Burada sunulan peptid tabanlı Küçük unilamellar veziküller büyüme yeteneğine oluşturulması için protokoller vardır. Membran peptid vesiculo üretiminde kolaylaştırmak için, bu veziküller bir transkripsiyon-çeviri sistemi ve peptid-kodlama Plasmid ile donatılmıştır.
Biyokimyasal reaksiyonlar bölümlendirme sentetik hücrelerin merkezi bir yönüdür. Bu amaçla, peptid tabanlı reaksiyon bölmeleri lipozomlar veya yağlı asit bazlı veziküller için cazip bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Dıştan veya veziküller içinde, peptidler kolayca ifade ve membran öncüleri sentezini basitleştirebilirsiniz. Burada sağlanan, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan amphiphilik elastin benzeri polipeptidler (ELP) temelinde ~ 200 Nm çapları ile veziküllerin oluşturulması için bir protokoldür. Ayrıca sunulan bakteriyel ELP ifadesi ve ters sıcaklık Bisiklet yoluyla arıtma için protokoller, hem de floresan boyalar ile onların kovalent functionalization. Ayrıca, bu raporda bir biyokimyasal reaksiyon için daha az karmaşık bir örnek olarak ELP veziküller içinde RNA aptamer dBroccoli transkripsiyon etkinleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Son olarak, bir protokol sağlanır, hangi floratik proteinleri ve membran peptid vesiculo ifadesinde sağlar, vezikül büyüme ikincisi sonucu sentezinde ise.
Sentetik canlı hücresel sistemlerin oluşturulması genellikle iki farklı yöne yaklaştı. Yukarıdan aşağı yöntemle, bir bakterinin genomu temel bileşenlerine düşer, sonuçta minimal bir hücreye yol açılır. Aşağıdan yukarı yaklaşımda, yapay hücreler, fonksiyonel olarak tutarlı bir hücre benzeri sisteme entegre edilmesi gereken moleküler bileşenlerden veya hücresel alt sistemlerinden de Novo monte edilir.
De Novo yaklaşımı, gerekli biyokimyasal bileşenlerin bölümlendirme genellikle fosfolipidler veya yağ asitleri1,2,3,4yapılan membranların kullanılarak elde edilir. Çünkü “modern” hücre membranlarının ağırlıklı olarak fosfolipidler oluşur, yağ asitleri prebiyotik membran muhafazaları makul adaylar kabul edilir ise5,6. Yeni membranların oluşumu veya membran büyümesini kolaylaştırmak için, amphiphilik yapı taşları dış7 veya ideal bir membranlı bölme içinde üretim ile ilgili anabolik süreçleri kullanarak sağlanmalıdır4 ,8.
Lipid sentezi nispeten karmaşık bir metabolik süreçtir iken, peptidler hücre içermeyen gen ifade reaksiyonları kullanarak oldukça kolay üretilebilmektedir9,10. Bu nedenle, amphiphilik peptidler tarafından oluşturulan peptid membranların büyüme edebiliyoruz yapay hücre taklit için muhafazaları olarak lipid membranlara ilginç bir alternatif temsil11.
Amphiphilik elastin-gibi di-blok kopolimerler (ELPs) peptidler, bu tür membranların için yapı taşı olarak hizmet verebilir çekici bir sınıftır12. ELPS temel amino asit sırası motif (gagvp)n, burada “a” prolin ve “n” dışında herhangi bir amino asit olabilir motifi tekrarı sayısı13,14,15,16,17 . ELPs esas olarak glutamik asit11oluşan bir hidrofilik blok ve ağırlıklı olarak fenilalanin içeren bir hidrofobik blok ile oluşturulmuştur. PH ve tuz konsantrasyonu gibi bir ve çözüm parametrelerine bağlı olarak, ELPS sıcaklık tt‘de sözde ters sıcaklık geçişi sergiler, peptidler hidrofilik bir hidrofobik tamamen geri dönüşümlü faz geçişi geçmesi Durum. Peptidler sentezini kullanarak veziküller içinde kolayca uygulanabilir “TX-TL” bakteriyel hücre ekstresi11,18,19,20,21, hangi sağlar birleştirilmiş transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları için gerekli tüm bileşenleri.
TX-TL sistemi birlikte kapsüllenmiş, DNA şablonu ile ELP ‘Ler, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan ELPS veziküllerine sağlam bir destek olarak kodlanıyor. Veziküllerin oluşumu, boncuk yüzeyinden kuru peptitlerin rehidrasyon yoluyla oluşur11. Vezikül oluşumu için22 diğer yöntemler, potansiyel olarak daha düşük polydispersity ve daha büyük vezikül boyutlarını (örn. Elektro-oluşum, emülsiyon faz transferi veya mikrofluidik tabanlı Yöntemler) gösterebilir. Kapsülleme yönteminin canlığını sınamak için, fluorogenic aptamer dBroccoli23 ‘ ün TRANSKRIPSIYONU, TX-TL sistemi ile gen ifadesinden daha az karmaşık olan11‘ i alternatif olarak kullanılabilir.
Vesiculo membran yapı taşları ve membran içine daha sonra birleşmesi ifadesi nedeniyle, veziküller büyümeye başlar11. ELPs membran birleşme bir FRET tahlil aracılığıyla gösterilebilir. Bu amaçla, ilk vezikül nüfusun oluşumu için kullanılan ELPs bir FRET çifti oluşturan eşit hisseler floresan boyalar ile konjuated edilmelidir. Vesiculo ‘da etiketli olmayan ELPs ‘in ve membranın içine birleşmesi üzerine, membran içinde etiketli ELPs seyreltilir ve dolayısıyla FRET sinyali11‘ i düşürür. Konjugasyon için çok yönlü ve ortak bir yöntem olarak, bakır katalizlü Azide-alkyne halkakatılma kullanılır. Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin gibi bir stabilizasyon ligand kullanımı ile, reaksiyon reaksiyonlarının hidroliz olmadan bir fizyolojik pH ‘da sulu bir çözelti yapılabilir11, hangi konjugasyon reaksiyonlar için uygun olan peptidler dahil.
Aşağıdaki protokol büyüyen ELP tabanlı peptidosomes için hazırlık ayrıntılı bir açıklamasını sunar. Cam boncuk metodunu kullanarak peptidler ve vezikül oluşumunun ifadesi açıklanmıştır. Ayrıca, flororojenik dBroccoli aptamer ve ELP veziküller içinde protein ifadesi için transkripsiyon-çeviri reaksiyonu transkripsiyon nasıl uygulanacağı açıklanmıştır. Son olarak, sağlanan bir FRET tahlil ile vezikül büyümesini kanıtlamak için kullanılabilecek fluorophores ile ELPs konjugasyon için bir işlemdir11.
Film rehidrasyon Küçük unilamellar veziküller oluşturulması için ortak bir işlemdir. Başarısızlık ana kaynağı prosedürde kullanılan malzemelerin yanlış işleme olduğunu.
Başlangıçta, ELPs E. coli hücreleri tarafından üretilmektedir. ELP arıtma sonrası verim önemli adımlarla protokolün ne kadar dikkatle gerçekleştirileceğinden bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bunlar ters sıcak…
The authors have nothing to disclose.
Biz minnetle DFG TRR 235 (yaşam doğuşu, proje P15), Avrupa Araştırma Konseyi (Grant anlaşması No. 694410 AEDNA) ve TUM Uluslararası Enstitüsü bilim ve mühendislik ıGSSE (Proje No. 9,05) aracılığıyla mali destek kabul . Biz örnek hazırlama ile onun yardımı için E. Falgenhauer teşekkür ederiz. TX-TL sistemi ve yararlı tartışmalar konusunda yardım almak için A. Dupin ve M. Schwarz-Schilling ‘ e teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar için N. B. Holland teşekkür ederiz.
2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
CTP | USB | 14121 | |
CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
DNase I | NEB | M0303S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
GTP | USB | 16800 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
KCl | Carl Roth | P017.1 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
methanol | Carl Roth | 82.2 | |
MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
rNTP | NEB | N0466S | |
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
T7 polymerase | NEB | M0251S | |
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Tris base | Fischer | BP1521 | |
tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
UTP | USB | 23160 |