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Genetics

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

doi: 10.3791/59830 Published: July 17, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Abstract

Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína desempeñan un papel importante en procesos biológicos como la transcripción, la recombinación y el metabolismo del ARN. Los métodos experimentales para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos requieren el uso de etiquetas fluorescentes, isótopos radiactivos u otras etiquetas para detectar y analizar moléculas diana específicas. La biotina, una etiqueta de ácido nucleico no radiactivo, se utiliza comúnmente en los ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), pero no se ha empleado regularmente para controlar la actividad proteica durante los procesos de ácido nucleico. Este protocolo ilustra la utilidad del etiquetado de la biotina durante las reacciones enzimáticas in vitro, demostrando que esta etiqueta funciona bien con una gama de diferentes ensayos bioquímicos. Específicamente, en consonancia con los hallazgos anteriores utilizando sustratos marcados con radioisótopos 32P, se confirma a través de EMSA etiquetada con biotina que MEIOB (una proteína específicamente implicada en la recombinación meiótica) es una proteína de unión al ADN, que MOV10 (una Helicase de ARN) resuelve estructuras dúplex de ARN etiquetadas con biotina, y ese MEIOB corta ADN de cadena única etiquetado por biotina. Este estudio demuestra que la biotina es capaz de sustituir 32P en diversos ensayos bioquímicos relacionados con el ácido nucleico in vitro.

Introduction

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Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína están involucradas en muchos procesos celulares esenciales, como la reparación del ADN, la replicación, la transcripción, el procesamiento de ARN y la traducción. Las interacciones proteicas con secuencias de ADN específicas dentro de lacromatina son necesarias para el control estricto de la expresión génica en el nivel de transcripción 1. La regulación posttranscripcional precisa de numerosos ARN de codificación yno codificación requiere interacciones extensas y complicadas entre cualquier proteína y ARN 2. Estas capas de mecanismo regulador de la expresión génica comprenden una cascada de eventos intermoleculares dinámicos, que se coordinan mediante interacciones de factores de transcripción/epigenética o proteínas de unión al ARN con sus objetivos de ácido nucleico, así como interacciones proteína-proteína. Para diseccionar si las proteínas in vivo están asociadas directa o indirectamente con ácidos nucleicos y cómo tales asociaciones se producen y culminan, se llevan a cabo ensayos bioquímicos in vitro para examinar la afinidad de unión o la actividad enzimática de las proteínas de interés sustratos diseñados de ADN y/o ARN.

Se han desarrollado muchas técnicas para detectar y caracterizar complejos de ácido-proteína nucleico, incluido el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), también llamado ensayo de retardo de gel o ensayo de cambio de banda3,4,5 . EMSA es un método bioquímico versátil y sensible que se utiliza ampliamente para estudiar la unión directa de proteínas con ácidos nucleicos. EMSA se basa en el cambio electroforético de gel en las bandas, que se visualizan rutinariamente utilizando quimioluminiscencia para detectar etiquetas de biotina6,7, la fluorescencia de las etiquetas de fluoróforo8,9,o por autoradiografía de etiquetas radiactivas de 32P10,11. Otros propósitos de los estudios bioquímicos son la identificación y caracterización de la actividad de procesamiento de ácido snúcleo de proteínas, tales como reacciones basadas en nucleasas para evaluar los productos de escisión a partir de sustratos de ácido nucleico12, 13 , 14 y ensayos de desenredado de estructura ADN/ARN para evaluar las actividades de helicaso15,16,17.

En tales ensayos de actividad enzimática, los ácidos nucleicos etiquetados con radioisótopos o con etiqueta de fluoróforo se utilizan a menudo como sustratos debido a su alta sensibilidad. Se ha encontrado que el análisis de radiografías de reacciones enzimáticas con 32Radiosondas con etiqueta P son sensibles y reproducibles18. Sin embargo, en un número cada vez mayor de laboratorios en el mundo, el uso de radioisótopos está restringido o incluso prohibido debido a los riesgos para la salud asociados con la exposición potencial. Además de los problemas de bioseguridad, otros inconvenientes son el equipo necesario para llevar a cabo el trabajo con radioisótopos, la licencia de radiactividad requerida, una vida media corta de 32P (alrededor de 14 días) y un deterioro gradual de la calidad de la sonda debido a radiolisis. Por lo tanto, se han desarrollado métodos alternativos no isotópicos (es decir, el etiquetado de la sonda con fluoróforos permite la detección por imágenes fluorescentes19). Sin embargo, se necesita un sistema de imágenes de alta resolución cuando se utilizan sondas etiquetadas fluorescentemente. La biotina, una etiqueta de uso común, se une fácilmente a macromoléculas biológicas como proteínas y ácidos nucleicos. El sistema Biotin-streptavidin funciona de manera eficiente y mejora la sensibilidad de detección sin aumentar los antecedentes no específicos20,21. Además de EMSA, la biotina es ampliamente utilizada para la purificación de proteínas y el extracción de ARN, entre otros22,23,24.

Este protocolo utiliza con éxito ácidos nucleicos etiquetados con biotina como sustratos para ensayos bioquímicos in vitro que incluyen EMSA, además de reacciones enzimáticas en las que no se ha utilizado comúnmente la biotina. El dominio MEIOB OB está construido y dos mutantes (truncamiento y mutación puntual) se expresan como proteínas de fusión GST25,26,27,así como ratón MOV10 proteína de fusión FLAG recombinante16. Este informe destaca la eficacia de este protocolo combinado para la purificación de proteínas y ensayos etiquetados con biotina con fines experimentales diversos.

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Protocol

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1. Preparación de proteínas

  1. Construcciones de expresión MEIOB y MOV10
    1. Generar construcciones de expresión cDNA codificando el mouse MEIOB-A, C y E (Figura1A)y MOV10.
      1. Configure las reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada fragmento. Mezclar 1 l de ADNc del ratón (a partir de C57BL/6 mouse testis), 1 l de dNTP, 2 ml de imprimación hacia delante de 10 m, 2 ml de imprimación inversa de 10 m, 1 l de polimerasa de ADN, 25 ml de 2 x tampón de PCR y 18 ml de H 2 O destilado doble (ddH 2 O) en una fase final de 2O de ADN y 18 o L de H2O (ddH2O) en una volumen de 50 l.
        NOTA: Las imprimaciones para la amplificación de fragmentos de genes Meiob y Mov10 se enumeran en la Tabla 1.
      2. Realizar reacciones de PCR utilizando los siguientes programas: 95 oC durante 5 min, 35 ciclos de calentamiento a 95 oC durante 15 s, recocido a 64 oC durante 15 s, extensión a 72 oC para 20 s (2 min para extender la longitud completa MOV10), y extensión final a 68 oC durante 7 min.
        NOTA: Utilice el par de imprimación MEIOB-E (F1) y MEIOB-E-mut (R1) y MEIOB-E-mut (F2) y MEIOB-E (R2) para amplificar dos segmentos que contienen la secuencia mutante dentro de una secuencia superpuesta en los extremos 3' y 5', respectivamente, para generar una plantilla de PCR mutante.
    2. Analizar el ADN de PCR amplificado por electroforesis de gel, cortar la banda del tamaño requerido del gel rápidamente bajo una lámpara UV, y colocar en un tubo centrífugo.
      NOTA: Los tamaños de producto esperados visibles en el gel de agarosa para MEIOB-A es de 536 bp, MEIOB-C es de 296 bp, MEIOB-E son 312 bp y 229 bp, y MOV10 es 3015 bp.
    3. Purificar el ADN PCR con un kit de extracción de gel siguiendo el protocolo del fabricante.
      1. Añadir un volumen igual de tampón de disolución en el tubo centrífugo del paso 1.1.2 y fundir el gel en un baño de agua de 50-55 oC durante 5-10 min, asegurando que las piezas de gel se derritan por completo. Centrifugar brevemente para recoger las gotas de la pared del tubo.
        NOTA: La concentración de masa/volumen del gel y el tampón de disolución es de 1 mg/L.
      2. Coloque la columna de adsorción en el tubo de recogida, transfiera la solución que contiene el fragmento de gel disuelto a la columna de adsorción y centrifugar a 12.000 x g durante 2 min.
      3. Deseche el filtrado en la parte inferior de los tubos de recogida. Añadir 600 l del tampón de lavado a la columna, centrifugar a 12.000 x g durante 1 min y desechar el filtrado.
      4. Repita el paso 1.1.3.3 una vez.
      5. Vuelva a colocar la columna en el tubo de recogida y centrifugar a 12.000 x g durante 2 min para eliminar todo el tampón de lavado restante.
      6. Colocar la columna de adsorción en un tubo de centrífuga esterilizado de 1,5 ml, añadir 50 l de ddH2O al centro de la columna de adsorción y centrifugar a 12.000 x g durante 1 min. Medir la concentración de ADN del eluido utilizando el espectrofotómetro.
    4. Restricción de la digestión de plásmidos
      1. Digerir el vector pGEX-4T-1 con BamHI y NotI. Para ello, mezcle 4 g de vector pGEX-4T-1, 5 ml de tampón de digestión 10x, 1 l de BamHI y 1 l de NotI y ddH2O a un volumen de reacción final de 50 ml. Incubar a 37oC durante 2 h.
      2. Digerir el vector pRK5 con BamHI y XhoI mezclando 4 g de vector pRK5, 5 l de tampón de digestión 10x, 1 l de BamHI y 1 l de XhoI y ddH2O a un volumen de reacción final de 50 l. Incubar a 37oC durante 2 h.
    5. Analizar el ADN vectorial por electroforesis de gel, cortar la banda de tamaño deseado del gel rápidamente con un bisturí debajo de una lámpara UV y colocarlo en un tubo centrífugo.
    6. Purificar el ADN vectorial con un kit de extracción de gel como 1.1.3 siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La longitud de los plásmidos linealizados: pGEX-4T-1, 4.4 kb; pRK5, 4,7 kb.
    7. Establecer una reacción de ligadura recombinante estándar combinando 0,03 pmol de vector linealizado, 0,06 pmol de fragmento de ADNc, 2 ml de ligasa y 4 l de tampón de ligasa de 5x y ddH2O en un volumen de reacción final de 10 l.
      NOTA: Clonar MEIOB-A, C y E en un vector pGEX-4T-1 y MOV10 en un vector pRK5.
    8. Incubar la mezcla a 37 oC durante 30 minutos, y luego enfriar la reacción inmediatamente durante 5 minutos sobre hielo. Transforma los plásmidos recombinantes MEIOB en bacterias BL21 y plásmidos recombinantes MOV10 en bacterias DH5.
      NOTA: Verifique todas las construcciones recombinantes mediante la secuenciación de Sanger.
    9. Preparar las reservas de glicerol de cultivos bacterianos que contengan plásmidos recombinantes verificados añadiendo un volumen igual de 50% de glicerol a cultivos líquidos, y almacenar a -80 oC.
      NOTA: Para cada experimento posterior, exhala rallar las bacterias de las existencias de glicerol en una placa de agar fresca y utilizar una sola colonia para la expansión como se describe en el paso 1.2.
  2. Extractos de proteína MEIOB de bacterias
    1. Escoge una colonia de cada cepa BL21 transllenada con el plásmido pGEX-4T-1 vacío o recombinante verificado por secuenciación e inocular en 3 ml de LB que contenga 100 g/ml de ampicilina. Crecer durante la noche a 37oC con agitación a 220 rpm.
    2. Inocular 300 ml lb que contiene 100 g/ml de ampicilina a partir de 3 ml de cultivo nocturno (a partir del paso 1.2.1). Cultivar los cultivos con temblores a 37 oC durante 2 h hasta que OD600 alcance 0.5-1.0.
    3. Inducir la expresión de proteína añadiendo isopropilo beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a una concentración final de 0,2 mM. Incubar los cultivos durante 3 h adicionales con agitación a 180 rpm y 18oC.
    4. Centrifugar el cultivo bacteriano a 3.500 x g y 4 oC durante 20 min.
    5. Resuspenda el pellet en 20 ml del tampón de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco helado (DPBS). Sonicar la suspensión bacteriana sobre hielo durante 25 ciclos en ráfagas cortas de 10 s (potencia de salida 20%) seguido de 2-3 s descansando sobre hielo.
    6. Centrifugar el lisado a 12.000 x g y 4 oC durante 15 minutos. Transfiera todo el sobrenadante a un tubo nuevo.
    7. Prelavado de cuentas.
      1. Añadir 300 sl de cuentas de glutatión-sepharose a un tubo fresco de 15 ml y lavar las perlas con 10 ml de tampón PBS helado.
      2. Centrifugar a 750 x g y 4 oC durante 1 min para peletizar las perlas y desechar la solución de lavado.
    8. Añadir el lisado a las cuentas lavadas e incubar a 4oC durante 2 h. Centrífuga a 750 x g y 4oC durante 1 min para peletizar las perlas. Enjuague las perlas en 10 ml de PBS 8x helado.
    9. Elite las perlas con 1 mL del tampón de elución (10 mM de glutatión en Tris-HCl de 50 mM a pH 8.0) 6x, incubando a 4oC durante 10 minutos antes de cada paso de elución. Centrífuga a 750 x g y 4 oC durante 1 min para peletizar las perlas. Recoger y agrupar las 6 fracciones.
    10. Transfiera las proteínas eluted asadas en un filtro centrífugo y concentre por centrifugación a 7.500 x g para obtener un volumen final de 100-200 l.
  3. Extractos de proteína MOV10 de células HEK293T
    1. Expresar transitoriamente las proteínas MOV10 en células HEK293T cultivadas.
      1. Preparar el plásmido MOV10-pRK5 a una concentración >500 ng/L.
      2. Células de semilla HEK293T en platos de 15 cm. Cuando la densidad celular alcance el 70%-90%, sustituya el medio de cultivo celular por el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contenga un 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina.
      3. Para una transfección, diluir 60 g de ADN plásmido MOV10-pRK5 en 3 ml del medio sérico reducido, luego añadir 120 l del reactivo potenciador de la transfección, y mezclar bien.
      4. En un tubo separado diluir 90 l del reactivo de transfección con 3 ml de medio sérico reducido (sin penicilina-estreptomicina) y mezclar bien.
      5. Añadir el ADN diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
      6. Agregue la mezcla de transfección al cultivo celular y las células de cultivo por 36-48 h.
    2. Después de 36-48 h, recoger las células de cada placa en un tubo de 50 ml. Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4oC. Lave cada pellet con 10 ml de PBS helado y recoja las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4 oC.
    3. Resuspenda el pellet en 3 ml de tampón de lisis celular que contenga un cóctel completo de inhibidor de proteasa libre de ácido ehylenediaminetetraacético (EDTA). Incubar durante 30 minutos sobre hielo. Centrifugar el lisado a 20.000 x g y 4oC durante 20 min.
    4. Añadir 100 l de perlas magnéticas anti-FLAG por plato de células en un tubo de 1,5 ml.
    5. Lave las perlas magnéticas 2x con tampón K150 (50 mM HEPES a pH 7.5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0.1% NP-40).
      1. Resuspenda las perlas magnéticas en 1 ml de tampón K150 helado.
      2. Incubar las perlas magnéticas durante 2 minutos a 4 oC con rotación suave y peletizar las cuentas magnéticas con la ayuda de un imán. Retire y deseche el sobrenadante.
    6. Añadir las perlas magnéticas a la célula lisado sobrenadante desde el paso 1.3.3 e incubar a 4 oC durante 2 h.
    7. Lave las perlas magnéticas unidas a proteínas 3veces con el tampón K150, luego 2x con K150 que contiene 250 mM de NaCl, luego 3x con tampón K150 como 1.3.5.
    8. Resuspender las perlas en 300 l de tampón de elución FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerol), añadir péptido FLAG a una concentración final de 0,5 g/l, e incubar con perlas en un rotador a 4 oC durante 1 h durante 1 h , a continuación, pellet las cuentas magnéticas con la ayuda de un imán.
    9. Recoger el sobrenadante que contiene las proteínas MOV10 elued, determinar la concentración, y almacenar a -80 oC para su uso futuro.

2. Preparación de ácido nucleico

  1. Comprar ADN y ARN oligonucleótidos (oligos) con o sin etiquetas de biotina de una fuente adecuada. Diluir cada oligo en ddH libre de RNase2O a 20 m y mantenerlo a -80 oC para su uso futuro.
    NOTA: Las secuencias oligodeantes de sustratos de ADN/ARN utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla2.
  2. Preparar la siguiente mezcla para la reacción de recocido de ARN de doble cadena (dsRNA) para el ensayo de actividad de helicaso MOV10: mezclar 60 mM N-2-hidroxietiloganazina-N-ácido sulfonónico (HEPES) a pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 y ddH 2 sin rnalosa O en un volumen de reacción final de 20 l.
  3. Arn oligo formar ARN dúplex calentando una mezcla de la hebra superior etiquetada con biotina (2 m, concentración final) y 1,5 veces su hebra inferior complementaria sin etiquetar en el tampón de recocido (paso 2.2) a 95 oC durante 5 min, y luego enfriarla lentamente hasta la habitación (RT).

3. Ensayos bioquímicos in vitro

  1. EMSA y reacciones enzimáticas
    1. Para el ensayo MEIOB EMSA, mezclar 50 mM Tris HCl a pH 7.5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% NP-40, 0.8 mM (u otras concentraciones relevantes como se muestra en la Figura 2 y Figura 3)MEIOB oligonucleótidos etiquetados con biotina y ddH2O en un volumen de reacción final de 20 l. Incubar a RT durante 30 minutos, y añadir 5x tampón de parada (125 mM EDTA, 50% glicerol) para detener la reacción.
    2. Configure las reacciones de actividad de nucleasa MEIOB como se describe en el paso 3.1.1 pero sin la adición de 10 mM EDTA.
    3. Para el ensayo de actividad de helicase MOV10, mezcle 50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0.01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U / L RNase inhibidor, 10 nM biotina-etiquetado ARN sustrato, 2 mM trifosfato de adenosina (ATP), 100 nM trampa de ARN, y 20 ng de proteína MOV10 y ddH2O en un volumen de reacción final de 20 l. Incubar la mezcla de reacción a 37oC durante 10 min, 30 min y 60 min. Añadir el tampón de parada 5x para detener la reacción.
      NOTA: Trampa de ARN, un oligo sin etiqueta biotina con secuencia, complementariedad al oligo etiquetado, que evita que el dsRNA desenrollado se retenga de nuevo.
  2. Geles de poliacrilamida
    1. Lavar las placas de gel (16 cm x 16 cm) y los peines de 1,5 mm. Montar las unidades de electroforesis de gel.
    2. Para preparar un gel de poliacrilamida nativo al 10%, mezcla 14 ml de ddH2O, 1,25 mL de 10x Tris-boric acid-EDTA (TBE), 8,3 mL de 30% de acrilamida, 1,25 ml de 50% de glicerol, 187,5 l de persulfato de amonio recién preparado al 10% (APS) y 12,5 ml de glicerol al 50%, 187,5 l de persulfato de amonio recién preparado (APS) y 12,5 tetrametiletilendiamina (TEMED).
    3. Para preparar un gel de poliacrilamida 20% nativo, mezclar 5,5 ml de ddH2O, 1,25 ml de 10x TBE, 1,25 ml de 50% de glicerol, 16,7 ml de 30% de acrilamida, 187,5 ml de 10% APS y 12,5 oL de TEMED.
    4. Vierta la solución de acrilamida inmediatamente en el gel e inserte el peine. Deje que la mezcla se polimerice durante aproximadamente 30 minutos.
  3. Gel running
    1. Retire el peine, llene los tanques con el tampón de electroforesis en funcionamiento (0,5x TBE).
    2. Enjuague los pozos de muestra con un tampón TBE de 0,5x y, a continuación, ejecute previamente el gel a 100 V sobre hielo durante 30 minutos.
    3. Cargue muestras de 20-25 l en cada poca.
    4. Usa un gel de acrilamida nativo al 10% para el ensayo EMSA y un gel de acrilamida nativo al 20% para los ensayos enzimáticos. Ejecute la electroforesis a 100 V en el baño de hielo hasta que el marcador azul del bromofenol haya migrado al cuarto inferior del gel.
  4. Desmontar las placas de gel, recortar el gel quitando los pozos de carga y los carriles no utilizados. Coloque el gel en un tampón TBE de 0,5x.
  5. Corte el papel filtrante y la membrana de nylon al tamaño del gel. Humedezca previamente el papel de filtro limpio y la membrana de nylon.
  6. Montar la pila para transferirla.
    1. Coloque la membrana prehúmeda en el papel de filtro prehúmedo.
    2. Coloque el gel sobre la membrana.
    3. Cubra el gel con otra capa de papel de filtro prehúmedo.
    4. Retire todas las burbujas de aire rodando una pipeta limpia de centro a borde.
  7. Transfiera las muestras del gel a la membrana en un aparato electroforético semiseco a 90 mA durante 20 min.
  8. Detenga la transferencia y, a continuación, seque la membrana en un nuevo papel de filtro durante 1 min.
  9. Reticule las muestras irradiando la membrana a 120 mJ/cm2 para 45-60 s en un reticulante de luz UV equipado con bombillas de 254 nm (función de enlace cruzado automático). Seque al aire la membrana a RT durante 30 min.
  10. Detección de quimioluminiscencia
    1. Protocolo 1: Utilice un volumen estándar de kit comercial de detección de ácido nucleico quimioluminiscente.
      1. Añadir 20 ml de tampón de bloqueo a la membrana e incubar durante 15-30 min con un suave temblor en un rotador a 20-25 rpm.
      2. Prepare la solución de tampón conjugado/bloqueo añadiendo 66,7 ml de conjugado de peroxidasa de estripaviovidina-baramán estabilizado de 66,7 l a 20 ml de tampón de bloqueo.
      3. Retire suavemente el búfer de bloqueo y reemplácelo con el búfer conjugado/bloqueo. Incubar durante 15 minutos en un rotador a 20-25 rpm.
      4. Lavar la membrana 4x con agitación a 40-45 rpm durante 5 min cada una.
      5. Añadir 30 ml de tampón de equilibrio de sustrato a la membrana. Incubar la membrana durante 5 min con agitación a 20-25 rpm.
      6. Preparar la solución de trabajo del sustrato añadiendo 6 ml de solución luminol/enhancer a 6 ml de solución estable de peróxido. Evite la luz.
      7. Cubrir toda la superficie de la membrana con solución de trabajo de sustrato e incubar durante 5 min.
      8. Escanee la membrana en un sistema de imágenes quimioluminiscente durante 1-3 s.
    2. Protocolo 2: Utilice 2 x kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscente comercial diluido 2 veces y siga los pasos 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. Protocolo 3: Utilice reactivos autofabricados6.
      1. Prepare el tampón de bloqueo: mezclar 0,1 M Tris-HCl a pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2y 3% de albúmina sérica bovina Fracción V. AP 7,5 buffer: mezclar 0,1 M Tris-HCl a pH 7,5, 0,1 M NaCl y 2 mM MgCl2. Búfer AP 9.5: mezclar 0,1 M Tris-HCl a pH 9,5, 0,1 M NaCl y 50 mM MgCl2. Tampón TE: mezclar 10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 1 mM EDTA a pH 8.0.
      2. Remoje la membrana en tampón de bloqueo a 30 oC durante 1 h.
      3. Añadir 8,5 ml de fosfatasa alcalina de estreptavidina a 10 ml de AP 7,5 Tampón. Agitar suavemente la membrana en esta solución a RT durante 10 min. A continuación, lave la membrana 2x en 15 ml de tamón AP 7.5 durante 10 min.
      4. Lave la membrana una vez más en 20 ml de tampón AP 9.5 durante 10 min. Añadir 20 ml de tampón TE para detener la reacción.
      5. Añadir 7,5 ml de solución de desarrollo a la membrana, y escanear la membrana en un sistema de imágenes quimioluminiscente durante 1-3 s.

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Representative Results

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La estructura proteica de MEIOB y las construcciones de expresión utilizadas en este estudio se ilustran en la Figura 1A. Los pliegues OB en MEIOB son estructuras compactas similares a barriles que pueden reconocer e interactuar con ácidos nucleicos de una sola cadena. Uno de los dominios OB (aa 136-307, construir A) une ADN trenzado único (ssDNA), la proteína truncada (aa 136-178 truncamientos, construcción C) y la forma mutante de punto (mutación R235A, construcción E) de MEIOB no tienen actividad de unión al ADN26. Las proteínas de fusión GST-MEIOB se sobreexpresaron en bacterias BL21, con pasos de aislamiento posteriores que resultaron en proteínas purificadas mostradas por la tinción azul de Coomassie y el análisis de manchas occidentales (Figura1B). Los sustratos de ácido nucleico a diferentes concentraciones ilustran la alta sensibilidad de la señal de biotina, con una señal detectable de 1 nM oligo después de un tiempo de exposición relativamente corto para 1-3 s (Figura2A). La proteína MEIOB-A de tipo salvaje, pero no las proteínas mutantes MEIOB-E y MEIOB-C, se unen fuertemente a sustratos de SsDNA etiquetados con biotina de 36 nt (la misma longitud y secuencia que se utilizaron anteriormente26) (Figura2B)y separan los sustratos en escaleras(Figura 2C).

El ensayo in vitro de proteínas MEIOB con arns oligos de la misma secuencia que los sustratos de ssDNA utilizados en la Figura 2B,C ilustra la capacidad de unión y la actividad de exonucleasa de MEIOB en ARN de una sola cadena (ssRNA) (Figura3A,B) ). La actividad de unión de MEIOB con ADN y ARN se analizó cuantitativamente (Figura3C). Además, las proteínas MOV10 con etiqueta FLAG se purificaron a partir de células HEK293T (Figura4A). Para medir la actividad de la helilínea de MOV10, se diseñó un ARN dúplex (misma longitud pero secuencia diferente a la utilizada anteriormente16) con un voladizo de 18 nt 5' (Figura4B). Cuando el dúplex de ARN etiquetado con biotina fue incubado con MOV10 en presencia de ATP, una banda inferior correspondiente al ARN etiquetado biotina liberado de una sola cadena apareció con tiempo creciente, reflejando la función del MOV10 como un helicaso de ARN. Por último, para reducir los costes, se intentó optimizar el uso de reactivos para la detección de quimioluminiscencia de la etiqueta de biotina. Se encontró que una doble dilución del kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscente no afectaba negativamente a la sensibilidad cromogénica del sistema biotina-estreptavidina, y emocionantemente, los reactivos autofabricados funcionaban casi igual de bien (Figura5 ).

Figure 1
Figura 1 : Purificación de Proteínas MEIOB. (A) Representación esquemática de las construcciones MEIOB utilizadas en este estudio26. MEIOB contiene un dominio OB. Todas las construcciones MEIOB (A, C, E) se expresaron como proteínas de fusión GST. (B) Tinción azul coomassia y análisis de manchas occidentales de las proteínas MEIOB purificadas mediante el sistema de bacterias GST. Las flechas rojas indican las posiciones de las proteínas MEIOB purificadas. Las bandas de aproximadamente 26 KDa corresponden al glutatión. Para la mancha occidental, se utilizó anticuerpo anti-GST con dilución 1:6000. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Ensayos in vitro de interacciones MEIOB-ssDNA . (A) Prueba de resistencia a la señal de diferentes concentraciones de 36 nt con la etiqueta ssDNA con biotina. (B) EMSA resultado de la unión a proteínameMES a sustratos de ADN etiquetados finales de biotina 5' (10% gel nativo). (C) Escisión mediada por MEIOB de sustratos de ADN etiquetados finales de 5' biotina (20% gel nativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Ensayos in vitro de interacciones MEIOB-ssRNA. (A) EMSA resultado de la unión a proteínameMES a sustratos de ARN etiquetados finales de biotina 5' (10% gel nativo). (B) Escisión mediada por MEIOB de sustratos de ARN etiquetados finales de 5' biotina (20% gel nativo). (C) Gráfica del porcentaje de adn/ARN enlazado frente a la concentración MEIOB-A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Proteína MOV10 purificada y su desenredo de 5' cola dsRNA in vitro. (A) Mancha azul coomassia de proteína MOV10 purificada utilizando el sistema FLAG-HEK293T. Las flechas rojas indican las posiciones de la proteína MOV10 purificada. Las bandas del gel coomassie con un peso molecular aproximado de 55 kDa corresponden a la cadena de inmunoglobulina pesada (IgG) del anticuerpo FLAG. (B) MOV10 desenrolla 5' decolación dsRNA con tiempo creciente (10, 30, 60 min) a 37 oC. arnderos de 18 nt de una sola cadena, ARN de doble cadena dsRNA a 54 nt con una cola de 18 nt 5' (20% gel nativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Alternativa métodos de usando biotina cromogénico reactivo s en el ensayo MEIOB. Volumen estándar comercial: instruido por kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscente; 2x volumen comercial diluido: dilución doble de cada tampón en kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscente, reactivos hechos a sí mismos: ver detalles en el paso 3.7.3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: Primers utilizados para la PCR amplifican el gen fragmentos de Meiob y Mov10. Las letras en negrita en los primeros delanteros y reversos son sitios de corte BamHI y NotI; las letras en negrita cursiva en una imprimación inversa son sitios de corte XhoI; las letras en negrita en las casillas indican los nucleótidos correspondientes a la mutación de puntor R235A.

Table 2
Tabla 2: Secuencias de sustratos de ADN/ARN utilizados en este trabajo.

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Discussion

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Investigar las interacciones proteína-ácido nucleico es fundamental para nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a diversos procesos biológicos. Por ejemplo, MEIOB es una proteína específica para la meiosis y la fertilidad en mamíferos25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB que se une al ADN de una sola cadena y exhibe una actividad de exonucleasa de 3' a 5'26,que se relaciona directamente con su relevancia fisiológica durante la recombinación meiótica. Como otro ejemplo, MOV10 es un helipuerto de ARN con función omnipresente que puede asociarse con las estructuras secundarias de ARN16. En consecuencia, MOV10 muestra amplias propiedades de unión al ARN y una actividad de desenrollado dúplex de ARN de 5' a 3'16. Los estudios que informaban de las actividades bioquímicas antes mencionadas de estas proteínas se basaron en el uso de isótopo de 32P para etiquetar ácidos nucleicos para ensayos in vitro. En el presente estudio, hemos establecido protocolos para una serie de experimentos in vitro etiquetados con biotina de función MEIOB y MOV10. Estos protocolos comienzan con la preparación de proteínas activas y terminaron con la toma de imágenes de señales de biotina.

Específicamente, en línea con estudios anteriores25,26, las proteínas MEIOB se sobreexpresaron en bacterias con y purificación produjo una sola banda con señal de tinción de Coomassie fuerte después de la electroforesis de gel. Sin embargo, la purificación de la proteína MOV10 de longitud completa fue más eficaz cuando se sobreexpresó como proteína fusionada con etiqueta FLAG en células HEK293T que como una proteína fusionada con GST en bacterias (datos no mostrados). Para obtener cantidades suficientes de proteína según la pureza adecuada para reacciones posteriores, estos dos sistemas de purificación de proteínas deben compararse para determinar el método más adecuado para proteínas con diferentes tamaños y/o propiedades. Los ácidos nucleicos fueron etiquetados utilizando biotina en lugar de 32P como sustrato y obtuvieron una señal robusta al examinar la afinidad de unión a ácidos nucleicos o las actividades de procesamiento de ácido nucleico de ambas proteínas. Sin embargo, como las proteínas purificadas a partir de bacterias con frecuencia están contaminadas con RNase, es difícil descartar la posibilidad de que la actividad de escisión vista durante la reacción in vitro pueda ser en parte el resultado de contaminar la RNase. Los ensayos in vitro con mutantes MEIOB con actividad catalítica reducida (truncado y mutante puntual) mostraron un deterioro sustancial del procesamiento del sustrato de ARN, pero no se puede excluir la posible contaminación por RNase. Los resultados obtenidos con cada una de las construcciones MEIOB que actúan sobre ssDNA y MOV10 desenrollando dsRNA son similares a los obtenidos en el estudio anterior16,26. Sin embargo, MEIOB procesa el ADN para generar un frotis, mientras que una banda más discreta se ve con ARN de acuerdo con los resultados experimentales (Figura2C y Figura 3B). Posiblemente, MEIOB tiene capacidades de unión diferenciales al sustrato de ADN y ARN (Figura2B, Figura 3A,C), lo que lleva a la diferencia en sus productos de escisión. También puede ser posible que MEIOB obstina el ADN y el ARN de una manera distinta. Queda por investigar el papel exacto de MEIOB en el procesamiento de ARN (por ejemplo, utilizando la proteína MEIOB fusionada con etiqueta FLAG expresada en células HEK293T).

Las sondas de ácido nucleico etiquetadas con biotina son ventajosas en las 32sondas con etiqueta P, ya que no requieren protección específica ni eliminación de residuos. En segundo lugar, las sondas etiquetadas con biotina se pueden conservar de forma estable durante al menos 1 año a -20 oC, mientras que las sondas etiquetadas con Psolo duran 2 semanas. Por lo tanto, el mismo lote de ácidos nucleicos etiquetados con biotina se puede utilizar durante un largo período de tiempo, manteniendo la reproducibilidad de los experimentos. Por último, la autoradiografía rápida de las sondas radiactivas puede depender de instrumentos caros como la pantalla de fósforo. Por el contrario, todos los ensayos etiquetados con biotina descritos aquí se pueden realizar en el plazo de un día y no requieren equipo especial. Los inconvenientes del etiquetado de la biotina abarcan principalmente pasos experimentales adicionales, incluyendo la transferencia de gel y la quimioluminiscencia que son necesarios para detectar sustratos etiquetados con biotina, pero que además pueden requerir optimización o solución de problemas. Otra debilidad general es la sensibilidad relativamente baja del etiquetado de la biotina en comparación con la del etiquetado de radioisótopos. En estos ensayos, sin embargo, se logró una detección bien visible de una concentración muy baja de ácidos nucleicos (Figura2A).

Además, el aparato de transferencia de gel semiseco es adecuado para transferir geles más largos de lo regular a membranas. En comparación con la transferencia húmeda, la transferencia semiseca es más rápida, especialmente para los ácidos nucleicos, y produce una señal de fondo baja. Además, los costes de la reacción cromogénica del sistema biotina-estreptavidina se redujeron diluyendo los reactivos comerciales o haciendo los nuestros, los cuales lograron señales similares. La sensibilidad de detección de los reactivos autofabricados puede no parecer tan alta, aunque suficiente en el presente documento (Figura5C),pero se puede mejorar ampliando el tiempo de bloqueo (datos no publicados). Además, las señales se pueden mejorar con una mayor concentración de la sonda de ácido nucleico utilizada para los ensayos. Dada la evidencia experimental anterior, la etiqueta de biotina puede ser un sustituto ventajoso de 32P en múltiples ensayos bioquímicos in vitro.

En conjunto, este protocolo ofrece una plataforma etiquetada por biotina para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos que resulta ser robusta, confiable, eficiente y asequible.

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Disclosures

No se declaran conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a P. Jeremy Wang (Universidad de Pensilvania) por ediciones y discusiones útiles. También agradecemos a Sigrid Eckardt por la edición de idiomas. K. Z. contó con el apoyo del Programa Nacional Clave de I+D de China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) y la National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81471502, 31871503) y el Programa Innovador e Empresarial de la Provincia de Jiangsu. J. N. contó con el apoyo de Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31771588) y el 1000 Youth Talent Plan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Germany 5242R
Chemiluminescent Imaging System Tanon, China 5200
Digital sonifer Branson, USA BBV12081048A 450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotter Hoefer, USA TE77XP
Tube Revolver  Crystal, USA 3406051
UV-light cross-linker UVP, USA CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter  Milipore, USA UFC801096 4 ml/10 K
Nylon membrane Thermo Scientific, USA TG263940A
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430167 100 mm 
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430597 150 mm 
Microtubes tubes AXYGEN, USA MCT-150-C 1.5 mL 
Tubes Corning, USA 430791 15 mL
Reagents 
Ampicillin SunShine Bio, China 8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beads Sigma, USA M8823
ATP Thermo Scientific, USA 591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime, China C3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent  Sigma, USA 107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit  Vazyme, China C112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit Thermo Scientific, USA T1269950
dNTP Sigma-Aldrich, USA DNTP100-1KT
DMEM Gibco, USA 10569044
DPBS buffer Gibco, USA 14190-136
EDTA Invitrogen, USA AM9260G 0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktail Roche, USA 04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit  Vazyme, China  
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit Vazyme, China DC301-01
FBS Gibco, USA 10437028
FLAG peptide Sigma, USA F4799
Glycerol Sigma, USA SHBK3676
GST Bulk Kit GE Healthcare, USA 27-4570-01
HEPES buffer Sigma, USA SLBZ2837 1 M 
IPTG Thermo Scientific, USA 34060
KoAc Sangon Biotech, China 127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent Thermo Scientific, USA L3000001
MgCl2 Invitrogen, USA AM9530G 1 M
NaCl Invitrogen, USA AM9759
 
5 M 
NP-40 Amresco, USA M158-500ML
Opti-MEM medium Gibco, USA 31985062
PBS Gibco, USA 10010023 PH 7.4
RNase Inhibitor Promega, USA N251B
Streptavidin alkaline phosphatase Promega, USA V5591
TBE Invitrogen, USA 15581044
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15567027 1 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15568025 1 M, PH 8.0
Tween-20 Sangon Biotech, China A600560

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Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos
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Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).More

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).

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