Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

Сравнительный анализ поражений с помощью целевого подхода к секвенированию

doi: 10.3791/59844 Published: November 5, 2019

Summary

В этой статье описывается метод выявления клональных и субклональных изменений между различными образцами от данного пациента. Хотя описанные здесь эксперименты сосредоточены на определенном типе опухоли, этот подход в целом применим к другим твердым опухолям.

Abstract

Оценка внутриопухолевой неоднородности (ITH) имеет первостепенное значение для прогнозирования отказа целевых методов лечения и разработки соответственно эффективных противоопухолевых стратегий. Хотя опасения часто возникают из-за различий в обработке образцов и глубине покрытия, последовательность твердых опухолей следующего поколения распутала весьма изменчивую степень ITH по типам опухолей. Захват генетической родственности между первичными и метастатическими поражениями путем выявления клональных и субклональных популяций имеет решающее значение для разработки методов лечения заболеваний на запредлечных стадиях. Здесь мы сообщаем о методе анализа сравнительных поражений, который позволяет идентифицировать клональные и подклональные популяции между различными образцами одного и того же пациента. Описанный здесь экспериментальный подход объединяет три хорошо зарекомендовавших себя подхода: гистологический анализ, секвенирование с высоким уровнем поражения и иммунофенотипический анализ. Для того, чтобы свести к минимуму воздействие на обнаружение субклональных событий путем неправильной обработки образцов, мы подвергли ткани тщательному патологическому исследованию и обогащению неопластических клеток. Контрольная качественная ДНК от неопластических поражений и нормальных тканей была затем подвергнута высокому секвенированию покрытия, ориентируясь на области кодирования 409 соответствующих генов рака. Рассматривая только ограниченное геномное пространство, наш подход позволяет оценить степень неоднородности между соматическими изменениями (однонуклеотидные мутации и вариации числа копий) в различных поражениях от данного пациента. Благодаря сравнительному анализу данных секвенирования мы смогли различать клональные и субклональные изменения. Большинство ITH часто приписывают пассажирские мутации; Поэтому мы также использовали иммуногистохимию для прогнозирования функциональных последствий мутаций. Хотя этот протокол был применен к определенному типу опухоли, мы ожидаем, что описанная здесь методология в целом применима к другим твердым типам опухолей.

Introduction

Появление следующего поколения секвенирования (NGS) революционизировал способ рака диагностируется и лечится1. NGS в сочетании с межрегиональным секвенированием выявили высокую степень внутриопухолевой неоднородности (ITH) в твердых опухолях2, что частично объясняет провал целевой терапии из-за присутствия субклонов с различной чувствительностью к лекарственным препаратам2 . Важной проблемой, поставленной в ходе исследований секвенирования генома, является необходимость проведения различия между мутациями пассажира (т.е. нейтрального) и драйвера при индивидуальных раковых заболеваниях3. Несколько исследований действительно показали, что при некоторых опухолях, пассажирские мутации составляют большинство ITH, в то время как изменения водителя, как правило, сохраняются среди поражений одного и того же человека4. Важно также отметить, что большая мутационная нагрузка (как это видно при раке легких и меланоме) не обязательно подразумевает большое субклональное бремя мутаций2. Таким образом, высокая степень ITH может быть найдена в опухолях с низкой мутационной нагрузкой.

Метастаза являются причиной более 90% смертей, связанных с раком во всем мире5; Поэтому, захват мутационной неоднородности генов драйверов среди первичных и метастатических поражений имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения заболеваний на поздних стадиях. Клиническое секвенирование обычно проводится на нуклеиновых кислотах из фиксированных тканей, что затрудняет исследование генома из-за низкого качества ДНК. С другой стороны, цель клинического секвенирования заключается в выявлении действенных мутаций и/или мутаций, которые могут предсказать отзывчивость/безответственность к данному терапевтическому режиму. В его нынешнем виде секвенирование может быть ограничено меньшей долей генома для своевременной извлечения клинически релевантной информации. Переход от профилирования ДНК с низкой пропускной способностью (например, Секвенирование Сэнгера) к NGS позволил проанализировать сотни генов, имеющих отношение к раку, на высокой глубине охвата, что позволяет выявлять субклональные события. Здесь мы сообщаем о методе анализа сравнительных поражений, который позволяет идентифицировать клональные и подклональные популяции между различными образцами одного и того же человека. Описанный здесь метод объединяет три хорошо зарекомендовавших себя подхода (гистологический анализ, секвенирование с высоким уровнем охвата и иммунофенотипический анализ) для прогнозирования функциональных последствий выявленных вариаций. Этот подход схематично описан на рисунке 1 и применяется к изучению 5 метастатических случаев твердых псевдопапиллярных неоплазм (SPNs) поджелудочной железы. В то время как мы описываем обработку и анализ формалина-фиксированного парафина-встроенных (FFPE) образцов ткани, та же процедура может быть применена к генетическому материалу из свежезамороженной ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Материалы, использованные в исследовании, были собраны в соответствии с конкретным протоколом, который был одобрен местным комитетом по этике. Было получено письменное информированное согласие всех пациентов.

1. Гистологический и иммунофенотипический пересмотр образцов тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперт-патологоанатом отвечает за деятельность, описанную в дальнейшем.

  1. Гистопатологический пересмотр отдельных случаев в соответствии с устоявшимися диагностическими критериями.
    1. Используйте микротом, чтобы вырезать 4'5 мкм толстые участки ткани из репрезентативных блоков ткани FFPE и смонтировать разделы на стандартных гистологических слайдов.
    2. Выполните гематоксилин и эозина окрашивания для каждого слайда с помощью автоматизированного пятна слайд ткани (Таблица материалов).
    3. Обзор гистопатологического диагноза выбранных случаев опухоли в соответствии с диагностическими критериями ВОЗ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, патологоанатом может определить морфологически различных областях опухоли в рамках одного и того же раздела ткани. Можно собирать эти участки отдельно (см. раздел 2). Гистологическое сходство опухоли и нормальных клеток для SPN предусмотрено на рисунке 2.
    4. Выполните иммуногистохимическое окрашивание установленных маркеров в дополнение к гистологическому анализу и оценке иммунофенотипической неоднородности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Патологоанатом может определить иммунофенотипически различных областях опухоли в рамках одного и того же раздела ткани. Можно собирать эти участки отдельно (см. раздел 2).
  2. Оцените неопластическую клеточность секции опухолевой ткани и спланируйте ручной микродиссекцию соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это патологоанатом генерируемых оценка опухолевой клеточной.
    1. Если содержание неопластических клеток в секции тканей превышает 70%, то ручной микрорассеификация не является обязательной; перейти непосредственно к шагу 3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель 70% неопластического содержания клеток для того, чтобы (i) обеспечить адекватную чувствительность для мутантов аллельных частотных оценок и (ii) возможно проверить клональные мутации менее чувствительными методологиями (например, секвенирование капилляров).
    2. Если содержание неопластических клеток в секции тканей ниже 70%, необходимо микрорассечение и перейти к шагу 2.
  3. Оцените участки тканей из блока FFPE, где ненеопластическая ткань была отобрана. Эта ткань используется в качестве источника зародышевой ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь является альтернативным источником зародышевой ДНК. В этом случае, приступить к извлечению ДНК в качестве рекомендации в записке шаг 4.1.
    1. Если в разделе тканей видна только неоопластическая ткань(рисунок 2D),то ручная микрорассеяция не требуется; перейти непосредственно к шагу 3.1.
    2. Если существенное загрязнение от неопластических клеток присутствует в разделе ткани, то требуется ручной микрорассеификация; перейти на раздел 2.

2. Ручная микродиссекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим к различным типам твердых опухолей, и он предназначен для увеличения содержания неопластических клеток образцов тканей. Кроме того, этот метод может быть использован для сбора морфологически и / или иммунофенотипически различных областях в рамках одного и того же раздела ткани.

  1. Используя микротом, разрежьте до десяти секций опухолевой ткани FFPE толщиной 4,6 мкм и смонтируй их на незаряженных слайдах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если только одно 1 мм2 гнезда раковых клеток видно в образце, 10 тканей слайды должны быть сокращены и подвергнуты ручной микродиссекции для того, чтобы получить целевое количество ДНК (40 нг); это при условии, что 1 мм2 кластера содержит от 700 до 1000 ядер опухоли.
  2. Инкубировать слайды при 60 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
  3. Поместите горки в стойку и выполните следующие стишки: ксилен на 20 мин, 100% этанол в течение 10 мин, 80% этанола в течение 10 мин, 70% этанола в течение 10 мин, дистиллированная вода на 1 мин, гематоксилин контрпятно на 10 с, водопроводная вода на 1 мин.
  4. На стандартном перевернутом микроскопе используйте 27 G иглу на шприце в качестве инструмента микродиссекции и соберите репрезентативные кластеры опухолевых клеток. Урожай не менее десяти 1 мм2 кластеров клеток для обеспечения необходимого количества ДНК для секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если морфологически различные области предназначены для анализа в качестве различных сущностей, а затем использовать инструмент микродиссекции для сбора этих областей отдельно.
  5. Поместите собранные кластеры в 1,5 мл трубок(Таблица материалов) ранее заполнены с 20 зл и 180 Л буфера лисиса(Таблица материалов, как включены в комплект экстракции ДНК) и смешать путем вихря.

3. Обработка тканей без предварительного микрорассечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура используется для тканевых блоков, которые содержат только ненеопластические клетки (источник зародышевой ДНК) или содержат по крайней мере 70% морфологически однородных раковых клеток.

  1. С помощью микротома вырезать до шести 4'5 мкм толстых секций ткани из выбранных блоков ткани FFPE. Поместите свитки ткани в трубки 1,5 мл, как описано в шаге 2.5.

4. Извлечение ДНК из нормальных и неопластических клеток

  1. Очистите ДНК от нормальной и неопластической ткани с помощью комплекта экстракции ткани ДНК FFPE(Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда кровь используется в качестве источника зародышевой нуклеиновой кислоты, очистить ДНК с помощью комплекта экстракции крови ДНК (Таблица материалов).
  2. Количественная оценка ДНК и проверка качества
    1. Для количественной оценки количества двухцепочечного (dsDNA), добавьте аликот образца ДНК в раствор, содержащий флуоресцентное окретное окноду нуклеиновой кислоты(Таблица материалов)и измерьте испускаемую флюоресценцию с помощью фторметра скамейки(Таблица материалов ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ измеряет интенсивность флуоресцентного сигнала, испускаемого из флуоресцентных красителей, прикрепленных к dsDNA, и определяет количество ДНК с помощью стандартной кривой.
    2. Используйте микротом ный спектрофотометр(Таблица материалов)для измерения соотношений образца 260/280 и 260/230 для того, чтобы квалифицировать ДНК. "Чистая" ДНК должна иметь 260/280 из 1,8 и 260/230 в диапазоне 1,8-2,2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спектрофотометрическая оценка образца предназначена для доказательства наличия химических загрязнителей (например, фенола), которые влияют на реакции вниз по течению. В случае загрязнения химическими реагентами выполните этап очистки с помощью комплекта на основе столбцов.

5. Подготовка и количественная оценка библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая диаграмма подготовки библиотеки и квантификации шагов сообщается на рисунке 3.

  1. Подготовка библиотеки ДНК (4 грунтовых пула, созданных для каждого образца)
    ПРИМЕЧАНИЕ: 4 грунтовки бассейны принадлежат к раку панели сообщили вТаблица материалов. Каждый пул содержит грунтовые пары, предназначенные для мультиплексного целевого выбора из 409 генов. Ссылка на список генов, составляющих панель NGS, приведена вТаблица материалов.
    1. Подготовьте четыре реакции на усиление ДНК для каждого образца, по одному на пул праймера. Для каждого грунтового пула (Таблица материалов), добавить в 0,2 мл трубки (Таблица материалов: 4 л мастер-микс (Таблица материалов, включенных в библиотечный комплект), 10 л высокой точности грунтовки бассейн смеси (Таблица материалов, включенных в рак панели библиотеки), и 6 зЛ ДНК (10 нг всего).
    2. Усильте целевые области каждого грунтового бассейна отдельно в четырех трубках длиной 1,5 мл, выполняющих следующую программу: удерживайте при 99 кв.м. в течение 2 мин (активация горячего старта полимераза), 16 циклов (денатурнатура при 99 кв. м на 15 с, аннальивная и протягивайте при 60 градусах по Цельсию в течение 8 мин) , удерживайте при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остановка точки. Храните целевые реакции усиления при 4 градусах Цельсия на ночь или при -20 градусов в течение более длительного времени.
    3. Частичное переваривание ампронов заканчивается
      ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство, предоставленное комплектом производителя NGS, предусматривает шаг, в котором различные реакции усиления из каждого образца объединяются до частичного пищеварения. Избегайте этого шага и продолжайте обрабатывать каждое пищеварение усиления отдельно.
      1. Добавьте 2 злицита специфического смеси пищеварения(Таблица материалов,включенных в библиотечный набор) к каждому усиленному пулу каждого образца (общий объем каждой трубки 0,2 мл составляет 22 л). Vortex тщательно и центрифуги каждой трубки для сбора капель.
      2. Загрузите трубки в тепловой циклик и запустите следующую программу: 50 градусов по Цельсию в течение 10 мин, 55 градусов по Цельсию в течение 10 мин, 60 градусов по Цельсию в течение 20 мин, 10 градусов по Цельсию (на срок до 1 ч).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Остановка точки. Хранить тарелку при -20 градусах по Цельсию в течение более длительных периодов.
    4. Гибкие адаптеры ligate для ампликонов и очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте другой адаптер штрих-кода для каждого образца при секвенировании нескольких библиотек на одном чипе. Все четыре реакции усиления из одного образца должны получить один и тот же штрих-код.
      1. Подготовка адаптеров(Таблица материалов, набор адаптеров штрих-кодов). Для каждого штрих-кода X, подготовить смесь P1 адаптер и уникальные адаптеры штрих-кода (Таблица материалов) на окончательное разбавление 1:4. Смешайте 4 злицы воды с 2 юл адаптера P1 и 2 Зл уникальных адаптеров штрих-кода. Используйте 2 злицы этого адаптера штрих-кода для проходов вниз по течению.
      2. Выполните реакцию перевязки, добавляя к каждому усиленному пулу каждого образца в этом порядке: 4 злику коммутатора(Таблица материалов,включенных в библиотечный комплект), 2 злицита адаптера штрих-кода и 2 Зла ДНК-лигазы(Таблица материалов, включенных в библиотечный комплект) (общий объем - 30 евро).
      3. Вихрь тщательно и кратко центрифуги для сбора капель.
      4. Загрузите каждую трубку в тепловой циклизатор и запустите следующую программу: 22 градуса по Цельсию в течение 30 мин, 68 градусов по Цельсию в течение 5 мин, 72 кв. м в течение 5 мин, 4 градуса по Цельсию (до 24 ч).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Остановка точки. Хранить тарелку при -20 градусах по Цельсию в течение более длительных периодов.
    5. Очистка и усиление библиотеки
      1. Centrifuge каждой трубки, а затем передать каждый штрих-код образца в 1,5 мл трубки. Добавьте 45 qL реагента очистки на основе бисера(Таблица материалов)к каждому пулу каждого образца. Pipet вверх и вниз 5x смешать подвеску биса с ДНК.
      2. Инкубировать смесь в течение 5 минут при комнатной температуре (RT), затем поместите каждую трубку в магнитную стойку и инкубировать в течение 2 мин. Тщательно удалить и отбросить супернатант, не нарушая гранулы.
      3. Добавьте в каждую трубку по 150 л свежего этанола. Вымойте бусины, движущиеся каждой трубкой из стороны в сторону от двух положений магнита. Откажитесь от супернатанта и обратите внимание, чтобы не беспокоить гранулы.
      4. Повторите процедуры, описанные в шаге 5.1.5.3, а затем держать трубки в магните и воздушно-сухой бусы на RT в течение 5 минут.
      5. Удалите трубки с очищенными библиотеками каждого грунтового бассейна из магнита и добавьте 50 злификаторов высокой точности PCR Mix(Таблица материалов)и 2 Зл библиотечного грунтового микса(Таблица материалов, включенных в библиотечный комплект) к гранулы из бисера каждой трубки.
      6. Vortex каждая трубка 1,5 мл и кратко центрифуга для сбора капель.
      7. Поместите 1,5 мл труб в магнит в течение 2 мин и осторожно перенесите супернатант (50 л) из каждой трубки в новую трубку 0,2 мл, не нарушая гранулы.
      8. Усильте библиотеки каждого грунтового бассейна, выполняемого по следующей программе: удерживайте при 98 градусах по Цельсию в течение 2 минут, чтобы активировать фермент, 5 циклов (денатурации при 98 градусах по Цельсию на 15 с, аннеал и расширяйте при 64 кв 1 мин), удерживайте при 4 градусах по Цельсию. Храните образцы при -20 градусах По Цельсию.
    6. Очистка усиленной библиотеки
      1. Centrifuge каждую трубку, чтобы собрать содержимое в нижней части и передать каждый усиленный образец библиотеки в трубку 1,5 мл.
      2. Добавьте 25 злифика реагента на основе очищения на основе бисера. Pipet вверх и вниз 5x смешать подвеску биса с ДНК.
      3. Инкубировать смесь в течение 5 минут на RT, а затем поместить трубки в магнит в течение 5 минут.
      4. Тщательно перенесите супернатант, который содержит ампиконы, из каждой трубки в новые трубки, не нарушая гранулы.
      5. Добавьте 60 зЛ реагента на основе бисера для очистки в супернатант каждой трубки и пайпет вверх и вниз, чтобы смешать подвеску бисера и ДНК.
      6. Инкубировать смесь в течение 5 минут на RT, а затем поместить трубки в магнит в течение 3 мин.
      7. Откажитесь от супернатанта с каждой трубки и обратите внимание, чтобы не беспокоить гранулы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ампелоны привязаны к бисеру.
      8. Добавьте в каждую трубку по 150 л свежего этанола. Вымойте бусины, перемещающие трубки из стороны в сторону в двух положениях магнита. Откажитесь от супернатанта и обратите внимание, чтобы не беспокоить гранулы.
      9. Повторите процедуру в шаге 5.1.6.8 и просушите шарики воздуха на RT в течение 3 мин. Избегайте чрезмерной сушки бисера.
      10. Удалите трубки из магнита и добавьте 50 зл и с низким Tris EDTA (TE)(Таблица материалов,включенных в библиотечный комплект) в гранулы для разгона бисера.
      11. Пайпет смесь вверх и вниз несколько раз и инкубировать на RT в течение 2 минут.
      12. Поместите трубки в магнит, по крайней мере 2 мин и тщательно передать супернатант, который содержит ампиконы, на новые трубы, не нарушая бисера.
  2. Количественная оценка библиотеки
    1. Используйте инструмент анализа фрагментов(Таблица материалов)для запуска чипа ДНК в соответствии с протоколом высокой чувствительности ДНК комплект.

6. Объединение библиотек и секвенирование библиотек

  1. Разбавить каждую библиотеку до 100 pM с нуклеазой свободной воды. Объедините 10 юртей из каждой 100 pM библиотек для одного запуска в одной трубке. Смешайте комбинированные библиотеки путем пипетки и приступите к шаблонированию и секвенированию.
  2. Запланированное создание запуска
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный запуск включает в себя четыре образца, которые могут быть загружены на два различных типа полупроводниковых чипов (чип Ion PI или чип Ion 540) на основе секвенсора, доступного в лаборатории (Ion Proton System или GeneStudio S5 System, Таблица материалов). Эти системы обычно производят 80 миллионов считываемых за пробег.
    1. Откройте Torrent Browser на компьютере, подключенном к системе секвенирования (например, ion Chef System) и запланируйте новый запуск с использованием общего шаблона для выбранного приложения (AmpliSeqDNA).
    2. Переключитесь на вкладку Наборы плана. Выберите Ion Proton System или Ion GeneStudio S5 System из списка отбрасывания приборов на основе используемой системы секвенирования.
    3. В зависимости от системы секвенирования выберите подходящий чип (чип PI для Ion Proton Systems; 540 чипов для Ion GeneStudio S5 Systems) из списка отсеивания типа чипа.
    4. Выберите набор библиотекI-библиотеки Ion AmpliSeq 2.0 из списка выпадающих наборов библиотек.
    5. Выберите кнопку Ion Chef для комплекта шаблонов, а затем выберите подходящий комплект шеф-повара (Ion PI Hi-я chef Kit для чипа PI или Ion 540 Kit-Chef для 540 чипов) из списка выпадающих наборов шаблонов.
    6. Выберите подходящий комплект для секвенирования (Ion PI Hi-я Sequencing 200 Kit для чипа PI или Набор для sequencing для 540 chip) из списка выпадающих наборов Sequencing Kit, а затем выберите IonXpress из списка отбрасывания Mcode Set.
    7. Переключитесь на вкладку Plugin и выберите плагин анализа покрытия.
    8. Переключитесь на вкладку План. Выберите геном GRCh37/hg19 из списка выпадающих справочных библиотек. Из списка целевых регионов выберите соответствующую панель для секвенирования.
    9. Установите количество штрих-кодов для секвенирования и этикетку библиотечных проб трубок в соответствующие поля.
    10. Установите имя штрих-кода и название образца для каждой библиотеки.
  3. Разбавление и загрузка библиотек образцов.
    1. Разбавить фондовой библиотеки с нуклеайза воды до 25 pM для чипа PI или 32 pM для 540 чип.
    2. Pipet 50 л каждой разбавленной библиотеки на дно соответствующей трубки образца библиотеки.
    3. Включите систему секвенирования и следуйте инструкциям на экране, чтобы загрузить все необходимые реагенты и импортировать план выполнения.
    4. Загрузите образец библиотеки трубки, содержащей объединенные библиотеки и начните программу клонального усиления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система Ионшефа требует двух фишек, которые должны быть подготовлены за пробег.
  4. Секвенирование на Ион протон или Ион GeneStudio S5.
    1. Включите систему секвенирования и следуйте инструкциям на экране, чтобы инициализировать секвенирование и импортировать план выполнения.
    2. Загрузите чип секвенирования после удаления его из системы секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте заземлены, прежде чем забрать чип, чтобы избежать повреждения чипа из-за электростатического разряда. Обработка/позиционирование чипов наряду с примерами успешной/неудачной загрузки приведены в рисунке 4.
    3. Закройте крышку отсека чипа и подождите, пока значок состояния чипа не упомянет "Готов".
    4. Освободите контейнер для отходов, когда первый запуск будет завершен, а затем последовательность оставшегося чипа как можно скорее.

7. Анализ мутаций и вариаций числа копий (CNV)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание данных секвенирования с геномом ДНК GRCh37/hg19 человека автоматически выполняется после установки в Плане (шаг 6.2.8).

  1. Используйте плагин анализа покрытия(Таблица материалов)выход для проверки глубины покрытия и единообразия.
  2. Выполните вариант вызова с помощью плагина вызывающего абонента варианта Torrent (Таблица материалов), выбрав зародышевой или соматический рабочий процесс по мере необходимости.
  3. Скачать отфильтрованные варианты Variant Call Format (VCF) файлы. Аннотировать варианты с использованием программного обеспечения Variant Effect Predictor (VEP)6 и базы данных NCBI RefSeq.
  4. Загрузите данные по секвенированию на Программное обеспечение Ion Reporter с помощью плагина для загрузчика Ion Reporter и используйте комплексный цикл опухолей для опухоли, нормального парного процесса, для анализа данных для оценки CNV.
  5. Ручно фильтруйте мутации и CNV на основе баллов, назначенных программным обеспечением, и визуально проверяйте их с помощью интегративной genomics Viewer (IGV)7.
    1. Визуально проинспектируйте выравнивание на наличие необычных считывателей (из-за, например, неправильного, чрезмерного усиления или чтения мягкой обрезки), которые могут генерировать артефальные вызовы.
    2. Проверить CNVs путем проверки нормализованного покрытия для всех ампиконов через данный ген против нормализованного покрытия базового.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это помогает исправить ложные вызовы из-за сегментации программного обеспечения, которое иногда вызывает CNV на основе симметрично ненормальное покрытие нескольких ампронов в конце одного гена и в начале последовательного гена.
  6. Индексирование соматических мутаций
    1. Для каждого случая, индекс мутации звонки от секвенирования нормальной ткани / крови, первичной опухоли и метастазов.
    2. Пометить как зародышевой линии и отказаться от вызовов, которые также очевидны из последовательности данных зародышевой ДНК.
    3. Пометить как клональный / основатель мутаций, которые разделяют между всеми поражениями данного пациента.
    4. Пометить как подклональные / прогрессор мутации, которые обнаруживаются в некоторых, но не все поражения данного пациента.

8. Иммунофенотипический анализ: иммуногистохимия для релевантного экспрессии белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимия была использована для проверки функциональных последствий инактивации мутаций в генах супрессоров опухоли.

  1. Используя микротом, вырезать 3'4 мкм толщиной FFPE ткани разделов и смонтировать их на заряженных слайдов и инкубировать слайды на 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
  2. Поместите горки в стойку и выполните следующие шаги: ксилен в течение 10 мин, ксилен на 10 мин, 95% этанола в течение 4 мин, 95% этанола в течение 4 мин, 70% этанола в течение 4 мин, 70% этанола в течение 4 мин, дистиллированная вода в течение 4 мин.
  3. Выполните извлечение антигена на основе указаний производителей антител(Таблица материалов).
    1. Поместите горки в стойку со специфическим раствором извлечения антигена и погрузите в водяную ванну при температуре подкипания.
    2. Удалите горки из ванны и запустить водопроводную воду, чтобы остыть в течение 10 минут.
  4. Поместите слайды в новую стойку с 3% H2O2 в 1x Tris-буферный солен (TBS) в течение 20 минут на RT для того, чтобы инактивировать эндогенные перекисты.
  5. Поместите слайды в новую стойку и мыть 3x с TBS и 0,1% от Tween 20 (TBST).
  6. Используйте ручку PAP(Таблица материалов) для рисования гидрофобного круга вокруг слайд-установленной ткани.
  7. Поместите слайды во влажную камеру и выполните блокировку в течение 1 ч на RT, используя 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в TBST в качестве блокирующего решения.
  8. Инкубировать слайды с первичными антителами (Таблица материалов) во влажной камере на ночь при 4 градусах Цельсия. Разбавить первичные антитела блокирующим раствором в соответствии с рекомендацией.
  9. Поместите слайды в новую стойку и мыть 3x с TBST.
  10. Инкубировать слайды с конкретными вторичными антителами (анти-мышь или анти-кролик) (4'5 капель на 1 слайд) в течение 30 минут на RT во влажной камере.
  11. Место слайды в новую стойку и мыть 3x с TBST и после в дистиллированной воде.
  12. Подготовка 3,3'-диаминобензидин (DAB) раствор разбавления 1 капля в 1 мл буфера разбавления (Таблица материалов). Инкубировать слайды максимум за 5 минут проверки под микроскопом.
  13. Используйте положительный контроль для расчета времени инкубации, следуя развитию реакции под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое антитело нуждается в определенном времени инкубации.
  14. Неактивный DAB (остановка хромогенных осадков) путем погружения слайдов в дистиллированную воду.
  15. Счетчик слайды, погружая их в новую стойку с гематоксилином в течение 10 с, а затем промыть водопроводной водой.
  16. Поместите горки в стойку и выполните следующие шаги: 70% этанола в течение 4 мин, 70% этанола в течение 4 мин, 95% этанола в течение 4 мин, 95% этанола в течение 4 мин, ксилен на 10 мин, ксилен в течение 10 мин.
  17. Уплотнение слайды положить пару капель монтажа среды (Таблица материалов) на каждой ткани слайд и крышка с крышкой.
  18. Нанесите давление на покрывало, чтобы переместить излишки средних и воздушных пузырьков от ткани и из coverslip и высохнуть воздуха.
  19. Оценить и оценка результаты окрашивания под перевернутым микроскопом с экспертом патологоанатома.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система подсчета очков будет зависеть от конкретных антигенов, для которых информация в литературе может уже существовать. Если информация не доступна в литературе, получить скоринг системы с использованием выражения антигена в нормальной ткани в качестве эталона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рабочий процесс исследования иллюстрируется на рисунке 1. Многопоражения (n No 13) секвенирование 5 случаев SPN, нацеленных на последовательности кодирования 409 генов, связанных с раком, выявили в общей сложности 27 соматических мутаций в 8 генах(CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1, и FGFR3). Мутации были определены как основатель / клональный, когда разделяют между всеми поражениями данного пациента, и прогрессор / subclonal при обнаружении в некоторых, но не все поражения данного пациента (Рисунок 5A, B). В целом, большинство точек мутаций, выявленных в когорте были клональные события, которые включали мутации CTNNB1, KDM6A, TET1, и FLT1. Последовательно, иммуногистохимическое окрашивание для q-катенин (белковый продукт CTNNB1) и KDM6A был однородным среди разнообразных поражений случаев с мутациями соответствующих генов (Рисунок 6A, B). Умеренное окрашивание KDM6A в мутировавших образцах свидетельствует о том, что генетическое изменение, скорее всего, изменит функцию, а не экспрессию белка. KDM6A потеря функции в опухолях поджелудочной железы связано с upregulation гипоксии маркер GLUT18, и, соответственно GLUT1 был перевыражен в случаях, несущих kDM6A мутаций(Рисунок 6C). Было установлено, что субклональные мутации влияют на BAP1, SMAD4, TP53 и FGFR3. Иммуногистохимия для BAP1 и TP53 подтвердила, что мутации в этих генах были субклональными(рисунок 6D,E). Анализ вариации копирования (CNV) был проведен с использованием данных секвенирования и выявил изменения во всех образцах, проанализированных на рисунке 7A. По-разному от перегласовок точек, большинство изменений CNV были subclonal(рисунок 7B).

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма потока анализа, проведенного на метастатических поражениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представительная гистология нормальных и опухолевых тканей.
(A, B) Опухолевые ткани (T) рядом с нормальной тканью (N). В этих двух секциях тканей, опухоль и нормальные ткани идентифицируются как отдельные и хорошо ограниченные области. (C) Кластеры нормальных клеток поджелудочной железы (НЗ) можно рассматривать как встроенные в ткани опухоли (T). (D) Морфология нормальной ткани поджелудочной железы. Шкала бар представляют 1 мм.

Figure 3
Рисунок 3: Схематическая диаграмма потока шага шага подготовки библиотеки и шага протокола количественной оценки.

Figure 4
Рисунок 4: Ионно-протонный чип нагрузки и работает.
( A ) Направлениечипаи размещение в зажим чипа (слева). Замена металлической вкладки (справа). (B) Тепловые карты, отображающие плотность библиотек в двух различных загрузках чипов. Пример хорошей плотности загрузки (вверху) из-за успешного клонального усиления библиотек, что привело к 94% загрузке поверхности чипа секвенированием частиц (139 миллионов считывается, окончательный выход 90 миллионов считывает после автоматической фильтрации качества). Пример плохой загрузки (внизу) из-за неэффективного клонального усиления библиотек, что приводит к 40% загрузке поверхности чипа секвенирующих частиц (59 миллионов считывает, окончательный выход 12 миллионов считывает после автоматической фильтрации качества).

Figure 5
Рисунок 5: Соматические изменения в метастатических поражениях.
(A) Соматические мутации, выявленные в соответствующих первичных / метастатических поражений. (B) Всего соматические мутации отображаются в случае, в том числе изменения, общие между всеми поражениями (основатель / клональный) и те, обнаруженные в одном или нескольких, но не все образцы для данного случая (прогрессор / subclonal). Указывается количество отдельных метастатических поражений (м) секвенированных в случае. Эта цифра была переиздана из Amato и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Иммуностоина для катенина, KDM6A, GLUT1, BAP1 и TP53 в первичных и метастатических поражений.
(A) Представитель иммуногистохимических изображений, показывающих ядерное накопление катенина во всех образцах (первичных и метастатических) от мутации SPN подшипников CTNNB1. (B) Иммуногистохимическое окрашивание поражений от метастатическая клональная мутация SPN подшипников KDM6A. (C) Переэкспрессия GLUT1 в одном SPN подшипник KDM6A мутации, в то время как иммунореактивность не наблюдалось в ткани дикого типа. (D, E) Данные экспрессии BAP1 и TP53 означают, что мутации в этих двух генах являются субклональными. Шкала баров представляют 100 мкм и увеличение всета 600X. Эта цифра была изменена с Amato и др.8.

Figure 7
Рисунок 7: Соматические изменения числа копий в метастатических поражениях.
(A) Виртуальный вид кариотипа показывает расположение, близость и статус номера копии измененных генов в репрезентативном случае. Схема окраски хромосомных полос таков: черный и серый , гимса положительный, светло-красный центрометр, фиолетовый и переменная область. Изменения аннотируются в соответствии с цветовыми кодами, представленными на рисунке. Аббревиативы: CNV, вариация номера копий; P, первичный SPN; L (a-c), метастаза печени. (B) Всего соматические изменения (гены, затронутые CNV) отображаются в случае, в том числе изменения, общие между всеми поражениями (основатель / клональный) и те, обнаруженные в одном или нескольких (но не все) образцов для данного случая (прогрессор / subclonal). Указывается количество отдельных метастатических поражений (м) секвенированных в случае. Эта цифра была переиздана из Amato и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наш метод позволяет выявить молекулярные изменения, участвующие в прогрессировании твердых опухолей, путем интеграции вертикальных данных (т.е. морфологии, секвенирования ДНК и иммуногистохимии) от различных поражений данного пациента. Мы продемонстрировали способность нашего метода для обнаружения клональных и субклональных событий в мутационных молчаливых опухолей типа (т.е., SPN, твердо-псевдопапиллярный неоплазмы поджелудочной железы) путем допроса кодирования последовательностей 409 рака соответствующих генов8. Преимуществом подхода целевого секвенирования на основе ампииконов, используемого здесь, является единообразие охвата (90% целевых баз покрыты 100x, 95% покрыты 20x) в раздвиненных регионах (15 992) при типичной средней глубине покрытия 1000x. Высокая глубина покрытия в сочетании с неопластическим обогащением клеток через микродиссекцию гарантирует высокую чувствительность для обнаружения событий низкой частоты аллелей. Как мы уже показали9, целевой подход к секвенированию позволяет обнаружить мутации до 2% частоты аллелей на образцах ДНК из ткани FFPE. В качестве примера, в настоящей работе мы смогли определить 4% частоты tP53 неправильно мутации как субклонального события в метастатических образцов(Рисунок 5) и проверить это явление иммуногистохимии (Рисунок 6). Наш протокол предусматривает секвенирование соответствующей опухоли и зародышевой ДНК для выявления соматических событий и, соответственно, снижения ложной скорости обнаружения субклональных мутаций только раковтрубопровода 10. Когда соответствует зародышевой ДНК не доступна, можно было бы рассмотреть вопрос о принятии более консервативных параметров в анализе данных секвенирования, в том числе строгие фильтры, основанные на минимальной глубине охвата, а также ограничение вариантов вызова "горячих точек мутаций" и мутации, широко аннотированные в доступных базах данных. Секвенирование зародышевой ДНК наряду с соответствующими опухолями также имеет преимущество, позволяющее точно ею обнаружить вариации числа копий (CNV). Кроме того, пулы по гендерным диплоидным геномам могут использоваться для уменьшения шума от данных секвенирования и облегчения обнаружения CNV. В дополнение к включению зародышевой ДНК, мы изменили библиотечный протокол, чтобы уменьшить дисбаланс грунтового пула и улучшить вызов CNV. Согласно первоначальному протоколу, четыре пула ампликонов, полученных из каждого образца ДНК после мультиплекса ПЦР, должны быть смешаны вместе, а остальные шаги будут выполнены в одной трубке на образец. Это, однако, вызывает колебания в на пул средней глубины покрытия в связи с тем, что мультиплекс ПЦР может иметь различную эффективность в различных трубах. В первоначальном протоколе не было не было шага по количественной оценке/нормализации пула для учета этого эффекта. Чтобы избежать описанных выше колебаний, мы решили сохранить каждый из четырех бассейнов ампииконов разделенным по всему протоколу производства библиотеки, пока они не будут количественно оценены. При количественной оценке одинаковое количество каждого из четырех пулов для каждого образца ДНК может быть добавлено в окончательный пул библиотеки, гарантируя, что окончательный средний охват будет как можно более однородным.

Оценка внутриопухолевой неоднородности (ITH) на генетическом уровне имеет важные клинические последствия, но также создает новые проблемы2. Одной из основных проблем действительно является необходимость проведения различия между мутациями драйверов и стохасическими событиями (т.е. мутациями пассажиров). Различие между мутациями водителя и пассажира часто осуществляется вычислительно, но не без предубеждений. В то время как систематическая функционализация обнаруженных вариантов является дорогостоящей и трудоемкой, функциональные последствия генетических вариантов могут быть оценены, по крайней мере для подмножества генов, путем иммуногистохимического анализа соответствующего белка или, косвенно, путем измерения экспрессии суррогатных маркеров белковой дисфункции. Наш протокол был применен к тканям FFPE, который представляет собой основной источник материалов в клинических условиях, но создает проблемы для секвенирования; качество изолированных нуклеиовых кислот всегда следует оценивать до секвенирования11. Хотя целевое секвенирование имеет главное преимущество в том, что оно является экономически эффективным и не очень требовательным с точки зрения вычислительных требований, оно имеет основной недостаток допроса лишь ограниченной части генома, что, вероятно, приводит к недооценке внутриопухолевая неоднородность. Кроме того, этот подход не рассматривает соответствующие эпигенетические и транскриптомические различия между метастазами и первичных опухолей, которые недавно были показаны перевешивают генетические различия в некоторых типах опухолей4,12, 13. Вместе с тем можно было бы предвидеть, что технологические достижения в скором времени позволят интегрировать более богатый вертикальный ансамбль данных для более точной оценки ITH. Наш подход предпочитает глубину физическому охвату генома, что ограничивает нашу способность строить надлежащие филогении на основе SNV. Тем не менее, наш метод предоставляет возможность изучения генетической родственности в клинических образцах с соответствующей чувствительностью и специфичностью за счет интеграции молекулярного и гистопатологического анализа. Мы успешно применили этот протокол на определенном типе опухоли (например, SPN) и прогнозируем, что метод будет аналогичным образом работать на других твердых типов опухолей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследование было поддержано итальянским проектом по геному рака (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Грант No 12182 в AS и 18178 в VC), FP7 Европейского сообщества Грант (Cam-Pac No 602783 в AS). Финансируя учреждения не принимали никакого роли в сборе, анализе и толковании данных или в написании рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155, (1), 27-38 (2013).
  2. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, (4), 613-628 (2017).
  3. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458, (7239), 719-724 (2009).
  4. Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49, (3), 358-366 (2017).
  5. Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18, (1-2), 43-73 (2013).
  6. McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26, (16), 2069-2070 (2010).
  7. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29, (1), 24-26 (2011).
  8. Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247, (1), 123-134 (2019).
  9. Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9, (8), e104979 (2014).
  10. Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25, (6), 1446-1457 (2018).
  11. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8, (6), e62692 (2013).
  12. Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35, (2), 267-282 (2019).
  13. Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. (2018).
Сравнительный анализ поражений с помощью целевого подхода к секвенированию
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).More

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter