Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kortsigtede fritflydende udsnit kulturer fra den voksne menneskelige hjerne

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

En protokol til at forberede fritflydende skive kulturer fra voksne menneskelige hjerne er præsenteret. Protokollen er en variation af den udbredte skive kultur metode ved hjælp af membran skær. Det er simpelt, omkostningseffektivt, og anbefales til at kørekort sigtede assays sigter mod at opklare mekanismer af neurodegeneration bag aldersrelaterede hjernesygdomme.

Abstract

Organotypiske, eller skive kulturer, er blevet bredt anvendt til at modellere aspekter af det centrale nervesystem fungerer in vitro. På trods af potentialet i Skive kulturer i neurovidenskab, undersøgelser ved hjælp af voksne nervevæv til at forberede sådanne kulturer er stadig knappe, især dem fra menneskelige. Brugen af voksne menneskelige væv til at forberede skive kulturer er særligt attraktivt at forbedre forståelsen af humane neuropatiologier, da de har unikke egenskaber typisk for den modne menneskelige hjerne mangler i skiver fremstillet af gnaver (normalt neonatal) nervevæv. Denne protokol beskriver, hvordan man bruger hjernevæv indsamlet fra levende menneskelige donorer indsendt til resective hjernekirurgi til at forberede kortsigtede, fritflydende skive kulturer. Procedurer til at vedligeholde og udføre biokemiske og cellebiologi assays ved hjælp af disse kulturer er også præsenteret. Repræsentative resultater viser, at den typiske humane kortikale laminering bevares i skiver efter 4 dage in vitro (DIV4), med forventet tilstedeværelse af de vigtigste neurale celletyper. Desuden, skiver på DIV4 undergår robust celledød, når udfordret med en giftig stimulus (H2O2), hvilket indikerer potentialet i denne model til at fungere som en platform i celledød assays. Denne metode, et enklere og omkostningseffektivt alternativ til den udbredte protokol ved hjælp af membran skær, anbefales primært til at kørekort varige assays, der har til formål at opklare mekanismer af neurodegeneration bag aldersrelaterede hjernesygdomme. Endelig, selv om protokollen er afsat til anvendelse af kortikale væv indsamlet fra patienter indsendt til kirurgisk behandling af farmakoresistant temporale lobe epilepsi, det hævdes, at væv indsamlet fra andre hjerneregioner/betingelser bør også være betragtes som kilder til at producere lignende fritflydende udsnit kulturer.

Introduction

Brugen af humane prøver i forskning er utvetydigt en stor mulighed for at studere menneskelige hjerne patologier, og moderne teknikker har åbnet nye måder for robuste og etiske eksperimenter ved hjælp af patient-afledte væv. Metoder som organotypic/skive kulturer fremstillet af voksne menneskelige hjerne er blevet mere og mere anvendt i paradigmer såsom optogenetik1, Elektrofysiologi2,3,4,5, plasticitet 6,7,8,9, neurotoksicitet/neuroprotection10,11,12,13, celleterapi14, Drug screening15,16,17, genetik og genredigering12,18,19,20, blandt andre, som en strategi for bedre at forstå neurologiske sygdomme i voksenalderen.

Forståelsen af mekanismer underliggende menneskelige hjerne patologier afhænger af eksperimentelle strategier, der kræver et stort antal emner. Omvendt, i tilfælde af skive kulturer, selv om adgang til humane prøver stadig er vanskelig, muligheden for at generere op til 50 skiver fra en enkelt kortikal prøve delvist omgår kravet om rekruttering af flere frivillige ved at øge antal replikater og udførte assays pr. indsamlet væv21.

Flere protokoller for hjernen organotypic/skive kulturer er blevet beskrevet, spænder fra den klassiske oculo udkast22,23 til rullerør24,25,26, semi-permeable membraner grænseflade27,28,29,30og fritflydende udsnit31,32. Afhængigt af de særlige forhold i et eksperimentelt design, hver teknik har sine egne fordele og ulemper. Kortvarige, fritflydende skiver kulturer fra voksne menneskelige hjerner er i nogle tilfælde fordelagtige over den metode, der anvendes af Stoppini et al.27, hvis man tager i betragtning, at selv om langvarig celle overlevelse in vitro normalt er et stort problem, når man evaluerer en kultur metode, i mange eksperimenter kun korte perioder af tid i kulturen er nødvendige12,31,32,33,34,35. Under disse betingelser, brugen af fritflydende kulturer præsenterer fordelen ved at være enklere og mere omkostningseffektiv, samt mere præcist ligner den oprindelige menneskelige væv tilstand end skiver holdes i kulturen over 2-3 uger.

På trods af potentialet i Skive kulturer til neurovidenskab, er undersøgelser ved hjælp af voksne nervevæv til at forberede sådanne kulturer stadig knappe, især fra menneskelige. Denne artikel beskriver en protokol til at bruge indsamlede hjernevæv fra levende menneskelige donorer indsendt til resective hjernekirurgi til at forberede fritflydende skive kulturer. Procedurer til at vedligeholde og udføre biokemiske og cellebiologi assays ved hjælp af disse kulturer er detaljerede. Denne protokol er blevet bevist værdifuld for at analysere levedygtighed og neuronal funktion i undersøgelser af mekanismerne i neuropatiologier knyttet til voksenalderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Levende voksne hjernevæv blev opnået fra patienter, der gennemgik reektiv Neurokirurgi til behandling af farmakoresistant temporale lobe epilepsi (figur 1A). Alle procedurer blev godkendt af den etiske komité fra klinikker Hospital på Ribeirão Preto Medical School (17578/2015), og patienter (eller deres juridiske ansvarlige person) aftalt og underskrevet informeret samtykke vilkår. Indsamlingen af vævet blev udført af neuro kirurgi team på epilepsi kirurgi Center (CIREP-klinikker Hospital på Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brasilien).

1. sterilisering af materialer

Bemærk: alt materiale og alle opløsninger skal steriliseres før brug.

  1. Steriliser alle kirurgiske værktøjer og vibratome udskæring materiale (knivholder, prøve disk, buffer bakke) i en tør steriliserings ovnen i 4 h ved 180 °c.
  2. Steriliser temperaturfølsomt materiale eller udstyr ved UV-eller gammabestråling.
  3. Steriliser medier og opløsninger ved autoklavering eller filtrering gennem 0,22 μm pore membraner.

2. forberedelse af løsninger

  1. Forbered 15-20 mL transportløsning: 50% v/v Hanks ' balanceret saltopløsning (HBSS) pH 7,4, 50% v/v basal medium til vedligeholdelse af postnatal og voksne hjernen neuroner (tabel over materialer), suppleret med 10 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethansulfonsyre (Hepes), 3 mg/mL glucose og 33 μg/mL gentamicin.
    Bemærk: transport opløsningen skal opbevares i køleskab og iltning (boblende med carbogen-gas) i mindst 20 minutter før prøveindsamlingen.
  2. Der fremstilles 300 mL skære opløsning (HBU'ER suppleret med 10 mM HEPES og 3 mg/mL glucose) og afkøles i en fryser til det indledende krystaldannelse.
  3. Forbered 20 mL kulturmedium: basal medium til vedligeholdelse af postnatal og voksen hjernen neuroner (tabel over materialer) suppleret med 1% L-glutamin derivat (tabel over materialer), 2% supplement til neurale kultur (tabel over Stoffer), 1% penicillin/streptomycin og 0,25 μg/ml amphotericin B.

3. opsætning af udsnitnings apparater

Bemærk: denne protokol er ideelt udført med bistand fra en kollega på grund af logistik af prøveindsamling i operationsstuen.

  1. I en spand salt tilsat is, lad udskæring løsning hvile under carbogen blanding boblende (95% O2,5% co2) i mindst 20 min før brug.
  2. Forbered en blok på 3% agopstået (ca. 2 cm x 2 cm x 2 cm) og superlim den til vibratome-prøve disken for at skabe yderligere mekanisk støtte til vævsprøven under udskæring (figur 1E).
  3. Indstil vibratome til udskæring: snittykkelse på 200 μm, frekvens af vibrationer på 100 Hz, og hastigheden af udskæring mellem 0,5-1,0 mm/s.
  4. Lås vibratome buffer bakken til vibratome base og tilsæt is for at holde den afkølet, før du modtager skære opløsningen og prøven, og under hele udsnitnings proceduren.

4. indsamling af prøver

Bemærk: i denne protokol blev humant neortical væv indsamlet i operationsstuen og transporteret til laboratoriet.

Forsigtig: når der er tale om humane prøver, følges de relevante sikkerhedsprotokoller, der er fastlagt af institutionen.

  1. Indstil transport apparatet (figur 1C), der består af: en bærbar Gascylinder med carbogen-blanding forbundet med en Tryk/flux-ventil, der styrer den gasudgang, der er forbundet med en silikone slange, som forbinder gasproduktionen til transport fartøj et transportfartøj, sædvanligvis et 50 mL konisk centrifugeglas med perforeret låg til gastilførsel, der indeholder transport opløsningen og is til prøve køling under transport.
  2. Indsamle og transportere prøven (figur 1B) straks til laboratoriet. Submerse prøven i kold transport opløsning (konstant bukkede med carbogen blanding).

5. udskæring

  1. Prøven overføres til en Petri skål (100 mm x 20 mm), der indeholder slicingopløsning, og med fine kirurgiske værktøjer skal du forsigtigt fjerne så meget som muligt af de resterende meninger i prøven (figur 1D).
  2. Vælg den bedste model til at fremstille skiver med de særlige karakteristika ved det eksperimentelle design, og med en no. 24 skalpelblade, trim en flad overflade, der skal fastklæbes til prøve disken.
  3. Brug en engangs plastik skeen og sarte pensler, Saml fragmentet fra Petri skålen og tør overskydende opløsning ved hjælp af filtrerpapir (tør ved kapillaritet og undgå at røre vævs fragmentet med papir).
  4. Ved hjælp af superlim, fastgør vævet til vibratome objekt disk, indtil det er fastklæbet til disken og i kontakt med den agopstået blok (figur 1E).
  5. Placer vibratome-prøve disken (med vævet korrekt påsat) i den vibratome buffer bakke, der er fyldt med udskæring-løsning, som skal boblende under hele processen.
  6. Lås knivholderen på plads med barberbladet fast monteret.
  7. Udsnitnings opløsningen skal dække både prøven og klingen, og først derefter begynde udskæring (figur 1F).
  8. Skær prøven i 200 μm skiver.
    Bemærk: selv om nogle vibratomer skærer prøverne automatisk, kan den tætte observation og mindre justeringer i skærehastigheden under processen hjælpe med at producere bedre skiver. Kassér oprindelige uregelmæssige udsnit.
  9. Overfør udsnittene fra buffer bakken til en Petri skål med udskæring Solution og trim løse kanter og overskydende hvidt mater til en andel på omkring 70% cortex/30% hvidt stof.

6. kultur

Bemærk: Udfør dette trin i et laminar flow kabinet under sterile omgivelser.

  1. Der tilsættes 600 μL kulturmedium pr. brønd (i en 24-brønd plade), og der inkubates i mindst 20 minutter ved 36 °C og 5% CO2 , før udsnittene klæber.
  2. Plade en skive pr brønd ved hjælp af en pensel (figur 1G).
  3. Hvis der er ubrugte brønde i pladen, fyldes de med 400 μL sterilt vand.
  4. Pladen inkubates ved 36 °C, 5% CO2.
    Bemærk: første medium udskiftning skal ske i mellem 8-16 h efter plating afhængigt af størrelsen af skiven.
  5. 10 mL af det tidligere tilberedte dyrkningsmedium suppleres med 50 ng/mL hjerne afledt neurotrofisk faktor (BDNF).
    Bemærk: i løbet af den første 8-16 h inkuberes udsnittene i 600 μL medium for at undgå næringsstof afsavn og forsuring, da middel forbruget i denne fase accelereres. Fra næste trin justeres mængden af medium pr. brønd til 400 μL.
  6. Fjern 333 μL af det konditionerede medium fra hver brønd og tilsæt 133 μL frisk BDNF-suppleret medium.
  7. Gentag processen med medium udskiftning hver 24 h ved at udskifte en tredjedel af det konditionerede medium med frisk BDNF-suppleret medium.

7. evaluering af sundhed, morfologi og funktion i dyrkede skiver

Bemærk: for at inducere celledød med henblik på illustration i de repræsentative resultater, blev nogle skiver underlagt en 24 timers behandling med den oxidativ stress induktor h2O2. Trin 7.1.2 og 7.1.3 beskriver brugen af H2O2 for at inducere celledød.

  1. Cellernes levedygtighed
    Bemærk: en enkel, ligetil metode til at evaluere neurotoksisk/neuroprotection i udfordrede skive kulturer er den 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) assay36, som måler procentdelen af metaboliske aktive celler under normale forhold sammenlignet med behandlede prøver.
    1. Udskift en tredjedel af mediet med et frisk medium i laminar flow kabinettet.
    2. Fra en 30% H2o2 stamopløsning tilsættes et rumfang H2o2 pr. brønd for at nå den tilsigtede endelige koncentration (30 mm eller 300 mm).
      Bemærk: H2O2 blev tilføjet efter den daglige ændring af mediet for at garantere korrekt forsyning af friske næringsstoffer forud for udfordringen.
    3. Pladen inkubates i 24 timer ved 36 °C, 5% CO2.
      Bemærk: efter H2O2 behandling (eller andre toksiske stimuli af interesse) beskriver følgende trin bestemmelse af CELLERNES levedygtighed ved MTT-analysen.
    4. Tilsæt 40 μL MTT-opløsning til en slutkoncentration på 0,5 mg/mL til hver brønd i pladen.
    5. Pladen inkubates ved 36 °C, 5% CO2 i 3 timer.
    6. Udsnittene vaskes med fosfat-bufferet saltvand (PBS) og overføres til et mikrorør.
    7. Fjern forsigtigt den resterende opløsning ved pipettering.
    8. Afvejes de mikrorør, der indeholder skiverne, for at bestemme massen af hver skive (dette er nøglen til normalisering af de opnåede absorbans aflæsninger).
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan prøverne fryses (-20 °C) på dette tidspunkt til senere behandling.
    9. Udsnittene i 200 μL isopropanol/HCl homogeniseres ved hjælp af en motoriseret Pestle.
    10. Centrifugeres ved stuetemperatur (RT) i 2 min. ved 2600 x g.
    11. Supernatanten opsamles, og absorbansen måles ved 540 nm.
  2. KCl-induceret neuronal depolarisering
    Bemærk: fosforylering af mitogen aktiveret protein kinase (MAPK) signalering Cascade protein ERK, efterfulgt af Western blotting, kan anvendes til kvantificering af neuronal respons på KCl-induceret depolarisering37 .
    1. Ved strømnings kabinettet skal du udskifte kulturmediet med 300 μL HBSS, som tidligere er blevet ækvibreret til 36 °C.
    2. HBU'ERNE udskiftes med 300 μL frisk HBSS, som tidligere er blevet ækvibteret til 36 °C.
    3. Pladen inkubates ved 36 °C, 5% CO2 i 15 min.
    4. HBU'ERNE udskiftes med enten den friske HBSS eller med 80 mM KCl depolariserende opløsning (begge ved 36 °C) og Inkubér ved 36 °C, 5% CO2 i 15 min.
    5. Overføre skiver fra pladen til mikrorør. På dette trin kan skiver opbevares ved-20 °C til senere behandling.
    6. Forbered vævs ekstrakter i 150 μL radioimmunopræcipitation (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% nonionisk overfladeaktivt stof; 0,1% natriumdodecylsulfat; pH 7,5). Centrifugerings ekstrakter ved 4 °C i 10 minutter ved 16000 x g, Saml supernatanten, og Bestem den totale proteinkoncentration ved hjælp af Bradford-metoden.
    7. 30 μg total protein belastes på en 12% natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side).
    8. Efter elektroforese overføres gel-indholdet til en nitrocellulose membran.
    9. Efter blokering af membranen med 5% fedtfri mælk i TBS plus 0,1% Tween, Inkuber med mus anti-pERK (1:1000) for 16 timer ved 4 °C. Efter vask, Inkuber i 2 timer ved RT med kanin anti-ERK1/2 (1:1000).
    10. Med det relevante HRP-konjugeret sekundære antistof ved RT i 1 time.
    11. Med det foretrukne HRP-substrat.
  3. Morfologisk evaluering
    Bemærk: ud over celle overlevelse og funktionelle evalueringer, er det vigtigt at analysere vævs morfologi. Vær opmærksom på, at resectioning den dyrkede skive er et vigtigt skridt til at producere så meget materiale af høj kvalitet som muligt for morfologiske analyse.
    1. Fastgørelse, cryoprottering og resectioning af udsnit
      1. Overføre skiver fra brøndene med kulturmedium til en ny 24 brønd plade indeholdende PBS.
      2. PBS fjernes, og 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) tilsættes. Det er vigtigt, at skiver holdes fladt, inden PFA tilføjes. Inkuber natten over ved 4 °C.
      3. Fjern forsigtigt PFA-opløsningen, og tilsæt 1 mL 30% saccharose opløsning. Inkuber i 48 h ved 4 °C.
      4. Sæt fryse mikrotomen til-40 °C.
      5. Der fremstilles en saccharosebase på mikrotomstadiet, hvor udsnittene skal anbringes (figur 2a). Lad det fryse helt og forsigtigt skære nogle af de frosne saccharose til at producere en flad overflade, hvor skiven vil blive placeret.
      6. Placer hver skive over en strakt plastikfilm og brug en pensel til at flade vævet.
      7. Overfør den strakte skive til den frosne saccharose base i et enkelt træk.
        Bemærk: det er ikke muligt at flytte udsnittet, når det er over den frosne saccharose base. Udfør dette overførselstrin omhyggeligt.
      8. Lad skiven hvile i 5-10 min for korrekt frysning.
      9. Skær skiven i 30 μm sektioner.
      10. Overfør de 30 μm sektioner til en Petri skål indeholdende PBS.
      11. Fortsæt til histologi protokollen mere passende til det eksperimentelle design.
        Bemærk: de 30 μm sektioner kan let bruges til fritflydende immun histokemi, monteret på mikroskopi-slides for yderligere histologi eller opbevaret i frostvæske ved-20 °C.
    2. Immunhistokemi
      Bemærk: Immunhistochemistry og immunofluorescens standardprotokoller varierer mellem laboratorier. For en detaljeret version af den protokol, der anvendes her, henvises til Horta et al.38. Primære antistoffer, der anvendes til immunostainings præsenteret i figur 2 omfatter neuronal kerner (Neun), sund moden neuron markør, gliaceller fibrillært syreholdigt protein (GFAP), astorcytter markør, ioniseret calcium bindende adapter (IBA-1), og microglia Markør.
      1. Inkuber udsnittene i blokerende opløsning (f. eks. 2% normalt æsel serum i PBS) i 40 min.
      2. Inkuber natten over med primært antistof under mild agitation ved 4 °C.
      3. Efter vask med PBS inkubateres 120 min med biotinyleret sekundært antistof under mild agitation ved RT.
      4. Efter vask med PBS, inkuberes ved RT for 120 min med avidin-peroxidase konjugat (tabel over materialer).
      5. Afslør med DAB + 0,04% nikkel ammonium.
      6. Monter de farvede sektioner på gelatine belagt mikroskopi slides og lad dem lufttørre. Dehydrat i ethanol, diaphanize i xylen, finish med monterings medium (tabel over materialer), dække med en dækseddel, og billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et kritisk aspekt for at evaluere kvaliteten og sundheden af dyrkede skiver er tilstedeværelsen og typiske morfologi af de forventede neurale celletyper, neuroner, og gliaceller celler. Den typiske arkitektur af den menneskelige kortikale laminering blev observeret i en skive på DIV4, afsløret af neuronal immunolabeling (figur 2D). Desuden blev den forventede tilstedeværelse af microglia og astroglia (figur 2B, C) også observeret. Disse resultater viser, at vævs arkitekturen ikke påvirkes væsentligt enten af den kirurgiske procedure/prøve behandling eller af den kortsigtede periode in vitro. I overensstemmelse med tidligere fund blev det påvist, at NeuN immunoreactivity ikke blev ændret mellem DIV0 og DIV432. Baseret på disse resultater, den fritflydende kultur format, forbundet til den reducerede tykkelse af skiven til 200 μm (i forhold til den udbredte 300-400 μm, når membran skær anvendes), bidrog til bedre diffusion af ilt og næringsstoffer til indre cellelag i skiver, som tidligere har vist sig at være afgørende for sundheden af dyrkede skiver39,40.

Kvantificering af celledød i skiver er også en værdifuld tilgang i ex vivo-modeller af neuropatiologier, såsom skive kulturer (gennemgået af Lossi et al.41). I en tidligere undersøgelse, vi brugte MTT assay til at bestemme celledød niveauer langs perioden i kultur32. Ud over levedygtigheden viste samme undersøgelse også, at kultiverede skiver (op til DIV4) bevarede kapaciteten til at frigive neurotransmittere ved KCl-induceret depolarisering32. Her blev disse fund udvidet ved at undersøge neuronal respons på KCl-induceret depolarisering på Erk fosforylering, en central kinase involveret i processer som synaptisk plasticitet og hukommelse42,43. Interessant, en klar stigning i ERK fosforylering blev set i KCl-behandlede skiver på DIV4 (figur 3a, B).

Endelig blev reaktionen af skiver på DIV4 til en giftig udfordring evalueret med en kendt oxidativ stress inducer, H2O2. Begrundelsen var, at omfanget af celledød bør være proportional med niveauet af cellernes levedygtighed i de dyrkede skiver. Som vist i figur 3Cmedførte udsnittene til 300 mm h2O2 for 24 timer et robust fald i MTT-reduktionen. Taget sammen, den massive celledød observeret i DIV5 efter H2O2 udfordring og KCl-induceret depolarisering resultater indikerer, at den bevarede generelle sundhed af skiver på DIV4 reagerer tilstrækkeligt på en giftig stimulus såsom oxidativ Stress.

Figure 1
Figur 1: prøveopsamling, transport, udskæring og dyrkning af kortikale væv fra voksne mennesker. Proceduren starter ved det kirurgiske rum med samling af kortikale væv fra Temporal lobectomy til behandling af farmakoresistant epilepsi (A, B). C) vævs fragmentet (n = 1) overføres straks til et rør, der indeholder iskold oxygenholdig transportmedium (se nedenfor). (D) i laboratoriet fjernes meninges ved hjælp af fine oftalmiske pincetter. Overskydende væske tørres ved hjælp af filtrerpapir, og fragmentet er over limet (E) til vibratome-prøve disken med den hvide substans vendt nedad og Pial overflade opad. F) ved hjælp af en kommerciel barberkniv skæres prøven i 200 μm skiver, der opsamles med en delikat pensel og føres tilbage til Petri skålen for yderligere trimning af overskydende hvidt stof og løse ender (ikke vist) før (G) ning og dyrkning i et frit flydende format. (H) skiver kulturer holdes levedygtige i flere dage og kan anvendes i en række eksperimentelle protokoller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: morfologisk analyse af neurale celler i Skive kulturer fra voksne menneskelige hjerne. Skiver blev fastgjort på den fjerde dag in vitro. (A, B, C) Repræsentative trin i skære proceduren forud for Immunhistokemi. Vævet var digitalt farvet for at forbedre visualiseringen. D) normal fordeling af neuroner i kortikale lag (romertal). (E) mikroglia ogf) astrocytter blev også tydeligt observeret (n = 1 skive pr. celletype mærkning). Alle skiver blev fremstillet af væv fra en enkelt donor. Skala stænger = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: funktionelle og cellelevedygtighed assays i voksne menneskelige hjerne skive kulturer. Neuronal aktivitet blev evalueret i skiver på dag in vitro 5 (DIV5) af KCl-induceret depolarisering og deraf følgende stigning i ERK fosforylering. A) et repræsentativt immunoblotresultat opnået med homogenater fra en skive. Bands svarende til fosho ERK (Perk) og total ERK (tERK) er indiceret. B) kvantificering af forholdet mellem frynsegode og Terk i tre uafhængige skiver fra en enkelt menneskelig donor. C) toksiciteten af hydrogenperoxid (H2O2) blev evalueret ved MTT-analysen i skiver ved div 5. De opnåede optiske tæthedsværdier blev normaliseret med massen af hver skive. Skiver blev udfordret med H2o2 ved de angivne koncentrationer (no H2o2; 30 mm h2o2; 300 mm h2o2) for 24 H. billeder af repræsentative skiver efter inkubation med MTT vises over søjlerne. Resultaterne præsenteres som gennemsnitlig ± standardfejl fra data indhentet fra tre uafhængige skiver fra en enkelt donor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol til produktion af fritflydende, kortvarige skive kulturer er en alternativ metode til dyrkning af voksne menneskelige neortikale skiver. En sådan protokol for skive kulturer kan være modtagelig for undersøgelser af (men ikke begrænset til) optogenetik1,44,45, Elektrofysiologi2,3,4,5 , kort tids plasticitet46,47, langsigtet plasticitet48,49, neurotoksicitet/neuroprotection10,11,12, 13, celleterapi14, Drug screening15,16,17, kræft50,51, genetik, og genredigering12,18 ,19,20.

Brugen af prøver fra voksne humane væv er særlig vigtigt at forstå humane neuropatiologier, på grund af unikke egenskaber typisk for den menneskelige hjerne mangler i skiver fremstillet af gnaver nervevæv52. Desuden er Skive kulturer fra gnavere hjerner almindeligt fremstillet af neonatal, umodne hjerner, som er meget plastik og indeholder migrerende celler, der kan ændre den oprindelige skive cytoarkitektur til at tilpasse sig in vitro-miljø26, 53,54,55. Sådanne plast hændelser fører til ændringer i kredsløb, der bør undgås, når målet er at efterligne in vivo tilstand, som anført af ting et al.30: "vi valgte at fokusere på kulturer på mindre end en uge, hvor strukturelle og funktionelle egenskaber er rimeligt opretholdes med minimal perturbation, at være så sammenlignelige som muligt til målinger opnået ved hjælp af Gold-standard akut skive præparater ". Selv om en metode, der anvendes til kort tids dyrkning, i første omgang kan betragtes som begrænset, er det derfor ikke nødvendigt med langsigtet dyrkning for at frembringe relevante resultater i mange eksperimentelle design32,33,34 ,35,56,57.

To kritiske trin i protokollen er den reducerede tykkelse af skiver (200 μm) og tilskud af kulturmediet med BDNF. I tidligere arbejde32, har vi vist bevarelse af cellernes levedygtighed op til 4 div og diskuterede det sandsynlige bidrag af reduktionen af skive tykkelse til 200 μm i forhold til de oftere anvendte 300-400 μm skiver12,29. Dybest set, reducere skiver tykkelse kan bidrage til en bedre iltning og næringsstoffer optagelse i fritflydende skiver, mindske chancerne for kerne hypoksi og neurodegeneration31,32,57, 58,59,60,61. Desuden anbefales det at holde væv i koldt, ilterede medier fra det kirurgiske rum til udskæring trin på vibratome, i betragtning af den høje efterspørgsel efter O2 af den voksne menneskelige centralnervesystemet. Tilskud af medium med BNDF er tidligere blevet set at let øge levedygtigheden i voksne menneskelige hjerne skiver kultiveret fritflydende32, i overensstemmelse med anbefalingerne for medium tilskud med neurotrofiske faktorer af andre forfattere 62af63.

Afslutningsvis, denne protokol beskriver metoder til at forberede og køre assays med kortsigtede, fritflydende skive kulturer fra voksne menneskelige hjerner. Denne model bør kunne gøres til genstand for undersøgelser af de mekanismer for toksicitet/Neuro beskyttelse, der er relevante for aldersrelaterede hjernesygdomme. Brugen af menneskeligt resekterede væv præsenterer fordelen ved at bevare hjernens cytoarkitektur og lokale kredsløb, tilføje translationel magt til opnåede resultater. Desuden kan brister brugen af humane-afledte prøver fra Neurokirurgi i neurovidenskab bidrage til at reducere behovet for dyreforsøg. Selv om denne protokol er centreret omkring brugen af væv indsamlet fra patienter indsendt til Neurokirurgi for farmakoresistant epilepsi behandling, det foreslås, at væv indsamlet fra andre hjerneregioner/betingelser også betragtes som kilder til produktion af skive kulturer på en enkel og omkostningseffektivmåde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde understøttes af FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doktor Fellowship PNPD/INCT-HSM til A.F. og præ-doktor stipendiat til N.D.M.) og FAEPA. G.M.A. har en Master's Fellowship fra FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. besidder et CNPq Research Fellowship. Vi takker patienterne og deres familier for at donere det viderekomne væv til denne undersøgelse. Vi vil gerne anerkende støtte fra beboere, sygeplejersker, teknikere og CIREP team, fra det kliniske Hospital på Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, der hjalp i forskellige stadier af processen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20 (2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103 (2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002 (2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Tags

Neurovidenskab histoculture neocortex ex vivo neurodegeneration epilepsi Alzheimers
Kortsigtede fritflydende udsnit kulturer fra den voksne menneskelige hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, A., Mendes, N. D.,… More

Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter