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Neuroscience

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età.

Abstract

Organotipica, o colture di fette, sono state ampiamente impiegate per modellare aspetti del funzionamento del sistema nervoso centrale in vitro. Nonostante il potenziale delle colture di fette nelle neuroscienze, gli studi che utilizzano il tessuto nervoso adulto per preparare tali culture sono ancora scarse, in particolare quelle provenienti da soggetti umani. L'uso di tessuto umano adulto per preparare le colture di fette è particolarmente interessante per migliorare la comprensione delle neuropatologie umane, in quanto contengono proprietà uniche tipiche del cervello umano maturo privo di fette prodotte da roditori (di solito neologati) tessuto nervoso. Questo protocollo descrive come utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette a breve termine, galleggianti libere. Vengono inoltre presentate procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture. I risultati rappresentativi dimostrano che la tipica laminazione corticale umana è conservata in fette dopo 4 giorni in vitro (DIV4), con la presenza prevista dei principali tipi di cellule neurali. Inoltre, le fette al DIV4 subiscono una robusta morte cellulare quando vengono sfidate con uno stimolo tossico (H2O2), indicando il potenziale di questo modello per fungere da piattaforma nei saggi di morte cellulare. Questo metodo, un'alternativa più semplice ed economica al protocollo ampiamente usato utilizzando inserti di membrana, è raccomandato principalmente per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età. Infine, sebbene il protocollo sia dedicato all'utilizzo del tessuto corticale raccolto da pazienti sottoposti al trattamento chirurgico dell'epilessia del lobo temporale farmacoresistente, si sostiene che anche i tessuti raccolti da altre regioni/condizioni cerebrali per produrre simili colture di fette a flotta ntetto.

Introduction

L'uso di campioni umani nella ricerca è inequivocabilmente una grande opzione per studiare le patologie cerebrali umane, e le tecniche moderne hanno aperto nuovi modi per la sperimentazione robusta ed etica utilizzando tessuti derivati dal paziente. Metodi come le colture organotipiche/fette preparate dal cervello umano adulto sono stati sempre più utilizzati in paradigmi come l'optogenetica1, l'elettrofisiologia2,3,4,5, plasticità 6,7,8,9,neurotossicità/neuroprotezione10,11,12,13, terapia cellulare14, screening farmacologico15,16,17, genetica e genetica editing12,18,19,20, tra gli altri, come strategia per la migliore neurologiche durante l'età adulta.

La comprensione dei meccanismi alla base delle patologie cerebrali umane dipende da strategie sperimentali che richiedono un gran numero di soggetti. Al contrario, nel caso delle colture di fette, anche se l'accesso a campioni umani è ancora difficile, la possibilità di generare fino a 50 fette da un singolo campione corticale elude parzialmente la necessità di reclutare più volontari aumentando la numero di repliche ed esegue saggi per tessuto raccolto21.

Sono stati descritti diversi protocolli per le colture organotipiche/fette cerebrali, che vanno dalle classiche bozze oculo22,23 al tubo a rulli24,25,26, membrane semipermeabili l'interfaccia27,28,29,30e le sezioni free-floating31,32. A seconda delle particolarità di un progetto sperimentale, ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi. Le colture di fette a breve termine e fluttuanti da cervelli umani adulti sono in alcuni casi vantaggiose rispetto al metodo utilizzato da Stoppini et al.27, se si considera il fatto che sebbene la sopravvivenza cellulare a lungo termine in vitro sia di solito una delle principali preoccupazioni quando si valuta un metodo di coltura, in molti esperimenti sono necessari solo brevi periodi di tempo nella coltura12,31,32,33,34,35. In queste condizioni, l'uso di colture a flottante presenta il vantaggio di essere più semplice e più conveniente, oltre a assomigliare in modo più accurato alla condizione originale del tessuto umano rispetto alle fette mantenute in coltura per 2-3 settimane.

Nonostante il potenziale delle colture di fette alle neuroscienze, gli studi sull'uso del tessuto nervoso adulto per preparare tali colture sono ancora scarse, in particolare da soggetti umani. Questo articolo descrive un protocollo per utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette galleggianti libere. Le procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture sono dettagliate. Questo protocollo si è dimostrato prezioso per analizzare la vitalità e la funzione neuronale nelle indagini sui meccanismi delle neuropatologie legate all'età adulta.

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Protocol

Tessuti cerebrali adulti vivi sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a neurochirurgia resective per il trattamento dell'epilessia del lobo temporale farmacoresistente (Figura 1A). Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Clinico della Scuola Medica Ribeiro Preto (17578/2015) e i pazienti (o la loro persona responsabile legale) hanno concordato e firmato i termini di consenso informato. La raccolta del tessuto è stata effettuata dal team di neurochirurgia presso il Centro di Chirurgia dell'Epilessia (CIREP - Clinica Ospedale presso la Ribeiro Preto Medical School, Università di San Paolo, Brasile).

1. Sterilizzazione dei materiali

NOTA: tutti i materiali e le soluzioni devono essere sterilizzati prima dell'uso.

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e il materiale di affettatura vibratoma (portacoltelli, disco campione, vassoio tampone) in un forno sterilizzante secco per 4 h a 180 gradi centigradi.
  2. Sterilizzare materiale o apparecchiature sensibili alla temperatura mediante irradiazione UV o gamma.
  3. Sterilizzare i supporti e le soluzioni per autoclavazione o filtrazione attraverso membrane di pori 0,22 m.

2. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparare 15-20 mL di soluzione di trasporto: 50% v/v Hanks' balanceed salt solution (HBSS) pH 7.4, 50% v/v basal basal medium for maintenance of post-natal and adult brain neurons (Table of Materials), integrato con 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- acido piperazinethanesulfonico (Epes), 3 glucosio mg/mL e 33 gentamicina.
    NOTA: la soluzione di trasporto deve essere refrigerata e ossigenata (bollente con gas carbogeno) per almeno 20 minuti prima della raccolta del campione.
  2. Preparare 300 mL di soluzione di taglio (HBSS integrata con 10 m HEPES e 3 mg/mL di glucosio) e raffreddarlo in un congelatore fino al punto di formazione iniziale del cristallo.
  3. Preparare 20 mL di mezzo di coltura medio: mezzo basale per la manutenzione dei neuroni cerebrali post-natale e adulti (Tabella dei materiali) integrato con 1% L-glutamine derivata ( Tabella deimateriali), supplemento del 2% per la coltura neurale (Tabella di Materiali, 1% penicillina/streptomicina, e 0,25 g/mL amphotericinB.

3. Impostazione dell'apparato di affettatura

NOTA: Questo protocollo viene eseguito idealmente con l'assistenza di un collega grazie alla logistica della raccolta dei campioni in sala chirurgica.

  1. In un secchio di ghiaccio aggiunto, lasciate riposare la soluzione di affettatura sotto la spumeggiante della miscela di carbogeni (95% O2, 5% CO2) per almeno 20 minuti prima dell'uso.
  2. Preparare un blocco di 3% agarose (circa 2 cm x 2 cm x 2 cm) e superincollarlo sul disco del provino vibratoma per creare ulteriore supporto meccanico al campione di tessuto durante la sezionamento (Figura 1E).
  3. Impostare il vibratome per il taglio: spessore della sezione di 200 m, frequenza di vibrazione di 100 Hz e velocità di taglio compresa tra 0,5 e 1,0 mm/s.
  4. Bloccare il vassoio del vibratome tampone alla base del vibratoma e aggiungere ghiaccio per conservarlo in frigorifero prima di ricevere la soluzione di affettatura e il campione e per tutta la procedura di taglio.

4. Raccolta di campioni

NOTA: In questo protocollo, il tessuto neocorticale umano è stato raccolto in sala chirurgica e trasportato in laboratorio.

AVVISO: quando si tratta di campioni umani, seguire i protocolli di sicurezza appropriati stabiliti dall'Istituzione.

  1. Impostare l'apparato di trasporto (Figura 1C) che consiste di: una bombola di gas portatile con miscela di carbogen collegata a una valvola di pressione/flusso che controlla l'uscita di gas collegata a un tubo di silicio che collega l'uscita di gas al trasporto nave; una nave da trasporto, di solito un tubo di centrifuga conicala da 50 mL con coperchio perforato per l'ingresso di gas, contenente la soluzione di trasporto; ghiaccio per il raffreddamento del campione durante il trasporto.
  2. Raccogliere e trasportare immediatamente il campione (Figura 1B) al laboratorio. Sommerse il campione in soluzione di trasporto a freddo (costantemente bollato con miscela di carbonte).

5. Affettare

  1. Trasferire il campione in un piatto Petri (100 mm x 20 mm) contenente soluzione di affettatura e, con strumenti chirurgici fini, rimuovere con cura il più possibile le meningi rimanenti nel campione (Figura 1D).
  2. Scegliere l'orientamento migliore per la produzione di fette con le particolari caratteristiche del progetto sperimentale, e con una lama di bisturi n. 24, tagliare una superficie piatta per essere la base incollata al disco del campione.
  3. Utilizzando un cucchiaio di plastica usa e getta e delicati pennelli, raccogliere il frammento dalla parabola Petri e asciugare la soluzione in eccesso utilizzando carta da filtro (asciugare per capillarità ed evitare di toccare il frammento di tessuto con la carta).
  4. Utilizzando la supercolla, collegare il tessuto al disco del provino vibratoma fino a quando non è saldamente aderente al disco e a contatto con il blocco di agarose (Figura 1E).
  5. Posizionare il disco del provino vibratoma (con tessuto correttamente collegato) nel vassoio del tampone del vibratome riempito con soluzione di affettatura che deve essere gorgogliante durante l'intero processo.
  6. Bloccare il supporto del coltello in posizione con la lama del rasoio saldamente fissata.
  7. La soluzione di affettatura deve coprire sia il campione che la lama, solo allora iniziare a affettare (Figura 1F).
  8. Tagliare l'esemplare a fette di 200 m.
    NOTA: Anche se alcuni vibratomi tagliano automaticamente i campioni, l'osservazione ravvicinata e le piccole regolazioni della velocità di taglio durante il processo possono aiutare a produrre fette migliori. Eliminare le fetta irregolari iniziali.
  9. Trasferire le fette dal vassoio tampone a una piastra Petri con soluzione di affettatura e tagliare i bordi sciolti e il mater bianco in eccesso ad una proporzione di circa il 70% di corteccia/30% materia bianca.

6. Cultura

NOTA: eseguire questo passaggio in un armadio a flusso laminare in ambiente sterile.

  1. Aggiungere 600 l di mezzo di coltura per pozzo (in un pozzo 24) e incubare per almeno 20 minuti a 36 e 5% di CO2 prima di placcare le fette.
  2. Piattare una fetta per bene utilizzando un pennello (Figura 1G).
  3. Se ci sono pozzi inutilizzati nel piatto, riempirli con 400 gradi di acqua sterile.
  4. Incubare la piastra a 36 gradi centigradi, 5% CO2.
    NOTA: La prima sostituzione media deve essere eseguita tra 8-16 h dopo la placcatura a seconda delle dimensioni della fetta.
  5. Supplemento 10 mL del mezzo di coltura precedentemente preparato con 50 ng/mL cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF).
    NOTA: Durante le prime 8-16 h, le fette vengono incubate a 600 gradi di mezzo per evitare la privazione e l'acidificazione dei nutrienti, poiché il consumo medio in questa fase è accelerato. Dalla fase successiva, il volume del mezzo per pozzo viene regolato a 400 gradi l.
  6. Togliere 333 l' del mezzo condizionato da ogni pozzo e aggiungere 133 lofde di mezzo fresco integrato BDNF.
  7. Ripetere il processo di sostituzione media ogni 24 h sostituendo un terzo del mezzo condizionato con un mezzo fresco integrato BDNF.

7. Valutazione della salute, della morfologia e della funzione nelle sezioni coltivate

NOTA: Per indurre la morte cellulare ai fini dell'illustrazione nei risultati rappresentativi, alcune fette sono state sottoposte a un trattamento di 24 ore con l'induttore di stress ossidativo H2O2. I passaggi 7.1.2 e 7.1.3 descrivono l'uso di H2O2 per indurre la morte cellulare.

  1. Vitalità cellulare
    NOTA: Un metodo semplice e diretto per valutare il neurotossico/neuroprotezione nelle colture di fette sfidate è il test 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) , che misura la percentuale di cellule metaboliche attive in condizioni normali rispetto ai campioni trattati.
    1. Nell'armadio di flusso laminare, sostituire un terzo del mezzo con un mezzo fresco.
    2. Da una soluzione di magazzino 30% H2O2, aggiungere un volume di H2O2 per pozzo per raggiungere la concentrazione finale prevista (30 mM o 300 mM).
      NOTA: H2O2 è stato aggiunto dopo il cambio quotidiano del mezzo per garantire il corretto apporto di nutrienti freschi prima della sfida.
    3. Incubare la piastra per 24 h a 36 gradi centigradi, 5% CO2.
      NOTA: Dopo il trattamento H2O2 (o altri stimoli tossici di interesse), i seguenti passi descrivono la determinazione della vitalità cellulare da parte del saggio MTT.
    4. Aggiungere 40 l di soluzione MTT ad una concentrazione finale di 0,5 mg/mL in ogni pozzo nella piastra.
    5. Incubare la piastra a 36 gradi centigradi, 5% CO2 per 3 h.
    6. Lavare le fette con la salina (PBS) con buffer fosfato e trasferirle in un microtubo.
    7. Rimuovere con cautela qualsiasi soluzione rimanente pipettando.
    8. Pesare i microtubi contenenti le fette per determinare la massa di ogni fetta (questa è la chiave per normalizzare le letture di assorbimento ottenute).
      NOTA: se necessario, i campioni possono essere congelati (-20 gradi centigradi) in questa fase per un'elaborazione successiva.
    9. Omogeneizzare le fette in 200 gradi l di isopropanol/HCl utilizzando un pestello motorizzato.
    10. Centrifuga a temperatura ambiente (RT) per 2 min a 2600 x g.
    11. Raccogliere il supernatante e misurare l'assorbimento a 540 nm.
  2. Depolarizzazione neuronale indotta da KCl
    NOTA: Il fosforolalazione della proteina mitogena attivata chinasi (MAPK) segnalando la proteina a cascata ERK, seguita da gonfiore occidentale, può essere utilizzata per la quantificazione della risposta neuronale alla depolarizzazione indotta da KCl37 .
    1. Nell'armadietto di flusso, sostituire il mezzo di coltura di 300 gradi l di HBSS precedentemente equilitale a 36 gradi centigradi.
    2. Sostituire l'HBSS con 300 l di HBSS fresco precedentemente equilibrato a 36 gradi centigradi.
    3. Incubare la piastra a 36 gradi centigradi, 5% CO2 per 15 min.
    4. Sostituire l'HBSS con l'HBSS fresco o con 80 mM KCl soluzione depolarizzazione (entrambi a 36 gradi centigradi) e incubare a 36 gradi centigradi, 5% CO2 per 15 min.
    5. Trasferire le fette dalla piastra ai microtubi. In questa fase, le sezioni possono essere conservate a -20 gradi centigradi per un'elaborazione successiva.
    6. Preparare estratti di tessuto in un buffer di 150 ol di analisi radioimmunoprecipitazione (RIPA) (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% di surfactant non ionico; 0,1% solfato di dodecyl di sodio; pH 7,5). Centrifuga estrae a 4 gradi centigradi per 10 min a 16000 x g, raccogliere supernatali e determinare la concentrazione totale di proteine utilizzando il metodo Bradford.
    7. Caricare 30 g di proteine totali su un 12% di solfato di solfato poliacrita elettroforesi gel (SDS-PAGE).
    8. Dopo l'elettroforesi, trasferire il contenuto di gel su una membrana di nitrocellulosa.
    9. Dopo aver bloccato la membrana con il 5% di latte secco non grasso in TBS più 0,1% Tween, incuba recitare con il topo anti-pERK (1:1,000) per 16 h a 4 gradi centigradi. Dopo il lavaggio, incubare per 2 h a RT con coniglio anti-ERK1/2 (1:1,000).
    10. Incubare con l'anticorpo secondario coniugato HRP appropriato a RT per 1 h.
    11. Rivelare con il substrato HRP preferito.
  3. Valutazione morfologica
    NOTA: Oltre alla sopravvivenza cellulare e alle valutazioni funzionali, è importante analizzare la morfologia dei tessuti. Essere consapevoli del fatto che la resezione della fetta coltivata è un passo importante per produrre quanto più materiale di alta qualità possibile per l'analisi morfologica.
    1. Fissaggio, crioprotezione e resezione delle fette
      1. Trasferire le fette dai pozzi con mezzo di coltura a un nuovo 24 piastra ben contenere PBS.
      2. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 mL di 4% paraformaldeide (PFA). È importante che le fette siano mantenute piatte prima di aggiungere PFA. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
      3. Rimuovere con attenzione la soluzione PFA e aggiungere 1 mL di 30% soluzione di saccarosio. Incubare per 48 h a 4 gradi centigradi.
      4. Impostare il microtoma di congelamento su -40 gradi centigradi.
      5. Preparare una base di saccarosio sullo stadio del microtoma in cui devono essere posizionate le fette (Figura 2A). Lasciare congelare completamente e tagliare con cura parte del saccarosio congelato per produrre una superficie piana su cui verrà posizionata la fetta.
      6. Posizionare ogni fetta su una pellicola di plastica allungata e utilizzare un pennello per appiattire il tessuto.
      7. Trasferire la fetta tesa alla base di saccarosio congelata in un'unica mossa.
        NOTA: Non è possibile spostare la fetta una volta sopra la base di saccarosio congelata. Eseguire questo passaggio di trasferimento con attenzione.
      8. Lasciare riposare la fetta per 5-10 min per un corretto congelamento.
      9. Tagliare la fetta in sezioni di 30 m.
      10. Trasferire le sezioni da 30 m in una piastra Petri contenente PBS.
      11. Procedere al protocollo di istologia più adeguato alla progettazione sperimentale.
        NOTA: Le 30 sezioni possono essere facilmente utilizzate per l'immunoistochimica a fluttuazione libera, montate su diapositive di microscopia per un'ulteriore istologia o conservate in soluzione antigelo a -20 gradi centigradi.
    2. Immunohistochemistry
      NOTA: I protocolli standard di immunoistochimica e immunofluorescenza variano da laboratorio a i laboratorio. Per una versione dettagliata del protocollo qui utilizzato, fare riferimento a Horta et al.38. Gli anticorpi primari utilizzati per le immunostainings presentati nella Figura 2 includono nuclei neuronali (NeuN), marcatore neurone maturo sano, proteine acidiche fibrillari gliali (GFAP), marcatore di atorciti, adattatore legante di calcio ionizzato (Iba-1) e microglia pennarello.
      1. Incubare le fette in soluzione di blocco (ad esempio, 2% siero d'asino normale in PBS) per 40 min.
      2. Incubare durante la notte con anticorpo primario in fase di lieve agitazione a 4 gradi centigradi.
      3. Dopo il lavaggio con PBS, incubare per 120 min con anticorpi secondari biotinylati in lieve agitazione a RT.
      4. Dopo il lavaggio con PBS, incubare a RT per 120 min con coniugato avidin-perossidasi (Tavolo dei materiali).
      5. Svelare con DAB - 0.04% di ammonio al nichel.
      6. Montare le sezioni colorate su vetrini di microscopia rivestiti di gelatina e lasciarli asciugare all'aria. Disidratare in etanolo, diaficare in xilene, finire con supporto di montaggio (Tavolo dei materiali), coprire con una copertina e immagine.

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Representative Results

Un aspetto critico per valutare la qualità e la salute delle fette coltivate è la presenza e la morfologia tipica dei tipi di cellule neurali previste, neuroni e cellule gliali. L'architettura tipica della laminazione corticale umana è stata osservata in una fetta al DIV4, rivelata dall'immunoetichettatura neuronale (Figura 2D). Inoltre, è stata osservata anche la prevista presenza di microglia e astroglia (Figura 2B,C). Questi risultati dimostrano che l'architettura tissutale non è influenzata in modo significativo né dalla procedura chirurgica/elaborazione del campione sia dal periodo a breve termine in vitro. In conformità con i risultati precedenti, è stato dimostrato che l'immunoreattività neuN non è stata alterata tra DIV0 e DIV432. Sulla base di questi risultati, il formato di coltura mobile, associato allo spessore ridotto della fetta a 200 m (rispetto ai 300-400 m ampiamente utilizzati quando vengono utilizzati inserti di membrana), ha contribuito a una migliore diffusione dell'ossigeno e dei nutrienti agli strati cellulari interni nelle sezioni, che in precedenza è stato dimostrato essere fondamentale per la salute delle sezioni coltivate39,40.

La quantificazione della morte cellulare nelle fette è anche un approccio prezioso nei modelli ex vivo di neuropatologie, come le colture di fette (riviste da Lossi et al.41). In uno studio precedente, abbiamo usato il saggio MTT per determinare i livelli di mortalità cellulare lungo il periodo di coltura32. Oltre alla vitalità, lo stesso studio ha anche dimostrato che le fette coltivate (fino a DIV4) conservavano la capacità di rilasciare neurotrasmettitori sulla depolarizzazione indotta da KCl32 . Qui, tali risultati sono stati ampliati studiando la risposta neuronale alla depolarizzazione indotta da KCl sulla fosfororylazione ERK, una chinasi centrale coinvolta in processi come plasticità sinaptica e memoria42,43. È interessante notare che è stato riscontrato un netto aumento della fosfororylazione ERK nelle fette trattate con KCl al DIV4(Figura 3A,B).

Infine, la risposta delle fette a DIV4 a una sfida tossica è stata valutata con un noto induttore di stress ossidativo, H2O2. La logica era che l'entità della morte cellulare doveva essere proporzionale al livello di vitalità cellulare nelle fette coltivate. Come mostrato nella Figura 3C, l'esposizione delle sezioni a 300 mM H2O2 per 24 h ha portato a una robusta diminuzione della riduzione MTT. Nel loro insieme, la massiccia morte cellulare osservata nel DIV5 dopo la sfida H2O2 e i risultati della depolarizzazione indotta da KCl indicano che la salute generale conservata delle fette al DIV4 risponde adeguatamente a uno stimolo tossico come l'ossidativo stress.

Figure 1
Figura 1: Raccolta dei campioni, trasporto, affettare e coltura di tessuto corticale da esseri umani adulti. La procedura inizia in sala chirurgica con raccolta di tessuto corticale dalla lobectomia temporale per il trattamento dell'epilessia farmacoresistente (A,B). (C) Il frammento di tessuto (n ) viene immediatamente trasferito in un tubo contenente un mezzo di trasporto ossigenato a freddo ghiaccio (vedi sotto). (D) In laboratorio, le meningi vengono rimosse utilizzando pinzette oftalmiche fini. Il liquido in eccesso viene essiccato utilizzando carta da filtro, e il frammento è superincollato (E) al disco del provino vibratoma con la materia bianca rivolta verso il basso e la superficie del pial rivolto verso l'alto. (F) Utilizzando un rasoio da barba commerciale, l'esemplare viene tagliato in fette di 200 m che vengono raccolte con un pennello delicato e riportate alla parabola Petri per un ulteriore taglio della materia bianca in eccesso e delle estremità sciolte (non mostrate) prima di (G) placcatura e coltura in un formato a flottante. (H) Le colture di fette sono mantenute vitali per diversi giorni e possono essere utilizzate in una varietà di protocolli sperimentali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi morfologica delle cellule neurali nelle colture di fette dal cervello umano adulto. Le fette sono state fissate al quarto giorno in vitro. (A,B,C) Passaggi rappresentativi della procedura di sezionamento prima dell'immunoistochimica. I tessuti sono stati colorati digitalmente per migliorare la visualizzazione. (D) Distribuzione normale dei neuroni negli strati corticali (numeri romani). (E) Sono state osservate anche microglia e(F) gli astrociti (n - 1 fetta per etichettatura di tipo cella). Tutte le fette sono state ottenute da tessuto da un singolo donatore. Barre della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Saggi di fattibilità funzionale e cellulare nelle colture di fette di cervello umano adulto. L'attività neuronale è stata valutata in fette al giorno in vitro 5 (DIV5) dalla depolarizzazione indotta da KCl e dal conseguente aumento della fosfororylazione ERK. (A) Un risultato rappresentativo dell'immunoblot ottenuto con gli omogenei da una fetta. Sono indicate bande corrispondenti al fosfo ERK (Perk) e al ERK totale (tERK). (B) Quantificazione del rapporto pERK/tERK in tre fette indipendenti di un singolo donatore umano. (C) La tossicità perossido di idrogeno (H2O2)è stata valutata dal test MTT a fette al DIV 5. I valori di densità ottica ottenuti sono stati normalizzati dalla massa di ogni fetta. Le fette sono state sfidate con H2O2 alle concentrazioni indicate (N. H2O2; 30 mM H2O2; 300 mM H2O2) per 24 h. Immagini di fette rappresentative dopo l'incubazione con MTT vengono visualizzati sopra le barre. I risultati sono presentati come media: errore standard da dati ottenuti da tre fette indipendenti di un singolo donatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo per la produzione di colture di fette a breve termine e galleggianti è un metodo alternativo per coltivare fette neocorticali umane adulte. Tale protocollo per le colture di fette può essere suscettibile di studi su (ma non limitato a) optogenetica1,44,45, elettrofisiologia2,3,4,5 , plasticità a breve termine46,47, plasticità a lungo termine48,49, neurotossicità / neuroprotezione10,11,12, 13, terapia cellulare14, screening farmacologico15,16,17, cancro50,51, genetica e editing genico12,18 ,19,20.

L'uso di campioni di tessuto umano adulto è particolarmente importante per comprendere le neuropatologie umane, a causa di proprietà uniche tipiche del cervello umano carente in fette prodotte dal tessuto nervoso del roditore52. Inoltre, le colture di fette da cervelli di roditori sono comunemente preparate da cervelli neoatali e immaturi, che sono altamente plastici e contengono cellule migratorie che possono cambiare la citoarchitettura a fette originale per adattarsi all'ambiente in vitro26, 53,54,55. Tali eventi plastici portano a cambiamenti nei circuiti che dovrebbero essere evitati quando l'obiettivo è quello di imitare la condizione in vivo, come dichiarato da Ting et al.30: "Abbiamo scelto di concentrarsi su colture di meno di una settimana, dove le proprietà strutturali e funzionali sono ragionevolmente con una perturbazione minima, per essere il più paragonabile possibile alle misurazioni ottenute utilizzando preparati a fette acute standard dorate". Pertanto, anche se un metodo dedicato alla coltura a breve termine può inizialmente essere visto come limitato, la coltura a lungo termine non è necessaria per produrre risultati rilevanti in molti progetti sperimentali32,33,34 ,35,56,57.

Due fasi critiche del protocollo sono lo spessore ridotto delle fette (200 m) e il completamento del supporto di coltura con BDNF. Nel lavoro precedente32, abbiamo dimostrato la conservazione della vitalità cellulare fino a 4 DIV e discusso il probabile contributo della riduzione dello spessore di fetta a 200 m rispetto alle più spesso utilizzate 300-400 sm fette12,29. Fondamentalmente, ridurre lo spessore delle fette può contribuire a una migliore ossigenazione e all'assorbimento di nutrienti nelle fette a flottante, diminuendo le probabilità di ipossia del nucleo e neurodegenerazione31,32,57, 58,59,60,61. Inoltre, si raccomanda di mantenere il tessuto a freddo, supporti ossigenati dalla sala chirurgica alla fase di affettatura al vibratoma, considerando l'elevata domanda di O2 da parte dell'uomo adulto nervoso centrale. Completamento del mezzo con BNDF è stato precedentemente visto per aumentare leggermente la vitalità nelle fette di cervello umano adulto fette coltivate free-floating32, in linea con le raccomandazioni per il completamento medio con fattori neurotrofici da altri autori 62,63.

In conclusione, questo protocollo descrive i metodi per preparare ed eseguire saggi con colture di fette a breve termine e galleggianti provenienti da cervelli umani adulti. Questo modello dovrebbe essere ammissibile per le indagini sui meccanismi di tossicità/neuroprotezione rilevanti per le malattie cerebrali associate all'età. L'uso di tessuto umano resezionato presenta il vantaggio di preservare la citoarchitettura cerebrale e i circuiti locali, aggiungendo potenza traslazionale ai risultati ottenuti. Inoltre, l'uso di campioni derivati dall'uomo dalla neurochirurgia nelle neuroscienze può contribuire a ridurre la necessità di sperimentazione animale. Sebbene questo protocollo sia incentrato sull'uso di tessuti raccolti da pazienti sottoposti a neurochirurgia per il trattamento dell'epilessia farmacoresistente, si suggerisce che i tessuti raccolti da altre regioni/condizioni cerebrali siano considerati anche come fonti per produrre colture di fette in modo semplice ed economico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato da FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. and Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) e FAEPA. G.M.A. ha conseguito una borsa di studio faPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. ha conseguito una borsa di studio CNPq Research. Ringraziamo i pazienti e le loro famiglie per aver donato i tessuti resezionati per questo studio. Vorremmo riconoscere il supporto dei residenti, delle infermiere, dei tecnici e del team CIREP, dell'Ospedale Clinico della Scuola Medica Ribeiro Preto, dell'Università di San Paolo, che ha contribuito in varie fasi del processo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

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Neuroscienze Numero 153 istocoltura neocorteccia ex vivo neurodegenerazione epilessia Alzheimer
A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto
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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

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