Summary
이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.
Abstract
종양 내 이질성 (ITH)을 평가하는 것은 표적으로 한 치료의 실패를 예상하고 그에 따라 효과적인 항 종양 전략을 디자인하기 위하여 가장 중요합니다. 시료 처리 및 커버리지 의 깊이의 차이로 인해 우려가 자주 제기되지만, 고형 종양의 차세대 시퀀싱은 종양 유형 전반에 걸쳐 매우 가변적인 ITH 정도를 해명했습니다. 클론 및 전이성 집단의 식별을 통해 1 차 및 전이성 병변 사이의 유전 적 관련성을 포착하는 것은 사전 단계 질병에 대한 치료법의 설계에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 동일 환자에서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에서 기술된 실험적인 접근은 세 개의 잘 확립된 접근을 통합합니다: 조직학 분석, 고범위 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석. 부적절한 시료 처리에 의한 소동 적 사건 의 검출에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 우리는 신중한 병리학 검사와 신 생물 세포 농축에 조직을 실시했다. 신생물 병변 및 정상 조직으로부터의 품질 조절 DNA는 409개의 관련 암 유전자의 코딩 영역을 표적으로 하는 높은 커버리지 시퀀싱을 실시하였다. 제한된 게놈 공간만을 보는 동안, 우리의 접근은 주어진 환자에게서 명백한 병변에 있는 체세포 변경 (단 핵약 돌연변이 및 사본 수 변이) 중 이질성의 정도를 평가할 수 있습니다. 시퀀싱 데이터의 비교 분석을 통해 클론 과 하위 클론 변경을 구별할 수 있었습니다. ITH의 대다수는 수시로 승객 돌연변이에 기인합니다; 그러므로, 우리는 또한 돌연변이의 기능적인 결과를 예측하기 위하여 면역성 화학을 이용했습니다. 이 프로토콜은 특정 종양 모형에 적용되는 동안, 우리는 여기에서 기술된 방법론이 그밖 고형 종양 모형에 광범위하게 적용가능하다는 것을 예상합니다.
Introduction
차세대 염기서열 분석(NGS)의 출현은 암이 진단되고 치료되는 방식에 혁명을 일으켰습니다1. 다국지 시퀀싱에 결합된 NGS는 고형 종양2에서고종양 내 이질성(ITH)의 높은 정도를 노출시켰으며, 이는 부분적으로 다른 약물 민감성을 가진 서브클론의 존재로 인한 표적 치료의 실패를 설명한다2 . 게놈 전체 시퀀싱 연구에 의해 제기 된 중요한 도전은 개별 적인 암에 있는 승객 (즉, 중립) 및 드라이버 돌연변이 를 구별하는필요성입니다 3. 몇몇 연구 결과는 실제로, 특정 종양에서, 승객 돌연변이가 ITH의 대다수를 차지한다는 것을 보여주었습니다, 운전사 변경은 동일 개별의 병변 중 보존되는 경향이 있는 동안4. 또한 큰 돌연변이 부담 (폐암 및 흑색종에서 볼 수 있듯이)이 반드시 큰 종하 돌연변이 부담을 의미하지는 않는다는 것을 주의하는 것이 중요합니다2. 따라서, 높은 수준의 ITH는 낮은 돌연변이 부담을 가진 종양에서 발견될 수 있다.
전이는 전 세계적으로 암 관련 죽음의 90% 이상에 책임 있습니다5; 그러므로, 1 차및 전이성 병변 중 드라이버 유전자의 돌연변이 이질성을 포착하는 것은 고급 단계 질병을 위한 효과적인 치료의 디자인에 중요합니다. 임상 시퀀싱은 일반적으로 고정 된 조직에서 핵산에 수행, 때문에 가난한 DNA 품질의 게놈 전체 탐사 어려운 렌더링. 다른 한편으로는, 임상 순서의 의도는 주어진 치료 식이요법에 응답성/무반응을 예측할 수 있는 실행 가능한 돌연변이 및/또는 돌연변이를 확인하는 것입니다. 시퀀싱은 임상적으로 관련된 정보를 적시에 추출하기 위해 게놈의 작은 분획으로 제한될 수 있습니다. 낮은 처리량의 DNA 프로파일링(예: Sanger Sequencing)에서 NGS로의 전환은 수백 개의 암 관련 유전자를 높은 범위의 범위에서 분석할 수 있게 하여 종전 이벤트를 검출할 수 있게 합니다. 여기에서, 우리는 동일 개별에게서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에 설명된 방법은 세 가지 잘 확립된 접근법(조직학적 분석, 고커버리지 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석)을 통합하여 확인된 변이의 기능적 결과를 예측합니다. 접근법은 도 1에 개략적으로 설명되고 췌장의 고체 가성 신생물(SPN)의 5가지 전이성 사례의 연구에 적용되었다. 우리는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 견본의 처리 그리고 분석을 기술하는 동안, 동일 절차는 신선한 동결 조직에서 유전 물질에 적용될 수 있습니다.
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Protocol
연구에 사용된 자료는 특정 프로토콜에 따라 수집되었으며, 이는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 환자로부터 서면 으로 통보 된 동의가 가능했습니다.
1. 조직 표본의 조직학적 및 면역적 전형적 개정
참고 : 전문 병리학자는 이후에 설명 된 활동에 대한 책임이 있습니다.
- 잘 확립 된 진단 기준에 따라 선택된 경우의 조직 병리학 적 개정.
- 마이크로토메를 사용하여 대표적인 FFPE 조직 블록에서 4−5 μm 두께의 조직 섹션을 절단하고 표준 조직학 슬라이드에 섹션을 장착하십시오.
- 자동화 된 조직 슬라이드 염색기(재료 표)를사용하여 각 슬라이드에 대해 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행합니다.
- WHO 진단 기준에 따라 선택된 종양 케이스의 조직 병리학 적 진단을 검토하십시오.
참고: 이 단계에서, 병리학자는 동일 조직 단면도 내의 종양의 형태학적으로 명백한 지역을 확인할 수 있습니다. 해당 영역을 별도로 수확할 수 있습니다(섹션 2 참조). SPN에 대한 종양 및 정상 세포의 조직학적 유사성은 그림 2에제공된다. - 조직학적 분석을 보완하고 면역 phenotypic 이질성을 추정하기 위해 확립 된 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 수행합니다.
참고: 병리학자는 동일 조직 단면도 내의 종양의 전형적으로 명백한 지역을 면역pheno를 확인할 수 있습니다. 해당 영역을 별도로 수확할 수 있습니다(섹션 2 참조).
- 종양 조직 섹션의 신가소성 셀룰러를 평가하고 그에 따라 수동 미세 해부를 계획합니다.
참고: 이것은 종양 세포의 병리학 생성 한 추정입니다.- 조직 섹션의 신생물 세포 함량이 70 % 이상이면 수동 미세 해부가 필수적이지 않습니다. 3.1단계로 바로 이동합니다.
참고: (i) 돌연변이 대립 유전자 주파수 추정에 대한 적절한 감도를 보장하고 (ii) 덜 민감한 방법론(예를 들어, 모세관 시퀀싱)에 의해 클론 돌연변이를 검증하기 위해 신생물 세포 함량의 70%를 타겟팅합니다. - 조직 섹션의 신생물 세포 함량이 70 % 미만이면 미세 해부가 필요하며 2 단계로 이동합니다.
- 조직 섹션의 신생물 세포 함량이 70 % 이상이면 수동 미세 해부가 필수적이지 않습니다. 3.1단계로 바로 이동합니다.
- 비 신생물 조직이 샘플링 된 FFPE 블록에서 조직 섹션을 평가하십시오. 이 조직은 생식선 DNA의 근원으로 이용됩니다.
참고: 혈액은 생식선 DNA의 대체 공급원입니다. 이 경우, 4.1단계의 노트에서 권장되는 대로 DNA 추출을 진행한다.- 비 신생물 조직만 조직 섹션(그림 2D)에서볼 수있는 경우, 수동 미세 절제술이 필요하지 않습니다. 3.1단계로 바로 이동합니다.
- 신생물 세포에서 상당한 오염이 조직 섹션에 존재하는 경우, 수동 미세 해부가 필요합니다. 섹션 2로 이동합니다.
2. 수동 미세 해부
참고 : 이 방법은 다양한 고형 종양 유형에 적용 가능하며 조직 표본의 신생물 세포 함량을 증가시키기위한 것입니다. 대안적으로, 이 방법은 형태학적으로 및/또는 면역페노전형적으로 동일한 조직 섹션 내의 별개의 영역을 수확하는데 사용될 수 있다.
- 마이크로토메를 사용하여 최대 10개의 4-6 μm 두께의 FFPE 종양 조직 부분을 잘라내고 충전되지 않은 슬라이드에 장착합니다.
참고 : 암 세포의 1mm2 둥지가 표본에서 볼 수있는 경우, 10 개의 조직 슬라이드를 절단하고 DNA (40 ng)의 표적 량을 얻기 위해 수동 미세 해부를 실시해야합니다. 이것은 1 mm2 클러스터가 700과 1000 종양 핵 사이를 포함한다는 것을 가정합니다. - 60 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 슬라이드를 랙에 놓고 20 분 동안 자일렌, 10 분 동안 100 % 에탄올, 10 분 동안 80 % 에탄올, 10 분 동안 70 % 에탄올, 1 0 분 동안 증류수, 10 s의 헤마톡실린 카운터 스테인, 1 분 동안 수돗물을 하십시오.
- 표준 반전 현미경에, 현미경 으로 주사기에 27 G 바늘을 사용 하 고 종양 세포의 대표 클러스터를 수집. 시퀀싱에 필요한 양의 DNA를 보장하기 위해 최소 1mm2 세포 군집을 수확합니다.
참고: 형태학적으로 구별되는 영역을 다른 개체로 분석하려는 경우 미세 해부 도구를 사용하여 해당 영역을 별도로 수확합니다. - 이전에 프로테아제 K 20 μL과 용해 완충액 180 μL로 채워진 1.5 mL 튜브(재료 표)에수확 한 클러스터를 놓고 소용돌이에 의해 혼합하십시오.
3. 사전 미세 해부없이 조직 처리
참고 : 이 절차는 비 신생물 세포 (생식선 DNA의 근원)만 포함하거나 형태학적으로 균질한 암세포의 적어도 70 %를 포함하는 조직 블록에 사용됩니다.
- 선택된 FFPE 조직 블록으로부터 최대 6개의 4-5 μm 두께의 조직 절편을 마이크로토메를 사용한다. 2.5단계에서 설명한 대로 조직 두루마리를 1.5 mL 튜브에 놓습니다.
4. 정상 및 신생물 세포에서 DNA 추출
- 제조업체의 지시에 따라 DNA FFPE 조직 추출 키트(재료 표)를사용하여 정상 및 신생물 조직에서 DNA를 정화합니다.
참고 : 혈액이 생식선 핵산의 공급원으로 사용되는 경우 DNA 혈액 추출 키트(재료 표)를사용하여 DNA를 정화하십시오. - DNA 정량화 및 품질 검사
- 이중 가닥(dsDNA)의 양을 정량화하기 위해 형광 핵산얼룩(물자 표)을함유하는 용액에 DNA 샘플의 aliquot를 추가하고 벤치탑 형광계를 사용하여 방출된 형광을 측정합니다(재료표) ).
참고: 이 분석은 dsDNA에 부착된 형광 염료에서 방출되는 형광 신호의 강도를 측정하고 표준 곡선을 사용하여 DNA의 양을 결정합니다. - 마이크로볼륨 분광광도계(재료표)를사용하여 DNA를 검증하기 위해 시료의 260/280 및 260/230 비율을 측정합니다. "순수한" DNA는 1.8의 260/280및 1.8−2.2의 범위에 있는 260/230이 있어야 합니다.
참고: 시료의 분광도 측정 평가는 하류 반응에 영향을 미치는 화학 적 오염 물질 (예 : 페놀)의 존재를 입증하기위한 것입니다. 화학 시약으로 인한 오염의 경우 컬럼 기반 키트를 사용하여 정화 단계를 수행합니다.
- 이중 가닥(dsDNA)의 양을 정량화하기 위해 형광 핵산얼룩(물자 표)을함유하는 용액에 DNA 샘플의 aliquot를 추가하고 벤치탑 형광계를 사용하여 방출된 형광을 측정합니다(재료표) ).
5. 도서관 준비 및 정량화
참고: 라이브러리 준비 및 정량화 단계의 회로도는 그림 3에보고됩니다.
- DNA 라이브러리 준비 (각 샘플에 대해 설정 된 4 프라이머 풀)
참고 : 4 프라이머 풀은보고 암 패널에 속한다재료 표. 각 풀에는 409개의 유전자의 다중화 표적 선택을 위해 설계된 프라이머 쌍이 포함되어 있습니다. NGS 패널을 구성하는 유전자 목록에 대한 링크가 제공됩니다.재료 표.- 프라이머 풀당 하나씩 각 샘플에 대해 4개의 DNA 표적 증폭 반응을 준비합니다. 각 프라이머 풀(재료 표)에대해 0.2 mL 튜브(재료 표)4 μL의 마스터 믹스(재료 표,라이브러리 키트에 포함), 10 μL의 고충실도 프라이머 풀 믹스(재료 표,포함) 암 패널 라이브러리), DNA의 6 μL (총 10 ng).
- 다음 프로그램을 실행하는 4개의 1.5 mL 튜브에서 각 프라이머 풀의 대상 영역을 별도로 증폭: 2분 동안 99°C에서 홀드(핫 스타트 폴리머라제의 활성화), 16사이클(15s의 경우 99°C에서 변성, 어닐레및 60°C에서 8분 동안 연장) , 4 °C에서 유지합니다.
참고: 중지 지점. 대상 증폭 반응을 하룻밤 동안 4°C 또는 -20°C에서 장시간 저장합니다. - 앰플리온 의 부분 소화 끝
참고: NGS 제조업체 키트에서 제공하는 설명서는 부분 소화 전에 각 샘플의 다양한 증폭 반응이 결합되는 단계를 예견합니다. 이 단계를 피하고 각 증폭 소화를 별도로 처리하십시오.- 각 샘플의 각 증폭 풀에 특정 소화혼합(재료 표,라이브러리 키트에 포함됨)의 2 μL을 추가합니다(각 0.2 mL 튜브의 총 부피는 22μL입니다). 소용돌이 철저하게 각 튜브를 원심 분리하여 물방울을 수집합니다.
- 튜브를 열 사이클러에 로드하고 다음 프로그램을 실행합니다: 10분 동안 50°C, 10분동안 55°C, 20분동안 60°C, 10°C 홀드(최대 1시간).
참고: 중지 지점. 플레이트를 -20°C에서 장시간 보관하십시오.
- 앰플리톤과 정화에 리게이트 어댑터.
참고: 단일 칩에서 여러 라이브러리를 시퀀싱할 때 각 샘플에 대해 다른 바코드 어댑터를 사용합니다. 동일한 샘플의 4가지 증폭 반응은 모두 동일한 바코드를 수신해야 합니다.- 어댑터 준비(재료 표,바코드 어댑터 키트). 각 바코드 X에 대해 P1 어댑터와 고유한 바코드 어댑터(재료표)를1:4의 최종 희석시 에 혼합하여 준비합니다. 물 4 μL을 P1 어댑터 2 μL과 독특한 바코드 어댑터 2 μL과 혼합합니다. 다운스트림 통로에는 이 바코드 어댑터 믹스의 2 μL을 사용합니다.
- 각 시료의 각 증폭풀에 이 순서대로 합리반응을 수행한다: 스위치 용액 4μL(재료표,라이브러리 키트에 포함), 바코드 어댑터 믹스 2 μL 및 DNA 리가제 2 μL(재료표, 포함) 라이브러리 키트) (총 볼륨 = 30 μL).
- 소용돌이철분과 짧은 원심분리기는 물방울을 수집합니다.
- 각 튜브를 열 사이클러에 로드하고 다음 프로그램을 실행합니다: 30분 동안 22°C, 5분 동안 68°C, 5분 동안 72°C, 4°C 홀드(최대 24시간).
참고: 중지 지점. 플레이트를 -20°C에서 장시간 보관하십시오.
- 라이브러리 정화 및 증폭
- 각 튜브를 원심분리하고 각 바코드 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 전송합니다. 각 시료의 각 풀에 45 μL의 비드 계 정제 시약(재료표)을추가합니다. 비드 현탁액을 DNA와 혼합하기 위해 5배 위아래로 피펫을 피펫합니다.
- 실온 (RT)에서 5 분 동안 혼합물을 배양 한 다음 각 튜브를 자기 랙에 넣고 2 분 동안 배양하십시오.
- 각 튜브에 신선한 70 % 에탄올150 μL을 추가하십시오. 각 튜브를 자석의 두 위치의 좌우로 움직이는 구슬을 세척합니다. 상급자를 버리고 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 5.1.5.3 단계에서 설명된 절차를 반복한 다음 튜브를 자석에 넣고 5분 동안 RT에서 구슬을 공기 건조시.
- 자석에서 각 프라이머 풀의 정제 된 라이브러리와 튜브를 제거하고 고충실도 PCR 믹스(재료 표)의50 μL과 라이브러리 증폭 프라이머 믹스 2 μL을 추가(재료표,라이브러리 키트에 포함) 구슬 펠릿에 각 튜브.
- 소용돌이 각 1.5 mL 튜브 및 잠시 원심 분리기를 물방울을 수집합니다.
- 1.5 mL 튜브를 자석에 2 분 동안 놓고 각 튜브에서 상층부 (~ 50 μL)를 펠릿을 방해하지 않고 새로운 0.2 mL 튜브로 조심스럽게 옮니다.
- 다음 프로그램을 실행하는 각 프라이머 풀의 라이브러리를 증폭: 효소를 활성화하기 위해 2 분 동안 98 °C에서 홀드, 5 사이클 (15 s에 대한 98 °C에서 변성, 어닐및 64 °C에서 연장 1 분), 4 °C에서 유지. 샘플을 -20°C에서 보관합니다.
- 증폭 된 라이브러리의 정화
- 각 튜브를 원심분리기하여 하단에 있는 내용물들을 수집하고 각 증폭된 라이브러리 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮김을 전송한다.
- 25 μL의 비드 계 정제 시약을 첨가하십시오. 비드 현탁액을 DNA와 혼합하기 위해 5배 위아래로 피펫을 피펫합니다.
- RT에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션 한 다음 튜브를 자석에 5 분 동안 넣습니다.
- 앰플리컨이 들어있는 상급체를 각 튜브에서 펠릿을 방해하지 않고 새로운 튜브로 조심스럽게 옮김을 옮김을 옮김을 조심스럽게 옮김.
- 비드 현탁액과 DNA를 혼합하기 위해 각 튜브의 상층부와 피펫에 60 μL의 비드 기반 정제 시약을 추가합니다.
- RT에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션 한 다음 튜브를 자석에 3 분 동안 놓습니다.
- 각 튜브에서 상급을 버리고 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.
참고 : 앰플리폰은 구슬에 바인딩됩니다. - 각 튜브에 신선한 70 % 에탄올150 μL을 추가하십시오. 튜브를 좌우로 움직이는 구슬을 자석의 두 위치에서 세척합니다. 상급자를 버리고 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 5.1.6.8 단계에서 절차를 반복하고 RT에서 구슬을 3 분 동안 건조시고 구슬을 과도하게 건조하지 마십시오.
- 자석에서 튜브를 제거하고 50 μL의 낮은 Tris EDTA (TE)(재료 표,라이브러리 키트에 포함)를 펠릿에 추가하여 구슬을 분산시다.
- 혼합물을 위아래로 여러 번 파이펫하고 RT에서 2 분 동안 배양하십시오.
- 적어도 2 분 동안 자석에 튜브를 놓고 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 앰플리온을 포함하는 상급을 새로운 튜브로 옮김하십시오.
- 라이브러리 정량화
- 고감도 DNA 키트 프로토콜에 따라 DNA 칩을 실행하기 위해 단편 분석기기(물자 표)를사용한다.
6. 라이브러리 풀링 및 시퀀싱 실행
- 각 라이브러리를 뉴클레아제없는 물로 100 pM으로 희석합니다. 단일 튜브에서 단일 실행을 위해 각 100 pM 라이브러리의 10 μL을 결합합니다. 파이펫팅하여 결합된 라이브러리를 혼합하고 템플릿 및 시퀀싱을 진행합니다.
- 계획된 실행 생성
참고: 일반적인 실행에는 실험실에서 사용할 수 있는 시퀀서(Ion Proton System 또는 GeneStudio S5 시스템, 재료 표)에따라 두 가지 유형의 반도체 칩(이온 PI 칩 또는 이온 540 칩)에 로드할 수 있는 4개의 샘플이 포함됩니다. 이러한 시스템은 일반적으로 실행당 8천만 개의 읽기를 생성합니다.- 시퀀싱 시스템(예: 이온 셰프 시스템)에 연결된 컴퓨터에서 토런트 브라우저를 열고 선택한 응용 프로그램(AmpliSeqDNA)에 대한 일반 템플릿을 사용하여 새 실행을 계획합니다.
- 계획의 키트 탭으로 전환합니다. 사용 중인 시퀀싱 시스템에 따라 계측기 드롭다운 목록에서 이온 양성자 시스템 또는 이온 GeneStudio S5 시스템을 선택합니다.
- 시퀀싱 시스템에 따라 칩 유형 드롭다운 목록에서 적절한 칩(이온 양성자 시스템의 PI 칩, Ion GeneStudio S5 시스템의 경우 540칩)을 선택합니다.
- 라이브러리 키트 드롭다운 목록에서 이온 AmpliSeq 2.0 라이브러리 키트를 선택합니다.
- 템플릿 키트의 이온 셰프 버튼을 선택한 다음 템플릿 키트 드롭다운 목록에서 적절한 Chef 키트(PI 칩용 Ion PI Hi-Q Chef 키트 또는 540 칩용 Ion 540 키트-Chef)를 선택합니다.
- 시퀀싱 키트 드롭다운 목록에서 적절한 시퀀싱 키트(PI 칩용 Ion PI Hi-Q 시퀀싱 200 키트 또는 540 칩용 Ion S5 시퀀싱 키트)를 선택한 다음 바코드 세트 드롭다운 목록에서 IonXpress를 선택합니다.
- 플러그인 탭으로 전환하고 커버리지 분석 플러그인을 선택합니다.
- 계획 탭으로 전환. 참조 라이브러리 드롭다운 목록에서 GRCh37/hg19 게놈을 선택합니다. 대상 영역 드롭다운 목록에서 순서대로 지정할 적절한 패널을 선택합니다.
- 시퀀스할 바코드 수와 라이브러리 샘플 튜브의 레이블을 적절한 필드로 설정합니다.
- 각 라이브러리의 바코드 이름과 샘플 이름을 설정합니다.
- 샘플 라이브러리 희석 및 로딩.
- PI 칩의 경우 25 pM, 540 칩의 경우 32 pM으로 뉴클레아제 없는 물로 스톡 라이브러리를 희석합니다.
- 각 희석 된 라이브러리의 50 μL을 적절한 라이브러리 샘플 튜브의 바닥에 피펫.
- 시퀀싱 시스템을 켜고 화면의 지침에 따라 필요한 모든 시약을 로드하고 실행 계획을 가져옵니다.
- 풀링된 라이브러리가 포함된 라이브러리 샘플 튜브를 로드하고 클론 증폭 프로그램을 시작합니다.
참고: 이온 셰프 시스템은 실행당 두 개의 칩을 준비해야 합니다.
- 이온 양성자 또는 이온 진 스튜디오 S5에 시퀀싱.
- 시퀀싱 시스템을 켜고 화면의 지침에 따라 시퀀싱을 초기화하고 실행 계획을 가져옵니다.
- 시퀀싱 시스템에서 분리한 후 시퀀싱 칩을 로드합니다.
참고: 정전기 방전으로 인한 칩 손상을 방지하기 위해 칩을 집어 들기 전에 접지하십시오. 칩 처리/위치 지정 및 성공/실패 로딩의 예는 그림 4에보고됩니다. - 칩 구획 뚜껑을 닫고 칩 상태 아이콘이 "준비됨"을 표시할 때까지 기다립니다.
- 첫 번째 실행이 완료되면 폐기물 용기를 비우고 가능한 한 빨리 나머지 칩을 순서를 정합니다.
7. 돌연변이 및 카피 수 변이 (CNV) 분석
참고: GRCh37/hg19 인간 참조 게놈에 대한 시퀀싱 데이터의 정렬은 계획(6.2.8 단계)에 설정되면 자동으로 수행됩니다.
- 커버리지 분석플러그인(재료 표)출력을 사용하여 커버리지 깊이와 균일성을 확인합니다.
- 적절 한 생식선 또는 신체 워크플로를 선택 하는 Torrent 변형 호출자 플러그인(재료의 표)를사용 하 여 변형 호출을 수행 합니다.
- 필터링 된 변형 변형 호출 형식 (VCF) 파일을 다운로드합니다. 변형 효과 예측기(VEP) 소프트웨어6 및 NCBI RefSeq 데이터베이스를 사용하여 변형에 추가합니다.
- Ion Reporter 업로더 플러그인을 사용하여 이온 리포터 소프트웨어의 로드 시퀀싱 데이터를 사용하고 포괄적인 암 패널 종양-정상 쌍 워크플로우를 사용하여 CNV를 추정하기 위해 데이터를 분석합니다.
- 소프트웨어에서 할당한 점수를 기반으로 수동으로 돌연변이 및 CNV를 필터링하고 통합 유전체학 뷰어(IGV)7을통해 시각적으로 확인합니다.
- artefactual 호출을 생성할 수 있는 비정상적인 읽기(예: 잘못된 프림, 과암화 또는 소프트 클리핑 읽기)에 대한 정렬을 시각적으로 검사합니다.
- 기준선의 정규화된 엄호에 대하여 주어진 유전자에 걸쳐 있는 모든 앰플리코에 대한 정규화된 엄호를 검사하여 CNV를 확인하십시오.
참고 : 이것은 때때로 하나의 유전자의 끝과 연속유전자의 시작 부분에 몇 앰플리콘의 대칭 비정상적인 범위에 따라 CNV를 호출 하는 세분화 소프트웨어로 인해 거짓 호출을 수정 하는 데 도움이.
- 체세포 돌연변이의 색인
- 각 경우에 대 한, 인덱스 돌연변이 정상 조직/혈액의 시퀀싱에서 호출, 원발 성 종양 및 전이.
- 생식선으로 플래그를 표시하고 생식선 DNA의 시퀀싱 데이터에서 명백한 호출을 폐기합니다.
- 클론 / 설립자로 플래그 주어진 환자의 모든 병변 사이에 공유되는 돌연변이.
- 주어진 환자의 모든 병변을 제외한 일부에서 검출되는 돌연변이를 소동/진행자로 플래그합니다.
8. 면역 표현형 분석 : 관련 단백질 발현을위한 면역 성화학
참고: 면역성 화학은 종양 억제 유전자에 있는 돌연변이를 비활성화의 기능적인 결과를 검증하기 위하여 이용되었습니다.
- 마이크로토메를 사용하여 3−4 μm 두께의 FFPE 조직 섹션을 잘라내고 충전된 슬라이드에 장착하고 60°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 랙에 놓고 10 분 동안 자일렌, 10 분 동안 자일렌, 4 분 동안 95 % 에탄올, 4 분 동안 95 % 에탄올, 4 분 동안 70 % 에탄올, 4 분 동안 70 % 에탄올, 4 분 동안 증류수를 수행하십시오.
- 항체 의 제조자(재료표)의표시에 근거를 둔 항원 검색을 수행합니다.
- 슬라이드를 특정 항원 회수 용액이 있는 랙에 놓고 끓는 온도에서 수조에 담급하십시오.
- 욕조에서 슬라이드를 제거하고 수돗물을 실행하여 10 분 동안 식힙니다.
- 내생성 과산화증을 비활성화하기 위해 RT에서 20 분 동안 1 x 트리스 버퍼링 식염수 (TBS)에 3 % H2O2로 새 랙에 슬라이드를 놓습니다.
- 슬라이드를 새 랙에 놓고 TBS로 3x를 세척하고 Tween 20(TBST)의 0.1%를 세척합니다.
- PAP펜(재료 표)을사용하여 슬라이드 장착 조직 주위에 소수성 원을 그립니다.
- 습한 챔버에 슬라이드를 놓고 차단 용액으로 TBST에서 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 RT에서 1 시간 동안 차단을 수행합니다.
- 1차항체(재료 표)로슬라이드를 밤새 4°C에서 습한 챔버에 인큐베이팅한다. 권장대로 차단 용액으로 1 차 항체를 희석하십시오.
- 슬라이드를 새 랙에 놓고 TBST로 3x를 세척합니다.
- 습한 챔버에서 RT에서 30 분 동안 특정 이차 항체 (항 마우스 또는 항 토끼)(1 슬라이드에 4−5 방울)로 배양하십시오.
- 슬라이드를 새 랙에 놓고 TBST로 3x를 씻고 증류수로 씻으십시오.
- 희석 완충제 1 mL에 1 방울을 희석하는 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB) 용액을 준비한다(재료표). 현미경으로 검사하는 5 분 동안 최대 인큐베이트 슬라이드.
- 현미경 하에서 반응의 발달을 따라 배양 시간을 계산하기 위해 양성 대조군을 사용한다.
참고: 각 항체는 특정 인큐베이션 시간이 필요합니다. - 비활성 DAB (크로모겐 침전을 중지)는 증류수에 슬라이드를 침수하여.
- 10s에 대한 헤마톡슬린과 새로운 랙에 침지하여 카운터 스테인 슬라이드 다음 수돗물로 헹구십시오.
- 슬라이드를 랙에 놓고 4분 동안 70% 에탄올, 4분 동안 70% 에탄올, 4분 동안 95% 에탄올, 4분 동안 95% 에탄올, 10분 동안 자일렌, 10분 동안 자일렌을 수행합니다.
- 밀봉 슬라이드는 각 조직 슬라이드에 장착 매체(재료 표)의몇 방울을 넣고 커버 슬립으로 덮습니다.
- 커버 슬립에 압력을 가하여 여분의 매체와 기포를 조직에서 멀리 그리고 커버슬립에서 밖으로 옮기고 공기건조로 옮김을 제거합니다.
- 전문 병리학자와 함께 반전 된 현미경으로 염색 결과를 평가하고 점수를 매김하십시오.
참고 : 채점 시스템은 문헌의 정보가 이미 존재 할 수있는 특정 항원에 따라 달라집니다. 문헌에서 정보를 사용할 수 없는 경우, 정상 조직에서 항원발현을 기준으로 하여 채점 시스템을 도출한다.
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Representative Results
스터디 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 409개의 암 관련 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 5개의 SPN 케이스의 다중 병변 (n=13) 염기서열 분석은 8개의 유전자에서 총 27개의 체세포 돌연변이를확인하였다(CTNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1및 FGFR3). 돌연변이는 주어진 환자의 모든 병변 사이에서 공유될 때 창립자/클로날로 정의되었고, 주어진 환자의 모든 병변에서 검출될 때 진행자/소클레날(subclonal)으로 정의되었다(그림5A,B). 전반적으로, 코호트에 걸쳐 확인된 점 돌연변이의 대다수는 CTNNB1, KDM6A, TET1 및 FLT1의돌연변이를 포함하는 클론 사건이었습니다. 일관되게, β-카테닌(CTNB1의 단백질 생성물)과 KDM6A에 대한 면역성화학적 염색은 상응하는 유전자의 돌연변이를 가진 다양한 병변 중에서 균질하였다(도6 A, B). 돌연변이된 견본에 있는 KDM6A를 위한 온건한 염색은 유전 변경이 단백질 발현 보다는 오히려 기능을 바꾸기 위하여 확률이 높다는 것을 건의했습니다. 췌장 종양에서의 기능의 KDM6A 손실은 저산소증 마커 GLUT18의상류 조절과 연관되며, 이에 따라 GLUT1은 KDM6A 돌연변이를 가진 경우에 과발현되었다(도6C). 서브클로날 돌연변이는 BAP1, SMAD4, TP53 및 FGFR3에 영향을 미치는 것으로 나타났다. BAP1 및 TP53에 대한 면역조직화학은 이들 유전자의 돌연변이가 종소임을 확인하였다(도6D,E). 도 7A에도시된 바와 같이 분석된 모든 시편에서 시퀀싱 데이터와 개시된 변경을 사용하여 카피-수 변동(CNV) 분석을 수행하였다. 포인트 돌연변이와 는 달리, CNV 변경의 대부분은 서브클로날(도7B)이었다.
그림 1: 전이성 병변에 대해 수행된 분석의 흐름 도표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 정상 및 종양 조직의 대표적인 조직학.
(A, B) 종양 조직 (T) 정상 조직에 인접 (N). 이 2개의 조직 단면도에서는, 종양 과 정상 조직은 분리되고 잘 제한된 지역으로 식별가능합니다. (C)정상 췌장 세포의 클러스터(N*)는 종양 조직(T) 내에 내장된 것으로 볼 수 있다. (D)정상 췌장 조직의 형태. 축척 막대는 1mm를 나타냅니다.
도 3: 라이브러리 준비 및 정량화 프로토콜 단계의 개략적 흐름도.
그림 4: 이온 양성자 칩 로딩 및 실행.
(A)칩 클램프의 칩 방향 및 배치(왼쪽). 금속 탭 뒷면 교체(오른쪽). (B)두 개의 서로 다른 칩 하중에서 라이브러리의 밀도를 표시하는 히트맵. 라이브러리의 성공적인 클론 증폭으로 인해 양호한 로딩 밀도(top)의 예로, 시퀀싱 입자가 있는 칩 표면의 94% 로딩(1억 3,900만 판독, 자동 품질 필터링 후 최종 출력 9,000만 개 판독). 라이브러리의 비효율적인 클로날 증폭으로 인한 열악한 로딩(하단)의 예로, 시퀀싱 입자가 있는 칩 표면의 40% 로딩(5,900만 판독, 자동 품질 필터링 후 최종 출력 1,200만 판독).
그림 5: 전이성 병변의 체세포 변경.
(A)일치하는 1 차/전이성 병변에서 확인된 체세포 돌연변이. (B)모든 병변 (설립자 / 클론) 및 주어진 경우 (진행자 / 소경)에 대한 모든 표본을 제외한 하나 이상의 표본에서 검출 된 변경을 포함하여 사례당 총 체세포 돌연변이가 표시됩니다. 케이스당 시퀀스된 개별 전이성 병변(m)의 수는 지시된다. 이 그림은 Amato 등에서 다시게시되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: β-카테닌, KDM6A, GLUT1, BAP1 및 TP53에 대한 면역 염색은 1차 및 전이성 병변에서.
(A) CTNB1의 SPN 베어링 돌연변이로부터 모든 표본에서 β-카네닌의 핵 축적을 나타내는 대표적인 면역성화학적이미지(B)병변의 면역성화학적 염색 KDM6A의 전이성 SPN 베어링 클론 돌연변이. (C)KDM6A 돌연변이를 하나의 SPN 베어링에서 GLUT1의 과발현, 반면 야생형 조직에서 면역반응성은 관찰되지 않았다. (D, E) BAP1 및 TP53 발현 데이터는 이 두 유전자의 돌연변이가 소충적임을 나타낸다. 축척 막대는 100 μm를 나타내고 인세트 배율은 600X입니다. 이 그림은 Amato등에서 수정되었습니다. 8.
그림 7: 전이성 병변의 체세포 카피 수 변화.
(a)가상 카요타입 뷰는 대표적인 경우에 변경된 유전자의 위치, 근접 성 및 카피 번호 상태를 나타낸다. 염색체 밴드의 착색 방식은 다음과 같은데, 검은색과 회색 = 지암사 양성, 연한 빨간색 = 센트로메레, 보라색 = 가변 영역. 변경은 그림에 제시된 색상 코드에 따라 주석이 추가됩니다. 약어: CNV, 복사 번호 변형; P, 1차 SPN; L (a-c), 간 전이. (B)총 체세포 변경 (CNV에 의해 영향을받는 유전자)은 모든 병변 (설립자 / 클론) 및 주어진 경우 (진행자 / 서브 클로날)에 대한 표본의 하나 이상의 (전부는 아님)에서 검출 된 변경을 포함하여 사례별로 표시됩니다. 케이스당 시퀀스된 개별 전이성 병변(m)의 수는 지시된다. 이 그림은 Amato 등에서 다시게시되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 방법은 주어진 환자의 별개의 병변에서 수직 데이터 (즉, 형태학, DNA 염기서열 분석 및 면역 조직 화학)의 통합을 통해 고형 종양의 진행에 관여하는 분자 변이를 식별 할 수 있습니다. 우리는 409개의 암 관련 유전자8의 코딩 서열을 심문하여 돌연변이 침묵 종양 유형(즉, SPN, 췌장의 고체-가성세포 신생물)에서 클론 및 하부 클론 이벤트를 검출하는우리의 방법의 능력을 입증하였다. 여기서 사용되는 앰플리코 기반 표적 시퀀싱 접근법의 장점은 1000x의 전형적인 평균 커버리지 깊이에서 심문 된 영역 (15,992)에 걸쳐 커버리지 (90 % 표적 염기는 100x, 95 %는 20 배 커버)의 균일성입니다. 미세 해부를 통한 신생물 세포 농축에 결합된 높은 커버리지 커버리지는 낮은 대문자 주파수 이벤트를 검출하기 위한 높은 감도를 보장합니다. 우리가 이전에9를보여주었듯이, 표적으로 한 순서 는 FFPE 조직에서 DNA 견본에 2% eele 주파수까지 돌연변이의 검출을 허용합니다. 일례로, 본 작품에서 우리는 전이성 시편에서 의 한체 사건으로서 4% 대립 유전자 주파수 TP53 오센스 돌연변이를 확인할 수있었다(도 5)면역조직화학에 의해 이러한 발생을 검증하였다(도6). 우리의 프로토콜은 체세포 적 사건을 식별하고 그에 따라 암 전용 파이프 라인(10)의종하 돌연변이의 거짓 검출 속도를 감소시키기 위해 일치하는 종양 및 생식선 DNA의 염기서열 을 상상한다. 일치하는 생식선 DNA를 사용할 수 없는 경우 최소 범위 깊이에 기반한 엄격한 필터를 비롯하여 "핫스팟 돌연변이"로 호출하는 변이체를 제한하는 등 시퀀싱 데이터 분석에서 보다 보수적인 매개 변수를 채택하는 것을 고려할 수 있습니다. 사용 가능한 데이터베이스에 광범위하게 추가된 돌연변이입니다. 일치하는 종양과 함께 세균선 DNA를 시퀀싱하는 것은 또한 카피 수 변이(CNV)의 정확한 검출을 가능하게 하는 장점이 있다. 또는, 성별에 맞는 디플로이드 게놈 풀을 사용하여 시퀀싱 데이터에서 잡음이 줄어들고 CNV검출을 용이하게 할 수 있습니다. 생식선 DNA의 포함 이외에, 우리는 프라이머 풀 불균형을 감소시키고 CNV 호출을 향상시키기 위하여 라이브러리 프로토콜을 수정했습니다. 원래 프로토콜에 따르면, 멀티플렉스 PCR 후 각 DNA 샘플에서 생성 된 4 개의 앰플리콘 풀은 함께 혼합되어야하고 나머지 단계는 샘플 당 하나의 튜브에서 수행 될 것이다. 그러나 이것은 멀티플렉스 PCR이 다른 관에 걸쳐 다른 효율을 가질 수 있다는 사실 때문에 풀 당 평균 커버리지 깊이의 변동을 야기한다. 원래 프로토콜에서 이러한 효과를 설명하는 풀 정량화/정규화 단계가 없었습니다. 위에서 설명한 변동을 피하기 위해 전체 라이브러리 프로덕션 프로토콜에 걸쳐 4개의 앰플리톤 풀을 각각 정량화할 수 있도록 유지하기로 결정했습니다. 정량화 시, 각 DNA 샘플에 대한 4개의 풀의 동일한 양을 최종 라이브러리 풀에 추가하여 최종 평균 커버리지가 가능한 한 균일하게 되도록 할 수 있습니다.
유전 수준에서 종양 내 이질성 (ITH)의 평가는 중요한 임상 연루가 있습니다 그러나 유사하게 새로운 도전을제기합니다 2. 주요 과제는 실제로 운전자 돌연변이와 경위 적 사건 (즉, 승객 돌연변이)을 구별할 필요성입니다. 운전자와 승객 돌연변이의 구별은 종종 계산적으로 수행되지만 편견이 없는 것은 아닙니다. 검출된 변이체의 체계적인 기능화는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되지만, 적어도 유전자의 하위 집합에 대해 해당 단백질의 면역 조직 화학적 분석 또는 간접적으로, 단백질 기능 장애의 대리 마커의 발현을 측정하여. 우리의 프로토콜은 FFPE 조직에 적용되었습니다, 이는 임상 설정에서 재료의 주요 소스를 나타내는 아직 시퀀싱에 대한 도전을 포즈; 분리 된 핵산의 품질은 항상 시퀀싱11전에 평가되어야한다. 표적 시퀀싱은 비용 효율적이고 전산 요구 사항 측면에서 매우 까다롭지 않다는 주요 장점을 가지고 있지만, 게놈의 제한된 부분만 심문하는 것이 큰 단점이 있어 과소평가될 가능성이 높습니다. 종양 내 이질성. 더욱이, 이 접근법은 최근 특정 종양 유형4,12에서유전적 차이를 능가하는 것으로 나타난 전이와 원발성 종양 사이의 관련 후성유전학 및 전사성 차이를 고려하지 않고있다. 13. 그러나 기술 발전이 곧 ITH에 대한 더 나은 평가를 위해 풍부한 수직 데이터 앙상블을 통합할 수 있을 것으로 예상됩니다. 우리의 접근은 적당한 SNV 기지를 둔 생리학을 건축하는 우리의 능력을 제한하는 게놈의 물리적 엄호에 깊이를 선호합니다. 그러나, 우리의 방법은 분자와 조직 병리학 분석의 통합 때문에 적당한 감도 및 특이성을 가진 임상 견본에 있는 유전 관련성을 탐구하는 기회를 제공합니다. 우리는 특정 종양 모형 (예를 들면, SPN)에 이 프로토콜을 성공적으로 적용하고 그 방법이 그밖 고형 종양 모형에 유사하게 작동할 것이라는 점을 예측합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
연구 결과는 이탈리아 암 게놈 프로젝트 (그랜트 번호)에 의해 지원되었습니다. FIRB RBAP10AHJB), 아소시아지오네 이탈리아나 리케르카 칸크로 (AIRC; 그랜트 번호 12182 에 AS 와 18178 VC), FP7 유럽 공동체 보조금 (캠 팩 No 602783 에 AS). 자금 조달 기관은 데이터의 수집, 분석 및 해석또는 원고 작성에 아무런 역할을하지 않았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | - | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | - | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | - | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software - uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | - | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | - | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | - | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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