Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

doi: 10.3791/59844 Published: November 5, 2019

Summary

Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.

Abstract

Beoordeling van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) is van het allergrootste belang om te anticiperen op falen van gerichte therapieën en het ontwerp dienovereenkomstig effectieve anti-tumor strategieën. Hoewel bezorgdheid vaak wordt opgeworpen als gevolg van verschillen in monsterverwerking en diepte van dekking, de volgende generatie sequencing van solide tumoren hebben ontrafeld een zeer variabele mate van ITH over tumortypen. Het vastleggen van de genetische verwantschap tussen primaire en gemetastaseerde laesies door de identificatie van klonale en subklonale populaties is van cruciaal belang voor het ontwerp van therapieën voor aandoeningen aan de voor fase. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde patiënt mogelijk maakt. De hier beschreven experimentele aanpak integreert drie gevestigde benaderingen: histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing, en immunophenotypic analyses. Om de effecten op de detectie van subklonale gebeurtenissen te minimaliseren door ongepaste monsterverwerking, hebben we weefsels onderworpen aan zorgvuldig pathologisch onderzoek en neoplastische celverrijking. Op kwaliteit gecontroleerd DNA van neoplastische laesies en normale weefsels werd vervolgens onderworpen aan een hoge dekkings volgorde, gericht op de codeer gebieden van 409 relevante kanker genen. Terwijl we alleen naar een beperkte genomische ruimte kijken, maakt onze aanpak het mogelijk om de mate van heterogeniteit te evalueren bij somatische veranderingen (single-nucleotide mutaties en Copy-Number variaties) in verschillende laesies van een bepaalde patiënt. Door middel van vergelijkende analyse van sequentie gegevens konden we klonale versus subklonale wijzigingen onderscheiden. De meerderheid van ITH wordt vaak toegeschreven aan passagiers mutaties; Daarom gebruikten we ook immunohistochemie om functionele gevolgen van mutaties te voorspellen. Hoewel dit protocol is toegepast op een specifiek tumor type, verwachten we dat de hier beschreven methodologie algemeen toepasbaar is op andere vaste tumortypen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De opkomst van Next generation sequencing (NGS) heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop kanker wordt gediagnosticeerd en behandeld1. NGS gekoppeld aan multiregionale sequencing hebben blootgesteld een hoge mate van intra-tumorele heterogeniteit (ITH) in vaste tumoren2, die verklaart deels het falen van gerichte therapie als gevolg van de aanwezigheid van subklonen met verschillende geneesmiddel gevoeligheid2 . Een belangrijke uitdaging van genoom-brede sequentie studies is de noodzaak om onderscheid te maken tussen passagier (d.w.z. neutraal) en bestuurders mutaties in individuele kankers3. Verschillende studies hebben inderdaad aangetoond dat, in bepaalde tumoren, passagiers mutaties rekening voor de meerderheid van ITH, terwijl de wijzigingen van de bestuurder neiging om te worden bewaard tussen laesies van dezelfde persoon4. Het is ook belangrijk op te merken dat grote mutationele last (zoals te zien in longkanker en melanoom) niet noodzakelijkerwijs een grote subklonale mutationele last2impliceert. Daarom kan een hoge mate van ITH worden gevonden in tumoren met een lage mutationele Last.

Metastasen zijn verantwoordelijk voor meer dan 90% van de kanker-gerelateerde dood wereldwijd5; Daarom is het vastleggen van de mutationele heterogeniteit van de bestuurders genen bij primaire en gemetastaseerde laesies van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve therapieën voor gevorderde-fase ziekten. Klinische sequentie wordt over het algemeen uitgevoerd op nucleïnezuren uit vaste weefsels, waardoor genoom verkenning moeilijk is vanwege de slechte DNA-kwaliteit. Aan de andere kant is de intentie van klinische sequencing om bruikbare mutaties en/of mutaties te identificeren die de responsiviteit/onresponsiviteit op een bepaald therapeutisch regime kunnen voorspellen. In de huidige stand kan sequentiëren worden beperkt tot een kleinere fractie van het genoom voortijdige extractie van klinisch relevante informatie. De overgang van DNA-profilering met een lage doorvoer (bijvoorbeeld Sanger-sequencing) naar NGS heeft het mogelijk gemaakt om honderden kankerrelevante genen te analyseren op een hoge dekkingsgraad, waardoor de detectie van subklonale gebeurtenissen mogelijk is. Hier rapporteren we een methode voor vergelijkende laesies analyse die de identificatie van klonale en subklonale populaties tussen verschillende specimens van dezelfde persoon mogelijk maakt. De hier beschreven methode integreert drie gevestigde benaderingen (histologische analyse, High-coverage multi-Lesion sequencing en immunophenotypic analyses) om functionele gevolgen van de geïdentificeerde variaties te voorspellen. De aanpak wordt schematisch beschreven in Figuur 1 en is toegepast op de studie van 5 gemetastaseerde gevallen van vaste pseudopapillaire Neoplasmata (spn's) van de alvleesklier. Terwijl we de verwerking en analyse beschrijven van formalin-vaste paraffine-ingesloten (FFPE) weefsel specimens, kan dezelfde procedure worden toegepast op genetisch materiaal uit vers bevroren weefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het materiaal dat in de studie werd gebruikt, werd verzameld onder een specifiek protocol, dat door de lokale ethische commissie werd goedgekeurd. Schriftelijke geïnformeerde toestemming van alle patiënten was beschikbaar.

1. histologische en immunofenotypische herziening van weefsel specimens

Opmerking: een deskundige patholoog is verantwoordelijk voor de hierna beschreven activiteiten.

  1. Histopathologische herziening van geselecteerde gevallen volgens gevestigde diagnostische criteria.
    1. Gebruik de microtoom om 4 − 5 μm dikke weefsel secties te knippen van representatieve FFPE weefsel blokken en monteer de secties op standaard histologische dia's.
    2. Voer HEMA oxylin en eosine kleuring uit voor elke dia met behulp van een geautomatiseerde tissue Slide Stainer (tabel met materialen).
    3. Bekijk de histopathologische diagnose van de geselecteerde tumor gevallen volgens de diagnostische criteria van de WHO.
      Opmerking: in dit stadium kan de patholoog morfologisch verschillende delen van de tumor binnen dezelfde weefsel sectie identificeren. Het is mogelijk om die gebieden afzonderlijk te oogsten (zie rubriek 2). Histologische gelijkenis van tumor en normale cellen voor Spn's is te vinden in Figuur 2.
    4. Voer immunohistochemische kleuring uit voor gevestigde markers ter aanvulling van histologische analyse en schatting van immunophenotypische heterogeniteit.
      Opmerking: de patholoog kan immunofenotypisch afzonderlijke delen van de tumor binnen dezelfde weefsel sectie identificeren. Het is mogelijk om die gebieden afzonderlijk te oogsten (zie rubriek 2).
  2. Evalueer neoplastische cellulariteit van de tumorweefsel sectie en plan handmatige microdissectie dienovereenkomstig.
    Opmerking: dit is een patholoog-gegenereerde schatting van tumor cellulariteit.
    1. Als de neoplastische celinhoud van de weefsel sectie hoger is dan 70%, is handmatige microdissectie niet verplicht; Ga rechtstreeks naar stap 3,1.
      Opmerking: Streef naar 70% van de neoplastische celinhoud om (i) te zorgen voor voldoende gevoeligheid voor gemuteerde allel-frequentie schattingen en (II) om eventueel klonale mutaties te valideren door minder gevoelige methodologieën (bijv. capillaire sequencing).
    2. Als de neoplastische celinhoud van de weefsel sectie lager is dan 70%, is microdissection noodzakelijk en gaat u naar stap 2.
  3. Evalueer weefsel secties van het FFPE-blok waar niet-neoplastisch weefsel is bemonsterd. Dit weefsel wordt gebruikt als een bron van kiembaan DNA.
    Opmerking: bloed is een alternatieve bron van kiembaan DNA. In dit geval gaat u verder met DNA-extractie zoals aanbevolen in de nota van stap 4,1.
    1. Als alleen niet-neoplastisch weefsel zichtbaar is in de weefsel sectie (figuur 2D), is handmatige microdissectie niet nodig; Ga rechtstreeks naar stap 3,1.
    2. Als er substantiële verontreiniging van neoplastische cellen aanwezig is in de weefsel sectie, dan is handmatige microdissectie noodzakelijk; Ga naar sectie 2.

2. handmatige microdissectie

Opmerking: deze methode is van toepassing op verschillende soorten vaste tumor, en het is bedoeld om het gehalte aan neoplastische cellen van weefsel specimens te verhogen. Als alternatief kan deze methode worden gebruikt om morfologisch en/of immunofenotypisch afzonderlijke gebieden binnen dezelfde weefsel sectie te oogsten.

  1. Gebruik een microtoom, snijd tot tien 4 − 6 μm dikke FFPE tumorweefsel secties en monteer ze op onopgeladen glijbanen.
    Opmerking: als er slechts één 1 mm2 nest van kankers cellen in het preparaat zichtbaar is, moeten 10 weefsel glaasjes worden gesneden en onderworpen aan handmatige microdissectie om de beoogde hoeveelheid DNA te verkrijgen (40 ng); Dit ervan uitgaande dat 1 mm2 cluster tussen 700 en 1000 tumor kernen bevat.
  2. Incubate glaasjes bij 60 °C gedurende 10 min.
  3. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende wassingen uit: xyleen gedurende 20 min, 100% ethanol gedurende 10 min, 80% ethanol gedurende 10 min, 70% ethanol gedurende 10 min, gedistilleerd water gedurende 1 minuut, hematoxyline-tegen werk voor 10 sec., kraanwater gedurende 1 minuut.
  4. Op een standaard omgekeerde Microscoop, gebruik een 27 G naald op een spuit als de microdissection tool en verzamelen representatieve clusters van tumorcellen. Oogst minimaal tien 1 mm2 clusters cellen om de vereiste hoeveelheid DNA voor sequentiëren te garanderen.
    Opmerking: als morfologisch verschillende gebieden zijn bedoeld om te worden geanalyseerd als verschillende entiteiten, gebruik dan de microdissection tool om die gebieden afzonderlijk te oogsten.
  5. Plaats geoogste clusters in 1,5 mL buisjes (tabel met materialen) die eerder zijn gevuld met 20 μl protease K en 180 μl lysisbuffer (tabel van de materialen, beide opgenomen in de DNA-extractie Kit) en meng door vortexing.

3. verwerking van weefsels zonder voorafgaande microdissectie

Opmerking: deze procedure wordt gebruikt voor weefsel blokken die alleen niet-neoplastische cellen (bron van kiembaan-DNA) bevatten of ten minste 70% van de morfologisch homogene kankercellen bevatten.

  1. Met behulp van een microtoom geknipt tot zes 4 − 5 μm dikke weefsel secties van geselecteerde FFPE weefsel blokken. Plaats weefsel schuift in 1,5 mL buizen zoals beschreven in stap 2,5.

4. DNA-extractie uit normale en neoplastische cellen

  1. Zuiver DNA van normaal en neoplastisch weefsel met behulp van de DNA FFPE weefsel extractie Kit (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: wanneer bloed wordt gebruikt als bron van nucleïnezuur van kiembaan, zuiver DNA met behulp van een DNA bloed extractie Kit (tabel van materialen).
  2. DNA-kwantificering en kwaliteitscontrole
    1. Om de hoeveelheid dubbel gestrande (dsDNA) te kwantificeren, voegt u een aliquot van het DNA-monster toe aan een oplossing die een fluorescerende nucleïnezuur vlek (tabel met materialen) bevat en meet de fluorescentie met behulp van een tafel-fluor meter (tabel met materialen ).
      Opmerking: de bepaling meet de intensiteit van het fluorescerende signaal dat wordt afgegeven door fluorescerende kleurstoffen die aan dsDNA zijn bevestigd en bepaalt de hoeveelheid DNA met behulp van een standaard curve.
    2. Gebruik een microvolume spectrofotometer (tabel met materialen) om de verhouding 260/280 en 260/230 van het monster te meten om DNA te kwalificeren. "Zuiver" DNA moet een 260/280 van 1,8 en een 260/230 in het bereik van 1.8 − 2.2 hebben.
      Opmerking: spectrofotometrische evaluatie van het monster is bedoeld om de aanwezigheid van chemische verontreinigingen (bv. fenol) te bewijzen die van invloed zijn op de downstreamreacties. In geval van verontreiniging door chemische reagentia voert u een opruimings stap uit met behulp van een op een kolom gebaseerde Kit.

5. voorbereiding en kwantificering van de bibliotheek

Opmerking: het schematische stroomschema van de voorbereiding van de bibliotheek en de kwantificerings stappen wordt gerapporteerd in Figuur 3.

  1. DNA-bibliotheek voorbereiding (4 primer Pools voor elk monster ingesteld)
    Let op: de 4 primer Pools behoren tot het kanker panel gerapporteerd inTabel met materialen. Elke pool bevat primer paren die zijn ontworpen voor een multiplexed target selectie van 409 genen. Een link naar de lijst van genen die het NGS-paneel componeren isTabel met materialen.
    1. Bereid vier DNA-doel versterkings reacties voor elk monster, één per primer pool. Voeg voor elke primer pool (tabel met materialen) een tube van 0,2 ml (tabel metmaterialen) toe: 4 ΜL Master Mix (tabel metmaterialen, opgenomen in de Bibliotheekset), 10 μL High Fidelity primer pool mix (tabel metmaterialen, opgenomen in de kanker panel Library) en 6 μL DNA (10 ng totaal).
    2. Versterk de doelgebieden van elke primer pool afzonderlijk in vier 1,5 mL tubes met het volgende programma: vasthouden bij 99 °C gedurende 2 min (activering van de Hot-start polymerase), 16 cycli (denature bij 99 °C gedurende 15 s, anneal en verlengen bij 60 °C gedurende 8 minuten) , vasthouden bij 4 °C.
      Opmerking: stoppunt. Bewaar target versterkings reacties bij 4 °C 's nachts of bij-20 °C gedurende langere tijd.
    3. Gedeeltelijke vertering van amplicons eindigt
      Opmerking: de handleiding van de NGS-constructeur Kit voorziet in een stap waarin de verschillende versterkings reacties van elk monster worden gecombineerd vóór gedeeltelijke spijsvertering. Vermijd die stap en blijf elke amplificatie vertering afzonderlijk verwerken.
      1. Voeg aan elke versterkte pool van elk monster 2 μL specifiek verterings mengsel (tabel met materialen, opgenomen in de bibliotheekset) toe (het totale volume van elke buis van 0,2 ml is 22 μL). Vortex grondig en centrifugeer elke buis om druppels te verzamelen.
      2. Laad de buizen in de thermische cycler en voer het volgende programma uit: 50 °C gedurende 10 min, 55 °C gedurende 10 min, 60 °C gedurende 20 min, 10 °C (voor maximaal 1 uur).
        Opmerking: stoppunt. Bewaar plaat bij-20 °C gedurende langere periodes.
    4. Ligate adapters voor amplicons en zuiveren.
      Opmerking: gebruik een andere barcode adapter voor elk sample bij het sequentiëren van meerdere bibliotheken op een enkele chip. Alle vier de versterkings reacties van hetzelfde monster moeten dezelfde streepjescode ontvangen.
      1. Voorbereiden van adapters (tabel van materialen, barcodes adapters Kit). Voor elke streepjescode X bereidt u een combinatie van P1-adapter en unieke barcode adapters (tabel met materialen) voor bij een uiteindelijke verdunning van 1:4. Meng 4 μL water met 2 μL P1-adapter en 2 μL unieke barcode adapters. Gebruik 2 μL van deze barcode adaptermix voor downstreampassages.
      2. Voer de ligatie reactie door toe te voegen aan elke versterkte pool van elk monster in deze volgorde: 4 μL switchoplossing (tabel van de materialen, opgenomen in de bibliotheekset), 2 μl barcode adaptermix en 2 μl DNA ligase (Inhoudsopgave, inbegrepen in de Library Kit) (totaal volume = 30 μL).
      3. Vortex grondig en centrifugeer kort om druppels te verzamelen.
      4. Laad elke buis in de thermische cycler en voer het volgende programma uit: 22 °C gedurende 30 min, 68 °C gedurende 5 min, 72 °C gedurende 5 min, 4 °C (voor maximaal 24 uur).
        Opmerking: stoppunt. Bewaar plaat bij-20 °C gedurende langere periodes.
    5. Bibliotheek zuivering en-versterking
      1. Centrifugeer elke buis en breng vervolgens elk gebarcoded monster over in een buis van 1,5 mL. Voeg 45 μL op parels gebaseerde zuiverings reagens (tabel met materialen) toe aan elke pool van elk monster. Pipet op en neer 5x om de kraal suspensie te mengen met het DNA.
      2. Inbroed het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT), plaats vervolgens elke buis in een magnetisch rek en incuberen gedurende 2 min. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg zonder de pellet te storen.
      3. Voeg in elke Tube 150 μL verse 70% ethanol toe. Was de parels die elke buis aan de zijkant van de twee posities van de magneet bewegen. Gooi de supernatant weg en Let op dat je de pellet niet verstoort.
      4. Herhaal de procedures beschreven in stap 5.1.5.3 en houd de buizen in de magneet en lucht-droog de parels bij RT gedurende 5 minuten.
      5. Verwijder buisjes met gezuiverde bibliotheken van elke primer pool van de magneet en voeg 50 μL High-Fidelity PCR mix (tafel van de materialen) en 2 μL Library Amplification primer mix (tabel met materialen, opgenomen in de bibliotheekset) toe aan de kralen pellet van elke buis.
      6. Vortex elke 1,5 mL buis en kort Centrifugeer om druppels te verzamelen.
      7. Plaats 1,5 mL buisjes in de magneet gedurende 2 minuten en breng voorzichtig het supernatant (~ 50 μL) van elke buis over naar een nieuwe 0,2 mL Tube zonder de pellet te storen.
      8. Amplify bibliotheken van elke primer pool met het volgende programma: Houd bij 98 °C gedurende 2 minuten om het enzym te activeren, 5 cycli (denature bij 98 °C gedurende 15 s, anneal en strek bij 64 °C 1 min), vasthouden bij 4 °C. Bewaar voorbeelden bij-20 °C.
    6. Zuivering van versterkte bibliotheek
      1. Centrifugeer elke buis om de inhoud onderaan te verzamelen en breng elk versterkt bibliotheek monster over naar een buis van 1,5 mL.
      2. Voeg 25 μL op parels gebaseerde zuiverings reagens toe. Pipet op en neer 5x om de kraal suspensie te mengen met het DNA.
      3. Inbroed het mengsel gedurende 5 minuten bij RT, en plaats vervolgens de buisjes in de magneet gedurende 5 minuten.
      4. Breng het supernatant voorzichtig over, dat de amplicons bevat, van elke buis naar nieuwe buizen zonder de pellet te storen.
      5. Voeg 60 μL op parels gebaseerde zuiverings reagens toe aan de supernatant van elke buis en pipet op en neer om de kraal suspensie en het DNA te mengen.
      6. Inbroed het mengsel gedurende 5 min bij RT en plaats de buisjes in de magneet voor 3 min.
      7. Gooi het supernatant van elke tube weg en Let op dat je de pellet niet verstoort.
        Let op: de amplicons zijn gebonden aan de parels.
      8. Voeg in elke Tube 150 μL verse 70% ethanol toe. Was de kralen in de twee standen van de magneet om de buizen van de zijkant naar de zijkant te bewegen. Gooi de supernatant weg en Let op dat je de pellet niet verstoort.
      9. Herhaal de procedure in stap 5.1.6.8 en lucht droog de parels bij RT gedurende 3 min. Vermijd overmatig drogen van de kralen.
      10. Verwijder de buisjes van de magneet en voeg 50 μL lage tris EDTA (TE) (tabel met materialen, opgenomen in de bibliotheekset) toe aan de pellet om de kralen te dispergeren.
      11. Pipet teren van het mengsel meerdere malen op en neer en incuberen bij RT gedurende 2 minuten.
      12. Plaats de buizen in de magneet voor ten minste 2 min en voorzichtig overbrengen van de supernatant, die de amplicons bevat, nieuwe buizen zonder verstoring van de kralen.
  2. Kwantificering van de bibliotheek
    1. Gebruik een fragment analyse-instrument (tabel met materialen) om een DNA-chip uit te voeren volgens het hoge gevoeligheids Protocol van de DNA-Kit.

6. bibliotheken groeperen en sequentiëren uitvoeren

  1. Verdun elke wisselaar tot 100 pM met Nuclease-vrij water. Combineer 10 μL van elke 100 pM-bibliotheken voor een enkele hardloopsessie in een enkele buis. Meng de gecombineerde bibliotheken door te pipetteren en door te gaan met het templates en sequentiëren.
  2. Gepland uitvoeren maken
    Opmerking: een typische run bevat vier samples die kunnen worden geladen op twee verschillende soorten halfgeleider chip (Ion PI chip of Ion 540 chip) op basis van de sequencer beschikbaar in het laboratorium (Ion Proton systeem of GeneStudio S5 systeem, tabel van de materialen). Deze systemen produceren meestal 80.000.000 leesbewerkingen per run.
    1. Open de torrent-browser op een computer die is aangesloten op het volgorde systeem (bijv. ion chef-systeem) en plan een nieuwe uitvoering met behulp van de algemene sjabloon voor de geselecteerde toepassing (AmpliSeqDNA).
    2. Schakel over naar het tabblad kits van het plan. Selecteer Ion Proton System of Ion genestudio S5 systeem uit de instrument dropdown lijst op basis van de sequencing systeem wordt gebruikt.
    3. Afhankelijk van het volgorde systeem, selecteert u de juiste chip (PI-chip voor Ion Proton systemen; 540-chip voor Ion GeneStudio S5-systemen) uit de keuzelijst met chip typen .
    4. Selecteer Ion AmpliSeq 2,0 Library Kit in de vervolgkeuzelijst Library Kit .
    5. Selecteer de Ion chef knop voor template Kit, selecteer vervolgens de juiste chef Kit (Ion Pi Hi-Q chef Kit voor PI chip of Ion 540 Kit-chef voor 540 chip) uit de sjabloon Kit vervolgkeuzelijst.
    6. Selecteer de juiste sequencing Kit (Ion PI Hi-Q sequencing 200 Kit voor PI-chip of Ion S5 sequencing Kit voor 540 chip) uit de Sequentiëren Kit vervolgkeuzelijst, selecteer vervolgens Ionxpress van de streepjescode instellen vervolgkeuzelijst.
    7. Schakel over naar het tabblad plugin en selecteer de plugin voor dekkingsanalyse .
    8. Schakel over naar het tabblad plan. Selecteer het GRCh37/hg19 genoom in de vervolgkeuzelijst referentie bibliotheek. Selecteer in de vervolgkeuzelijst doelregio's het juiste deelvenster dat moet worden gesequentieerd.
    9. Stel het aantal streepjescodes in dat moet worden gesequentieerd en het label van de buisjes voor de bibliotheek in de juiste velden.
    10. Stel de streepjescode naam en de voorbeeld naam in voor elke bibliotheek.
  3. Monster bibliotheken verdunning en laden.
    1. Verdun de voorraad bibliotheek met Nuclease-vrij water tot 25 pM voor PI-chip of 32 pM voor 540-chip.
    2. Pipet keer 50 μL van elke verdunde wisselaar naar de onderzijde van de juiste bibliotheek monsterbuis.
    3. Schakel het volgorde systeem in en volg de instructies op het scherm om alle vereiste reagentia te laden en het uitvoeringsplan te importeren.
    4. Laad de bibliotheek sample tube met de gepoolde bibliotheken en start het van klonen Amplification programma.
      Let op: het ion chef-systeem vereist twee chips voorbereid per run.
  4. Sequencing op Ion proton of Ion GeneStudio S5.
    1. Schakel het volgorde systeem in en volg de instructies op het scherm om de volgorde te initialiseren en het uitvoeringsplan te importeren.
    2. Laad de volgorde-chip na het verwijderen uit het volgorde systeem.
      Opmerking: Wees geaard voordat u een chip ophaalt om spaan beschadiging door elektrostatische ontlading te voorkomen. Spaan verwerking/positionering samen met voorbeelden van succesvolle/mislukte belasting worden gerapporteerd in Figuur 4.
    3. Sluit het deksel van het spaan compartiment en wacht tot het pictogram van de chip status "Ready" aangeeft.
    4. Leeg de afvalbak wanneer de eerste uitvoering is voltooid en volg de resterende chip zo snel mogelijk.

7. mutaties en kopie-nummer variaties (Cnv's) analyse

Opmerking: de uitlijning van sequentiegegevens naar het menselijk referentie genoom van de GRCh37/hg19 wordt automatisch uitgevoerd eenmaal ingesteld in het plan (stap 6.2.8).

  1. Gebruik de invoegtoepassing dekkingsanalyse (tabel met materialen) om de diepte van de dekking en uniformiteit te controleren.
  2. Voer de variant aanroepen met behulp van de torrent variant beller plug-in (tabel met materialen), selecteren van de kiembaan of somatische werkstroom indien van toepassing.
  3. Download bestanden van de variant Call Format (VCF) van gefilterde varianten. Annoteren varianten met behulp van de variant effect Predictor (VEP) software6 en de NCBI refseq database.
  4. Load sequentie gegevens op de Ion reporter software met behulp van de Ion reporter Uploader plugin en gebruik de uitgebreide kanker panel tumor-normale paar werkstroom om de gegevens te analyseren om cnv's te schatten.
  5. Filter mutaties en Cnv's handmatig op basis van de door de software toegewezen scores en verifieer ze visueel met de Integrative Genomics Viewer (IGV)7.
    1. Inspecteer visueel de uitlijning op ongebruikelijke leesbewerkingen (bijvoorbeeld door het afknippen van het voorkomen, overamplificatie of leest) die artefeitelijke oproepen kunnen genereren.
    2. Verifieer Cnv's door de genormaliseerde dekking te inspecteren voor alle amplicons in een bepaald gen tegen de genormaliseerde dekking van de baseline.
      Opmerking: dit helpt bij het corrigeren van valse oproepen vanwege de segmentatie software, die soms een CNV noemt op basis van symmetrisch abnormale dekking van enkele amplicons aan het einde van een gen en aan het begin van het opeenvolgende gen.
  6. Indexering van somatische mutaties
    1. Voor elk geval, index mutatie aanroepen van sequencing van normaal weefsel/bloed, primaire tumor en metastasen.
    2. Markeer als kiembaan en gooi de oproepen die ook blijken uit sequentiëren van gegevens van kiembaan DNA.
    3. Markeer als clonal/oprichter van de mutaties die worden gedeeld tussen alle laesies van een bepaalde patiënt.
    4. Markeer als subklonale/progressor de mutaties die in sommige, maar niet alle laesies van een bepaalde patiënt worden gedetecteerd.

8. immunophenotypic analyse: immunohistochemie voor relevante eiwit expressie

Opmerking: immunohistochemie werd gebruikt om de functionele gevolgen van het inactiveren van mutaties in tumor suppressor genen te valideren.

  1. Gebruik een microtoom, snijd 3 − 4 μm dikke FFPE weefsel secties en monteer ze op opgeladen glijbanen en incuberen de glijbanen bij 60 °C gedurende 10 minuten.
  2. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende stappen uit: xyleen gedurende 10 min, xyleen gedurende 10 min, 95% ethanol gedurende 4 min, 95% ethanol gedurende 4 min, 70% ethanol gedurende 4 min, 70% ethanol gedurende 4 min, gedistilleerd water gedurende 4 min.
  3. Antigeen-opvraging uitvoeren op basis van de indicatie van de fabrikanten van antilichamen (tabel met materialen).
    1. Plaats de dia's in een rek met de specifieke antigeen-ophaal oplossing en dompel ze onder in een waterbad bij sub-kooktemperaturen.
    2. Verwijder de dia's uit het bad en voer kraanwater uit om gedurende 10 minuten af te koelen.
  4. Plaats dia's in een nieuw rek met 3% H2O2 in 1x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 20 minuten bij RT om endogene peroxiasen te deactiveren.
  5. Plaats dia's in een nieuw rek en was 3x met TBS en 0,1% van tween 20 (TBST).
  6. Gebruik een PAP-pen (tabel met materialen) om een hydrofobe cirkel rond op een dia gemonteerd weefsel te tekenen.
  7. Plaats de glaasjes in een vochtige kamer en voer gedurende 1 uur bij RT een blokkering uit met 5% boviene serumalbumine (BSA) in TBST als blokkerende oplossing.
  8. Incuberen de glijbanen met primaire antilichamen (tafel van de materialen) in een vochtige kamer, 's nachts bij 4 °c. Verdun primair antilichaam met blokkerende oplossing zoals aanbevolen.
  9. Plaats dia's in een nieuw rek en was 3x met TBST.
  10. Inincubatie van dia's met specifieke secundaire antilichamen (anti-muis of anti-konijn) (4 − 5 druppels voor 1 glijbaan) gedurende 30 min bij RT in een vochtige kamer.
  11. Plaats dia's in een nieuw rek en was 3x met TBST en daarna in gedistilleerd water.
  12. Bereid een 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) oplossing die 1 druppel in 1 mL verdunningsbuffer (tabel met materialen) verdunnen. Incubate dia's maximaal gedurende 5 minuten controle onder de Microscoop.
  13. Gebruik een positieve controle om de incubatietijd te berekenen door de ontwikkeling van de reactie onder de Microscoop te volgen.
    Opmerking: elk antilichaam heeft een specifieke incubatietijd nodig.
  14. Inactieve DAB (stop chromogeen neerslag) door het samenvoegen van dia's in gedestilleerd water.
  15. Contrastain dia's door ze te domlen in een nieuw rek met hematoxyline voor 10 s en vervolgens spoelen met kraanwater.
  16. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende stappen uit: 70% ethanol voor 4 min, 70% ethanol gedurende 4 min, 95% ethanol gedurende 4 min, 95% ethanol gedurende 4 min, xyleen gedurende 10 min, xyleen gedurende 10 min.
  17. DICHTING schuift een paar druppels afdekmedium (Inhoudsopgave) op elke weefsel glijbaan en dek af met dekglaasje.
  18. Druk op de dekslip toe om overtollig medium en luchtbellen weg te bewegen van het weefsel en uit de dekslip en lucht drogen.
  19. Evalueer en scoor de kleuringsresultaten onder omgekeerde Microscoop met een deskundige patholoog.
    Opmerking: het scorings systeem is afhankelijk van de specifieke antigenen, waarvoor al informatie in de literatuur bestaat. Indien informatie niet beschikbaar is in de literatuur, wordt een scorings systeem afgeleid met behulp van de uitdrukking van het antigeen in normaal weefsel als referentie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De studie werkstroom wordt geïllustreerd in Figuur 1. Multi-laesies (n = 13) de sequencing van 5 SPN-gevallen gericht op de coderings sequenties van 409 kanker gerelateerde genen identificeerden in totaal 27 somatische mutaties in 8 genen (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1en FGFR3). Mutaties werden gedefinieerd als oprichter/clonal wanneer ze werden gedeeld door alle laesies van een bepaalde patiënt, en progressor/subclonal bij detectie in sommige, maar niet alle laesies van een bepaalde patiënt (Figuur 5a, B). Over het algemeen waren de meeste puntmutaties die in de cohort werden geïdentificeerd, klonale gebeurtenissen, die mutaties van CTNNB1, KDM6A, TET1 en FLT1omvatte. Consequent was immunohistochemische kleuring voor β-bovenarm (proteïne product van CTNNB1) en KDM6A homogeen bij de diverse laesies van gevallen met mutaties van de corresponderende genen (Figuur 6A, B). De gematigde kleuring voor KDM6A in gemuleerde specimens suggereerde dat genetische modificatie de functie in plaats van eiwit expressie kon veranderen. KDM6A verlies van functie in pancreas tumoren wordt geassocieerd met opregulatie van de hypoxie marker GLUT18, en dienovereenkomstig GLUT1 werd overexpressie in gevallen die KDM6A mutaties (figuur 6c). Subklonale mutaties bleken van invloed te zijn op BAP1, SMAD4, TP53 en FGFR3. Immunohistochemie voor BAP1 en TP53 bevestigde dat mutaties in die genen subklonale waren (Figuur 6D, E). De CNV-analyse werd uitgevoerd met behulp van sequentie gegevens en onthulde wijzigingen in alle geanalyseerde specimens zoals weergegeven in figuur 7A. Anders dan puntmutaties waren de meeste CNV-wijzigingen subclonal (figuur 7b).

Figure 1
Figuur 1: stroomdiagram van de analyse uitgevoerd op gemetastaseerde laesies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: representatieve histologie van normale en tumorweefsels.
(a, B) Tumor weefsel (T) grenzend aan normaal weefsel (N). In deze twee weefsel secties zijn de tumor en de normale weefsels identificeerbaar als afzonderlijke en goed beperkte gebieden. C) clusters van normale pancreas cellen (N *) kunnen worden gezien als ingebed in het tumorweefsel (T). D) morfologie van normaal pancreatisch weefsel. Schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm.

Figure 3
Figuur 3: schematisch stroomschema van de stap bibliotheek voorbereiding en kwantificerings protocol.

Figure 4
Figuur 4: ionen Proton chip laden en hardlopen.
(A) spaan richting en plaatsing in de spaan klem (links). Metalen tab terug vervanging (rechts). B) Heatmaps die de dichtheid van bibliotheken in twee verschillende spaan belastingen weergeven. Voorbeeld van een goede laad dichtheid (boven) als gevolg van een geslaagde klonale versterking van Bibliotheken, resulterend in 94% laden van het spaan oppervlak met sequentiele deeltjes (139.000.000 leest, Final output 90.000.000 leest na automatische kwaliteits filtering). Voorbeeld van een slechte belasting (onder) als gevolg van een inefficiënte klonale versterking van Bibliotheken, resulterend in 40% belasting van het spaan oppervlak met sequencing deeltjes (59.000.000 leest, Final output 12.000.000 leest na automatische kwaliteits filtering).

Figure 5
Figuur 5: somatische veranderingen in gemetastaseerde laesies.
A) somatische mutaties geïdentificeerd in gecompenseerde primaire/gemetastaseerde laesies. B) het totale aantal somatische mutaties wordt per geval weergegeven, inclusief wijzigingen die worden gedeeld door alle laesies (oprichter/clonal) en die welke zijn gedetecteerd in een of meer, maar niet alle specimens voor een bepaald geval (progressor/subclonal). Het aantal individuele gemetastaseerde laesie (m) per geval wordt aangegeven. Dit cijfer is heruitgegeven uit Amato et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: immunokleuring voor β-bovendeel, KDM6A, GLUT1, BAP1 en TP53 in primaire en gemetastaseerde laesies.
A) representatieve immunohistochemische beelden die de kern accumulatie van β-bovendeel in alle specimens (primair en gemetastaseerd) vertonen uit een SPN-Lagermutatie van CTNNB1. B) immunohistochemische kleuring van laesies metastatische SPN-lager clonale mutatie van KDM6A. C) overexpressie van GLUT1 in één SPN met KDM6A mutatie, terwijl in wild type weefsel geen immunoreactiviteit werd waargenomen. (D, E) BAP1 en TP53 expressie gegevens geven aan dat de mutaties in deze twee genen subclonal zijn. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm en inzet vergroting is 600x. Dit cijfer is gewijzigd van Amato et al.8.

Figure 7
Figuur 7: somatische kopie-aantal veranderingen in gemetastaseerde laesies.
(A) de virtuele karyotype-weergave toont de locatie, nabijheid en kopie status van gewijzigde genen in een representatief geval. Het kleurenschema van chromosomale banden is de volgende: zwart en grijs = Giemsa positief, licht rood = centromere, Purple = variabel gebied. Wijzigingen worden geannoeerd volgens de kleurcodes die in de afbeelding worden weergegeven. Afkortingen: CNV, afschriftnummer variatie; P, primaire SPN; L (a-c), Levermetastasen. (B) totale somatische veranderingen (door CNV aangetaste genen) worden per geval weergegeven, inclusief wijzigingen die worden gedeeld door alle laesies (oprichter/clonal) en die zijn gedetecteerd in een of meer (maar niet alle) monsters van de specimens voor een bepaald geval (progressor/subclonal). Het aantal individuele gemetastaseerde laesie (m) per geval wordt aangegeven. Dit cijfer is heruitgegeven uit Amato et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Onze methode maakt de identificatie mogelijk van moleculaire veranderingen die betrokken zijn bij de progressie van vaste tumoren door integratie van verticale gegevens (d.w.z. morfologie, DNA-sequencing en immunohistochemie) van verschillende laesies van een bepaalde patiënt. We toonden het vermogen van onze methode voor het opsporen van klonale en subklonale gebeurtenissen in een mutatie Silent tumor type (dat wil zeggen, SPN, Solid-pseudopapillaire neoplasma van de alvleesklier) door het ondervragen van de codeer sequenties van 409 kanker relevante genen8. Een voordeel van de op amplicon gebaseerde gerichte sequentie benadering die hier wordt gebruikt, is de uniformiteit van de dekking (90% doel grondslagen zijn gedekt 100x, 95% zijn bedekt met 20x) over ondervragende gebieden (15.992) met een typische gemiddelde dekkings diepte van 1000x. Hoge diepte dekking gekoppeld aan neoplastische celverrijking via micro dissectie garandeert een hoge gevoeligheid voor de detectie van lage allel frequentie gebeurtenissen. Zoals we eerder hebben aangetoond9, de gerichte sequentie aanpak maakt het mogelijk de detectie van mutaties tot een 2% allel frequentie op DNA-monsters van ffpe weefsel. Als voorbeeld, in het huidige werk waren we in staat om een 4% allel frequentie TP53 missense mutatie te identificeren als een subklonale gebeurtenis in een gemetastaseerd monster (Figuur 5) en gevalideerd dit voorval door immunohistochemie (Figuur 6). Ons protocol voorziet in het sequentiëren van gematched tumor en kiembaan DNA om somatische gebeurtenissen te identificeren en dienovereenkomstig de valse Detectiesnelheid van subklonale mutaties van kankers-alleen pijpleiding10te verminderen. Wanneer matched kiembaan DNA niet beschikbaar is, kan men overwegen om meer conservatieve parameters in de analyse van sequentiegegevens te nemen, inclusief strenge filters op basis van minimale diepte van dekking en beperkende varianten die oproepen naar "hot-spots-mutaties" en mutaties uitgebreid geannobeerd in beschikbare databases. Het sequentiëren van kiembaan DNA naast matched tumoren heeft ook het voordeel dat het nauwkeurige detectie van Copy-Number variaties (CNV) mogelijk maakt. Als alternatief kunnen Pools van met geslacht overeenkomende diploïde genomen worden gebruikt om ruis van sequentie gegevens te verminderen en de detectie van CNV te vergemakkelijken. Naast het opnemen van kiembaan DNA, hebben we het bibliotheek protocol aangepast om de onbalans van de primer pool te verminderen en CNV-roeping te verbeteren. Volgens het oorspronkelijke protocol, de vier ampliconlengte voor temp Pools geproduceerd uit elk DNA monster na de multiplex PCR moeten worden gemengd en de resterende stappen zouden worden uitgevoerd in één buis per monster. Dit veroorzaakt echter schommelingen in de gemiddelde dekkings diepte per pool vanwege het feit dat multiplex PCR verschillende efficiëntie kan hebben in verschillende buizen. Er is geen stap van de pool kwantificering/normalisatie voor dit effect in het oorspronkelijke protocol. Om de hierboven beschreven schommelingen te voorkomen, hebben we besloten om elk van de vier ampliconlengte voor temp zwembaden gescheiden te houden in het hele bibliotheek productieprotocol, totdat ze kunnen worden gekwantificeerd. Bij kwantificering kon hetzelfde bedrag van elk van de vier Pools voor elk DNA-monster worden toegevoegd aan de uiteindelijke bibliotheek pool, zodat de uiteindelijke gemiddelde dekking zo uniform mogelijk was.

De beoordeling van intra-tumor heterogeniteit (ITH) op genetisch niveau heeft belangrijke klinische implicaties, maar vormt op dezelfde manier nieuwe uitdagingen2. Een grote uitdaging is inderdaad de noodzaak om onderscheid te maken tussen bestuurders mutaties en stochastische gebeurtenissen (d.w.z. passagiers mutaties). Het onderscheid tussen bestuurder en passagier mutaties wordt vaak uitgevoerd computationally, maar niet zonder biases. Hoewel systematische functionalisatie van gedetecteerde varianten kostbaar en tijdrovend is, kunnen functionele gevolgen van genetische varianten worden geëvalueerd, althans voor een subset van genen, door immunohistochemische analyse van het overeenkomstige eiwit of, indirect, door het meten van de expressie van surrogaat markers van eiwit dysfunctie. Ons protocol is toegepast op FFPE weefsels, dat de belangrijkste bron van materialen in de klinische setting vertegenwoordigt, maar toch uitdagingen voor sequencing vormt; de kwaliteit van geïsoleerde nucleïnezuren moet altijd worden geëvalueerd vóór de sequentie11. Hoewel gerichte sequencing het grote voordeel heeft dat ze kosteneffectief zijn en niet veeleisend zijn in termen van computervereisten, heeft dit het grote nadeel van het ondervragen van slechts een beperkt deel van het genoom, wat waarschijnlijk leidt tot een onderschat intra-tumor heterogeniteit. Bovendien overweegt deze benadering geen relevante epigenetische en transcriptomische verschillen tussen metastase en primaire tumoren die recentelijk zijn aangetoond op te wegen tegen genetische verschillen in bepaalde tumortypen4,12, 13. Men zou echter willen dat de technologische vooruitgang binnenkort de integratie van een rijkere verticale data-ensemble mogelijk maakt voor een betere beoordeling van ITH. Onze aanpak geeft de voorkeur aan diepte naar fysieke dekking van het genoom, wat ons vermogen beperkt om goede op SNV gebaseerde fylogenieën te bouwen. Toch biedt onze methode de mogelijkheid om genetische relatediteit in klinische specimens te onderzoeken met een gepaste gevoeligheid en specificiteit als gevolg van de integratie van moleculaire en histopathologische analyses. We hebben dit protocol met succes toegepast op een specifiek tumor type (bijvoorbeeld SPN) en voorspellen dat de methode op dezelfde manier zal werken op andere solide tumortypes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De studie werd gesteund door het Italiaanse kanker genoom project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana ricerca cancro (AIRC; Grant No. 12182 tot en met 18178 tot en met VC), KP7-subsidie van de Europese Gemeenschap (CAM-Pac nr. 602783 tot AS). De financierings bureaus hadden geen rol bij het verzamelen, analyseren en interpreteren van gegevens of bij het schrijven van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155, (1), 27-38 (2013).
  2. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, (4), 613-628 (2017).
  3. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458, (7239), 719-724 (2009).
  4. Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49, (3), 358-366 (2017).
  5. Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18, (1-2), 43-73 (2013).
  6. McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26, (16), 2069-2070 (2010).
  7. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29, (1), 24-26 (2011).
  8. Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247, (1), 123-134 (2019).
  9. Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9, (8), e104979 (2014).
  10. Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25, (6), 1446-1457 (2018).
  11. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8, (6), e62692 (2013).
  12. Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35, (2), 267-282 (2019).
  13. Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. (2018).
Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).More

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter