Summary
Presenteras här är protokoll för in vitro biokemiska analyser med hjälp av biotin etiketter som kan vara allmänt tillämpliga för att studera protein-nukleinsyra interaktioner.
Abstract
Interaktioner mellan protein och nukleinsyror spelar viktiga roller i biologiska processer som transkription, rekombination och RNA-metabolism. Experimentella metoder för att studera interaktioner mellan protein och nukleinsyror kräver användning av fluorescerande taggar, radioaktiva isotoper eller andra etiketter för att upptäcka och analysera specifika målmolekyler. Biotin, en icke-radioaktivt nukleinsyra etikett, används ofta i elektroforetiska rörlighet Shift analyser (EMSA) men har inte regelbundet använts för att övervaka protein aktivitet under nukleinsyra processer. Detta protokoll illustrerar nyttan av biotin märkning under in vitro enzymatiska reaktioner, visar att denna etikett fungerar bra med en rad olika biokemiska analyser. Specifikt, i linje med tidigare fynd med hjälp av radio Isotope 32P-märkta substrat, det bekräftas via biotin-märkt EMSA att meiob (ett protein som är särskilt involverade i meiotiska metafaserna rekombination) är ett DNA-bindande protein, att MOV10 (en RNA-Spiras) löser biotin-märkta RNA duplex strukturer, och att MEIOB klyver biotin-märkt enkelsträngad DNA. Denna studie visar att biotin kan ersätta 32P i olika nukleinsyrafelaterade biokemiska analyser in vitro.
Introduction
Protein-nukleinsyra interaktioner är involverade i många viktiga cellulära processer såsom DNA-reparation, replikering, transkription, RNA-bearbetning, och översättning. Proteininteraktioner med specifika DNA-sekvenser inom kromatin krävs för en snäv kontroll av genuttrycket på den transkriptionella nivån1. Exakt posttranskriptionell reglering av många kodning och icke-kodande rnas kräver omfattande och komplicerade interaktioner mellan något protein och RNA2. Dessa lager av genexpression reglerande mekanism omfattar en kaskad av dynamiska intermolekyl ära händelser, som samordnas av interaktioner mellan transkription/epigenetiska faktorer eller RNA-bindande proteiner med deras nukleinsyra mål, samt protein-proteininteraktioner. För att dissekera om proteiner in vivo direkt eller indirekt associeras med nukleinsyror och hur sådana associationer uppträder och kulminerar, utförs in vitro biokemiska analyser för att undersöka bindningsaffiniteten eller enzymatiska aktiviteten hos proteiner av intresse på designade substrat av DNA och/eller RNA.
Många tekniker har utvecklats för att upptäcka och karakterisera nukleinsyra-proteinkomplex, inklusive den elektroforetiska rörligheten Shift-analysen (EMSA), även kallad Gel utvecklingsstörning assay eller band Shift assay3,4,5 . EMSA är en mångsidig och känslig biokemisk metod som ofta används för att studera den direkta bindningen av proteiner med nukleinsyror. EMSA förlitar sig på gel-elektroforetisk förskjutning i band, som rutinmässigt visualiseras med hjälp av kemiluminiscensen för att detektera biotin-etiketter6,7, fluorescensen hos fluorophore-märkningen8,9 autoradiografi av radioaktiva 32P-etiketter10,11. Andra ändamål av biokemiska studier är identifiering och karakterisering av nukleär syra-bearbetning aktivitet av proteiner, såsom nukleasbaserade reaktioner för att bedöma klyvning produkter från nukleinsyra substrat12, 13 , 14 och DNA/RNA strukturera-varva ner analyser för att utvärdera Escherichia aktiviteter15,16,17.
I sådana enzymatiska aktivitets analyser används ofta radioisotope-märkta eller fluorophore-märkta nukleinsyror som substrat på grund av deras höga känslighet. Analys av röntgenbilder av enzymatiska reaktioner med 32P märkt radiotracers har visat sig vara känsliga och reproducerbara18. Men i ett ökande antal laboratorier i världen är användningen av radioisotoper begränsad eller till och med förbjuden på grund av de hälsorisker som är förknippade med potentiell exponering. Förutom biosäkerhets frågor, andra nackdelar är nödvändiga nödvändig utrustning för att utföra arbete med radioisotoper, krävs radioaktivitet licens, kort halveringstid på 32P (ca 14 dagar), och gradvis försämring av sonden kvalitet på grund av radiolys. Sålunda har alternativa icke-isotopiska metoder utvecklats (dvs. märkning av sonden med fluoroforer möjliggör detektering genom fluorescerande avbildning19). Det behövs dock ett bildsystem med hög upplösning när man använder fluorescerande märkta prober. Biotin, en vanligt förekommande etikett, binder lätt till biologiska makromolekyler som proteiner och nukleinsyror. Biotin-streptavidin systemet fungerar effektivt och förbättrar detekterings känslighet utan att öka icke-specifik bakgrund20,21. Förutom EMSA, biotin används ofta för Proteinrening och RNA pull-down, bland annat22,23,24.
Detta protokoll använder framgångsrikt biotin-märkta nukleinsyror som substrat för in vitro biokemiska analyser som inkluderar EMSA, förutom enzymatiska reaktioner där biotin inte har använts ofta. Den meiob ob domänen är konstruerad och två mutanter (trunkering och punktmutation) uttrycks som gst fusion proteiner25,26,27, samt mus MOV10 rekombinant flagg fusionsprotein16. Denna rapport belyser effektiviteten i detta kombinerade protokoll för Proteinrening och biotin-märkta analyser för diverse experimentella ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein beredning
- MEIOB och MOV10 uttryck konstruktioner
- Generera cDNA-uttryck konstruerar kodning mus MEIOB-A, C och E (figur 1a) och MOV10.
- Ställ in polymeras kedjereaktion (PCR) reaktioner för varje fragment. Blanda 1 μL cDNA-mus (från C57BL/6-musens testis), 1 μL dNTP, 2 μL 10 μM framåt primer, 2 μL 10 μM omvänd primer, 1 μL DNA-polymeras, 25 μL 2x PCR-buffert och 18 μL dubbeldestillerat H2o (DDH2o) i en slutlig volym på 50 μL.
Anmärkning: primers för förstärkning av Meiob -och Mov10 -genfragment listas i tabell 1. - Utför PCR-reaktioner med hjälp av följande program: 95 ° c i 5 min, 35 värmecykler vid 95 ° c i 15 s, glödgning vid 64 ° c i 15 s, förlängning vid 72 ° c i 20 s (2 min för förlängning full längd MOV10) och slutlig förlängning vid 68 ° c i 7 min.
Anmärkning: Använd primer par MEIOB-E (F1) och MEIOB-E-Mut (R1) och MEIOB-E-Mut (F2) och MEIOB-E (R2) för att förstärka två segment som innehåller Mutant sekvens inom en överlappande sekvens vid 3 ' och 5 ' ändarna, respektive, att generera en mutant PCR mall.
- Ställ in polymeras kedjereaktion (PCR) reaktioner för varje fragment. Blanda 1 μL cDNA-mus (från C57BL/6-musens testis), 1 μL dNTP, 2 μL 10 μM framåt primer, 2 μL 10 μM omvänd primer, 1 μL DNA-polymeras, 25 μL 2x PCR-buffert och 18 μL dubbeldestillerat H2o (DDH2o) i en slutlig volym på 50 μL.
- Analysera förstärks PCR DNA genom gel elektrofores, skär bandet av erforderlig storlek från gelen snabbt under en UV-lampa, och placera i en centrifug röret.
Anmärkning: de förväntade produktstorlekar synlig på aguppstod gel för MEIOB-A är 536 BP, MEIOB-C är 296 BP, MEIOB-E är 312 BP och 229 BP, och MOV10 är 3015 BP. - Rena PCR-DNA med en gel Extraction Kit enligt tillverkarens protokoll.
- Tillsätt en lika volym upplösning buffert i centrifugröret från steg 1.1.2 och smält gel i ett 50-55 ° c vattenbad för 5-10 min, se till att gelen bitarna smälter helt. Centrifugera kort för att samla in droppar från väggen på röret.
Obs: massan/volymkoncentrationen av gelen och den upplösande bufferten är 1 mg/μL. - Placera adsorptionskolonnen i samlingsröret, överför lösningen som innehåller det upplösta gelfragmentet till adsorptionskolonnen och centrifugera vid 12 000 x g i 2 min.
- Kassera filtratet i botten av uppsamlings rören. Tillsätt 600 μL av tvättbufferten till kolonnen, Centrifugera vid 12 000 x g i 1 min och kassera filtratet.
- Upprepa steg 1.1.3.3 en gång.
- Placera kolonnen tillbaka in i samlingsröret, och centrifugera vid 12 000 x g i 2 min för att ta bort alla kvarvarande tvättbuffert.
- Placera adsorptionskolonnen i ett 1,5 mL steriliserat centrifugrör, tillsätt 50 μL ddH2O till mitten av adsorptionspalten och centrifugera vid 12 000 x g under 1 min. Mät eluatens DNA-koncentration med spektrofotometer.
- Tillsätt en lika volym upplösning buffert i centrifugröret från steg 1.1.2 och smält gel i ett 50-55 ° c vattenbad för 5-10 min, se till att gelen bitarna smälter helt. Centrifugera kort för att samla in droppar från väggen på röret.
- Begränsning nedbrytning av plasmider
- Digest pGEX-4T-1 vektor med BamHI och e. För att göra detta, blanda 4 μg pGEX-4T-1 vektor, 5 μL 10X sammanfattad buffert, 1 μL BamHI, och 1 μL av den och ddH2O till en slutlig reaktions volym av 50 μl. Inkubera vid 37 ° c i 2 timmar.
- Digest pRK5 Vector med BamHI och XhoI genom att blanda 4 μg pRK5 vektor, 5 μL 10X sammanfattningsbuffert, 1 μL BamHI och 1 μL XhoI och ddH2O till en slutlig reaktions volym på 50 μl. Inkubera vid 37 ° c i 2 timmar.
- Analysera vektor-DNA genom gel elektrofores, skär önskad storlek bandet från gelen snabbt med en skalpell under en UV-lampa och placera den i en centrifug röret.
- Rena vektor-DNA med en gel Extraction Kit som 1.1.3 efter tillverkarens instruktion.
Anmärkning: längden på linearized plasmider: pGEX-4T-1, 4,4 KB; pRK5, 4,7 KB. - Ställ in en standard rekombinant ligering reaktion genom att kombinera 0,03 pmol av linearized vektor, 0,06 pmol av cDNA fragment, 2 μL Ligase, och 4 μL av 5x Ligase buffert och ddH2O i en slutlig reaktions volym av 10 μl.
Obs: klon MEIOB-A, C och E till en pGEX-4T-1 vektor och MOV10 till en pRK5 vektor. - Inkubera blandningen vid 37 ° c i 30 min, och sedan kyla reaktionen omedelbart för 5 min på is. Omvandla MEIOB rekombinanta plasmider till BL21 bakterier och MOV10 rekombinanta plasmider till DH5α bakterier.
Anmärkning: Kontrollera alla rekombinanta konstruktioner med Sanger sekvensering. - Förbered glycerol lager av bakteriekulturer som innehåller kontrollerade rekombinanta plasmider genom att tillsätta en lika volym av 50% glycerol till flytande kulturer, och lagra vid-80 ° c.
Anmärkning: för varje efterföljande experiment, strimma ut bakterier från glycerol lager på en ny agarplatta och använda en enda koloni för expansion som beskrivs i steg 1,2.
- Generera cDNA-uttryck konstruerar kodning mus MEIOB-A, C och E (figur 1a) och MOV10.
- MEIOB proteinextrakt från bakterier
- Välj en koloni av varje BL21 stam transfekterade med den tomma eller rekombinanta pgex-4T-1 plasmid verifieras genom sekvensering och Inokulera i 3 ml lb innehållande 100 μg/ml ampicillin. Växa över natten vid 37 ° c med skakning vid 220 RPM.
- Inokulera 300 mL LB innehållande 100 μg/mL ampicillin från 3 mL över natten kultur (från steg 1.2.1). Odla kulturerna med skakning vid 37 ° c i 2 h till OD600 når 0.5-1.0.
- Inducera protein uttrycket genom att tillsätta isopropylbeta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) till en slutkoncentration på 0,2 mM. Inkubera kulturerna i ytterligare 3 timmar med skakning vid 180 rpm och 18 ° c.
- Centrifugera bakteriekulturen vid 3 500 x g och 4 ° c i 20 min.
- Omsuspendera pelleten i 20 mL iskall Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) buffert. Sonikera den bakteriella suspensionen på is för 25 cykler i korta 10 s skurar (uteffekt 20%) följt av 2-3 s vilande på is.
- Centrifugera lysatet vid 12 000 x g och 4 ° c i 15 min. överför alla supernatanten till ett nytt rör.
- Pre-tvätta pärlor.
- Tillsätt 300 μL av Glutathione-sepharose-pärlorna till ett nytt 15 mL-rör och tvätta pärlorna med 10 mL iskall PBS-buffert.
- Centrifugera vid 750 x g och 4 ° c i 1 min för att pelletera pärlorna och kassera tvättlösningen.
- Tillsätt lysatet till de tvättade pärlorna och inkubera vid 4 ° c i 2 h. Centrifugera vid 750 x g och 4 ° c i 1 min för att pelleten av pärlorna. Skölj pärlorna i 10 mL iskall PBS 8x.
- Eluera pärlorna med 1 mL elueringbuffert (10 mM glutation i 50 mM Tris-HCl vid pH 8,0) 6x, inkuberat vid 4 ° c i 10 min före varje elutionssteg. Centrifugera vid 750 x g och 4 ° c i 1 min för att pelleten pärlorna. Samla in och pool de 6 fraktioner.
- Överför de eluerade proteinerna till ett centrifugalfilter och koncentrera genom centrifugering vid 7 500 x g för att få en slutlig volym på 100-200 μl.
- MOV10 proteinextrakt från HEK293T celler
- Transitivt uttrycka MOV10 proteiner i odlade HEK293T celler.
- Bered MOV10-pRK5 plasmid vid en koncentration > 500 ng/μL.
- Utsäde HEK293T celler i 15 cm rätter. När CELLTÄTHETEN når ~ 70%-90%, ersätta cellen odlingssubstrat med färska Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10% foster bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin.
- För en transfektion, späd 60 μg MOV10-pRK5 plasmid-DNA i 3 mL av det reducerade serum mediet, tillsätt sedan 120 μL av transfektionshöjande reagens och blanda väl.
- Späd 90 μL av transfektionsreagenset i ett separat rör med 3 mL reducerat serum medium (utan penicillin-streptomycin) och blanda väl.
- Tillsätt det utspädda DNA till varje tub med utspädd transfektionsreagens. Inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt transfektion blandningen till cellkulturen, och kultur celler för ~ 36-48 h.
- Efter 36-48 h, samla celler från varje tallrik i en 50 mL tub. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 ° c. Tvätta varje pellet med 10 mL iskall PBS och samla celler genom centrifugering vid 500 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Omsuspendera pelleten i 3 mL celllysbuffert som innehåller komplett ehylendiamintetraättiksyra (EDTA)-fri cocktail av proteashämmare. Inkubera i 30 min på is. Centrifugera lysatet vid 20 000 x g och 4 ° c i 20 min.
- Tillsätt 100 μL anti-FLAG magnetiska pärlor per maträtt av celler i en 1,5 mL tub.
- Tvätta de magnetiska pärlorna 2x med K150 buffert (50 mM HEPES vid pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
- Omsuspendera de magnetiska pärlorna i 1 mL iskall K150 buffert.
- Inkubera de magnetiska pärlorna i 2 min vid 4 ° c med varsam rotation och pelleten de magnetiska pärlorna med hjälp av en magnet. Ta bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt de magnetiska pärlorna till cellen lysate supernatanten från steg 1.3.3 och inkubera vid 4 ° c i 2 timmar.
- Tvätta proteinet bundna magnetiska pärlor 3x med K150 buffert, sedan 2x med K150 som innehåller 250 mM NaCl, sedan 3x med K150 buffert som 1.3.5.
- Omsuspendera pärlorna i 300 μL flagga elutionsbuffert (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl vid pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glycerol), tillsätt flagga peptid till en slutlig koncentration av 0,5 μg/μl, och inkubera med pärlor på en rotator vid 4 ° c i 1 h , sedan pellets de magnetiska pärlor med hjälp av en magnet.
- Samla supernatanten som innehåller de eluerade MOV10 proteinerna, Bestäm koncentrationen och förvara vid-80 ° c för framtida bruk.
- Transitivt uttrycka MOV10 proteiner i odlade HEK293T celler.
2. framställning av nukleinsyra
- Köpa DNA och RNA oligonukleotides (oligos) med eller utan biotin etiketter från en lämplig källa. Späd varje oligo i RNase-fritt ddH2O till 20 μm och förvara den vid-80 ° c för framtida bruk.
Obs: oligo-sekvenser av DNA/RNA-substrat som används i denna studie listas i tabell 2. - Förbered följande blandning för den dubbelsträngade RNA (dsRNA) glödgning reaktion för MOV10 Escherichia Activity assay: blanda 60 mm n-2-hydroxyethylpiperazin-N-Ethane-sulfonsyra (Hepes) vid pH 7,5, 6 mm KCL, 0,2 mm mgcl2 och RNase-gratis DDH2 O i en slutlig reaktions volym på 20 μl.
- Anneal RNA oligos att bilda RNA duplex genom upphettning av en blandning av den biotin-märkta Top strand (2 μM, slutkoncentration) och en 1,5-faldigt av dess omärkta kompletterande botten strand i glödgningsbuffert (steg 2,2) vid 95 ° c i 5 min, och sedan sakta svalna det till rum temperatur (RT).
3. biokemiska analyser in vitro
- EMSA och enzymatiska reaktioner
- För MEIOB EMSA-analysen, blanda 50 mM Tris HCl vid pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 2 mm Ditiotreitol (dTT), 0,01% NP-40, 0,8 mm (eller andra relevanta koncentrationer som visas i figur 2 och figur 3) Meiob-protein och 10 nm Biotin-märkta oligonukleotides och ddH2O i en slutlig reaktions volym på 20 μl. Inkubera vid RT i 30 min, och tillsätt 5x stoppbuffert (125 mM EDTA, 50% glycerol) för att stoppa reaktionen.
- Ställ in MEIOB nukleasaktivitet reaktioner som beskrivs i steg 3.1.1 men utan tillsats av 10 mM EDTA.
- För MOV10 Escherichia Activity assay, blanda 50 mm Tris-HCl vid pH 7,5, 20 mm koac, 2 mm mgcl2, 0,01% NP-40, 1 mm DTT, 2 U/μl RNase inhibitor, 10 nm biotin-märkt RNA-substrat, 2 mm adenosintrifosfat (ATP), 100 nm RNA-fälla, och 20 ng av MOV10 protein och DDH < C6 > 2O i en slutlig reaktions volym på 20 μl. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° c i 10 min, 30 min och 60 min. Lägg till 5x-stoppbufferten för att stoppa reaktionen.
Anmärkning: RNA-fälla, en biotin-omärkt oligo med sekvens, komplementaritet med den märkta oligo, som förhindrar att det sår som glödgas igen.
- Polyakrylamidgeler
- Tvätta gel plattorna (16 cm x 16 cm) och 1,5 mm kammar. Montera gel elektrofores enheter.
- För att bereda en 10% inhemsk polyakrylamidgel, blanda 14 mL ddH2O, 1,25 ml av 10X Tris-Boric Acid-EDTA (TBE), 8,3 ml 30% akrylamid, 1,25 ml av 50% glycerol, 187,5 μl av 10% nyberedd ammoniumpersulfat (APS) och 12,5 μl av tetrametylethylendiamamin (TEMED).
- För att förbereda en 20% Native polyakrylamidgel, blanda 5,5 mL ddH2O, 1,25 ml 10X tbe, 1,25 ml av 50% glycerol, 16,7 ml 30% akrylamid, 187,5 μl av 10% APS, och 12,5 μl TEMED.
- Häll omedelbart akrylamidlösningen på gelen och sätt i kammen. Låt blandningen polymerisera i ca 30 min.
- Gel Running
- Ta bort kammen, Fyll tankarna med elektrofores löpbuffert (0.5 x TBE).
- Skölj provet brunnar med 0,5 x TBE buffert, sedan Pre-Run gelen vid 100 V på is i 30 min. Byt ut löpbufferten mot färsk 0,5 x TBE.
- Fyll på 20-25 μL prover i varje brunn.
- Använd en 10% inbyggd akrylamidgel för EMSA-analysen och en 20% inbyggd akrylamidgel för enzymatiska analyser. Kör elektrofores vid 100 V på isbadet tills bromofenol blå markören har migrerat till det nedre kvartalet av gelen.
- Demontera gel plattorna, trimma gelen genom att ta bort lastbrunnar och oanvända körfält. Placera gelen i 0,5 x TBE buffert.
- Skär filterpapperet och nylonmembranet till storleken på gelen. Förblöt det rena filterpapperet och nylonmembranet.
- Montera stacken för överföring.
- Placera pre-Wet-membranet på det för våta filterpapperet.
- Placera gelen på membranet.
- Täck gelen med ett annat skikt av pre-våt filterpapper.
- Ta bort alla luftbubblor genom att rulla en ren pipett från centrum till kant.
- Överför proverna från gelen till membranet i en halvtorr elektroforetisk apparat vid 90 mA i 20 minuter.
- Stoppa överföringen och torka sedan membranet på ett nytt filterpapper i 1 min.
- Korslänka proverna genom att bestråa membranet vid 120 mJ/cm2 för 45-60 s i en UV-ljus crosslinker utrustad med 254 nm glödlampor (Auto Crosslink funktion). Lufttorka membranet vid RT i 30 minuter.
- Kemiluminiscensdetektion
- Protokoll 1: Använd en standardvolym av kommersiella kemiluminiscente nukleinsyrsdetekterings sats.
- Tillsätt 20 mL blockerande buffert till membranet och inkubera i 15-30 min med skonsam skakning på en rotator vid 20-25 RPM.
- Bered konjugatlösning/blockeringsbuffert genom att tillsätta 66,7 μL stabiliserad streptavidin-pepparrotperoxidaskonjugat till 20 mL blockeringsbuffert.
- Ta försiktigt bort blockeringsbufferten och ersätt den med konjugatblockering/blockeringsbuffert. Inkubera i 15 minuter på en rotator vid 20-25 RPM.
- Tvätta membranet 4x med skakning vid 40-45 rpm i 5 min vardera.
- Tillsätt 30 mL av substratets equilibrationbuffert till membranet. Inkubera membranet i 5 minuter med skakning vid 20-25 RPM.
- Förbered substrat arbetslösning genom att tillsätta 6 mL luminol/Enhancer lösning till 6 mL stabil peroxid lösning. Undvik ljus.
- Täck hela ytan av membranet med substrat arbetslösning och inkubera i 5 min.
- Skanna membranet i ett Kemiluminiscens avbildningssystem för 1-3 s.
- Protokoll 2: Använd 2x utspädda kommersiella kemiluminiscente nukleinsyra Detection kit och följ stegen 3.10.1.1-3.10.1.8.
- Protokoll 3: Använd egentillverkade reagenser6.
- Förbered blockeringsbuffert: Blanda 0,1 M Tris-HCl vid pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2och 3% bovint serumalbumin fraktion V. AP 7,5 buffert: Blanda 0,1 m Tris-HCl vid pH 7,5, 0,1 m NaCl och 2 mm mgcl2. AP 9,5 buffert: Blanda 0,1 M Tris-HCl vid pH 9,5, 0,1 M NaCl och 50 mM MgCl2. TE-buffert: blanda 10 mM Tris-HCl vid pH 8,0, 1 mM EDTA vid pH 8,0.
- Blötlägg membranet i blockeringsbuffert vid 30 ° c i 1 h.
- Tillsätt 8,5 μl av konjugerat alkaliskt fosfatas till 10 ml AP 7,5 buffert. Skaka membranet försiktigt i denna lösning vid RT i 10 min. Tvätta sedan membranet 2x i 15 mL AP 7,5 buffert i 10 min.
- Tvätta membranet ytterligare en gång i 20 mL AP 9,5 buffert för 10 min. Tillsätt 20 mL TE buffert för att stoppa reaktionen.
- Tillsätt 7,5 mL utvecklingslösning på membranet, och skanna membranet i ett kemiluminescent avbildningssystem för 1-3 s.
- Protokoll 1: Använd en standardvolym av kommersiella kemiluminiscente nukleinsyrsdetekterings sats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den proteinstruktur MEIOB och uttrycket konstruktioner som används i denna studie illustreras i figur 1A. OB veck i MEIOB är kompakta fat-liknande strukturer som kan känna igen och interagera med enkelsträngade nukleinsyror. En av OB domäner (AA 136-307, konstruera A) binder enda strandsatta DNA (ssDNA), den stympade proteinet (AA 136-178 truncations, konstruera C) och den punkt Mutant form (R235A mutation, konstruera E) av MEIOB inte har DNA-bindande aktivitet26. Den GST-MEIOB fusion proteiner var överuttryckt i BL21 bakterier, med efterföljande isolerings steg resulterar i renade proteiner som visas av Coomassie Blåfärgning och Western blot analys (figur 1B). Nukleinsyrad substrat vid olika koncentrationer illustrerar den höga känsligheten hos biotin-signalen, med en detekterbar signal på 1 nM oligo efter en relativt kort exponeringstid för 1-3 s (figur 2a). Den vildtyp MEIOB-ett protein, men inte den muterade MEIOB-E och MEIOB-C proteiner, binda starkt till 36 NT biotin-märkta ssDNA substrat (samma längd och sekvens som används tidigare26) (figur 2B) och klyva substrat i stegar (figur 2C).
In vitro-analysen av MEIOB-proteiner med RNA-oligos i samma sekvens som ssDNA-substrat som används i figur 2B, C illustrerar bindnings kapacitet och exonukleasaktivitet av meiob på 36 NT enkelsträngat RNA (ssRNA) (figur 3A, B ). Bindnings aktiviteten hos MEIOB med DNA och RNA analyserades ytterligare kvantitativt (figur 3C). Dessutom, flagga-märkta MOV10 proteiner renades från HEK293T celler (figur 4a). För att mäta Escherichia aktiviteten hos MOV10, ett duplex-RNA utformades (samma längd men olika sekvens än tidigare använt16) med en 18 NT 5 ' överhäng (figur 4B). När den biotin-märkta RNA duplex inkuberades med MOV10 i närvaro av ATP, ett lägre band som motsvarar den utgivna enda strandsatta biotin-märkt RNA dök upp med ökande tid, reflekterande av MOV10's funktion som en RNA-Spiras. Slutligen, för att minska kostnaderna, var det försökt att optimera användningen av reagens för kemiluminiscensdetektion av biotin etiketten. Det konstaterades att en två-faldig utspädning av kemiluminescent nukleinsyra detekterings sats inte påverkade den kromogena känsligheten hos biotin-streptavidin-systemet negativt och excitingly fungerade de egentillverkade reagenser nästan lika bra (figur 5 ).
Figur 1 : Rening av Meiob proteiner. (A) schematisk representation av meiob-konstruktionskonstruktioner som används i denna studie26. MEIOB innehåller en OB-domän. Alla MEIOB konstruktioner (A, C, E) uttrycktes som GST fusion proteiner. (B) Coomassie Blue färgning och Western blot analys av meiob proteiner renas med hjälp av gst-bakterier system. De röda pilarna indikerar positionerna för renade MEIOB-proteiner. Band vid cirka 26 KDa motsvarar glutation. För Western blot användes anti-GST-antikroppar med 1:6000 utspädning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : In vitro-analyser av interaktioner med MEIOB-ssDNA . A) signal styrketest av olika koncentrationer av 36 NT biotin-märkt ssDNA. (B) EMSA-resultat av meiob-proteinbindning till biotin 5 ' End-märkta DNA-substrat (10% Native gel). C) meiob-medierad klyvning av biotin 5 End-märkta DNA-substrat (20% Native gel). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : In vitro-analyser av MEIOB-ssRNA interaktioner. (A) EMSA-resultat av meiob-proteinbindning till biotin 5 ' End-märkta RNA-substrat (10% Native gel). (B) meiob-medierad klyvning av biotin 5 End-märkta RNA-substrat (20% Native gel). C) Plot av procentandel DNA/RNA-bundet kontra Meiob-A-koncentration. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Renat MOV10 protein och dess avveckling av 5 ' tailed dsRNA in vitro. (A) Coomassie Blåfärgning av MOV10 protein renat med flaggan-HEK293T systemet. De röda pilarna indikerar positionerna för renat MOV10 protein. Band på Coomassie gel med en molekylvikt på cirka 55 kDa motsvarar den tunga immunglobulinkedjan (IgG) från flagg antikroppen. (B) MOV10 unwinds 5 ' tailed dsRNA med ökande tid (10, 30, 60 min) vid 37 ° c. ssRNA = 18 NT enkelsträngat RNA, dsRNA = 54 NT dubbelsträngat RNA med en 18 NT 5 ' svans (20% Native gel). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Alternativ metoder av använda biotin kromogena reagens s på MEIOB-analys. Kommersiell standardvolym: instruerad av kemiluminiscente nukleinsyra Detection kit; 2x utspädd kommersiell volym: tvåfaldig utspädning av varje buffert i kemiluminiscente nukleinsyra detekterings sats, egentillverkade reagenser: se detaljer i steg 3.7.3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: primrar som används för PCR förstärker genen fragment av Meiob och Mov10. De djärva bokstäverna i forward och reverse primers är BamHI och den kursiv fet bokstäverna i en omvänd primer är XhoI skär platser; de fetstilta bokstäverna i rutorna indikerar de nukleotider som motsvarar punkt mutationen R235A.
Tabell 2: sekvenser av DNA/RNA-substrat som används i detta arbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att utreda interaktioner mellan protein och nukleinsyror är avgörande för förståelsen av molekylära mekanismer bakom olika biologiska processer. Till exempel är meiob ett testis-specifikt protein som är viktigt för meios och fertilitet hos däggdjur25,26,27. Meiob innehåller en OB-domän som binder till enkelsträngad DNA och uppvisar 3 "till 5" exonukleasaktivitet26, som direkt hänför sig till dess fysiologiska relevans under meiotiska metafaserna rekombination. Som ett annat exempel, MOV10 är en RNA-Escherichia med allestädes närvarande funktion som kan associera med RNA sekundära strukturer16. MOV10 visar därför breda RNA-bindande egenskaper och 5 ' till 3 ' RNA duplex-avlindningsaktivitet16. Studierna som rapporterade de ovan nämnda biokemiska aktiviteterna av dessa proteiner förlitade sig på användningen av 32P-isotopen för att märka nukleinsyror för in vitro-analyser. I den nuvarande studien har vi etablerat protokoll för en serie biotin-märkta in vitro -experiment av meiob och MOV10 funktion. Dessa protokoll inleds med beredning av aktiva proteiner och avslutas med avbildning av biotin signaler.
Specifikt, i linje med tidigare studier25,26, var meiob proteiner överuttrycks i bakterier med och rening gav ett enda band med stark Coomassie färgning signal efter gel elektrofores. Emellertid var rening av fullängds MOV10 protein effektivare när överuttryckt som flagga-tag-smält protein i HEK293T celler än som en GST-smält protein i bakterier (data som inte visas). För att erhålla tillräckliga mängder protein vid tillräcklig renhet för efterföljande reaktioner måste dessa två system för Proteinrening jämföras för att bestämma den lämpligaste metoden för proteiner med olika storlekar och/eller egenskaper. Nukleinsyror märktes sedan med biotin istället för 32P som substrat och fick en robust signal vid undersökning av nukleinsyra-bindande affinitet eller nukleinsyrabridande verksamhet av båda proteinerna. Men eftersom proteiner som renas från bakterier ofta förorenas med RNase, är det svårt att utesluta möjligheten att klyvning aktivitet sett under in vitro-reaktion kan delvis resultera från kontaminerande RNase. In vitro-analyser med MEIOB mutanter med reducerad katalytisk aktivitet (stympad och punkt Mutant) uppvisade betydande försämring av RNA-substrat bearbetning, men möjlig RNase förorening kan inte uteslutas. De resultat som erhålls med var och en av meiob-konstruktioner som verkar på ssDNA och MOV10-avlindnings-dsRNA liknar dem som erhållits i tidigare studie16,26. MEIOB bearbetar dock DNA för att generera ett utstryk, medan ett mer diskret band ses med RNA enligt de experimentella resultaten (figur 2C och figur 3B). Möjligen har MEIOB differential bindningsförmåga till DNA och RNA-substrat (figur 2B, figur 3A, C), vilket leder till skillnaden i deras klyvning produkter. Det kan också vara möjligt att MEIOB klyver DNA och RNA på ett distinkt sätt. Den exakta rollen av MEIOB i RNA-bearbetning återstår att undersökas ytterligare (till exempel med hjälp av flagg-tagg-smält MEIOB protein uttryckt i HEK293T celler).
Biotin-märkta nukleinsyra sonder är fördelaktigt över 32P-märkta sonder i att de inte kräver särskilt skydd och bortskaffande av avfall. För det andra, biotin-märkta sonder kan vara stabilt bevaras för minst 1 år vid-20 ° c, medan 32P-märkta sonder varar endast i 2 veckor. Därför kan samma parti av de biotin-märkta nukleinsyror användas under en lång tid, bibehålla reproducerbarhet av experiment. Slutligen, snabb autoradiografi av radioaktiva sonder kan bero på dyra instrument såsom fosfor skärmen. Däremot kan alla biotin-märkta analyser som beskrivs här utföras inom en dag och kräver inte särskild utrustning. Nackdelarna med biotin märkning omfattar främst ytterligare experimentella steg inklusive gel överföring och av kemiluminiscensanalysatorn av som är nödvändiga för att upptäcka biotin-märkta substrat men kan dessutom kräva optimering eller felsökning. En annan allmän svaghet är den relativt låga känsligheten hos biotin-märkning jämfört med radioisotope-märkning. I dessa analyser uppnåddes dock en väl synlig detektion av mycket låg koncentration av nukleinsyror (figur 2a).
Dessutom är semi-Dry gel transfer apparat lämplig för överföring av längre än vanliga geler till membran. Jämfört med våt överföring, semi-Dry Transfer är snabbare, särskilt för nukleinsyror, och ger en låg bakgrunds signal. Dessutom var kostnaderna för den kromogena reaktionen av biotin-streptavidin systemet skära genom att antingen späda kommersiella reagenser eller göra vår egen, som båda uppnådde liknande signaler. Detekterings känsligheten hos de egentillverkade reagenser kanske inte verkar som hög, om än tillräckligt häri (figur 5C), men det kan förbättras genom att förlänga blockeringstid (opublicerade data). Dessutom kan signalerna förbättras med en ökad koncentration av nukleinsyran sond som används för analyserna. Med tanke på ovanstående experimentella bevis, kan biotin etiketten vara ett fördelaktigt substitut för 32P i flera in vitro biokemiska analyser.
Kollektivt, detta protokoll erbjuder en biotin-märkt plattform för studier av protein-nukleinsyra interaktioner som visar sig vara robust, tillförlitlig, effektiv, och prisvärd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) för hjälpsamma redigeringar och diskussioner. Vi tackar också Sigrid Eckardt för språk redigering. K. Z. stöddes av National Key R & D program i Kina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) och National Natural Science Foundation i Kina (31771653). L. Y. stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81471502, 31871503) och innovativt och entreprenöriellt program i Jiangsu-provinsen. J. N. stöddes av Zhejiang medicinsk vetenskap och teknikprojekt (2019KY499). M. L. stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (31771588) och 1000 Youth Talent plan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
- Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
- Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
- Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
- Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
- Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
- Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
- Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
- Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
- Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
- Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
- Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
- Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
- Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
- Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
- Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
- Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).
