Summary

Vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

Published: June 28, 2019
doi:

Summary

Burada sunulan peptid tabanlı Küçük unilamellar veziküller büyüme yeteneğine oluşturulması için protokoller vardır. Membran peptid vesiculo üretiminde kolaylaştırmak için, bu veziküller bir transkripsiyon-çeviri sistemi ve peptid-kodlama Plasmid ile donatılmıştır.

Abstract

Biyokimyasal reaksiyonlar bölümlendirme sentetik hücrelerin merkezi bir yönüdür. Bu amaçla, peptid tabanlı reaksiyon bölmeleri lipozomlar veya yağlı asit bazlı veziküller için cazip bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Dıştan veya veziküller içinde, peptidler kolayca ifade ve membran öncüleri sentezini basitleştirebilirsiniz. Burada sağlanan, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan amphiphilik elastin benzeri polipeptidler (ELP) temelinde ~ 200 Nm çapları ile veziküllerin oluşturulması için bir protokoldür. Ayrıca sunulan bakteriyel ELP ifadesi ve ters sıcaklık Bisiklet yoluyla arıtma için protokoller, hem de floresan boyalar ile onların kovalent functionalization. Ayrıca, bu raporda bir biyokimyasal reaksiyon için daha az karmaşık bir örnek olarak ELP veziküller içinde RNA aptamer dBroccoli transkripsiyon etkinleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Son olarak, bir protokol sağlanır, hangi floratik proteinleri ve membran peptid vesiculo ifadesinde sağlar, vezikül büyüme ikincisi sonucu sentezinde ise.

Introduction

Sentetik canlı hücresel sistemlerin oluşturulması genellikle iki farklı yöne yaklaştı. Yukarıdan aşağı yöntemle, bir bakterinin genomu temel bileşenlerine düşer, sonuçta minimal bir hücreye yol açılır. Aşağıdan yukarı yaklaşımda, yapay hücreler, fonksiyonel olarak tutarlı bir hücre benzeri sisteme entegre edilmesi gereken moleküler bileşenlerden veya hücresel alt sistemlerinden de Novo monte edilir.

De Novo yaklaşımı, gerekli biyokimyasal bileşenlerin bölümlendirme genellikle fosfolipidler veya yağ asitleri1,2,3,4yapılan membranların kullanılarak elde edilir. Çünkü “modern” hücre membranlarının ağırlıklı olarak fosfolipidler oluşur, yağ asitleri prebiyotik membran muhafazaları makul adaylar kabul edilir ise5,6. Yeni membranların oluşumu veya membran büyümesini kolaylaştırmak için, amphiphilik yapı taşları dış7 veya ideal bir membranlı bölme içinde üretim ile ilgili anabolik süreçleri kullanarak sağlanmalıdır4 ,8.

Lipid sentezi nispeten karmaşık bir metabolik süreçtir iken, peptidler hücre içermeyen gen ifade reaksiyonları kullanarak oldukça kolay üretilebilmektedir9,10. Bu nedenle, amphiphilik peptidler tarafından oluşturulan peptid membranların büyüme edebiliyoruz yapay hücre taklit için muhafazaları olarak lipid membranlara ilginç bir alternatif temsil11.

Amphiphilik elastin-gibi di-blok kopolimerler (ELPs) peptidler, bu tür membranların için yapı taşı olarak hizmet verebilir çekici bir sınıftır12. ELPS temel amino asit sırası motif (gagvp)n, burada “a” prolin ve “n” dışında herhangi bir amino asit olabilir motifi tekrarı sayısı13,14,15,16,17 . ELPs esas olarak glutamik asit11oluşan bir hidrofilik blok ve ağırlıklı olarak fenilalanin içeren bir hidrofobik blok ile oluşturulmuştur. PH ve tuz konsantrasyonu gibi bir ve çözüm parametrelerine bağlı olarak, ELPS sıcaklık tt‘de sözde ters sıcaklık geçişi sergiler, peptidler hidrofilik bir hidrofobik tamamen geri dönüşümlü faz geçişi geçmesi Durum. Peptidler sentezini kullanarak veziküller içinde kolayca uygulanabilir “TX-TL” bakteriyel hücre ekstresi11,18,19,20,21, hangi sağlar birleştirilmiş transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları için gerekli tüm bileşenleri.

TX-TL sistemi birlikte kapsüllenmiş, DNA şablonu ile ELP ‘Ler, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan ELPS veziküllerine sağlam bir destek olarak kodlanıyor. Veziküllerin oluşumu, boncuk yüzeyinden kuru peptitlerin rehidrasyon yoluyla oluşur11. Vezikül oluşumu için22 diğer yöntemler, potansiyel olarak daha düşük polydispersity ve daha büyük vezikül boyutlarını (örn. Elektro-oluşum, emülsiyon faz transferi veya mikrofluidik tabanlı Yöntemler) gösterebilir. Kapsülleme yönteminin canlığını sınamak için, fluorogenic aptamer dBroccoli23 ‘ ün TRANSKRIPSIYONU, TX-TL sistemi ile gen ifadesinden daha az karmaşık olan11‘ i alternatif olarak kullanılabilir.

Vesiculo membran yapı taşları ve membran içine daha sonra birleşmesi ifadesi nedeniyle, veziküller büyümeye başlar11. ELPs membran birleşme bir FRET tahlil aracılığıyla gösterilebilir. Bu amaçla, ilk vezikül nüfusun oluşumu için kullanılan ELPs bir FRET çifti oluşturan eşit hisseler floresan boyalar ile konjuated edilmelidir. Vesiculo ‘da etiketli olmayan ELPs ‘in ve membranın içine birleşmesi üzerine, membran içinde etiketli ELPs seyreltilir ve dolayısıyla FRET sinyali11‘ i düşürür. Konjugasyon için çok yönlü ve ortak bir yöntem olarak, bakır katalizlü Azide-alkyne halkakatılma kullanılır. Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin gibi bir stabilizasyon ligand kullanımı ile, reaksiyon reaksiyonlarının hidroliz olmadan bir fizyolojik pH ‘da sulu bir çözelti yapılabilir11, hangi konjugasyon reaksiyonlar için uygun olan peptidler dahil.

Aşağıdaki protokol büyüyen ELP tabanlı peptidosomes için hazırlık ayrıntılı bir açıklamasını sunar. Cam boncuk metodunu kullanarak peptidler ve vezikül oluşumunun ifadesi açıklanmıştır. Ayrıca, flororojenik dBroccoli aptamer ve ELP veziküller içinde protein ifadesi için transkripsiyon-çeviri reaksiyonu transkripsiyon nasıl uygulanacağı açıklanmıştır. Son olarak, sağlanan bir FRET tahlil ile vezikül büyümesini kanıtlamak için kullanılabilecek fluorophores ile ELPs konjugasyon için bir işlemdir11.

Protocol

1. elastin-benzeri polipeptitlerin ifadesi 1. gün: başlangıç kültürünün hazırlanması ve peptit ifadesi için sarf malzemeleri Hazırlamak ve otoklav ifade kültürü şişeler (4 x 2,5 l) ve 3 L lb orta. 1 l lb orta için 1 l ultra saf su lb toz 25 gr ekleyin. 100 ml lb orta, 50 μL steril filtre (0,22 μm filtre) kloramfenikol çözeltisi (EtOH ‘da 25 mg/ml) ve 50 μL steril filtreli (0,22 μm filtre) karbenikilin çözeltisi (100 mg/ml,% 50 EtOH ve% 50 ultra saf…

Representative Results

Vezikül üretimiŞekil 1 , farklı şişme çözeltileri ve cam boncuk yöntemiyle hazırlanan veziküllerin iletim elektron MIKROSKOBU (Tem) görüntülerini gösterir (Ayrıca bakınız VOGELE ve al.11). Şekil 1a’da örnek için sadece PBS, veziküller oluşumunu kanıtlamak ve boyutlarını belirlemek için şişlik çözeltisi olarak kullanılmıştır. TX-TL şişme çözeltisi olarak kullanıldığında (<stro…

Discussion

Film rehidrasyon Küçük unilamellar veziküller oluşturulması için ortak bir işlemdir. Başarısızlık ana kaynağı prosedürde kullanılan malzemelerin yanlış işleme olduğunu.

Başlangıçta, ELPs E. coli hücreleri tarafından üretilmektedir. ELP arıtma sonrası verim önemli adımlarla protokolün ne kadar dikkatle gerçekleştirileceğinden bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bunlar ters sıcak…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz minnetle DFG TRR 235 (yaşam doğuşu, proje P15), Avrupa Araştırma Konseyi (Grant anlaşması No. 694410 AEDNA) ve TUM Uluslararası Enstitüsü bilim ve mühendislik ıGSSE (Proje No. 9,05) aracılığıyla mali destek kabul . Biz örnek hazırlama ile onun yardımı için E. Falgenhauer teşekkür ederiz. TX-TL sistemi ve yararlı tartışmalar konusunda yardım almak için A. Dupin ve M. Schwarz-Schilling ‘ e teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar için N. B. Holland teşekkür ederiz.

Materials

2xYT MP biomedicals 3012-032
3-PGA Sigma-Aldrich P8877
5PRIME Phase Lock GelTM tube VWR 733-2478
alkine-conjugated Cy3 Sigma-Aldrich 777331
alkine-conjugated Cy5 Sigma-Aldrich 777358
ATP Sigma-Aldrich A8937
benzamidin Carl Roth CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Novagen 71402
Bradford BSA Protein Assay Kit Bio-rad 500-0201
cAMP Sigma-Aldrich A9501
carbenicillin Carl Roth 6344.2
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
chloramphenicol Carl Roth 3886.3
chloroform Carl Roth 4432.1
CoA Sigma-Aldrich C4282
CTP USB 14121
CuSO4 Carl Roth P024.1
DFHBI Lucerna Technologies 410
DMSO Carl Roth A994.1
DNase I NEB M0303S
DTT Sigma-Aldrich D0632
Ethanol Carl Roth 9065.2
Folinic acid Sigma-Aldrich F7878
Glass beads, acid-washed Sigma-Aldrich G1277
GTP USB 16800
HEPES Sigma-Aldrich H6147
IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) Sigma-Aldrich I6758
KCl Carl Roth P017.1
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149
LB Broth Carl Roth X968.2
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
methanol Carl Roth 82.2
MgCl2 Carl Roth KK36.3
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 732-6204
NAD Sigma-Aldrich N6522
NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) Baseclick BCL-033-5
PEG-8000 Carl Roth 263.2
pH stripes Carl Roth 549.2
phenylmethylsulfonyl fluoride Carl Roth 6367.2
phosphate-buffered saline VWR 76180-684
phosphoric acid Sigma-Aldrich W290017
polyethyleneimine Sigma-Aldrich 408727
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich P8709
Qiagen Miniprep Kit Qiagen 27106
RNAPol reaction buffer NEB B9012
RNase inhibitor murine NEB M0314S
RNaseZap Wipes ThermoFisher AM9788
rNTP NEB N0466S
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol Carlroth A156.1
RTS Amino Acid Sampler 5 Prime 2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo-Scientific 66382
sodium chloride Carl Roth 9265.1
sodium hydroxide Carl Roth 8655.1
Spermidine Sigma-Aldrich 85558
sterile-filtered (0.22 µm filter) Carl Roth XH76.1
T7 polymerase NEB M0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) Sigma-Aldrich 678937
TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) Sigma-Aldrich C4706
Tris base Fischer BP1521
tRNA (from E. coli) Roche Applied Science MRE600
UTP USB 23160

References

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -. S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

Play Video

Cite This Article
Vogele, K., Frank, T., Gasser, L., Goetzfried, M. A., Hackl, M. W., Sieber, S. A., Simmel, F. C., Pirzer, T. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. J. Vis. Exp. (148), e59831, doi:10.3791/59831 (2019).

View Video