Summary
Denna artikel beskriver en metod för att identifiera klonala och subklonala förändringar mellan olika prover från en given patient. Även om de experiment som beskrivs här fokuserar på en specifik tumörtyp, tillvägagångssättet är i stort sett tillämplig på andra solida tumörer.
Abstract
Att bedöma intra-tumoral heterogenitet (ITH) är av största vikt för att förutse misslyckande av riktade terapier och design därmed effektiva anti-tumör strategier. Även om oro ofta höjs på grund av skillnader i provbehandling och djup täckning, nästa generations sekvensering av solida tumörer har avslöjad en mycket varierande grad av ITH över tumörtyper. Att fånga den genetiska släktskap mellan primära och metastaserande lesioner genom identifiering av klonala och subklonala populationer är avgörande för utformningen av terapier för avancerade sjukdomar. Här rapporterar vi en metod för jämförande lesioner analys som möjliggör identifiering av klonala och subklonala populationer bland olika prover från samma patient. Den experimentella metoden som beskrivs här integrerar tre väl etablerade tillvägagångssätt: histologisk analys, hög täckning multi-lesion sekvensering, och immunophenotypic analyser. För att minimera effekterna på detektion av subklonala händelser genom olämplig provbehandling, vi utsätts vävnader för noggrann patologisk undersökning och neoplastiska cell berikning. Kvalitetskontrollerade DNA från neoplastiska lesioner och normala vävnader utsattes sedan för hög täckning sekvensering, inriktning på kodning regioner 409 relevanta cancergener. Samtidigt som man bara tittar på ett begränsat genomiskt utrymme, gör vårt tillvägagångssätt det möjligt att utvärdera omfattningen av heterogenitet mellan somatiska förändringar (single-nucleotide mutationer och kopior-nummer variationer) i distinkta lesioner från en given patient. Genom jämförande analys av sekvenserings data kunde vi urskilja klonala vs. subklonala förändringar. Majoriteten av ITH tillskrivs ofta passagerar mutationer; Därför använde vi också immunohistokemi för att förutsäga funktionella konsekvenser av mutationer. Även om detta protokoll har tillämpats på en viss tumörtyp, vi räknar med att den metod som beskrivs här är i stort sett tillämplig på andra solida tumörtyper.
Introduction
Tillkomsten av nästa generations sekvensering (NGS) har revolutionerat hur cancer diagnostiseras och behandlas1. NGS kopplat till multiregionala sekvensering har utsatt en hög grad av intratumoral heterogenitet (ITH) i solida tumörer2, vilket förklarar delvis misslyckandet med riktad behandling på grund av närvaron av subklonar med olika läkemedels känslighet2 . En viktig utmaning som orsakas av genomomfattande sekvenserings studier är nödvändigheten av att skilja mellan passagerare (dvs. neutrala) och förar mutationer i enskilda cancerformer3. Flera studier har verkligen visat att, i vissa tumörer, passagerar mutationer står för majoriteten av ITH, medan föraren förändringar tenderar att bevaras bland lesioner av samma individ4. Det är också viktigt att notera att stora mutationell börda (som kan ses i lungcancer och melanom) inte nödvändigtvis innebär en stor subklonala mutationell börda2. Därför, en hög grad av ITH kan hittas i tumörer med låg mutationell börda.
Metastaser är ansvariga för mer än 90% av cancerrelaterad död i hela världen5; Därför är det avgörande för utformningen av effektiva terapier för framskridna sjukdomar att fånga den mutationella heterogeniteten hos drivrutingener bland primära och metastaserande lesioner. Klinisk sekvensering utförs vanligtvis på nukleinsyror från fasta vävnader, vilket gör att genomomfattande prospektering är svår på grund av dålig DNA-kvalitet. Å andra sidan, avsikten med klinisk sekvensering är att identifiera angribara mutationer och/eller mutationer som kan förutsäga lyhördhet/oreaktionsförmåga till en given terapeutisk regim. I den mån det är, kan sekvensering begränsas till en mindre del av genomet för snabb extraktion av kliniskt relevant information. Övergången från DNA-profilering med låg kapacitet (t. ex. Sangersekvensering) till NGS har gjort det möjligt att analysera hundratals cancerrelevanta gener vid ett högt djup av täckning, vilket gör det möjligt att upptäcka subklonala händelser. Här rapporterar vi en metod för jämförande lesioner analys som möjliggör identifiering av klonala och subklonala populationer bland olika prover från samma individ. Den metod som beskrivs här integrerar tre väl etablerade metoder (histologisk analys, hög täckning multi-lesion sekvensering, och immunophenotypic analyser) för att förutsäga funktionella konsekvenser av de identifierade variationerna. Metoden beskrivs schematiskt i figur 1 och har tillämpats på studien av 5 metastatiska fall av solida pseudopapillära neoplasmer (SPN) i bukspottkörteln. Medan vi beskriver bearbetning och analys av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnadsprov, samma förfarande kan tillämpas på genetiskt material från färsk-fryst vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det material som användes i studien samlades in enligt ett särskilt protokoll som godkändes av den lokala etikkommittén. Skriftligt informerat samtycke från alla patienter fanns tillgängligt.
1. histologisk och immunophenotypisk revidering av vävnadsprov
Anmärkning: en expert patolog ansvarar för verksamhet som beskrivs nedan.
- Histopatologisk revidering av utvalda fall enligt väletablerade diagnostiska kriterier.
- Använd mikrotomen för att skära 4 − 5 μm tjock vävnad sektioner från representativa FFPE vävnads block och montera avsnitten på standard histologi diabilder.
- Utför hematoxylin och eosin färgning för varje bild med hjälp av en automatiserad vävnad Slide Stainer (tabell över material).
- Granska histopatologisk diagnos av valda tumör fall enligt WHO diagnostiska kriterier.
Obs: i detta skede, patologen kan identifiera morfologiskt distinkta områden av tumören inom samma vävnad avsnitt. Det är möjligt att skörda dessa områden separat (se avsnitt 2). Histologisk likhet med tumör-och normala celler för SPN-namn finns i figur 2. - Utför immunohistokemisk färgning för etablerade markörer för att komplettera histologisk analys och uppskatta immunophenotypic heterogenitet.
Anmärkning: patolog kan identifiera immunophenotypiskt distinkta områden av tumören inom samma vävnad avsnitt. Det är möjligt att skörda dessa områden separat (se avsnitt 2).
- Utvärdera neoplastiska cellularitet av tumörvävnad avsnitt och planera manuell microdissection därmed.
Anmärkning: Detta är en patolog-genererade uppskattning av tumör cellularitet.- Om neoplastiska cellinnehållet i vävnads sektionen är högre än 70%, är manuell mikrodissektion inte obligatorisk. gå direkt till steg 3,1.
Anmärkning: mål 70% av neoplastiska cellinnehåll för att (i) säkerställa adekvat känslighet för uppskattningar av Mutant allel frekvens och (II) att möjligen validera klonala mutationer genom mindre känsliga metoder (t. ex. kapillärsekvensering). - Om neoplastiska cellinnehållet i vävnads sektionen är lägre än 70%, är mikrodissektion nödvändigt och gå vidare till steg 2.
- Om neoplastiska cellinnehållet i vävnads sektionen är högre än 70%, är manuell mikrodissektion inte obligatorisk. gå direkt till steg 3,1.
- Utvärdera vävnads sektioner från FFPE-blocket där icke-neoplastisk vävnad har provtagits. Denna vävnad används som en källa till köns cells DNA.
Notera: blod är en alternativ källa av köns cells DNA. I detta fall, Fortsätt med DNA-extraktion som rekommenderar i anteckningen av steg 4,1.- Om endast icke-neoplastisk vävnad är synlig i vävnaden avsnitt (figur 2D), manuell microdissektion behövs inte; gå direkt till steg 3,1.
- Om betydande kontaminering från neoplastiska celler förekommer i vävnads sektionen är det nödvändigt med manuell mikrodissektion. Gå till avsnitt 2.
2. manuell microdissection
Obs: denna metod är tillämplig på olika solida tumörtyper, och det är avsett att öka neoplastiska celler innehållet i vävnadprover. Alternativt kan denna metod användas för att skörda morfologiskt och/eller immunophenotypiskt distinkta områden inom samma vävnads sektion.
- Med hjälp av en mikrotom, skära upp till tio 4 − 6 μm tjocka FFPE tumörvävnad sektioner och montera dem på oladdade diabilder.
Anmärkning: om endast en 1 mm2 Nest av cancerceller är synlig i preparatet, 10 vävnad diabilder bör skäras och utsätts för manuell microdissection för att få den riktade mängden DNA (40 ng); Detta förutsätter att 1 mm2 kluster innehåller mellan 700 och 1000 tumör kärnor. - Inkubera diabilder vid 60 ° c i 10 min.
- Placera bilderna i ett rack och utför följande tvättar: xylen för 20 min, 100% etanol i 10 min, 80% etanol i 10 min, 70% etanol i 10 min, destillerat vatten för 1 min, hematoxylin motfärgning för 10 s, kranvatten i 1 min.
- På en standard inverterad Mikroskop, Använd en 27 G nål på en spruta som microdissection verktyg och samla representativa kluster av tumörceller. Skörda minst tio 1 mm2 kluster av celler för att säkerställa erforderlig mängd DNA för sekvensering.
ANMÄRKNINGAR: om morfologiskt distinkta områden är avsedda att analyseras som olika entiteter, Använd sedan verktyget microdissection för att skörda dessa områden separat. - Placera skördade kluster i 1,5 mL-rör (tabell över material) som tidigare fyllts med 20 μl proteas K och 180 μl lyseringsbuffert (tabell över material, båda inkluderade i DNA Extraction Kit) och blanda genom vortexing.
3. bearbetning av vävnader utan föregående mikrodissektion
Anmärkning: denna procedur används för vävnads block som innehåller endast icke-neoplastiska celler (källa till köns cells DNA) eller innehålla minst 70% av morfologiskt homogena cancerceller.
- Med hjälp av en mikrotom skära upp till sex 4 − 5 μm tjockt vävnad sektioner från utvalda FFPE vävnads block. Placera vävnads rullarna i 1,5 mL-rör enligt beskrivningen i steg 2,5.
4. DNA-extraktion från normala och neoplastiska celler
- Rena DNA från normal och neoplastisk vävnad med hjälp av DNA FFPE vävnad extraktion Kit (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
Anmärkning: när blod används som en källa till köns cells nukleinsyra, rena DNA med hjälp av en DNA blod utvinning Kit (tabell över material). - DNA-kvantifiering och kvalitetskontroll
- För att kvantifiera mängden dubbelsträngad (dsDNA), tillsätt en alikvot av DNA-provet till en lösning som innehåller en fluorescerande nukleinsyrlig fläck (tabell över material) och mätning av utsänd fluorescens med hjälp av en bänkskiva fluorometer (tabell över material ).
Anmärkning: analysen mäter intensiteten hos den fluorescerande signal som avges från fluorescerande färgämnen som fästs på dsDNA och bestämmer mängden DNA med hjälp av en standardkurva. - Använd en mikrovolyms spektrofotometer (tabell över material) för att mäta förhållandet mellan 260/280 och 260/230 för att kvalificera DNA. "Pure" DNA bör ha en 260/280 av 1,8 och en 260/230 i intervallet 1,8 − 2,2.
Anmärkning: spektrofotometrisk utvärdering av provet är avsett att styrka förekomst av kemiska föroreningar (t. ex. fenol) som påverkar efterföljande reaktioner. I händelse av kontaminering på grund av kemiska reagenser, utför ett rensnings steg med hjälp av en kolumnbaserad sats.
- För att kvantifiera mängden dubbelsträngad (dsDNA), tillsätt en alikvot av DNA-provet till en lösning som innehåller en fluorescerande nukleinsyrlig fläck (tabell över material) och mätning av utsänd fluorescens med hjälp av en bänkskiva fluorometer (tabell över material ).
5. utarbetande och kvantifiering av bibliotek
Det schematiska flödesschemat för förberedelse-och kvantifiering av bibliotek rapporteras i figur 3.
- DNA Library beredning (4 primer pooler inrättas för varje prov)
Obs: de 4 primer-poolerna tillhör cancer panelen som rapporteras iTabell över material. Varje pool innehåller primer par som är utformade för en multiplexade mål urval av 409 gener. En länk till listan över gener som komponerar NGS-panelen finns iTabell över material.- Förbered fyra DNA-målamplifieringsreaktioner för varje prov, en per primer-pool. För varje primer pool (tabell över material), tillsätt i en 0,2 ml tub (tabell över material): 4 μl Master Mix (tabell över material, som ingår i biblioteket Kit), 10 μl av High Fidelity primer pool mix (tabell över material, som ingår i cancer panelens bibliotek) och 6 μL DNA (10 ng totalt).
- Förstärka mål områdena för varje primer-pool separat i fyra 1,5 ml-rör som kör följande program: Håll vid 99 ° c i 2 min (aktivering av varmstart Polymerase), 16 cykler (denaturering vid 99 ° c i 15 s, glödga och Förläng vid 60 ° c i 8 min) , håll vid 4 ° c.
Anmärkning: stopp punkt. Lagra mål förstärknings reaktioner vid 4 ° c över natten eller vid-20 ° c under längre tid. - Partiell nedbrytning av amplikonerna ändar
Obs: manualen som tillhandahålls av NGS Manufacturer kit förutser ett steg där de olika förstärknings reaktionerna från varje prov kombineras före partiell matsmältning. Undvik det steget och fortsätta att bearbeta varje amplifiering matsmältningen separat.- Tillsätt 2 μL specifik digestionsblandning (tabell över material, som ingår i biblioteks satsen) för varje amplifierad pool av varje prov (den totala volymen av varje 0,2 ml rör är 22 μl). Vortex grundligt och centrifugera varje tub för att samla in droppar.
- Fyll på rören i termocyklaren och kör följande program: 50 ° c i 10 min, 55 ° c i 10 min, 60 ° c i 20 min, 10 ° c Håll (upp till 1 h).
Anmärkning: stopp punkt. Förvara plattan vid-20 ° c under längre perioder.
- Ligate adaptrar för att amplikonerna och rena.
Obs: Använd en annan streckkod adapter för varje exempel när sekvensering flera bibliotek på ett enda chip. Alla fyra förstärknings reaktionerna från samma prov måste få samma streckkod.- Förbered adaptrar (tabell över material, streckkoder adaptrar Kit). För varje streckkod X, Förbered en blandning av P1 adapter och unika streckkod adaptrar (tabell över material) vid en slutlig utspädning av 1:4. Blanda 4 μL vatten med 2 μL P1-adapter och 2 μL unika streckkodskort. Använd 2 μL av denna streckkod adaptermix för nedströms passager.
- Utför ligering reaktionen genom att lägga till varje förstärks pool av varje prov i denna ordning: 4 μl av Switch lösning (tabell över material, som ingår i biblioteks satsen), 2 μl av streckkod adapter mix och 2 μl DNA Ligase (tabell över material, som ingår i biblioteks satsen) (total volym = 30 μL).
- Vortex grundligt och kortfattat Centrifugera för att samla droppar.
- Fyll på varje tub i termocyklaren och kör följande program: 22 ° c i 30 min, 68 ° c i 5 min, 72 ° c i 5 min, 4 ° c Håll (upp till 24 h).
Anmärkning: stopp punkt. Förvara plattan vid-20 ° c under längre perioder.
- Biblioteks rening och amplifiering
- Centrifugera varje tub och överför sedan varje barkodad prov i ett 1,5 mL-rör. Tillsätt 45 μL av de pärlbaserade renings reagenser (tabell över material) till varje pool av varje prov. Pipet upp och ner 5x att blanda pärla suspensionen med DNA.
- Inkubera blandningen i 5 min vid rumstemperatur (RT), placera sedan varje tub i ett magnetiskt rack och inkubera i 2 min. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Tillsätt i varje tub 150 μL färsk 70% etanol. Tvätta pärlorna flytta varje rör sida till sida av de två positionerna av magneten. Kassera supernatanten och uppmärksamma att inte störa pelleten.
- Upprepa procedurer som beskrivs i steg 5.1.5.3 och håll sedan rören i magneten och lufttorka pärlorna vid RT i 5 min.
- Ta bort rör med renade bibliotek av varje primer pool från magneten och tillsätt 50 μL av High Fidelity PCR mix (tabell över material) och 2 μl bibliotek amplifiering primer mix (tabell över material, som ingår i biblioteks satsen) till pärlpellets av varje tub.
- Vortex varje 1,5 mL rör och kort Centrifugera för att samla droppar.
- Placera 1,5 mL-rören i magneten i 2 minuter och överför försiktigt supernatanten (~ 50 μL) från varje tub till ett nytt 0,2 mL-rör utan att störa pelleten.
- Amplify bibliotek för varje primer pool kör följande program: Håll vid 98 ° c i 2 min för att aktivera enzymet, 5 cykler (denaturering vid 98 ° c för 15 s, glödga och förlänga vid 64 ° c 1 min), håll vid 4 ° c. Förvara proverna vid-20 ° c.
- Rening av förstärks bibliotek
- Centrifugera varje tub för att samla upp innehållet längst ner och överför varje förstärkt biblioteks prov till en 1,5 mL tub.
- Tillsätt 25 μL pärlbaserade renings reagens. Pipet upp och ner 5x att blanda pärla suspensionen med DNA.
- Inkubera blandningen i 5 min vid RT, och sedan placera rören i magneten i 5 min.
- Överför försiktigt supernatanten, som innehåller amplicons, från varje rör till nya rör utan att störa pelleten.
- Tillsätt 60 μL av pärlbaserade renings reagenser till supernatanten på varje tub och Pipettera upp och ner för att blanda pärlfjädring och DNA.
- Inkubera blandningen i 5 min vid RT och placera sedan rören i magneten i 3 min.
- Kassera supernatanten från varje tub och uppmärksamma att inte störa pelleten.
Obs: amplikonerna är bundna till pärlorna. - Tillsätt i varje tub 150 μL färsk 70% etanol. Tvätta pärlorna flytta rören sida-till-sida i de två positionerna av magneten. Kassera supernatanten och uppmärksamma att inte störa pelleten.
- Upprepa proceduren i steg 5.1.6.8 och lufttorka pärlorna vid RT i 3 min. Undvik överdriven torkning av pärlorna.
- Ta bort rören från magneten och tillsätt 50 μL låg Tris EDTA (TE) (tabell över material, som ingår i biblioteks satsen) till pelleten för att skingra pärlorna.
- Pipet blandningen upp och ner flera gånger och inkubera på RT för 2 min.
- Placera rören i magneten i minst 2 min och försiktigt överföra supernatanten, som innehåller amplicons, till nya rör utan att störa pärlorna.
- Kvantifiering av bibliotek
- Använd ett fragment analysinstrument (tabell över material) för att köra ett DNA-chip enligt hög känslighet DNA kit-protokollet.
6. bibliotek pooling och sekvensering Run
- Späd varje bibliotek till 100 pM med Nuclease-fritt vatten. Kombinera 10 μL av varje 100 pM bibliotek för en enda körning i ett enda rör. Blanda de kombinerade biblioteken genom att Pipettera och gå vidare till mallhantering och sekvensering.
- Planerad körning skapas
Anmärkning: en typisk körning innehåller fyra prover som kan lastas på två olika typer av halvledarchip (Ion PI chip eller Ion 540 chip) baserat på Sequencer finns i laboratoriet (Ion Proton system eller GeneStudio S5 system, tabell över material). Dessa system producerar vanligtvis 80 000 000 läsningar per körning.- Öppna torrent-webbläsaren på en dator som är ansluten till sekvenserings systemet (t. ex. Ion chef-systemet) och planera en ny körning med den generiska mallen för det valda programmet (AmpliSeqDNA).
- Växla till fliken Kits i planen. Välj Ion Proton system eller Ion GeneStudio S5 system från instrument listrutan baserat på det sekvenserings system som används.
- Beroende på sekvenserings systemet väljer du lämplig chip (PI-chip för Ion Proton-system; 540 chip för Ion GeneStudio S5-system) från listrutan chip Type .
- Välj Ion AmpliSeq 2,0 Library kit från den Library kit listrutan.
- Välj Jon -knappen för mallpaket och välj sedan lämplig kock-kit (Ion PI Hi-Q chef kit för PI-chip eller Ion 540 kit-chef för 540-chip) från listrutan mallpaket .
- Välj lämplig sekvenserings sats (Ion PI Hi-Q sekvensering 200 kit för PI-chip eller Ion S5 Sekvenserings sats för 540 chip) från den Sekvenserings sats listrutan, välj sedan Ionxpress från streckkods uppsättningen listrutan.
- Växla till fliken plugin och välj plugin-programmet för täcknings analys .
- Växla till den plan fliken. Välj den GRCh37/hg19 genomet från den nedrullningsbara listan referensbibliotek. I listrutan mål regioner väljer du lämplig panel som ska sekvenseras.
- Ange antalet streckkoder som ska ordnas och etiketten för bibliotekets prov rör i lämpliga fält.
- Ange streckkods namn och exempel namn för varje bibliotek.
- Prov bibliotek utspädning och lastning.
- Späd beståndet biblioteket med Nuclease-fritt vatten till 25 pM för PI chip eller 32 pM för 540 chip.
- Pipet 50 μL av varje utspätt bibliotek till botten av lämpligt biblioteks prov rör.
- Slå på sekvenserings systemet och följ instruktionerna på skärmen för att ladda alla nödvändiga reagenser och för att importera körningsplanen.
- Ladda biblioteks provröret som innehåller de poolade biblioteken och starta klon förstärknings programmet.
Obs: Jon systemet kräver två chips för att förberedas per körning.
- Sekvensering på Ion Proton eller Ion gen Studio S5.
- Aktivera sekvenserings systemet och följ instruktionerna på skärmen för att initiera sekvenseringen och importera körningsplanen.
- Ladda sekvenserings kretsen efter att du har avlägsnat den från sekvenserings systemet.
Obs: var jordad innan du plockar upp ett chip för att undvika spånskador på grund av elektrostatisk urladdning. Spånhantering/positionering tillsammans med exempel på lyckad/misslyckad lastning rapporteras i figur 4. - Stäng spånluckan och vänta tills ikonen för Chipstatus indikerar "klar".
- Töm avfallsbehållaren när den första körningen är slutförd, och sekvensera sedan återstående chip så snart som möjligt.
7. mutationer och analys av kopieringsnummervariationer (CNVs)
Anmärkning: justering av sekvenserings data till det mänskliga referensgenomet GRCh37/hg19 utförs automatiskt när de har angetts i planen (steg 6.2.8).
- Använd den täckning analys plugin (tabell över material) utdata för att kontrollera djupet av täckning och enhetlighet.
- Utför varianten ringer med hjälp av torrent variant Caller plugin (tabell över material), välja köns cells eller somatiska arbetsflödet efter behov.
- Hämta filtrerade varianter variant Call format (VCF) filer. Kommentera varianter med hjälp av den variant Effect Predictor (VEP) programvara6 och ncbi RefSeq databas.
- Ladda sekvensering data på Ion reporter programvara med hjälp av Ion reporter Uploader plugin och använda omfattande cancer panel tumör-normal par arbetsflöde för att analysera data för att uppskatta CNVs.
- Manuellt filtrera mutationer och CNVs baserat på poäng som tilldelats av programvaran och kontrollera dem visuellt med Integrative Genomics Viewer (IGV)7.
- Inspektera visuellt justeringen för ovanliga läsningar (till exempel genom att mispriming, överamplifiering eller läser av mjukt Urklipp) som kan generera artefakter.
- Kontrollera CNVs genom att inspektera den normaliserade täckningen för alla amplikonerna över en given gen mot den normaliserade täckningen av baslinjen.
Obs: Detta hjälper till att korrigera falska samtal på grund av segmentering programvara, som ibland kallar en CNV baserat på symmetriskt onormal täckning av några amplikonerna i slutet av en gen och i början av den successiva genen.
- Indexering av somatiska mutationer
- För varje fall, index mutation samtal från sekvensering av normal vävnad/blod, primär tumör och metastaser.
- Flagga som köns cells och ignorera de samtal som också framgår av sekvensering data av köns cells DNA.
- Flagga som klon/grundare de mutationer som delas mellan alla lesioner av en given patient.
- Flagga som subklonala/progressor de mutationer som upptäcks i vissa men inte alla lesioner av en given patient.
8. immunophenotypic analys: immunohistokemi för relevanta proteinuttryck
Obs: immunohistokemi användes för att validera de funktionella konsekvenserna av att inaktivera mutationer i tumörsuppressorgener.
- Med en mikrotom, skär 3 − 4 μm tjocka FFPE-vävnadssektioner och montera dem på laddade diabilder och inkubera diabilder vid 60 ° c i 10 min.
- Placera bilderna i ett rack och utför följande steg: xylen i 10 min, xylen i 10 min, 95% etanol i 4 min, 95% etanol i 4 min, 70% etanol i 4 min, 70% etanol i 4 min, destillerat vatten i 4 min.
- Utför antigen hämtning baserat på indikation på antikropps tillverkare (tabell över material).
- Placera bilderna i ett rack med den specifika antigen hämtnings lösningen och sänk samman i ett vattenbad vid sub-kokande temperaturer.
- Ta bort bilderna från badet och kör kranvatten för att kyla ner i 10 min.
- Placera diabilder i ett nytt rack med 3% H2O2 i 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS) i 20 minuter vid RT för att inaktivera endogena peroxiaser.
- Placera diabilder i ett nytt rack och tvätta 3x med TBS och 0,1% av Tween 20 (TBST).
- Använd en PAP-penna (tabell över material) för att rita en hydrofoba cirkel runt Slide-monterad vävnad.
- Placera bilderna i en fuktig kammare och utför blockering för 1 h vid RT med 5% bovint serum albumin (BSA) i TBST som blockerande lösning.
- Inkubera diabilder med primära antikroppar (tabell över material) i en fuktig kammare över natten vid 4 ° c. Späd primär antikropp med blockerande lösning enligt rekommendation.
- Placera diabilder i ett nytt rack och tvätta 3x med TBST.
- Inkubera diabilder med specifika sekundära antikroppar (anti-mus eller anti-kanin) (4 − 5 droppar för 1 bild) för 30 min vid RT i en fuktig kammare.
- Placera diabilder i ett nytt rack och tvätta 3x med TBST och efter i destillerat vatten.
- Förbered 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) lösning späda 1 droppe i 1 mL spädnings buffert (tabell över material). Inkubera diabilder maximalt för 5 min kontroll under mikroskopet.
- Använd en positiv kontroll för att beräkna inkubationstiden genom att följa utvecklingen av reaktionen under mikroskopet.
Anmärkning: varje antikropp behöver en specifik inkubationstid. - Inaktiv DAB (stoppa kromogen nederbörd) genom att dränka diabilder i destillerat vatten.
- Motfärgning glider genom att doppa dem i ett nytt rack med hematoxylin för 10 s och skölj sedan med kranvatten.
- Placera bilderna i ett rack och utför följande steg: 70% etanol i 4 min, 70% etanol i 4 min, 95% etanol i 4 min, 95% etanol i 4 min, xylen i 10 min, xylen i 10 min.
- Seal glider sätta ett par droppar av monteringsmedel (tabell över material) på varje vävnad glida och täck med täckglas.
- Applicera tryck på täckglappet för att förflytta överflödigt medium och luftbubblor bort från vävnaden och ut från täckslip och lufttorka.
- Utvärdera och värdering färgning resultat under inverterad Mikroskop med en expert patolog.
Anmärkning: poängsystemet kommer att bero på de specifika antigener, för vilka information i litteraturen kan redan finns. Om information inte finns tillgänglig i litteraturen, härleda ett poängsystem med uttrycket av antigenet i normal vävnad som referens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflödet för studien illustreras i figur 1. Multi-lesioner (n = 13) sekvensering av 5 SPN fall riktade kodning sekvenser av 409 cancerrelaterade gener identifierade totalt 27 somatiska mutationer i 8 gener (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1och FGFR3). Mutationer definierades som grundare/klon när de delades mellan alla lesioner av en given patient, och progressor/subklonala när de upptäcks i vissa men inte alla lesioner av en given patient (figur 5a, B). Sammantaget var de flesta punktmutationer som identifierats i kohorten klonala händelser, som inkluderade mutationer av CTNNB1, KDM6A, TET1 och FLT1. Konsekvent, immunohistokemisk färgning för β-catenin (proteinprodukt av CTNNB1) och KDM6A var homogen bland de olika lesioner av fall med mutationer av motsvarande gener (figur 6A, B). Den måttliga färgning för KDM6A i muterade exemplar föreslog att genetisk förändring sannolikt skulle förändra funktion snarare än proteinuttryck. KDM6A förlust av funktion i bukspottskörteln tumörer är associerad till uppreglering av hypoxi markören GLUT18, och därmed GLUT1 var överuttryckt i fall med KDM6A mutationer (figur 6c). Subklonala mutationer konstaterades påverka BAP1, SMAD4, TP53 och FGFR3. Immunohistokemi för BAP1 och TP53 bekräftade att mutationer i dessa gener var subklonala (figur 6D, E). Analys av kopieringsnummervariation (CNV) utfördes med sekvenserings data och avslöjade förändringar i alla prover som analyserades enligt figur 7a. På olika sätt från punktmutationer var majoriteten av CNV-förändringar subklonala (figur 7b).
Figur 1: flödesschema över den analys som utförts på metastaserande lesioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ histologi av normala och tumör vävnader.
(a, B) Tumör vävnad (T) i anslutning till normal vävnad (N). I dessa två vävnads sektioner, tumören och normala vävnader kan identifieras som separata och väl avgränsade områden. C) kluster av normala Pankreasceller (N *) kan ses som inbäddade i tumörvävnad (T). Dmorfologi av normal pankreasvävnad. Skalstapeln representerar 1 mm.
Figur 3: schematiskt flödesschema för steget för biblioteks förberedelse och kvantifieringsprotokoll.
Figur 4: Jon Proton-chip lastning och löpning.
(A) spånriktning och placering i spånklämman (vänster). Återanskaffning av metallflikar (höger). Bvärmekartor som visar bibliotekens täthet i två olika spånbelastningar. Exempel på en bra lastning densitet (överst) på grund av en lyckad klon förstärkning av bibliotek, vilket resulterar i 94% lastning av spånytan med sekvensering partiklar (139 000 000 läsningar, slutlig utgång 90 000 000 läsningar efter automatisk kvalitets filtrering). Exempel på en dålig lastning (botten) på grund av en ineffektiv klon förstärkning av bibliotek, vilket resulterar i 40% lastning av spånytan med sekvensering partiklar (59 000 000 läsningar, slutlig utgång 12 000 000 läsningar efter automatisk kvalitets filtrering).
Figur 5: somatiska förändringar vid metastaserande lesioner.
A) somatiska mutationer identifierade i matchade primära/metastaserande lesioner. (B) totala somatiska mutationer visas per fall, inklusive förändringar som delas mellan alla lesioner (grundare/klon) och de som upptäcks i ett eller flera men inte alla av proverna för ett givet fall (progressor/subklonala). Antalet enskilda metastaser (m) sekvenserade per fall indikeras. Denna siffra har publicerats på nytt från Amato et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: immunofärgning för β-catenin, KDM6A, GLUT1, BAP1 och TP53 i primära och metastaserande lesioner.
A) representativa immunohistokemiska bilder som visar nukleär ackumulering av β-catenin i alla prover (primära och metastaserande) från en SPN-bärande mutation av CTNNB1. B) immunohistokemisk färgning av lesioner från en metastaserande SPN-bärande klon mutation av KDM6A. C) ÖVERUTTRYCK av GLUT1 i ett SPN-lager KDM6A mutation, medan ingen immunoreaktivitet observerades i vildtyp vävnad. (D, E) BAP1 och TP53 uttrycks data betecknar att mutationerna i dessa två gener är subklonala. Skalstreck representerar 100 μm och infällbar förstoring är 600X. Denna siffra har modifierats från Amato et al.8.
Figur 7: somatiska kopior-antal förändringar i metastaserande lesioner.
(A) den virtuella karyotypsvyn visar placeringen, närheten och kopians nummer status för förändrade gener i ett representativt fall. Färgläggningsschemat för kromosomala band är följande: svart och grått = Giemsa positiv, ljusröd = centromere, lila = variabel region. Ändringar är kommenterad enligt de färgkoder som presenteras i figuren. Förkortningar: CNV, kopiera numrerar variation; P, primärt SPN; L (a-c), levermetastaser. (B) totala somatiska förändringar (gener som påverkas av CNV) visas per fall, inklusive förändringar som delas mellan alla lesioner (grundare/klon) och de som upptäcks i ett eller flera (men inte alla) av exemplaren för ett givet fall (progressor/subklonala). Antalet enskilda metastaser (m) sekvenserade per fall indikeras. Denna siffra har publicerats på nytt från Amato et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår metod möjliggör identifiering av molekylära förändringar involverade i progression av solida tumörer genom integration av vertikala data (dvs., morfologi, DNA-sekvensering, och immunohistokemi) från distinkta lesioner av en given patient. Vi visade förmåga att vår metod för att upptäcka klonala och subklonala händelser i en Mutations Silent tumörtyp (dvs., SPN, solid-pseudopapillary tumör i i bukspottkörteln) genom förhör kodnings sekvenser av 409 cancer relevanta gener8. En fördel med den amplicon-baserade riktade sekvenserings metoden som används här är likformigheten i täckningen (90% mål baser täcks 100x, 95% täcks 20x) över förhörs regioner (15 992) vid ett typiskt medel täcknings djup på 1000X. Hög djup-av-täckning kopplad till neoplastiska cell berikning genom microdissection garanterar hög känslighet för detektion av låga allel frekvens händelser. Som vi tidigare har visat9, den riktade sekvenserings metoden gör det möjligt att upptäcka mutationer ner till en 2% allel frekvens på DNA-prover från FFPE vävnad. Som ett exempel, i det nuvarande arbetet kunde vi identifiera en 4% allel frekvens TP53 genom mutation som en subklonala händelse i ett metastaserat prov (figur 5) och validerat denna förekomst av immunohistokemi (figur 6). Vårt protokoll förutser sekvensering av matchade tumör och arvsmassa DNA för att identifiera somatiska händelser och därmed minska den falska upptäckten hastighet av subklonala mutationer av cancer-endast pipeline10. När matchade köns cells DNA inte är tillgänglig, kan man överväga att anta mer konservativa parametrar i analysen av sekvenserings data, inklusive strikta filter baserade på minsta djup täckning samt begränsa varianter ringer till "hot-spots mutationer" och mutationer i stor utsträckning kommenterade i tillgängliga databaser. Sekvensering köns cells DNA tillsammans med matchade tumörer har också fördelen av att möjliggöra korrekt detektering av kopiera-nummer variationer (CNV). Alternativt kan pooler med könsmatchade diploida genom användas för att minska bullret från sekvenserings data och underlätta detektion av CNV. Förutom införandet av köns cells DNA, ändrade vi biblioteket protokollet för att minska primer pool obalans och förbättra CNV ringer. Enligt det ursprungliga protokollet ska de fyra amplikon-poolerna som framställs av varje DNA-prov efter Multiplex-PCR blandas tillsammans och resterande steg utföras i ett rör per prov. Detta orsakar emellertid variationer i per-pool medel täckning djup tack vare faktumet att Multiplex PCR kan ha olik effektivitet över olika rör. Det fanns ingen pool kvantifiering/normalisering steg för att ta hänsyn till denna effekt i det ursprungliga protokollet. För att undvika de ovan beskrivna fluktuationerna bestämde vi oss för att hålla var och en av de fyra amplikon poolerna separerade genom hela bibliotekets produktions protokoll, tills de kunde kvantifieras. Vid kvantifiering kan samma belopp för var och en av de fyra poolerna för varje DNA-prov läggas till den slutliga bibliotekspoolen, vilket säkerställer att den slutliga genomsnittliga täckningen var så enhetlig som möjligt.
Bedömningen av heterogenitet inom tumören (ITH) på genetisk nivå har viktiga kliniska konsekvenser, men på samma sätt innebär nya utmaningar2. En stor utmaning är verkligen nödvändigheten av att skilja mellan förar mutationer och stokastiska händelser (dvs. passagerar mutationer). Skillnaden mellan chaufför -och passagerare mutationer är ofta fulländad computationally, men inte utan fördomar. Även systematisk funktionalisering av upptäckta varianter är kostsamt och tidskrävande, kan funktionella konsekvenser av genetiska varianter utvärderas, åtminstone för en delmängd av gener, genom immunohistokemisk analys av motsvarande protein eller, indirekt, genom att mäta uttrycket av surrogatmarkörer för protein dysfunktion. Vårt protokoll har tillämpats på FFPE vävnader, som representerar den viktigaste källan till material i den kliniska inställningen ännu utgör utmaningar för sekvensering; kvaliteten på isolerade nukleinsyror ska alltid utvärderas före sekvensering11. Även om riktad sekvensering har den stora fördelen att vara kostnadseffektiv och inte mycket krävande när det gäller beräkningskrav, har den den största nackdelen att förhör endast en begränsad del av genomet, vilket sannolikt leder till underskattning heterogenitet inom tumören. Dessutom är detta tillvägagångssätt inte överväger relevanta epigenetiska och transkriptomiska skillnader mellan metastaser och primära tumörer som nyligen har visat sig uppväger genetiska skillnader i vissa tumörtyper4,12, 13. Man skulle dock tänka sig att tekniska framsteg snart kommer att möjliggöra integration av en rikare vertikal data Ensemble för en bättre bedömning av ITH. Vårt tillvägagångssätt föredrar djup till fysisk täckning av genomet, vilket begränsar vår förmåga att bygga ordentliga SNV-baserade phylogenies. Men vår metod ger möjlighet att utforska genetisk släktskap i kliniska prover med lämplig känslighet och specificitet på grund av integration av molekylära och histopatologiska analyser. Vi har framgångsrikt tillämpat detta protokoll på en specifik tumörtyp (t. ex. SPN) och förutsäga att metoden fungerar på samma sätt på andra solida tumörtyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av det italienska cancer arvs projektet (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana ricerca Cancro (AIRC; Grant nr 12182 till AS och 18178 till VC), FP7 Europeiska gemenskapens bidrag (Cam-PAC nr 602783 till AS). Finansieringsorganen hade ingen roll i insamlingen, analysen och tolkningen av uppgifterna eller i manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | - | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | - | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | - | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software - uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | - | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | - | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | - | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
