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Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida

doi: 10.3791/59844 Published: November 5, 2019

Summary

Este artículo describe un método para identificar alteraciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes de un paciente dado. Aunque los experimentos descritos aquí se centran en un tipo de tumor específico, el enfoque es ampliamente aplicable a otros tumores sólidos.

Abstract

Evaluar la heterogeneidad intratumoral (ITH) es de suma importancia para anticipar el fracaso de las terapias dirigidas y diseñar estrategias antitumorales eficaces en consecuencia. Aunque con frecuencia se plantean preocupaciones debido a las diferencias en el procesamiento de muestras y la profundidad de la cobertura, la secuenciación de próxima generación de tumores sólidos ha desentrañado un grado muy variable de ITH entre los tipos de tumores. La captura de la relación genética entre las lesiones primarias y metastásicas mediante la identificación de poblaciones clonales y subclonales es fundamental para el diseño de terapias para enfermedades en estadio avanzado. Aquí, informamos de un método para el análisis comparativo de lesiones que permite la identificación de poblaciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes del mismo paciente. El enfoque experimental descrito aquí integra tres enfoques bien establecidos: análisis histológico, secuenciación multilesione de alta cobertura y análisis inmunofenotípicos. Con el fin de minimizar los efectos en la detección de eventos subclonales por procesamiento inapropiado de muestras, sometimos a los tejidos a un examen patológico cuidadoso y el enriquecimiento de células neoplásicas. El ADN controlado por calidad de lesiones neoplásicas y tejidos normales fue sometido a una secuenciación de alta cobertura, dirigida a las regiones codificantes de 409 genes cancerosos relevantes. Aunque sólo se examina un espacio genómico limitado, nuestro enfoque permite evaluar el grado de heterogeneidad entre las alteraciones somáticas (mutaciones de un solo nucleótido y variaciones de números de copia) en lesiones distintas de un paciente determinado. A través del análisis comparativo de los datos de secuenciación, pudimos distinguir las alteraciones clonales frente a las subclonales. La mayoría de la ITH a menudo se atribuye a mutaciones de pasajeros; por lo tanto, también utilizamos la inmunohistoquímica para predecir las consecuencias funcionales de las mutaciones. Si bien este protocolo se ha aplicado a un tipo de tumor específico, anticipamos que la metodología descrita aquí es ampliamente aplicable a otros tipos de tumores sólidos.

Introduction

El advenimiento de la secuenciación de próxima generación (NGS) ha revolucionado la forma en que se diagnostican y tratan los cánceres1. NGS acoplado a la secuenciación multirregional han expuesto un alto grado de heterogeneidad intratumoral (ITH) en tumores sólidos2, lo que explica en parte el fracaso de la terapia dirigida debido a la presencia de subclones con diferente sensibilidad a los fármacos2 . Un desafío importante planteado por los estudios de secuenciación del genoma es la necesidad de distinguir entre mutaciones de pasajeros (es decir, neutrales) y conductores en cánceres individuales3. En efecto, varios estudios han demostrado que, en determinados tumores, las mutaciones de los pasajeros representan la mayoría de la ITH, mientras que las alteraciones del conductor tienden a conservarse entre las lesiones del mismo individuo4. También es importante tener en cuenta que la gran carga mutacional (como se ve en los cánceres de pulmón y el melanoma) no implica necesariamente una gran carga mutacional subclonal2. Por lo tanto, se puede encontrar un alto grado de ITH en tumores con baja carga mutacional.

Las metástasis son responsables de más del 90% de la muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo5; por lo tanto, la captura de la heterogeneidad mutacional de los genes del conductor entre las lesiones primarias y metastásicas es fundamental para el diseño de terapias eficaces para enfermedades en estadio avanzado. La secuenciación clínica se realiza generalmente en ácidos nucleicos de tejidos fijos, lo que dificulta la exploración en todo el genoma debido a la mala calidad del ADN. Por otro lado, la intención de la secuenciación clínica es identificar mutaciones y/o mutaciones procesables que podrían predecir la capacidad de respuesta/falta de respuesta a un régimen terapéutico determinado. Tal como está, la secuenciación puede limitarse a una fracción menor del genoma para la extracción oportuna de información clínicamente relevante. La transición de la generación de perfiles de ADN de bajo rendimiento (por ejemplo, secuenciación de Sanger) a NGS ha hecho posible analizar cientos de genes relevantes para el cáncer a una alta profundidad de cobertura, lo que permite la detección de eventos subclonales. Aquí, informamos de un método para el análisis comparativo de lesiones que permite la identificación de poblaciones clonales y subclonales entre diferentes especímenes del mismo individuo. El método descrito aquí integra tres enfoques bien establecidos (análisis histológico, secuenciación multilesional de alta cobertura y análisis inmunofenotípicos) para predecir las consecuencias funcionales de las variaciones identificadas. El enfoque se describe esquemáticamente en la Figura 1 y se ha aplicado al estudio de 5 casos metastásicos de neoplasias pseudopamizas sólidas (SPN) del páncreas. Si bien describimos el procesamiento y análisis de muestras de tejido sinovertina fijadas en formalina (FFPE), el mismo procedimiento se puede aplicar al material genético del tejido congelado.

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Protocol

El material utilizado en el estudio fue recogido bajo un protocolo específico, que fue aprobado por el comité de ética local. Se dispuso el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.

1. Revisión histológica e inmunofenotológica de muestras de tejido

NOTA: Un patólogo experto es responsable de las actividades descritas a continuación.

  1. Revisión histopatológica de casos seleccionados de acuerdo con criterios diagnósticos bien establecidos.
    1. Utilice el microtomo para cortar secciones de tejido grueso de 4 x 5 m de bloques de tejido FFPE representativos y monte las secciones en diapositivas histológicas estándar.
    2. Realizar la tinción de hematoxilina y eosina para cada diapositiva utilizando una tinción automatizada de deslizamiento de tejido(Tabla de materiales).
    3. Revisar el diagnóstico histopatológico de los casos de tumores seleccionados de acuerdo con los criterios de diagnóstico de la OMS.
      NOTA: En esta etapa, el patólogo podría identificar áreas morfológicamente distintas del tumor dentro de la misma sección tisular. Es posible cosechar esas zonas por separado (ver sección 2). En la Figura 2se proporciona semejanza histológica de células tumorales y normales para los SPN.
    4. Realizar tinción inmunohistoquímica para marcadores establecidos para complementar el análisis histológico y estimar la heterogeneidad inmunofenotípica.
      NOTA: El patólogo podría identificar áreas inmunofenotípicamente distintas del tumor dentro de la misma sección tisular. Es posible cosechar esas zonas por separado (ver sección 2).
  2. Evaluar la celularidad neoplásica de la sección del tejido tumoral y planificar la microdisección manual en consecuencia.
    NOTA: Esta es una estimación generada por un patólogo de la celularidad tumoral.
    1. Si el contenido celular neoplásico de la sección del tejido es superior al 70%, la microdisección manual no es obligatoria; pasar directamente al paso 3.1.
      NOTA: Dirigir el 70% del contenido de células neoplásicas para (i) garantizar una sensibilidad adecuada para las estimaciones de frecuencia de alelos mutantes y (ii) validar posiblemente mutaciones clonales por metodologías menos sensibles (por ejemplo, secuenciación capilar).
    2. Si el contenido celular neoplásico de la sección del tejido es inferior al 70%, la microdisección es necesaria y pasa al paso 2.
  3. Evaluar las secciones de tejido del bloque FFPE donde se ha muestreado tejido no neoplásico. Este tejido se utiliza como una fuente de ADN germinal.
    NOTA: La sangre es una fuente alternativa de ADN germinal. En este caso, proceda con la extracción de ADN como se recomienda en la nota del paso 4.1.
    1. Si sólo el tejido no neoplásico es visible en la sección de tejido(Figura 2D),no se necesita microdisección manual; pasar directamente al paso 3.1.
    2. Si hay contaminación sustancial de las células neoplásicas en la sección del tejido, entonces es necesaria una microdisección manual; pasar a la sección 2.

2. Microdisección manual

NOTA: Este método es aplicable a varios tipos de tumores sólidos, y está destinado a aumentar el contenido de células neoplásicas de muestras de tejido. Alternativamente, este método se puede utilizar para cosechar morfológicamente y/o áreas inmunofenotípicamente distintas dentro de la misma sección de tejido.

  1. Usando un microtome, corta hasta diez secciones de tejido tumoral FFPE de 4 x 6 m de espesor y méndalas en diapositivas sin carga.
    NOTA: Si sólo un nido de 1 mm2 de células cancerosas es visible en la muestra, 10 diapositivas de tejido deben ser cortadas y sometidas a microdisección manual para obtener la cantidad objetivo de ADN (40 ng); suponiendo que el racimo de 1 mm2 contenga entre 700 y 1000 núcleos tumorales.
  2. Incubar toboganes a 60oC durante 10 min.
  3. Colocar los portaobjetos en un bastidor, y realizar los siguientes lavados: xileno para 20 min, 100% etanol para 10 min, 80% etanol para 10 min, 70% etanol para 10 min, agua destilada durante 1 min, contramancha de hematoxilina para 10 s, agua del grifo durante 1 min.
  4. En un microscopio invertido estándar, utilice una aguja de 27 G en una jeringa como herramienta de microdisección y recopile grupos representativos de células tumorales. Cosecha un mínimo de diez 1 mm2 grupos de células para asegurar la cantidad necesaria de ADN para la secuenciación.
    NOTA: Si las áreas morfológicamente distintas están diseñadas para ser analizadas como entidades diferentes, utilice la herramienta de microdisección para cosechar esas áreas por separado.
  5. Colocar racimos cosechados en tubos de 1,5 ml(Tabla de Materiales)previamente llenados con 20 l de proteasa K y 180 l de tampón de lisis(Tabla de materiales,ambos incluidos en el kit de extracción de ADN) y mezclar por vórtice.

3. Procesamiento de tejidos sin microdisección previa

NOTA: Este procedimiento se utiliza para bloques de tejido que contienen sólo células no neoplásicas (fuente de ADN germinal) o contienen al menos el 70% de las células cancerosas morfológicamente homogéneas.

  1. Usando un microtome cortahasta seis secciones de tejido de 4 x 5 m de espesor de bloques de tejido FFPE seleccionados. Coloque los pergaminos de tejido en tubos de 1,5 ml como se describe en el paso 2.5.

4. Extracción de ADN de células normales y neoplásicas

  1. Purifique el ADN del tejido normal y neoplásico utilizando el kit de extracción de tejido DNA FFPE(Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Cuando se utilice sangre como fuente de ácido nucleico germinal, purifique el ADN utilizando un kit de extracción de sangre de ADN(Tabla de materiales).
  2. Cuantificación del ADN y control de calidad
    1. Para cuantificar la cantidad de doble cadena (dsDNA), añadir una alícuota de la muestra de ADN a una solución que contenga una mancha de ácido nucleico fluorescente (Tabla de materiales) y medir la fluorescencia emitida utilizando un fluorómetro de sobremesa(Tabla de materiales ).
      NOTA: El ensayo mide la intensidad de la señal fluorescente emitida por los colorantes fluorescentes unidos a dsDNA y determina la cantidad de ADN utilizando una curva estándar.
    2. Utilice un espectrofotómetro demicrovolúmenes (Tabla de materiales)para medir las relaciones 260/280 y 260/230 de la muestra con el fin de calificar el ADN. El ADN "puro" debe tener un 260/280 de 1.8 y un 260/230 en el rango de 1.8-2.2.
      NOTA: La evaluación espectrofotométrica de la muestra está destinada a evidenciar la presencia de contaminantes químicos (por ejemplo, fenol) que afectan las reacciones posteriores. En caso de contaminación debida a reactivos químicos, realice un paso de limpieza utilizando un kit basado en columnas.

5. Preparación y cuantificación de bibliotecas

NOTA: El diagrama de flujo esquemático de los pasos de preparación y cuantificación de la biblioteca se indica en la Figura 3.

  1. Preparación de la biblioteca de ADN (4 grupos de imprimación configurados para cada muestra)
    NOTA: Las 4 piscinas de imprimación pertenecen al panel de cáncerTabla de materiales. Cada grupo contiene pares de imprimación diseñados para una selección de objetivos multiplexado de 409 genes. Se proporciona un enlace a la lista de genes que componen el panel NGS enTabla de materiales.
    1. Prepare cuatro reacciones de amplificación de objetivos de ADN para cada muestra, una por grupo de imprimación. Para cada grupo de imprimación(Tabla de Materiales),añadir un tubo de 0,2 ml(Tabla de materiales):4 l de mezcla maestra(Tabla de materiales,incluido en el kit de la biblioteca), 10 l de mezcla de piscina de imprimación de alta fidelidad(Tabla de materiales,incluido en la mesa de materiales, incluido en el biblioteca del panel de cáncer), y 6 l de ADN (10 ng en total).
    2. Amplificar las regiones objetivo de cada piscina de imprimación por separado en cuatro tubos de 1,5 ml que ejecutan el siguiente programa: mantener a 99 oC durante 2 min (activación de la polimerasa de arranque en caliente), 16 ciclos (desnaturalidad a 99 oC para 15 s, recocido y extender a 60 oC durante 8 min) , sostenga a 4oC.
      NOTA: Punto de parada. Almacene las reacciones de amplificación objetivo a 4 oC durante la noche o a -20 oC durante más tiempo.
    3. Digestión parcial de los extremos de los amplicons
      NOTA: El manual proporcionado por el kit del fabricante de NGS prevé un paso en el que las diferentes reacciones de amplificación de cada muestra se combinan antes de la digestión parcial. Evite ese paso y siga procesando cada digestión de amplificación por separado.
      1. Añadir 2 l de mezcla de digestión específica(Tabla de Materiales,incluido en el kit de la biblioteca) a cada piscina amplificada de cada muestra (el volumen total de cada tubo de 0,2 ml es de 22 l). Vórtice a fondo y centrifugar cada tubo para recoger las gotas.
      2. Cargue los tubos en el ciclor térmico y ejecute el siguiente programa: 50 oC durante 10 min, 55 oC durante 10 min, 60 oC durante 20 min, 10 oC de retención (hasta 1 h).
        NOTA: Punto de parada. Conservar la placa a -20 oC durante períodos más largos.
    4. Adaptadores de ligado para amplificar y purificar.
      NOTA: Utilice un adaptador de código de barras diferente para cada muestra al secuenciar varias bibliotecas en un solo chip. Las cuatro reacciones de amplificación de la misma muestra deben recibir el mismo código de barras.
      1. Preparar adaptadores(Tabla de materiales,kit de adaptadores de códigos de barras). Para cada código de barras X, prepare una mezcla de adaptador P1 y adaptadores de código de barras únicos(Tabla de materiales)en una dilución final de 1:4. Mezclar 4 l de agua con 2 s de adaptador P1 y 2 l de adaptadores de código de barras únicos. Utilice 2 l de esta mezcla de adaptadores de código de barras para pasajes aguas abajo.
      2. Realice la reacción de ligadura añadiendo a cada piscina amplificada de cada muestra en este orden: 4 l de solución de interruptor(Tabla de materiales,incluida en el kit de la biblioteca), 2 l de mezcla de adaptador de código de barras y 2 l de ligada de ADN(Tabla de materiales,incluida en el kit de la biblioteca) (volumen total de 30 s.
      3. Vórtice a fondo y brevemente centrifugar para recoger gotas.
      4. Cargue cada tubo en el ciclor térmico y ejecute el siguiente programa: 22 oC durante 30 min, 68 oC durante 5 min, 72 oC durante 5 min, 4 oC de retención (hasta 24 h).
        NOTA: Punto de parada. Conservar la placa a -20 oC durante períodos más largos.
    5. Purificación y amplificación de la biblioteca
      1. Centrifugar cada tubo y luego transferir cada muestra de código de barras en un tubo de 1,5 ml. Añadir 45 l de reactivo de purificación a base de perlas(Tabla de materiales)a cada grupo de cada muestra. Pipet a arriba y abajo 5x para mezclar la suspensión del cordón con el ADN.
      2. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT), luego colocar cada tubo en un estante magnético e incubar durante 2 minutos. Retire cuidadosamente y deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet.
      3. Añadir en cada tubo 150 l de etanol fresco 70%. Lave las perlas moviendo cada tubo de lado a lado de las dos posiciones del imán. Deseche el sobrenadante y preste atención para no molestar el pellet.
      4. Repita los procedimientos descritos en el paso 5.1.5.3 y luego mantenga los tubos en el imán y seque al aire las perlas en RT durante 5 min.
      5. Retire los tubos con bibliotecas purificadas de cada piscina de imprimación del imán y añada 50 l de mezcla de PCR de alta fidelidad(Tabla de materiales)y 2 l de mezcla de imprimación de amplificación de biblioteca(Tabla de materiales,incluido en el kit de la biblioteca) a las cuentas de pellet de cada tubo.
      6. Vortex cada tubo de 1,5 ml y centrífuga brevemente para recoger gotas.
      7. Coloque los tubos de 1,5 ml en el imán durante 2 minutos y transfiera cuidadosamente el sobrenadante (50 l) de cada tubo a un nuevo tubo de 0,2 ml sin alterar el pellet.
      8. Amplificar las bibliotecas de cada grupo de imprimación ejecutando el siguiente programa: mantener a 98 oC durante 2 min para activar la enzima, 5 ciclos (desnaturalidad a 98 oC durante 15 s, anular y extender a 64 oC 1 min), mantener a 4 oC. Almacene las muestras a -20 oC.
    6. Purificación de la biblioteca amplificada
      1. Centrifugar cada tubo para recoger el contenido en la parte inferior y transferir cada muestra de biblioteca amplificada a un tubo de 1,5 ml.
      2. Añadir 25 l de reactivo de purificación a base de perlas. Pipet a arriba y abajo 5x para mezclar la suspensión del cordón con el ADN.
      3. Incubar la mezcla durante 5 minutos a RT, y luego colocar tubos en el imán durante 5 minutos.
      4. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante, que contiene los amplicons, de cada tubo a tubos nuevos sin molestar el pellet.
      5. Añadir 60 l de reactivo de purificación a base de perlas al sobrenadante de cada tubo y pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar la suspensión del cordón y el ADN.
      6. Incubar la mezcla durante 5 minutos a RT y luego colocar los tubos en el imán durante 3 minutos.
      7. Deseche el sobrenadante de cada tubo y preste atención para no molestar el pellet.
        NOTA: Los amplificadores están enlazados a los perlas.
      8. Añadir en cada tubo 150 l de etanol fresco 70%. Lave las perlas moviendo los tubos de lado a lado en las dos posiciones del imán. Deseche el sobrenadante y preste atención para no molestar el pellet.
      9. Repita el procedimiento en el paso 5.1.6.8 y seque al aire las perlas en RT durante 3 min. Evite el secado excesivo de las perlas.
      10. Retire los tubos del imán y añada 50 ml de Tris EDTA (TE)(Tabla de materiales,incluida en el kit de la biblioteca) al pellet para dispersar las perlas.
      11. Pipet a la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces e incubar a RT durante 2 min.
      12. Coloque los tubos en el imán durante al menos 2 minutos y transfiera cuidadosamente el sobrenadante, que contiene los amplicons, a tubos nuevos sin perturbar las perlas.
  2. Cuantificación de bibliotecas
    1. Utilice un instrumento de análisis de fragmentos(Tabla de materiales)para ejecutar un chip de ADN de acuerdo con el protocolo del kit de ADN de alta sensibilidad.

6. Ejecución de agrupación y secuenciación de bibliotecas

  1. Diluir cada biblioteca a 100 pM con agua libre de nucleasas. Combine 10 l de cada biblioteca de 100 pM para una sola tirada en un solo tubo. Mezcle las bibliotecas combinadas mediante la pipeteo y proceda a la creación de plantillas y la secuenciación.
  2. Creación de carreras planificadas
    NOTA: Una ejecución típica incluye cuatro muestras que se pueden cargar en dos tipos diferentes de chip semiconductor (chip Ion PI o chip Ion 540) basado en el secuenciador disponible en el laboratorio (Ion Proton System o GeneStudio S5 System, Tabla de materiales). Estos sistemas suelen producir 80 millones de lecturas por carrera.
    1. Abra el navegador Torrent en un equipo conectado al sistema de secuenciación (por ejemplo, Ion Chef System) y planifique una nueva ejecución utilizando la plantilla genérica para la aplicación seleccionada (AmpliSeqDNA).
    2. Cambie a la pestaña Kits del plan. Seleccione Ion Proton System o Ion GeneStudio S5 System en la lista desplegable de instrumentos en función del sistema de secuenciación que se esté utilizando.
    3. Dependiendo del sistema de secuenciación, seleccione el chip adecuado (chip PI para Ion Proton Systems; chip 540 para Ion GeneStudio S5 Systems) en la lista desplegable Tipo de chip.
    4. Seleccione Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit en la lista desplegable Kit de biblioteca.
    5. Seleccione el botón Ion Chef para Template Kit y, a continuación, seleccione el Kit de Chef apropiado (Ion PI Hi-Q Chef Kit for PI chip o Ion 540 Kit-Chef para el chip 540) en la lista desplegable Kit de plantillas.
    6. Seleccione el kit de secuenciación adecuado (Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit for PI chip o Ion S5 Sequencing Kit for 540 chip) en la lista desplegable Kit de secuenciación y, a continuación, seleccione IonXpress en la lista desplegable Conjunto de códigos de barras.
    7. Cambie a la pestaña Plugin y seleccione el complemento Análisis de cobertura.
    8. Cambie a la pestaña Plan. En la lista desplegable Regiones de destino, seleccione el panel adecuado que desea secuenciar.
    9. Establezca el número de códigos de barras que se van a secuenciar y la etiqueta de los tubos de muestra de la biblioteca en los campos apropiados.
    10. Establezca el nombre del código de barras y el nombre de muestra para cada biblioteca.
  3. Ejemplo de dilución y carga de bibliotecas.
    1. Diluir la biblioteca de existencias con agua libre de nucleasas a 25 pM para chip PI o 32 pM para 540 chips.
    2. Pipet 50 l de cada biblioteca diluida en la parte inferior del tubo de muestra de la biblioteca adecuado.
    3. Encienda el sistema de secuenciación y siga las instrucciones en pantalla para cargar todos los reactivos necesarios e importar el plan de ejecución.
    4. Cargue el tubo de muestra de la biblioteca que contiene las bibliotecas agrupadas e inicie el programa de amplificación clonal.
      NOTA: El sistema Ion Chef requiere que se preparen dos fichas por ejecución.
  4. Secuenciación en Ion Proton o Ion GeneStudio S5.
    1. Active el sistema de secuenciación y siga las instrucciones en pantalla para inicializar la secuenciación e importar el plan de ejecución.
    2. Cargue el chip de secuenciación después de retirarlo del sistema de secuenciación.
      NOTA: Estar conectado a tierra antes de recoger un chip con el fin de evitar daños en la viruta debido a la descarga electrostática. En la Figura 4se informa el manejo/posicionamiento de la viruta junto con ejemplos de carga correcta/sin éxito.
    3. Cierre la tapa del compartimiento de la ficha y espere hasta que el icono Estado de la ficha indique "Listo".
    4. Vacíe el contenedor de residuos cuando finalice la primera ejecución y, a continuación, secuenciar el chip restante lo antes posible.

7. Análisis de mutaciones y variaciones de números de copia (CNV)

NOTA: La alineación de los datos de secuenciación al genoma de referencia humana GRCh37/hg19 se realiza automáticamente una vez establecida en el Plan (paso 6.2.8).

  1. Utilice la salida del complemento Análisis de cobertura(Tabla de materiales) para verificar la profundidad de cobertura y uniformidad.
  2. Realice las llamadas de variante utilizando el plugin de llamadas de variante Torrent (Tabla de materiales), seleccionando el flujo de trabajo germinal o somático según corresponda.
  3. Descargue los archivos de formato de llamada variante (VCF) de variantes filtradas. Anote variantes utilizando el software Variant Effect Predictor (VEP)6 y la base de datos NCBI RefSeq.
  4. Cargue los datos de secuenciación en el software Ion Reporter utilizando el complemento uploader de Ion Reporter y utilice el flujo de trabajo de pares tumor-normal de Comprehensive Cancer Panel para analizar los datos con el fin de estimar los CNV.
  5. Filtre manualmente las mutaciones y los CNV en función de las puntuaciones asignadas por el software y compruébelas visualmente con el Visor de Genómica Integrativa (IGV)7.
    1. Inspeccione visualmente la alineación en busca de lecturas inusuales (debido, por ejemplo, a la morcedora, la sobreamplificación o el recorte suave) que pueden generar llamadas artefactofactuales.
    2. Verifique los CNV inspeccionando la cobertura normalizada de todos los amplificadores en un gen dado contra la cobertura normalizada de la línea de base.
      NOTA: Esto ayuda a corregir las llamadas falsas debido al software de segmentación, que a veces llama a un CNV basado en una cobertura simétricamente anormal de pocos amplicons al final de un gen y al principio del gen sucesivo.
  6. Indexación de mutaciones somáticas
    1. Para cada caso, las llamadas de mutación indexadas provienen de la secuenciación de tejido/sangre normal, tumor primario y metástasis.
    2. Marcar como germinal y descartar las llamadas que también son evidentes a partir de los datos de secuenciación del ADN germinal.
    3. Marcar como clonal/fundador las mutaciones que se comparten entre todas las lesiones de un paciente dado.
    4. Marcar como subclonal/progressor las mutaciones que se detectan en algunas pero no todas las lesiones de un paciente dado.

8. Análisis inmunofenotípico: inmunohistoquímica para la expresión proteica relevante

NOTA: La inmunohistoquímica se utilizó para validar las consecuencias funcionales de la inactivación de mutaciones en genes supresores de tumores.

  1. Usando un microtome, corta secciones de tejido FFPE de 3 x 4 m de espesor y mréñalas en portaobjetos cargados e incuba portaobjetos a 60 oC durante 10 min.
  2. Colocar los portaobjetos en un bastidor, y realizar los siguientes pasos: xileno durante 10 min, xileno durante 10 min, 95% etanol durante 4 min, 95% etanol para 4 min, 70% etanol para 4 min, 70% etanol para 4 min, agua destilada durante 4 min.
  3. Realizar la recuperación de antígenos en función de la indicación de los fabricantes de anticuerpos(Tabla de materiales).
    1. Coloque los portaobjetos en un bastidor con la solución específica de recuperación de antígenos y sumerja en un baño de agua a temperaturas de subebullición.
    2. Retire los portaobjetos del baño y corra el agua del grifo para enfriar durante 10 minutos.
  4. Coloque las diapositivas en un nuevo bastidor con 3% H2O2 en 1 solución salina tris tamponada (TBS) durante 20 minutos en RT para inactivar peroxidasas endógenas.
  5. Coloque las diapositivas en un estante nuevo y lave 3 veces con TBS y el 0,1% de Tween 20 (TBST).
  6. Utilice un bolígrafo PAP(Tabla de materiales)para dibujar un círculo hidrófobo alrededor del tejido montado en deslizamiento.
  7. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda y realice el bloqueo durante 1 h a RT utilizando albúmina sérica (BSA) al 5% bovina (BSA) en TBST como solución de bloqueo.
  8. Incubar portaobjetos con anticuerpos primarios(Tabla de Materiales)en una cámara húmeda durante la noche a 4oC. Diluir el anticuerpo primario con solución de bloqueo según lo recomendado.
  9. Coloque los portaobjetos en un estante nuevo y lave 3 veces con TBST.
  10. Incubar portaobjetos con anticuerpos secundarios específicos (antiratón o anticonejo) (4 x 5 gotas para 1 diapositiva) durante 30 minutos a RT en una cámara húmeda.
  11. Coloque los portaobjetos en un estante nuevo y lave 3 veces con TBST y después en agua destilada.
  12. Preparar 3,3'-diaminobenzidina (DAB) solución diluyendo 1 gota en 1 ml de tampón de dilución(Tabla de materiales). Incubar diapositivas máximas durante 5 minutos de control bajo el microscopio.
  13. Utilice un control positivo para calcular el tiempo de incubación siguiendo el desarrollo de la reacción bajo el microscopio.
    NOTA: Cada anticuerpo necesita un tiempo de incubación específico.
  14. DAB inactivo (detener la precipitación de cromógeno) sumergiendo diapositivas en agua destilada.
  15. La contramancha se desliza sumergiéndolas en un nuevo estante con hematoxilina durante 10 s y luego enjuaga con agua del grifo.
  16. Colocar los portaobjetos en un bastidor, y realizar los siguientes pasos: 70% etanol para 4 min, 70% etanol para 4 min, 95% etanol para 4 min, 95% etanol para 4 min, xileno para 10 min, xileno para 10 min.
  17. Selle las correderas poniendo un par de gotas de medio de montaje(Tabla de Materiales)en cada diapositiva de tejido y cubra con cubre.
  18. Aplique presión sobre el cubreobjetos para mover el exceso de medio y las burbujas de aire lejos del tejido y fuera del cubreobjetos y secar al aire.
  19. Evalúe y puntúe los resultados de tinción bajo microscopio invertido con un patólogo experto.
    NOTA: El sistema de puntuación dependerá de los antígenos específicos, para los cuales la información de la literatura ya existe. Si la información no está disponible en la literatura, derive un sistema de puntuación utilizando la expresión del antígeno en el tejido normal como referencia.

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Representative Results

El flujo de trabajo del estudio se ilustra en la Figura 1. La secuenciación multilesiones (n.o 13) de 5 casos de SPN dirigidos a las secuencias codificantes de 409 genes relacionados con el cáncer identificó un total de 27 mutaciones somáticas en 8 genes (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1y FGFR3). Las mutaciones se definieron como fundador/clonal cuando se compartieron entre todas las lesiones de un paciente dado, y progresor/subclonal cuando se detecta en algunas lesiones de un paciente dado, pero no todas(Figura 5A,B). En general, la mayoría de las mutaciones puntuales identificadas en toda la cohorte fueron eventos clonales, que incluían mutaciones de CTNNB1, KDM6A, TET1 y FLT1. Consistentemente, la tinción inmunohistoquímica para la -catenina (producto proteico de CTNNB1)y KDM6A fue homogénea entre las diversas lesiones de casos con mutaciones de los genes correspondientes(Figura 6A,B). La tinción moderada de KDM6A en muestras mutadas sugirió que la alteración genética era probable que alterara la función en lugar de la expresión proteica. La pérdida de función de KDM6A en los tumores pancreáticos está asociada a la regulación ascendente del marcador de hipoxia GLUT18, y en consecuencia GLUT1 se sobreexpresó en los casos con mutaciones de KDM6A(Figura 6C). Se encontró que las mutaciones subclonales afectaban a BAP1, SMAD4, TP53 y FGFR3. La inmunohistoquímica para BAP1 y TP53 confirmó que las mutaciones en esos genes eran subclonales(Figura 6D,E). El análisis de la variación de número de copia (CNV) se realizó utilizando datos de secuenciación y se revelaron alteraciones en todos los especímenes analizados como se muestra en la Figura 7A. A diferencia de las mutaciones puntuales, la mayoría de las alteraciones del VNC fueron subclonales(Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo del análisis realizado en lesiones metastásicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Histología representativa de los tejidos normales y tumorales.
(A, B) Tejido tumoral (T) adyacente al tejido normal (N). En estas dos secciones tisulares, el tumor y los tejidos normales son identificables como áreas separadas y bien confinadas. (C) Los grupos de células pancreáticas normales (N*) pueden verse como incrustados en el tejido tumoral (T). (D) Morfología del tejido pancreático normal. La barra de escala representa 1 mm.

Figure 3
Figura 3: Gráfico de flujo esquemático del paso del protocolo de preparación y cuantificación de la biblioteca.

Figure 4
Figura 4: Carga y funcionamiento del chip de protones de iones.
(A) Dirección y colocación del chip en la abrazadera de la viruta (izquierda). Reemplazo de la pestaña metálica (derecha). (B) Mapas de calor que muestran la densidad de las bibliotecas en dos cargas de chip diferentes. Ejemplo de una buena densidad de carga (superior) debido a una amplificación clonal exitosa de las bibliotecas, lo que resulta en una carga del 94% de la superficie del chip con partículas de secuenciación (139 millones de lecturas, salida final 90 millones de lecturas después del filtrado automático de calidad). Ejemplo de una carga deficiente (abajo) debido a una amplificación clonal ineficiente de las bibliotecas, lo que resulta en una carga del 40% de la superficie del chip con partículas de secuenciación (59 millones de lecturas, salida final 12 millones de lecturas después del filtrado automático de calidad).

Figure 5
Figura 5: Alteraciones somáticas en lesiones metastásicas.
(A) Mutaciones somáticas identificadas en lesiones primarias/metastásicas coincidentes. (B) Se muestran mutaciones somáticas totales por caso, incluidas las alteraciones compartidas entre todas las lesiones (fundador/clonal) y las detectadas en uno o más, pero no en todos los especímenes de un caso determinado (progreso/subclonal). Se indica el número de lesiones metastásicas individuales (m) secuenciadas por caso. Esta cifra ha sido reeditada de Amato et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Inmunostación para la catenina, KDM6A, GLUT1, BAP1 y TP53 en lesiones primarias y metastásicas.
(A) Imágenes inmunohistoquímicas representativas que muestren la acumulación nuclear de la catenina en todos los especímenes (primarios y metastásicos) a partir de una mutación del SPN de CTNNB1. (B) Tinción inmunohistoquímica de lesiones a partir de una mutación clonal del rodamiento SPN metastásico de KDM6A. (C) Sobreexpresión de GLUT1 en un SPN con mutación KDM6A, mientras que no se observó inmunoreactividad en tejido de tipo silvestre. (D, E) Los datos de expresión BAP1 y TP53 denota que las mutaciones en estos dos genes son subclonales. Las barras de escala representan 100 m y el aumento de inserción es de 600X. Esta cifra ha sido modificada de Amato et al.8.

Figure 7
Figura 7: Cambios somáticos del número de copia en lesiones metastásicas.
(A) La vista de cariotipo virtual muestra la ubicación, la proximidad y el estado del número de copia de los genes alterados en un caso representativo. El esquema de coloración de las bandas cromosómicas es el siguiente: negro y gris , Giemsa positivo, rojo claro , centromere, púrpura , región variable. Las alteraciones se anotan de acuerdo con los códigos de color presentados en la figura. Abreviaturas: CNV, variación del número de copia; P, SPN primario; L(a-c), metástasis hepáticas. (B) Se muestran alteraciones somáticas totales (genes afectados por el VNC) por caso, incluidas las alteraciones compartidas entre todas las lesiones (fundador/clonal) y las detectadas en uno o más (pero no todos) de los especímenes para un caso determinado (progreso/subclonal). Se indica el número de lesiones metastásicas individuales (m) secuenciadas por caso. Esta cifra ha sido reeditada de Amato et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Nuestro método permite la identificación de alteraciones moleculares implicadas en la progresión de tumores sólidos a través de la integración de datos verticales (es decir, morfología, secuenciación de ADN e inmunohistoquímica) a partir de lesiones distintas de un paciente determinado. Demostramos la capacidad de nuestro método para detectar eventos clonales y subclonales en un tipo de tumor silencioso mutacional (es decir, SPN, neoplasia sólida-pseudopapilar del páncreas) interrogando las secuencias de codificación de 409 genes relevantes para el cáncer8 . Una ventaja del enfoque de secuenciación dirigida basado en amplificación utilizado aquí es la uniformidad de la cobertura (90% bases objetivo están cubiertas 100x, 95% están cubiertas 20x) en las regiones interrogadas (15,992) a una profundidad de cobertura media típica de 1000x. La alta profundidad de cobertura acoplada al enriquecimiento de células neoplásicas a través de microdisección garantiza una alta sensibilidad para la detección de eventos de baja frecuencia de alelo. Como hemos demostrado anteriormente9, el enfoque de secuenciación dirigida permite la detección de mutaciones hasta una frecuencia de alelo del 2% en muestras de ADN del tejido FFPE. Como ejemplo, en el presente trabajo pudimos identificar una mutación de alelos TP53 con frecuencia de alelo del 4% como un evento subclonal en un espécimen metastásico(Figura 5)y validamos esta ocurrencia por inmunohistoquímica(Figura 6). Nuestro protocolo prevé la secuenciación del ADN tumoral y germinal emparejado con el fin de identificar eventos somáticos y, en consecuencia, reducir la falsa tasa de detección de mutaciones subclonales de la tubería10sólo de cáncer. Cuando el ADN de línea germinal coincidente no está disponible, uno podría considerar la adopción de parámetros más conservadores en el análisis de los datos de secuenciación, incluyendo filtros estrictos basados en la profundidad mínima de cobertura, así como variantes limitantes que llaman a "mutaciones de puntos calientes" y mutaciones ampliamente anotadas en las bases de datos disponibles. La secuenciación del ADN germinal junto con los tumores emparejados también tiene la ventaja de permitir la detección precisa de variaciones de númerode de copia (CNV). Alternativamente, las agrupaciones de genomas diploides emparejados con género podrían utilizarse para reducir el ruido de los datos de secuenciación y facilitar la detección del CNV. Además de la inclusión de ADN germinal, modificamos el protocolo de la biblioteca para reducir el desequilibrio de la piscina de imprimación y mejorar las llamadas CNV. De acuerdo con el protocolo original, las cuatro agrupaciones de amplificación producidas a partir de cada muestra de ADN después de que la PCR multiplex debe mezclarse y los pasos restantes se realizarían en un tubo por muestra. Sin embargo, esto causa fluctuaciones en la profundidad de cobertura media por piscina debido al hecho de que la PCR multiplex puede tener una eficiencia diferente a través de diferentes tubos. No hubo ningún paso de cuantificación/normalización de grupo para tener en cuenta este efecto en el protocolo original. Para evitar las fluctuaciones descritas anteriormente, decidimos mantener cada una de las cuatro agrupaciones de amplificación separadas a lo largo de todo el protocolo de producción de la biblioteca, hasta que pudieran cuantificarse. Tras la cuantificación, se podría añadir la misma cantidad de cada uno de los cuatro grupos para cada muestra de ADN al pool final de la biblioteca, asegurando que la cobertura media final fuera lo más uniforme posible.

La evaluación de la heterogeneidad intratumoral (ITH) a nivel genético tiene importantes implicaciones clínicas, pero también plantea nuevos desafíos2. Un desafío importante es, de hecho, la necesidad de distinguir entre mutaciones del conductor y eventos estocásticos (es decir, mutaciones de pasajeros). La distinción entre mutaciones de conductor y pasajero a menudo se logra computacionalmente, pero no sin sesgos. Si bien la funcionalización sistemática de las variantes detectadas es costosa y requiere mucho tiempo, las consecuencias funcionales de las variantes genéticas podrían evaluarse, al menos para un subconjunto de genes, mediante análisis inmunohistoquímicos de la proteína correspondiente o, indirectamente, midiendo la expresión de marcadores sustitutos de la disfunción proteica. Nuestro protocolo se ha aplicado a los tejidos FFPE, que representa la principal fuente de materiales en el entorno clínico, pero planteando desafíos para la secuenciación; la calidad de los ácidos nucleicos aislados siempre debe evaluarse antes de la secuenciación11. Aunque la secuenciación dirigida tiene la principal ventaja de ser rentable y no muy exigente en términos de requisitos computacionales, tiene la principal desventaja de interrogar sólo una parte limitada del genoma, lo que probablemente conduce a subestimar heterogeneidad intratumoral. Además, este enfoque no está considerando diferencias epigenéticas y transcriptomicas relevantes entre la metástasis y los tumores primarios que se ha demostrado recientemente que superan las diferencias genéticas en ciertos tipos de tumores4,12, 13. Sin embargo, se prevé que los avances tecnológicos pronto permitirán la integración de un conjunto de datos vertical más rico para una mejor evaluación de las TIH. Nuestro enfoque prefiere la profundidad a la cobertura física del genoma, lo que limita nuestra capacidad de construir filogenias adecuadas basadas en SNV. Sin embargo, nuestro método ofrece la oportunidad de explorar la relación genética en muestras clínicas con la sensibilidad y especificidad adecuadas debido a la integración de análisis moleculares e histopatológicos. Hemos aplicado con éxito este protocolo en un tipo de tumor específico (por ejemplo, SPN) y predecimos que el método funcionará de manera similar en otros tipos de tumores sólidos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El estudio fue apoyado por el Proyecto Génova Del Cáncer Italiano (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Concesión No 12182 a AS y 18178 a VC), 77 Subvención de la Comunidad Europea (Cam-Pac No 602783 a AS). Los organismos de financiación no tuvieron ningún papel en la recopilación, análisis e interpretación de datos ni en la redacción del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies G2939BA  Automated electrophoresis tool
Agencourt AMPure XP Kit Fisher Scientific NC9959336 Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4627 Library quantification
Anti-BAP1 Santa Cruz Biotechnology sc-28383 Antibody
Anti-GLUT1 Thermo Scientific RB-9052 Antibody
Anti-KDM6A Cell Signaling #33510 Antibody
Anti-p53 Novocastra NCL-L-p53-DO7 Antibody
Anti-βcatenin Sigma-Aldrich C7207 Antibody
Blocking Solution home made - 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST
Endogenous peroxidases inactivation solution home made - 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x
Leica CV ultra Leica 70937891 Entellan mountin media
Epitope Retrieval Solution 1 Leica Biosystems AR9961 Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution
Epitope Retrieval Solution 2 Leica Biosystems AR9640 EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution
Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear Eppendorf 951010006 Tubes
Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021 Tubes
Ethanol DIAPATH A0123 IHC deparaffinization reagent
ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H­4000 Hydrophobic Pen
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Laboratories SK­4105 HRP substrate
ImmPRESS Anti­Rabbit Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7401­50 Secondary antibody
ImmPRESS Anti­Mouse Ig Reagent Peroxidase Vector Laboratories MP­7402­50 Secondary antibody
Integrative Genomics Viewer (IGV) Broad Institute - https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel Thermofisher Scientific 4477685 Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermofisher Scientific 4480441 Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels
Ion Chef Instrument Thermofisher Scientific 4484177 Automated library preparation, template preparation and chip loading
Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip Thermofisher Scientific A26771 or A27766 Barcoded chips for sequencing
Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef Thermofisher Scientific A27198 or A30011 Template preparation
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit Thermofisher Scientific A26433 or A30011 Sequencing
Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System Thermofisher Scientific 4476610 or A38196 Sequencing system
Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair Thermofisher Scientific 4487118 Workflow
Ion Reporter Software - uploader plugin Thermofisher Scientific 4487118 Data analysis tool
Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin that describe the level of sequance coverage produced
Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin Thermofisher Scientific 4483643 Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference
Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit Thermofisher Scientific 4474517 Unique barcode adapters
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermofisher Scientific ND-2000 DNA purity detection
NCBI reference sequence (RefSeq) database NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix High Fidelity Fisher Scientific 12532-016 or 12532-024 SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix
QIAamp DNA Blood Mini Kit Quiagen 51106 0r 51104 DNA blood extraction kit
QIAamp DNA FFPE Tissue Quiagen 56404 DNA FFPE tissue extraction kit
Qubit 2.0 Fluorometer Thermofisher Scientific Q32866 DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermofisher Scientific Q32850 Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer
TBST home made - Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20
Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film Sakura Europe 6172 Automated tissue slide stainer instrument
Variant Effect Predictor (VEP) software EMBI-EBI - http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP
Xilene, mix of isomeres Carlo Erba 492306 IHC deparaffinization reagent

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References

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Análisis comparativo de lesiones a través de un enfoque de secuenciación dirigida
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Cite this Article

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).More

Vicentini, C., Mafficini, A., Simbolo, M., Fassan, M., Delfino, P., Lawlor, R. T., Rusev, B., Scarpa, A., Corbo, V. Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach. J. Vis. Exp. (153), e59844, doi:10.3791/59844 (2019).

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