplo-encalhado (dsRNA) para o ensaio de atividade de MOV10 helicase: misture 60 mM N-2-hidroxietil-piperazina-N-etano-ácido sulfónico (HEPES) em pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 O em um volume de reação final de 20 μl.
- Os oligos do RNA de Anneal para dar forma ao duplex do RNA aquecendo uma mistura da costa superior biotina-etiquetada (2 μm, concentração final) e um 1,5-fold de sua costa inferior complementar sem rótulo no amortecedor do recozimento (etapa 2,2) em 95 ° c por 5 minutos, e refrigeram-na então lentamente ao quarto temperatura (RT).
3. ensaios bioquímicos in vitro
- EMSA e reações enzimáticas
- Para o ensaio MeioB EMSA, misture 50 mm Tris HCl em pH 7,5, 2 mm MgCl2, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 2 mm ditiotreitol (DTT), 0, 1% NP-40, 0,8 mm (ou outras concentrações relevantes, como mostrado na Figura 2 e Figura 3) proteína MeioB, e 10 Nm oligonucleotídeos com rótulo de biotina e DDH2O num volume de reacção final de 20 μl. Incubar em RT por 30 min, e adicionar 5x Stop buffer (125 mM EDTA, 50% glicerol) para parar a reação.
- Configure as reações de atividade da nuclease de MEIOB, conforme descrito na etapa 3.1.1, mas sem a adição de EDTA de 10 mM.
- Para o ensaio de atividade MOV10 helicase, misture 50 mm Tris-HCl em pH 7,5, 20 mm koac, 2 mm MgCl2, 0, 1% NP-40, 1 mm DTT, 2 U/μL de inibidor de RNase, 10 Nm substrato de RNA com rótulo de biotina, 2 mm trifosfato de adenosina (ATP), 100 nm RNA armadilha, e 20 ng de proteína MOV10 e DDH > 2O em um volume de reação final de 20 μl. Incubar a mistura de reacção a 37 ° c durante 10 min, 30 min e 60 min. Adicione o tampão de paragem 5x para interromper a reacção.
Nota: a armadilha do RNA, um oligo biotina-unlabeled com seqüência, complementaridade ao oligo etiquetado, que impede o dsRNA desenrolado do recozimento outra vez.
- Géis de poliacrilamida
- Lave as placas de gel (16 cm x 16 cm) e pentes de 1,5 mm. Monte as unidades da electroforese do gel.
- Para preparar um gel de poliacrilamida 10% nativa, misture 14 mL de ddH2O, 1,25 ml de 10x Tris-ácido BÓRICO-EDTA (TBE), 8,3 ml de acrilamida a 30%, 1,25 ml de glicerol de 50%, 187,5 μL de persulfato de amônio recém-preparado a 10% (APS) e 12,5 μL de tetrametilethylenediamine (TEMED).
- Para preparar um gel de poliacrilamida 20% nativa, misture 5,5 mL de ddH2O, 1,25 ml de 10x tbe, 1,25 ml de glicerol de 50%, 16,7 ml de acrilamida a 30%, 187,5 ΜL de APS a 10% e 12,5 ΜL de TEMED.
- Despeje a solução de acrilamida imediatamente para o gel e insira o pente. Deixe a mistura polimerizar por aproximadamente 30 min.
- Funcionamento do gel
- Retire o pente, encha os tanques com o amortecedor running da electroforese (0.5 x TBE).
- Enxágüe os poços da amostra com o amortecedor de 0.5 x TBE, a seguir Pre-Run o gel em 100 V no gelo por 30 minutos substitua o amortecedor running com 0.5 x novo TBE.
- Carregar 20-25 μL de amostras em cada poço.
- Use um gel nativo da acrilamida de 10% para o ensaio de EMSA e um gel nativo da acrilamida de 20% para os ensaios enzimáticos. Funcione a electroforese em 100 V no banho de gelo até que o marcador azul do bromofenol migrou ao quarto inferior do gel.
- Desmontar as placas de gel, aparar o gel, removendo poços de carga e pistas não utilizadas. Coloque o gel em 0,5 x tampão TBE.
- Corte o papel de filtro e a membrana de nylon ao tamanho do gel. Pré-molhe o papel de filtro limpo e a membrana de nylon.
- Monte a pilha para transferência.
- Coloque a membrana pré-molhada no papel de filtro pré-molhado.
- Coloque o gel na membrana.
- Cubra o gel com outra camada de papel de filtro pré-molhado.
- Retire todas as bolhas de ar rolando uma pipeta limpa do centro para a borda.
- Transfira as amostras do gel para a membrana em um aparelho eletroforético semiseco a 90 mA por 20 min.
- Pare a transferência e, em seguida, seque a membrana em um novo papel de filtro por 1 min.
- Crosslink as amostras irradiando a membrana em 120 MJ/cm2 para 45-60 s em um chapéu cabeado da UV-luz equipado com os bulbos do nanômetro 254 (função do Crosslink do automóvel). Ar secar a membrana em RT por 30 min.
- Detecção de quimioluminescência
- Protocolo 1: Use um volume padrão de kit de detecção de ácido nucleico quimioluminescente comercial.
- Adicionar 20 mL de tampão de bloqueio para a membrana e incubar por 15-30 min com agitação suave em um rotador em 20-25 rpm.
- Prepare a solução tampão conjugada/bloqueadora adicionando 66,7 μL estabilizado streptavidin-horseradish peroxidase conjugada a 20 mL de tampão de bloqueio.
- Remova suavemente o buffer de bloqueio e substitua-o por buffer de conjugado/bloqueio. Incubar por 15 min em um rotador em 20-25 rpm.
- Lave a membrana 4x com agitação em 40-45 rpm por 5 min cada.
- Adicione 30 mL de tampão de equilíbrio de substrato à membrana. Incubar a membrana durante 5 min com agitação a 20-25 rpm.
- Prepare a solução de trabalho da carcaça adicionando 6 mL da solução do luminol/potenciador a 6 mL da solução estável do peróxido. Evite a luz.
- Cubra toda a superfície da membrana com a solução de trabalho do substrato e incubar por 5 min.
- Digitalizar a membrana em um sistema de imagem quimioluminescente para 1-3 s.
- Protocolo 2: Use o kit de detecção de ácido nucleico químico diluído comercial 2x e siga as etapas 3.10.1.1-3.10.1.8.
- Protocolo 3: utilizar reagentes autofabricados6.
- Prepare o tampão de bloqueio: misture 0,1 M Tris-HCl em pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2e 3% de albumina de soro de bovinos fração V. AP 7,5 tampão: misture 0,1 m Tris-HCl em pH 7,5, 0,1 m NaCl e 2 mm MgCl2. Tampão do AP 9,5: Misture o Tris-HCl de 0,1 M em pH 9,5, em 0,1 M NaCl, e em 50 milímetros MgCl2. Tampão TE: misture 10 mM Tris-HCl a pH 8,0, 1 mM EDTA a pH 8,0.
- Mergulhe a membrana no tampão de bloqueio a 30 ° c por 1 h.
- Adicionar 8,5 μL de fosfatase alcalina de estreptavidina a 10 mL de tampão AP 7,5. Agitar a membrana suavemente nesta solução em RT por 10 min. Em seguida, lave a membrana 2x em 15 mL de tampão AP 7,5 por 10 min.
- Lave a membrana mais uma vez em 20 mL de tampão AP 9,5 por 10 min. Adicione 20 mL de tampão TE para interromper a reação.
- Adicionar 7,5 mL de solução de desenvolvimento para a membrana, e digitalizar a membrana em um sistema de imagem quimioluminescente para 1-3 s.
- Protocolo 1: Use um volume padrão de kit de detecção de ácido nucleico quimioluminescente comercial.
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Representative Results
A estrutura proteica do MEIOB e os constructos de expressão utilizados neste estudo estão ilustrados na Figura 1A. As dobras do OB em MEIOB são estruturas barril-como compactas que podem reconhecer e interagir com os ácidos nucleicos single-encalhado. Um dos domínios do OB (AA 136-307, construção A) liga o ADN encalhado único (ssDNA), a proteína truncada (truncamentos do AA 136-178, a construção C) e o formulário do mutante do ponto (mutação de R235A, construção E) de MEIOB não tem a atividade DNA-obrigatória26. As proteínas de fusão GST-MEIOB foram superexpressas em bactérias BL21, com etapas de isolamento subsequentes, resultando em proteínas purificadas mostradas pela coloração azul de Coomassie e pela análise Western blot (Figura 1B). Substratos de ácidos nucleicos em diferentes concentrações ilustram a alta sensibilidade do sinal de biotina, com um sinal detectável de 1 nM de oligo após um tempo de exposição relativamente curto para 1-3 s (Figura 2a). O selvagem-tipo proteína de MEIOB-A, mas não o mutante MEIOB-e e as proteínas de MEIOB-C, ligam fortemente aos substratos de ssDNA de 36 NT biotina-etiquetados (o mesmo comprimento e seqüência que usado previamente26) (Figura 2B) e Cleave os substratos em escadas (Figura 2C).
O ensaio in vitro de proteínas MeioB com RNA oligos da mesma sequência que os substratos de ssDNA utilizados na Figura 2B, C ilustra a capacidade de ligação e a atividade da de de MeioB no RNA de 36 NT (ssrna) (Figura 3a, B ). A atividade vinculativa do MEIOB com DNA e RNA foi analisada quantitativamente (Figura 3C). Adicionalmente, as proteínas FLAG-Tagged MOV10 foram purificadas a partir de células HEK293T (Figura 4A). Para medir a atividade do helicase de MOV10, um RNA duplex foi projetado (mesmo comprimento mas seqüência diferente do que usado previamente16) que carregam um 18 NT 5 ' saliência (Figura 4B). Quando o duplex RNA biotina-etiquetado foi incubado com o MOV10 na presença de ATP, uma faixa mais baixa que corresponde ao RNA único-encalhado liberado da biotina-etiquetada apareceu com tempo crescente, reflexivo da função MOV10's como um helicase do RNA. Por fim, para reduzir custos, buscou-se otimizar o uso de reagentes para a detecção de quimioluminescência do rótulo da biotina. Verificou-se que uma diluição em duas dobras do kit de detecção de ácido nucleico quimioluminescente não afetou negativamente a sensibilidade cromogênica do sistema de biotina-streptavidina, e excitingly, os reagentes autofabricados funcionaram quase igualmente bem (Figura 5 ).
Figura 1 : Purificação de Proteínas MeioB. (A) representação esquemática dos constructos MEIOB utilizados neste estudo26. MEIOB contém um domínio OB. Todas as construções de MEIOB (A, C, E) foram expressas como proteínas de fusão GST. (B) coloração azul Coomassie e análise Western blot das proteínas MEIOB purificadas utilizando o sistema GST-bactérias. As setas vermelhas indicam as posições das proteínas MEIOB purificadas. Bandas de aproximadamente 26 KDa correspondem a glutationa. Para o borrão ocidental, o anticorpo de anti-GST foi usado com diluição 1:6000. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Ensaios in vitro de interações MEIOB-ssDNA . (A) teste de força do sinal de diferentes concentrações de 36 NT biotina-rotulado ssDNA. (B) EMSA resultado da ligação da proteína MEIOB à biotina 5 ' substratos de DNA com rótulo final (10% gel nativo). (C) clivagem mediada por MeioB de substratos de DNA de biotina 5 ' com rótulo final (20% gel nativo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Ensaios in vitro de interações MEIOB-ssRNA. (A) EMSA resultado da ligação da proteína MEIOB à biotina 5 ' substratos de RNA rotulados com fim (10% gel nativo). (B) clivagem mediada por MeioB de substratos de RNA com rótulo de biotina 5 ' (gel nativo de 20%). (C) parcela do percentual de DNA/RNA-Bound versus concentração de MEIOB-A. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Proteína MOV10 purificada e seu desenrolamento de 5 ' dsRNA atado in vitro. (A) coloração azul Coomassie de proteína MOV10 purificada utilizando o sistema Flag-HEK293T. As setas vermelhas indicam as posições da proteína MOV10 purificada. As faixas no gel de Coomassie com um peso molecular de aproximadamente 55 kDa correspondem à corrente pesada da imunoglobulina (IgG) do anticorpo da bandeira. (B) MOV10 desenrola 5 ' dsRNA atado com tempo crescente (10, 30, 60 min) em 37 ° c. ssRNA = 18 NT único-encalhou o RNA, dsRNA = 54 NT RNA dobro-encalhado com uma cauda de 18 NT 5 ' (gel nativo de 20%). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Alternativa métodos dos usando a biotina cromogênico reagente s no ensaio MEIOB. Volume comercial padrão: instruído pelo kit de detecção de ácido nucleico quimioluminescente; 2x volume comercial diluído: diluição em duas dobras de cada tampão em kit de detecção de ácido nucleico quimioluminescente, reagentes autofabricados: Ver detalhes no passo 3.7.3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: os primers utilizados para a PCR amplificam o gene fragmentos de MeioB e Mov10. As letras bold (realce) em primers para diante e reverso são locais do corte de BamHI e de NotI; as letras em negrito itálico em uma cartilha reversa são locais de corte XhoI; as letras em negrito em caixas indicam os nucleotídeos correspondentes à mutação de ponto R235A.
Tabela 2: sequências de substratos de DNA/RNA utilizados neste trabalho.
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Discussion
A investigação de interações ácido proteína-nucleico é fundamental para a nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a diversos processos biológicos. Por exemplo, o MeioB é uma proteína específica do testis essencial para a meiose e fertilidade em mamíferos25,26,27. MeioB contem um domínio do OB que se ligue ao ADN single-encalhado e exiba 3 ' a 5 ' a atividade26do de, que se relaciona diretamente a sua relevância physiological durante o recombination meiótico. Como um outro exemplo, MOV10 é um helicase do RNA com função onipresente que pode associar com as estruturas secundárias do RNA16. Conformemente, MOV10 indica Propriedades RNA-obrigatórias largas e 5 ' a 3 ' a atividade de desenrolamento duplex do RNA16. Os estudos que relatavam as atividades bioquímicas acima mencionadas dessas proteínas dependiam do uso de isótopos de 32P para rotular ácidos nucleicos para ensaios in vitro. No presente estudo, estabelecemos protocolos para uma série de experimentos in vitro com rótulo de biotina da função MEIOB e MOV10. Estes protocolos começam com a preparação de proteínas ativas e terminaram com a imagem latente de sinais da biotina.
Especificamente, em consonância com estudos prévios25,26, as proteínas MeioB foram superexpressas em bactérias com e a purificação rendeu uma única banda com forte sinal de coloração de Coomassie após a eletroforese de gel. No entanto, a purificação da proteína MOV10 de comprimento total foi mais eficaz quando superexpressa como proteína de sinalizador-tag-fundido em células HEK293T do que como uma proteína de GST-fundido em bactérias (dados não mostrados). Para obter quantidades suficientes de proteína em pureza adequada para reações subsequentes, esses dois sistemas de purificação de proteínas precisam ser comparados para determinar o método mais adequado para proteínas com diferentes tamanhos e/ou propriedades. Os ácidos nucleicos foram então rotulados usando biotina em vez de 32P como substrato e obtiveram sinal robusto ao examinar a afinidade de ligação ácida nucleica ou as atividades de processamento de ácido nucleico de ambas as proteínas. No entanto, como as proteínas purificadas de bactérias são freqüentemente contaminadas com RNase, é difícil descartar a possibilidade de que a atividade de clivagem observada durante a reação in vitro possa, em parte, resultar da contaminação de RNase. Os ensaios in vitro com mutantes de MEIOB com atividade catalítica reduzida (truncado e mutante do ponto) mostraram o prejuízo substancial do processamento da carcaça do RNA, mas a contaminação possível do RNase não pode ser excluída. Os resultados obtidos com cada um dos constructos de MeioB atuando em ssDNA e MOV10 desenrolamento dsRNA são semelhantes àqueles obtidos no estudo anterior16,17. No entanto, o MEIOB processa o DNA para gerar um esfregaço, enquanto uma faixa mais discreta é observada com RNA de acordo com os resultados experimentais (Figura 2C e Figura 3B). Possivelmente, o MEIOB possui habilidades de ligação diferencial para o substrato DNA e RNA (Figura 2B, Figura 3a, C), o que leva à diferença em seus produtos de clivagem. Também pode ser possível que MEIOB Cleaves DNA e RNA de uma forma distinta. O papel exato de MEIOB no processamento do RNA permanece ser investigado mais (por exemplo, usando a proteína da bandeira-tag-fundida de MEIOB expressada em HEK293T pilhas).
As sondas de ácido nucleico rotulados com biotina são vantajosas sobre 32P-sondas rotuladas em que eles não necessitam de proteção específica e descarte de resíduos. Em segundo lugar, sondas com rótulo de biotina podem ser preservadas de forma estável por pelo menos 1 ano a-20 ° c, enquanto 32P-sondas rotuladas duram apenas 2 semanas. Assim, o mesmo lote dos ácidos nucleicos rotulados com biotina pode ser usado durante um longo período de tempo, mantendo a reprodutibilidade dos experimentos. Finalmente, a autoradiografia rápida de sondas radioativas pode depender de instrumentos caros, como a tela de fósforo. Em contrapartida, todos os ensaios com rótulo de biotina descritos aqui podem ser realizados dentro de um dia e não necessitam de equipamento especial. As desvantagens da rotulagem da biotina abrangem principalmente etapas experimentais adicionais, incluindo transferência de gel e quimioluminescência que são necessárias para detectar substratos rotulados com biotina, mas também podem exigir otimização ou solução de problemas. Uma outra fraqueza geral é a sensibilidade relativamente baixa da biotina-rotulagem comparada com aquela do radioisotope-etiquetando. Nesses ensaios, no entanto, A detecção bem visível da concentração muito baixa de ácidos nucleicos foi alcançada (Figura 2A).
Além disso, o aparelho de transferência de gel semiseco é adequado para a transferência de géis mais longos do que regulares para as membranas. Comparado com transferência molhada, a transferência semiseca é mais rápida especialmente para ácidos nucleicos, e rende um sinal baixo do fundo. Além disso, os custos da reação cromogênica do sistema biotina-streptavidin foram cortados por diluir os reagentes comerciais ou fazer o nosso, ambos os quais alcançaram sinais semelhantes. A sensibilidade de detecção dos reagentes autofabricados pode não parecer tão elevada, embora suficiente aqui (Figura 5C), mas pode ser melhorada estendendo o tempo de bloqueio (dados não publicados). Também, os sinais podem ser aumentados com uma concentração aumentada da ponta de prova ácida nucleico usada para os ensaios. Dada a evidência experimental acima, a etiqueta da biotina pode ser um substituto vantajoso para 32P em ensaios bioquímicos in vitro múltiplos.
Coletivamente, este protocolo oferece uma plataforma rotulada de biotina para o estudo das interações ácido proteína-nucleico que se revela robusto, confiável, eficiente e acessível.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses é declarado.
Acknowledgments
Agradecemos P. Jeremy Wang (Universidade da Pensilvânia) por edições e discussões úteis. Agradecemos também a Sigrid Eckardt pela edição de idiomas. K. Z. foi apoiado pela chave nacional R & D programa da China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) e National natural Science Foundation da China (31771653). L. Y. foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81471502, 31871503) e programa inovador e empreendedor da província de Jiangsu. J. N. foi apoiado pelo Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. foi apoiado por concessões da Fundação Nacional da ciência natural de China (31771588) e do plano do Talent da juventude 1000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
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