Summary
Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.
Abstract
Avaliar a heterogeneidade intratumoral (ITH) é de suma importância para antecipar o fracasso das terapias direcionadas e projetar estratégias antitumorais, portanto, eficazes. Embora as preocupações sejam freqüentemente levantadas devido a diferenças no processamento de amostras e profundidade de cobertura, o sequenciamento de tumores sólidos na próxima geração desvendou um grau altamente variável de ITH entre os tipos de tumores. A captura da relação genética entre lesões primárias e metastáticas através da identificação de populações clonais e subclonais é fundamental para o projeto de terapias para doenças em estágio avançado. Aqui, relatamos um método de análise comparativa de lesões que permite a identificação de populações clonais e subclonais entre diferentes espécimes do mesmo paciente. A abordagem experimental descrita aqui integra três abordagens bem estabelecidas: análise histológica, sequenciamento multilesário de alta cobertura e análises imunoestatísticas. A fim de minimizar os efeitos na detecção de eventos subclonais por processamento inadequado de amostras, submetemos os tecidos a examepatológico cuidadoso e enriquecimento de células neoplásticas. O DNA controlado por qualidade de lesões neoplásticas e tecidos normais foi então submetido a sequenciamento de alta cobertura, visando as regiões de codificação de 409 genes cancerígenos relevantes. Embora apenas olhando para um espaço genômico limitado, nossa abordagem permite avaliar a extensão da heterogeneidade entre alterações somáticas (mutações de nucleotídeo único e variações de número de cópia) em lesões distintas de um determinado paciente. Através da análise comparativa dos dados de sequenciamento, fomos capazes de distinguir alterações clonais versus subclonais. A maioria da ITH é frequentemente atribuída a mutações de passageiros; Portanto, também usamos imunohistoquímica para prever consequências funcionais das mutações. Embora este protocolo tenha sido aplicado a um tipo específico de tumor, prevemos que a metodologia descrita aqui é amplamente aplicável a outros tipos de tumores sólidos.
Introduction
O advento do sequenciamento da próxima geração (NGS) revolucionou a forma como os cânceres são diagnosticados e tratados1. NGS acoplado ao sequenciamento multi-regional têm exposto um alto grau de heterogeneidade intratumoral (ITH) em tumores sólidos2, o que explica em parte a falha da terapia direcionada devido à presença de subclones com sensibilidade medicamentosa diferente2 . Um desafio importante colocado pelos estudos de sequenciamento em todo o genoma é a necessidade de distinguir entre mutações de passageiros (ou seja, neutro) e motoristaem cânceres individuais3. Vários estudos têm mostrado de fato que, em certos tumores, as mutações dos passageiros são responsáveis pela maioria da ITH, enquanto as alterações do motorista tendem a ser conservadas entre lesões do mesmo indivíduo4. Também é importante notar que a grande carga mutacional (como visto em cânceres de pulmão e melanoma) não implica necessariamente uma grande carga mutacional subclonal2. Portanto, um alto grau de ITH pode ser encontrado em tumores com baixa carga mutacional.
Metástases são responsáveis por mais de 90% da morte relacionada ao câncer em todo o mundo5; Portanto, a captura da heterogeneidade mutacional dos genes condutores entre lesões primárias e metastáticas é fundamental para o projeto de terapias eficazes para doenças em estágio avançado. O sequenciamento clínico é geralmente realizado em ácidos nucleicos de tecidos fixos, o que torna a exploração em todo o genoma difícil por causa da má qualidade do DNA. Por outro lado, a intenção do sequenciamento clínico é identificar mutações e/ou mutações acionáveis que possam prever a capacidade de resposta/sem resposta a um determinado regime terapêutico. Tal como está, o sequenciamento pode ser restrito a uma fração menor do genoma para extração oportuna de informações clinicamente relevantes. A transição do perfil de DNA de baixa taxa de rendimento (por exemplo, sequenciamento de sanger) para ngs tornou possível analisar centenas de genes relevantes para o câncer em uma alta profundidade de cobertura, o que permite a detecção de eventos subclonais. Aqui, relatamos um método de análise comparativa de lesões que permite a identificação de populações clonais e subclonais entre diferentes espécimes do mesmo indivíduo. O método descrito aqui integra três abordagens bem estabelecidas (análise histológica, sequenciamento multilesário de alta cobertura e análises imunoestatísticas) para prever consequências funcionais das variações identificadas. A abordagem é descrita schemticamente na Figura 1 e tem sido aplicada ao estudo de 5 casos metastáticos de neoplasias pseudopapilares sólidos (SPNs) do pâncreas. Embora descrevamos o processamento e a análise de espécimes de tecidos embutidos em parafina (FFPE) fixados em formalina, o mesmo procedimento pode ser aplicado ao material genético do tecido fresco-congelado.
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Protocol
O material utilizado no estudo foi coletado um protocolo específico, aprovado pelo comitê de ética local. O consentimento informado escrito de todos os pacientes estava disponível.
1. Revisão histológica e imunofenotípica de espécimes de tecidos
NOTA: Um patologista especialista é responsável pelas atividades descritas a seguir.
- Revisão histopatológica de casos selecionados de acordo com critérios diagnósticos bem estabelecidos.
- Use o microtome para cortar seções grossas de tecido de 4 a 5 μm de blocos representativos de tecido saff e montar as seções em slides de histologia padrão.
- Realizar hematoxilina e eosina coloração para cada slide usando um tecido automatizado slide stainer(Tabela de Materiais).
- Reveja o diagnóstico histopatológico dos casos selecionados do tumor de acordo com critérios diagnósticos do WHO.
NOTA: Nesta fase, o patologista pode identificar áreas morfologicamente distintas do tumor dentro da mesma seção de tecido. É possível colher essas áreas separadamente (ver seção 2). A semelhança histológica do tumor e das pilhas normais para SPNs é fornecida na figura 2. - Realize manchas imunohistoquímicas para marcadores estabelecidos para complementar a análise histológica e estimar a heterogeneidade imunopofonia.
NOTA: O patologista pode identificar áreas imunofenotipicamente distintas do tumor dentro da mesma seção de tecido. É possível colher essas áreas separadamente (ver seção 2).
- Avalie a celularidade neoplástica da seção do tecido tumoral e planeje a microdissecção manual em conformidade.
NOTA: Esta é uma estimativa gerada pelo patologista da celularidade tumoral.- Se o conteúdo de células neoplásticas da seção de tecido for superior a 70%, a microdissecção manual não é obrigatória; mova-se diretamente para o passo 3.1.
NOTA: Alvo de 70% do conteúdo de células neoplásticas, a fim de (i) garantir a sensibilidade adequada para estimativas de frequência de alelo mutante e (ii) para possivelmente validar mutações clonais por metodologias menos sensíveis (por exemplo, sequenciamento capilar). - Se o conteúdo de células neoplásticas da seção de tecido é inferior a 70%, a microdissecção é necessária e passar para o passo 2.
- Se o conteúdo de células neoplásticas da seção de tecido for superior a 70%, a microdissecção manual não é obrigatória; mova-se diretamente para o passo 3.1.
- Avalie seções de tecidos do bloco FFPE onde o tecido não neoplástico foi amostrado. Este tecido é usado como uma fonte de DNA germinal.
NOTA: O sangue é uma fonte alternativa de DNA germinal. Neste caso, prossiga com a extração do ADN como recomendado na nota da etapa 4.1.- Se apenas o tecido não neoplástico é visível na seção de tecidos(Figura 2D),microdissecção manual não é necessária; mova-se diretamente para o passo 3.1.
- Se a contaminação substancial das células neoplásticas estiver presente na secção do tecido, é necessária a microdissecção manual; passar para a seção 2.
2. Microdissese manual
NOTA: Este método é aplicável a vários tipos de tumor sólidos, e destina-se a aumentar o conteúdo das células neoplásticas de espécimes de tecido. Alternativamente, este método pode ser usado para colher áreas morfologicamente e/ou imunofenotipicamente distintas dentro da mesma seção de tecido.
- Usando um microtome, corte até dez seções grossas do tecido do tumor do FFPE de 4-6 μm e monte-as em corrediças não carregadas.
NOTA: Se apenas um ninho de células cancerosas de 1 mm2 for visível no espécime, 10 slides de tecido devem ser cortados e submetidos à microdissecção manual, a fim de obter a quantidade alvo de DNA (40 ng); este supondo que 1 mm2 cluster contém entre 700 e 1000 núcleos tumorais. - Incubate desliza a 60 °C por 10 min.
- Coloque os slides em um rack, e executar as seguintes lavilhas: xileno por 20 min, 100% etanol por 10 min, 80% etanol por 10 min, 70% etanol para 10 min, água destilada por 1 min, recounterilo de hematoxilina por 10 s, água da torneira por 1 min.
- Em um microscópio invertido padrão, use uma agulha 27 G em uma seringa como a ferramenta de microdissese e coletar clusters representativos de células tumorais. Colher um mínimo de dez 1 mm2 clusters de células para garantir a quantidade necessária de DNA para sequenciamento.
NOTA: Se áreas morfologicamente distintas se destinam a ser analisadas como diferentes entidades, use a ferramenta de microdissese para colher essas áreas separadamente. - Coloque clusters colhidos em tubos de 1,5 mL(Tabela de Materiais)anteriormente preenchido com 20 μL de protease K e 180 μL de tampão de lyse(Tabela de Materiais, ambos incluídos no kit de extração de DNA) e mistura por vórtice.
3. Processamento de tecidos sem microdissese prévia
NOTA: Este procedimento é usado para blocos de tecido que contêm apenas células não neoplásticas (fonte de DNA germinal) ou contêm pelo menos 70% das células cancerosas morfologicamente homogêneas.
- Usando um microtome cortado até seis seções grossas do tecido de 4-5 μm dos blocos selecionados do tecido de FFPE. Coloque os pergaminhos de tecido em tubos de 1,5 mL, conforme descrito no passo 2.5.
4. Extração de DNA de células normais e neoplásticas
- Purificar o DNA do tecido normal e neoplástico usando o kit de extração de tecido dna FFPE(Tabela de Materiais) deacordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Quando o sangue é usado como uma fonte de ácido nucleico germinal, purificar o DNA usando um kit de extração de sangue de DNA(Mesa de Materiais). - Quantificação de DNA e verificação de qualidade
- Para quantificar a quantidade de dupla encalhada (dsDNA), adicione um alibamento da amostra de DNA a uma solução contendo uma mancha de ácido nucleico fluorescente(Tabela de Materiais)e medir a fluorescência emitida usando um fluorometer bancada (Tabela de Materiais ).
NOTA: O ensaio mede a intensidade do sinal fluorescente emitido a partir de corantes fluorescentes ligados ao dsDNA e determina a quantidade de DNA usando uma curva padrão. - Use um espectrômetro de microvolume(Tabela de Materiais)para medir as proporções 260/280 e 260/230 da amostra para qualificar o DNA. O Adn "puro" deve ter um 260/280 de 1.8 e um 260/230 na escala de 1.8-2.2.
NOTA: A avaliação espectrofotométrica da amostra destina-se a evidenciar a presença de contaminantes químicos (por exemplo, fenol) que afetam as reações a jusante. Em caso de contaminação devido a reagentes químicos, realize uma etapa de limpeza usando um kit baseado em coluna.
- Para quantificar a quantidade de dupla encalhada (dsDNA), adicione um alibamento da amostra de DNA a uma solução contendo uma mancha de ácido nucleico fluorescente(Tabela de Materiais)e medir a fluorescência emitida usando um fluorometer bancada (Tabela de Materiais ).
5. Preparação e quantificação da biblioteca
NOTA: O fluxograma esquemático de preparação da biblioteca e etapas de quantificação é relatado na Figura 3.
- Preparação da biblioteca de DNA (4 piscinas primer configuradas para cada amostra)
NOTA: As 4 piscinas primer pertencem ao painel de câncer relatado emTabela de Materiais. Cada pool contém pares primer que são projetados para uma seleção de alvo multiplexed de 409 genes. Um link para a lista de genes que compõem o painel NGS é fornecido emTabela de Materiais.- Prepare quatro reações de amplificação de dna alvo para cada amostra, uma por pool de primer. Para cada pool primer(Mesa de Materiais),adicione um tubo de 0,2 mL(Tabela de Materiais):4 μL de mix mestre (Tabela de Materiais, incluído no kit da biblioteca), 10 μL de mistura de piscina primer de alta fidelidade ( Tabela deMateriais, incluído no biblioteca do painel do câncer), e 6 μL de DNA (10 ng total).
- Amplificar regiões-alvo de cada pool primer separadamente em quatro tubos de 1,5 mL executando o seguinte programa: segure a 99 °C por 2 min (ativação da polimererase hot-start), 16 ciclos (desnaturação em 99 °C para 15 s, anneal e estender a 60 °C para 8 min) , segure a 4 °C.
NOTA: Ponto de parada. Armazenar reações de amplificação alvo em 4 °C durante a noite ou a -20 °C por mais tempo. - Digestão parcial de amplicons termina
NOTA: O manual fornecido pelo kit do fabricante NGS prevê um passo em que as diferentes reações de amplificação de cada amostra são combinadas antes da digestão parcial. Evite essa etapa e continue processando cada digestão de amplificação separadamente.- Adicione 2 μL de mix de digestão específica(Tabela de Materiais, incluído no kit da biblioteca) a cada pool amplificado de cada amostra (o volume total de cada tubo de 0,2 mL é de 22 μL). Vórtice e centrífuga cada tubo para coletar gotículas.
- Carregue os tubos no pedaleiro térmico e execute o seguinte programa: 50 °C por 10 min, 55 °C por 10 min, 60 °C por 20 min, 10 °C (por até 1 h).
NOTA: Ponto de parada. Placa de loja em -20 °C por períodos mais longos.
- Adaptadores da ligapara amplicons e purificam.
NOTA: Use um adaptador de código de barras diferente para cada amostra ao sequenciar várias bibliotecas em um único chip. Todas as quatro reações de amplificação da mesma amostra devem receber o mesmo código de barras.- Prepare adaptadores(Tabela de Materiais,kit de adaptadores de códigos de barras). Para cada código de barras X, prepare uma mistura de adaptador P1 e adaptadores de código de barras exclusivos(Tabela de Materiais)em uma diluição final de 1:4. Misture 4 μL de água com 2 μL de adaptador P1 e 2 μL de adaptadores de código de barras exclusivos. Use 2 μL desta mistura de adaptador de código de barras para passagens a jusante.
- Realizar a reação de ligadura adicionando a cada pool amplificado de cada amostra nesta ordem: 4 μL de solução de interruptor(Tabela de Materiais, incluído no kit da biblioteca), 2 μL de mixde adaptador de código de barras e 2 μL de DNA ligase (Tabela de Materiais, incluído s o kit da biblioteca) (volume total = 30 μL).
- Vórtice completamente e brevemente centrífuga para coletar gotículas.
- Carregue cada tubo no cycler térmico e funcione o seguinte programa: 22 °C para 30 min, 68 °C para 5 min, 72 °C para 5 min, 4 °C preensão (para até 24 h).
NOTA: Ponto de parada. Placa de loja em -20 °C por períodos mais longos.
- Purificação e amplificação da biblioteca
- Centrífuga de cada tubo e, em seguida, transferir cada amostra de código de barras em um tubo de 1,5 mL. Adicione 45 μL de reagente de purificação à base de contas(Tabela de Materiais)a cada pool de cada amostra. Pipet para cima e para baixo 5x para misturar a suspensão de contas com o DNA.
- Incubar a mistura por 5 min à temperatura ambiente (RT), em seguida, coloque cada tubo em um rack magnético e incubar por 2 min. Cuidadosamente remover e descartar supernatant sem perturbar a pelota.
- Adicione em cada tubo 150 μL de etanol fresco de 70%. Lave as contas movendo cada tubo de lado a lado das duas posições do ímã. Descarte o supernatant e preste atenção para não perturbar a pelota.
- Procedimentos de repetição descritos na etapa 5.1.5.3 e, em seguida, manter os tubos no ímã e secar o ar as contas em RT por 5 min.
- Remover tubos com bibliotecas purificadas de cada pool primer do ímã e adicionar 50 μL de alta fidelidade PCR Mix(Tabela de Materiais)e 2 μL de biblioteca amplificação primer mix(Tabela de Materiais, incluído no kit da biblioteca) para a pelota de contas de cada tubo.
- Vortex cada tubo de 1,5 mL e brevemente centrífuga para coletar gotículas.
- Coloque 1,5 mL tubos no ímã por 2 min e cuidadosamente transferir o supernatant (~ 50 μL) de cada tubo para um novo tubo de 0,2 mL sem perturbar a pelota.
- Amplificar as bibliotecas de cada pool de primer que executa o seguinte programa: segure a 98 °C por 2 min para ativar a enzima, 5 ciclos (desnaturação a 98 °C para 15 s, anneal e estender a 64 °C 1 min), segure-se em 4 °C. Armazenar amostras em -20 °C.
- Purificação da biblioteca amplificada
- Centrífuga de cada tubo para coletar o conteúdo na parte inferior e transferir cada amostra de biblioteca amplificada para um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 25 μL de reagente de purificação à base de contas. Pipet para cima e para baixo 5x para misturar a suspensão de contas com o DNA.
- Incubar a mistura de 5 min em RT, e depois coloque tubos no ímã por 5 min.
- Transfira cuidadosamente o supernatant, que contém os amplicons, de cada tubo para novos tubos sem perturbar a pelota.
- Adicione 60 μL de reagente de purificação à base de contas para o supernatant de cada tubo e pipet para cima e para baixo, a fim de misturar suspensão de contas e DNA.
- Incubar a mistura de 5 min em RT e, em seguida, coloque os tubos no ímã por 3 min.
- Descarte o supernatant de cada tubo e preste atenção para não perturbar a pelota.
NOTA: Os amplicons são limitados aos grânulos. - Adicione em cada tubo 150 μL de etanol fresco de 70%. Lave as contas movendo os tubos de lado a lado nas duas posições do ímã. Descarte o supernatant e preste atenção para não perturbar a pelota.
- Repita o procedimento na etapa 5.1.6.8 e ar seque as contas em RT por 3 min. Evite a secagem excessiva dos grânulos.
- Retire os tubos do ímã e adicione 50 μL de baixo Tris EDTA (TE)(Tabela de Materiais, incluído no kit da biblioteca) para a pelota para dispersar as contas.
- Pipet a mistura para cima e para baixo várias vezes e incubar em RT por 2 minutos.
- Coloque os tubos no ímã por pelo menos 2 min e transfira cuidadosamente o supernatant, que contém os amplicons, para novos tubos sem perturbar as contas.
- Quantificação da biblioteca
- Use um instrumento de análise de fragmentos(Tabela de Materiais)para executar um chip de DNA de acordo com o protocolo de kit de DNA de alta sensibilidade.
6. Bibliotecas de agrupamento e seqüenciamento executado
- Diluir cada biblioteca para 100 pM com água livre de nuclease. Combine 10 μL de cada 100 bibliotecas pM para uma única corrida em um único tubo. Misture as bibliotecas combinadas por pipetting e proceder ao templating e sequenciamento.
- Criação planejada de execução
NOTA: Uma corrida típica inclui quatro amostras que podem ser carregadas em dois tipos diferentes de chip semicondutor (chip Ion PI ou chip Ion 540) com base no sequenciador disponível em laboratório (Ion Proton System ou GeneStudio S5 System, Table of Materials). Estes sistemas produzem tipicamente 80 milhão leituras por o funcionamento.- Abra o Navegador Torrent em um computador conectado ao sistema de sequenciamento (por exemplo, Ion Chef System) e planeje uma nova execução usando o modelo genérico para o aplicativo selecionado (AmpliSeqDNA).
- Mude para a guia Kits do plano. Selecione O Sistema Ion Proton ou o Sistema Ion GeneStudio S5 da lista de desistente do instrumento com base no sistema de sequenciamento que está sendo usado.
- Dependendo do sistema de sequenciamento, selecione o chip apropriado (chip PI para Ion Proton Systems; 540 chip para Ion GeneStudio S5 Systems) da lista de desistentedo do Chip Type.
- Selecione Kit biblioteca Ion AmpliSeq 2.0 da lista de desistentes do Kit da Biblioteca.
- Selecione o botão Ion Chef para Modelo Kit, em seguida, selecione o kit chef apropriado (Ion PI Hi-Q Chef Kit para chip PI ou Ion 540 Kit-Chef para 540 chips) da lista de abandono do Kit Modelo.
- Selecione o kit de sequenciamento apropriado (Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit para chip PI ou Kit de Sequenciamento Ion S5 para 540 chips) da lista de desistentes do Kit de Sequenciamento e selecione o IonXpress da lista de desistentes do Código de Código.
- Mude para a aba Plugin e selecione o plugin análise de cobertura.
- Mude para a guia Plan. Selecione o genoma GRCh37/hg19 da lista de desistentes da Biblioteca de Referência. A partir da lista de abandono das Regiões Alvo, selecione o painel apropriado para ser sequenciado.
- Defina o número de códigos de barras a serem sequenciados e o rótulo dos tubos de amostra da biblioteca nos campos apropriados.
- Defina o nome do código de barras e o nome da amostra para cada biblioteca.
- Exemplo de diluição e carregamento das bibliotecas.
- Diluir a biblioteca de ações com água livre de nuclease para 25 pM para chip PI ou 32 pM para 540 chips.
- Pipet 50 μL de cada biblioteca diluída para a parte inferior do tubo de amostra da biblioteca apropriado.
- Ligue o sistema de sequenciamento e siga as instruções na tela para carregar todos os reagentes necessários e importar o plano de execução.
- Carregue o tubo de amostra da biblioteca contendo as bibliotecas agrupadas e inicie o programa de amplificação clonal.
NOTA: O Sistema Chef de Íons requer dois chips para serem preparados por corrida.
- Sequenciamento em Ion Proton ou Ion GeneStudio S5.
- Ligue o sistema de sequenciamento e siga as instruções na tela para inicializar o sequenciamento e importar o plano de execução.
- Carregue o chip de sequenciamento após removê-lo do sistema de sequenciamento.
NOTA: Ser aterrado antes de pegar um chip, a fim de evitar danos chip devido à descarga eletrostática. Manuseio/posicionamento de chips, juntamente com exemplos de carregamento bem-sucedido/mal sucedido, são relatados na Figura 4. - Feche a tampa do compartimento do chip e espere até que o ícone chip status indique "Pronto".
- Esvazie o recipiente de resíduos quando a primeira corrida estiver completa e, em seguida, sequencie o chip restante o mais rápido possível.
7. Mutações e variações de números de cópia (CNVs) análise
NOTA: O alinhamento dos dados de sequenciamento com o genoma de referência humana GRCh37/hg19 é automaticamente realizado uma vez definido no Plano (passo 6.2.8).
- Use a saída de plugin análise de cobertura(Tabela de Materiais)para verificar a profundidade da cobertura e uniformidade.
- Realize a variante que faz a chamada usando o plugin de chamadas variante Torrent(Tabela de Materiais),selecionando a linha germinal ou o fluxo de trabalho somático conforme apropriado.
- Baixe os arquivos variantes filtradas variantes do Formato de Chamada (VCF). Variantes de anotação usando o software6 do Variant Effect Predictor (VEP) e o banco de dados NCBI RefSeq.
- Carregue dados de sequenciamento no Software De Repórter de Íons usando o plugin de uploader do Ion Reporter e use o fluxo de trabalho de pares normal para tumores do Painel de Câncer Abrangente para analisar os dados para estimar cnvs.
- Filtrar manualmente mutações e CNVs com base nas pontuações atribuídas pelo software e verificá-las visualmente com o Visualizador Integradode Genômica (IGV)7.
- Inspecione visualmente o alinhamento para leituras incomuns (devido, por exemplo, mispriming, overamplification ou lê soft-clipping) que podem gerar chamadas artefactual.
- Verifique cnvs inspecionando a cobertura normalizada para todos os amplicons através de um determinado gene contra a cobertura normalizada da linha de base.
NOTA: Isso ajuda a corrigir chamadas falsas devido ao software de segmentação, que às vezes chama um CNV com base na cobertura simetricamente anormal de poucos amplicons no final de um gene e no início do gene sucessivo.
- Indexação de mutações somáticas
- Para cada caso, a mutação do índice chama do sequenciamento do tecido normal/sangue, do tumor preliminar e das metástases.
- Sinalizar como germinação e descartar as chamadas que também são evidentes a partir de dados de sequenciamento de DNA germinal.
- Bandeira como clonal/fundador as mutações que são compartilhadas entre todas as lesões de um determinado paciente.
- Bandeira como subclonal/progressor as mutações que são detectadas em algumas mas não em todas as lesões de um paciente dado.
8. Análise imunophenotípica: imunohistoquímica para expressão proteica relevante
NOTA: A imunohistoquímica foi usada para validar as conseqüências funcionais de inativar mutações em genes supressores tumorais.
- Usando um microtome, corte 3-4 μm de espessura seções de tecido FFPE e montá-los em slides carregados e incubar slides em 60 °C para 10 min.
- Coloque os slides em um rack, e executar os seguintes passos: xileno por 10 min, xileno por 10 min, 95% etanol para 4 min, 95% etanol para 4 min, 70% etanol para 4 min, 70% etanol para 4 min, água destilada por 4 min.
- Realizar recuperação de antígeno com base na indicação dos fabricantes de anticorpos(Tabela de Materiais).
- Coloque os slides em um rack com a solução de recuperação de antígeno específico e submergir em um banho de água em temperaturas abaixo de ebulição.
- Retire os slides do banho e executar a água da torneira para esfriar por 10 min.
- Coloque slides em um novo rack com 3% H2O2 em soro fisiológico 1x Tris-buffered (TBS) para 20 min em RT, a fim de inativar peroxidases endógenas.
- Coloque slides em um novo rack e lave 3x com TBS e 0,1% do Tween 20 (TBST).
- Use uma caneta PAP(Mesa de Materiais)para desenhar um círculo hidrofóbico em torno de tecido montado em lâmina.
- Coloque os slides em uma câmara úmida e execute o bloqueio por 1 h na RT usando 5% de albumina de soro bovina (BSA) no TBST como solução de bloqueio.
- Incubar slides com anticorpos primários(Mesa de Materiais)em uma câmara úmida durante a noite a 4 °C. Diluir o anticorpo primário com solução de bloqueio, conforme recomendado.
- Coloque slides em um novo rack e lave 3x com TBST.
- Incubar slides com anticorpos secundários específicos (anti-rato ou anti-coelho) (4-5 gotas para 1 slide) para 30 min em RT em uma câmara úmida.
- Coloque slides em um novo rack e lave 3x com TBST e depois em água destilada.
- Prepare 3,3'-diaminobenzidina (DAB) solução diluindo 1 queda em 1 mL de buffer de diluição(Tabela de Materiais). Incubate desliza máximo para 5 min verificando o microscópio.
- Use um controle positivo para calcular o tempo de incubação, seguindo o desenvolvimento da reação o microscópio.
NOTA: Cada anticorpo precisa de um tempo de incubação específico. - DAB inativo (precipitação do cromogênio do batente) submergindo corrediças na água destilada.
- Contramancha desliza, desinfundindo-os em um novo rack com hematoxilina para 10 s e depois enxaguar com água da torneira.
- Coloque os slides em um rack, e executar os seguintes passos: 70% etanol para 4 min, 70% etanol para 4 min, 95% etanol para 4 min, 95% etanol para 4 min, xileno por 10 min, xileno por 10 min.
- Seal slides colocando um par de gotas de montagem médio(Tabela de Materiais)em cada slide de tecido e cubra com coverslip.
- Aplique pressão sobre o deslizamento de cobertura, a fim de mover o excesso de bolhas de médio e ar longe do tecido e para fora do deslizamento de terra e ar seco.
- Avalie e escume os resultados de coloração microscópio invertido com um patologista especialista.
NOTA: O sistema de pontuação dependerá dos antígenos específicos, para os quais a informação na literatura pode já existir. Se a informação não estiver disponível na literatura, derivar um sistema de pontuação usando a expressão do antígeno no tecido normal como referência.
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Representative Results
O fluxo de trabalho do estudo é ilustrado na Figura 1. Múltiplas lesões (n = 13) sequenciamento de 5 casos de SPN visando as sequências de codificação de 409 genes relacionados ao câncer identificou um total de 27 mutações somáticas em 8 genes (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1,e FGFR3). As mutações foram definidas como fundador/clonal quando compartilhadas entre todas as lesões de um determinado paciente, e progressor/subclonal quando detectadas em algumas, mas não todas as lesões de um determinado paciente (Figura 5A,B). No geral, a maioria das mutações pontuais identificadas em toda a coorte foram eventos clonais, que incluíram mutações de CTNNB1, KDM6A, TET1 e FLT1. Consistentemente, a coloração imunohistoquímica para β-catenina (produto proteico do CTNNB1)e KDM6A foi homogênea entre as diversas lesões de casos com mutações dos genes correspondentes (Figura 6A,B). A coloração moderada para KDM6A em espécimes mutados sugeriu que a alteração genética era provável alterar a função um pouco do que a expressão da proteína. A perda de função de KDM6A em tumores pancreáticos está associada à upregulação do marcador de hipóxia GLUT18,e, consequentemente, a GLUT1 foi superexpressa em casos com mutações kdm6a (Figura 6C). Mutações subclonais foram encontradas para afetar BAP1, SMAD4, TP53 e FGFR3. A imunohistoquímica para BAP1 e TP53 confirmou que as mutações nesses genes eram subclonais (Figura 6D,E). A análise de variação de número de cópia (CNV) foi realizada por meio de dados de sequenciamento e revelou alterações em todos os espécimes analisados, conforme mostrado na Figura 7A. Diferentemente das mutações pontuais, a maioria das alterações do CNV foi subclonal(Figura 7B).
Figura 1: Gráfico de fluxo da análise realizada em lesões metastáticas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Histologia representativa de tecidos normais e tumorais.
(A, B) Tecido tumoral (T) adjacente ao tecido normal (N). Nestas duas seções do tecido, o tumor e os tecidos normais são identificáveis como áreas separadas e bem-confinadas. (C) Aglomerados de células pancreáticas normais (N*) podem ser vistos como embutidos no tecido tumoral (T). (D)Morfologia do tecido pancreático normal. A barra de escala representa 1 mm.
Figura 3: Fluxograma esquemático da preparação da biblioteca e passo do protocolo de quantificação.
Figura 4: Carregamento e execução de chips de prótons de íons.
(A)Chip direção e colocação na braçadeira chip (esquerda). Substituição de metal tab back (direita). (B) Heatmaps exibindo a densidade de bibliotecas em dois carregamentos de chips diferentes. Exemplo de uma boa densidade de carregamento (superior) devido a uma amplificação clonal bem-sucedida de bibliotecas, resultando no carregamento de 94% da superfície do chip com partículas de sequenciamento (139 milhões de leituras, saída final 90 milhões de leituras após filtragem automática de qualidade). Exemplo de um carregamento ruim (inferior) devido a uma amplificação clonal ineficiente de bibliotecas, resultando em 40% de carregamento da superfície do chip com partículas de sequenciamento (59 milhões de leituras, saída final 12 milhões de leituras após filtragem automática de qualidade).
Figura 5: Alterações somáticas em lesões metastáticas.
(A)Mutações somáticas identificadas em lesões primárias/metastáticas combinadas. (B) Mutações somáticas totais são exibidas por caso, incluindo alterações compartilhadas entre todas as lesões (fundador/clonal) e aquelas detectadas em um ou mais, mas não em todos os espécimes para um determinado caso (progressor/subclonal). O número de lesões metastáticas individuais (m) sequenciadas por caso é indicada. Este número foi republicado a partir de Amato et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Imunocoloring para β-catenina, KDM6A, GLUT1, BAP1 e TP53 em lesões primárias e metastáticas.
(A)Imagens imunohistoquímicas representativas que mostram acúmulo nuclear de β-catenina em todos os espécimes (primários e metastáticos) a partir de uma mutação de SPN com tom o de CTNNB1. (B)Manchaimunohistoquímica de lesões de um spn metastático com mutação clonal de KDM6A. (C)Superexpressão de GLUT1 em um SPN com mutação KDM6A, enquanto nenhuma imunoreatividade foi observada no tecido do tipo selvagem. (D, E) Os dados de expressão BAP1 e TP53 denotam que as mutações nesses dois genes são subclonais. As barras de escala representam 100 μm e a ampliação da inserção é 600X. Este número foi modificado a partir de Amato et al.8.
Figura 7: Alterações somáticas do número de cópias nas lesões metastáticas.
(A)A visão virtual do cártipo mostra o status de localização, proximidade e número de cópia de genes alterados em um caso representativo. O esquema de coloração das bandas cromossômicas é o seguinte: preto e cinza = Giemsa positivo, vermelho claro = centromere, roxo = região variável. As alterações são anotadas de acordo com os códigos de cores apresentados na figura. Abreviaturas: CNV, variação do número de cópias; P, SPN primário; L (a-c), metástases hepáticas. (B) Alterações somáticas totais (genes afetados pelo CNV) são exibidas por caso, incluindo alterações compartilhadas entre todas as lesões (fundador/clonal) e aquelas detectadas em um ou mais (mas não em todos) dos espécimes para um determinado caso (progressor/subclonal). O número de lesões metastáticas individuais (m) sequenciadas por caso é indicada. Este número foi republicado a partir de Amato et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Nosso método permite a identificação de alterações moleculares envolvidas na progressão de tumores sólidos através da integração de dados verticais (ou seja, morfologia, sequenciamento de DNA e imunohistoquímica) a partir de lesões distintas de um determinado paciente. Demonstramos a capacidade de nosso método para detectar eventos clonais e subclonais em um tipo mutacional de tumor silencioso (ou seja, SPN, neoplasia pseudopapilar sólida do pâncreas) interrogando as sequências de codificação de 409 genes relevantes para câncer8. Uma vantagem da abordagem de sequenciamento direcionada baseada em amplicon usada aqui é a uniformidade da cobertura (90% das bases-alvo são cobertas 100x, 95% são cobertas 20x) em regiões interrogadas (15.992) em uma profundidade de cobertura média típica de 1000x. Alta profundidade de cobertura acoplada ao enriquecimento de células neoplásticas por meio da microdissese garante alta sensibilidade para a detecção de eventos de baixa frequência de alelo. Como já mostramos9,a abordagem de sequenciamento direcionada permite a detecção de mutações até uma frequência de alelo de 2% em amostras de DNA do tecido FFPE. Como exemplo, no presente trabalho conseguimos identificar uma mutação insensata tp53 de frequência de alelo de 4% como um evento subclonal em um espécime metastático(Figura 5)e validamos essa ocorrência por imunohistoquímica (Figura 6). Nosso protocolo prevê o sequenciamento do DNA de tumor e linha germinal compatível, a fim de identificar eventos somáticos e, consequentemente, reduzir a falsa taxa de detecção de mutações subclonais do pipeline somente paracâncer10. Quando o DNA da linha germinal combinado não está disponível, pode-se considerar a adoção de parâmetros mais conservadores na análise de dados de sequenciamento, incluindo filtros rigorosos com base na profundidade mínima de cobertura, bem como limitar variantes que chamam a "mutações de pontos quentes" e mutações extensivamente anotadas em bancos de dados disponíveis. O sequenciamento do DNA germinal ao lado de tumores combinados também tem a vantagem de permitir a detecção precisa de variações de números de cópia (CNV). Alternativamente, grupos de genomas diploides combinados por gênero podem ser usados para reduzir o ruído dos dados de sequenciamento e facilitar a detecção de CNV. Além da inclusão do DNA germinal, modificamos o protocolo da biblioteca para reduzir o desequilíbrio do pool de primer e melhorar a chamada cnv. De acordo com o protocolo original, as quatro piscinas amplicon produzidas a partir de cada amostra de DNA após o PCR multiplex devem ser misturadas e as etapas restantes seriam realizadas em um tubo por amostra. Isto entretanto causa flutuações na profundidade média da cobertura da por-associação devido ao fato de que o PCR multiplex pode ter a eficiência diferente através dos tubos diferentes. Não houve quantificação de pool / passo de normalização para explicar esse efeito no protocolo original. Para evitar as flutuações acima descritas, decidimos manter cada uma das quatro piscinas amplicon separadas em todo o protocolo de produção da biblioteca, até que pudessem ser quantificadas. Após a quantificação, a mesma quantidade de cada uma das quatro piscinas para cada amostra de DNA poderia ser adicionada ao pool final da biblioteca, garantindo que a cobertura média final fosse o mais uniforme possível.
A avaliação da heterogeneidade intratumoral (ITH) a nível genético tem implicações clínicas importantes, mas da mesma forma coloca novos desafios2. Um grande desafio é, de fato, a necessidade de distinguir entre mutações de motorista e eventos estocásticos (ou seja, mutações de passageiros). A distinção entre mutações de motorista e passageiro é muitas vezes realizada computacionalmente, mas não sem vieses. Embora a funcionalização sistemática de variantes detectadas seja cara e demorada, as consequências funcionais das variantes genéticas podem ser avaliadas, pelo menos para um subconjunto de genes, por análise imunohistoquímica da proteína correspondente ou, indiretamente, medindo a expressão de marcadores substitutos de disfunção proteica. Nosso protocolo foi aplicado aos tecidos da FFPE, o que representa a principal fonte de materiais no ambiente clínico, mas colocando desafios para o sequenciamento; qualidade de ácidos nucleicos isolados deve sempre ser avaliada antes do sequenciamento11. Embora o sequenciamento direcionado tenha a maior vantagem de ser econômico e não altamente exigente em termos de requisitos computacionais, ele tem a maior desvantagem de interrogar apenas uma parte limitada do genoma, o que provavelmente leva a subestimar heterogeneidade intratumoral. Além disso, essa abordagem não está considerando diferenças epigenéticas e transcriptômicas relevantes entre metástase e tumores primários que recentemente se mostraram superar as diferenças genéticas em certos tiposde tumor4,12, 13. No entanto, seria de se prever que os avanços tecnológicos em breve permitirão a integração de um conjunto de dados verticais mais rico para uma melhor avaliação da ITH. Nossa abordagem prefere profundidade à cobertura física do genoma, o que limita nossa capacidade de construir filogenias adequadas baseadas em SNV. No entanto, nosso método oferece a oportunidade de explorar a relação genética em espécimes clínicos com sensibilidade e especificidade adequadas devido à integração de análises moleculares e histopatológicas. Aplicamos com sucesso esse protocolo em um tipo específico de tumor (por exemplo, SPN) e prevemos que o método funcionará da mesma forma em outros tipos de tumores sólidos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado pelo Projeto Genoma do Câncer Italiano (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Subvenção nº 12182 à AS e 18178 ao VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 à AS). As agências de financiamento não tiveram nenhum papel na coleta, análise e interpretação de dados ou na redação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | - | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | - | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | - | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software - uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | - | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | - | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | - | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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