Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kortsiktiga fritt flytande segment kulturer från den vuxna mänskliga hjärnan

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/59845
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 4, 4, 5, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

Summary

Ett protokoll för att förbereda fritt flytande segment kulturer från vuxna mänskliga hjärnan presenteras. Protokollet är en variant av den allmänt använda segment kultur metoden med hjälp av membran skär. Det är enkelt, kostnadseffektivt, och rekommenderas för att köra kortsiktiga analyser syftar till att riva upp mekanismer för neurodegeneration bakom åldersrelaterade hjärnsjukdomar.

Abstract

Organotypic, eller segment kulturer, har varit i stor utsträckning används för att modellera aspekter av det centralanervsystemet fungerar in vitro-. Trots potentialen av segment kulturer i neurovetenskap, studier med hjälp av vuxna nervvävnad att förbereda sådana kulturer är fortfarande knappa, särskilt de från försökspersoner. Användningen av vuxna mänskliga vävnader för att förbereda segment kulturer är särskilt attraktiv för att öka förståelsen av mänskliga neuropatiologier, eftersom de har unika egenskaper som är typiska för den mogna mänskliga hjärnan saknas i skivor som produceras från gnagare (vanligtvis neonatal) nervvävnad. Detta protokoll beskriver hur man använder hjärnvävnad som samlats in från levande mänskliga givare lämnas till resektiv hjärnkirurgi för att förbereda kortsiktiga, fritt flytande segment kulturer. Förfaranden för att underhålla och utföra biokemiska och cellbiologi analyser med hjälp av dessa kulturer presenteras också. Representativa resultat visar att den typiska humana kortikala laminering bevaras i skivor efter 4 dagar in vitro (DIV4), med förväntad förekomst av de viktigaste neurala celltyper. Dessutom skivor på DIV4 genomgå robust celldöd när utmanas med en giftig stimulans (H2O2), som anger potentialen i denna modell för att fungera som en plattform i celldöd analyser. Denna metod, ett enklare och kostnadseffektivt alternativ till det allmänt använda protokollet med hjälp av membran skär, rekommenderas främst för att köra kortsiktiga analyser som syftar till att riva upp mekanismer för neurodegeneration bakom åldersrelaterade hjärnsjukdomar. Slutligen, även om protokollet ägnas åt att använda kortikal vävnad som samlats in från patienter som lämnats till kirurgisk behandling av farmakoresistent tinningloben epilepsi, det hävdas att vävnad som samlats in från andra regioner i hjärnan/villkor bör också vara betraktas som källor för att producera liknande fritt flytande segment kulturer.

Introduction

Användningen av mänskliga prover i forskning är otvetydigt ett bra alternativ för att studera mänskliga hjärnan patologier, och moderna tekniker har öppnat nya sätt för robusta och etiska experiment med hjälp av patient-derived vävnad. Metoder som organotypic/slice kulturer utarbetats från vuxna mänskliga hjärnan har alltmer använts i paradigm såsom optogenetik1, elektrofysiologi2,3,4,5,plasticitet 6,7,8,9, neurotoxicitet/neuroprotection10,11,12,13, cellterapi14, läkemedels screening15,16,17, genetik och gen editering12,18,19,20, bland annat som en strategi för bättre att förstå neurologiska sjukdomar under vuxen ålder.

Förståelsen av mekanismerna bakom mänskliga hjärnsjukdomar beror på experimentella strategier som kräver ett stort antal ämnen. Omvänt, när det gäller segment kulturer, även om tillgången till Human prov fortfarande är svår, kringgår möjligheten att generera upp till 50 skivor från ett enda kortikal prov delvis kravet på rekrytering av flera frivilliga genom att öka antal replikat och utförda analyser per insamlad vävnad21.

Flera protokoll för hjärnans organotypic/slice kulturer har beskrivits, allt från den klassiska endigital utkast22,23 till rullrör24,25,26, semi-permeabla membran gränssnitt27,28,29,30och fritt flytande skivor31,32. Beroende på särdragen i en experimentell design, har varje teknik sina egna fördelar och nackdelar. Kortsiktiga, fritt flytande skivor kulturer från vuxna mänskliga hjärnor är i vissa fall fördelaktiga över den metod som används av Stoppini et al.27, om man överväger det faktum att även om långsiktig cellöverlevnad in vitro är vanligtvis ett stort problem när man utvärderar en kultur metod, i många experiment endast kort perioder av tid i kultur behövs12,31,32,33,34,35. Under dessa förhållanden, användningen av fri-flytande kulturer ger fördelen av att vara enklare och mer kostnadseffektivt, samt mer exakt som liknar den ursprungliga människans vävnads tillstånd än skivor hålls i kulturen över 2-3 veckor.

Trots potentialen hos segment kulturer till neurovetenskap, studier med hjälp av vuxna nervvävnad att förbereda sådana kulturer är fortfarande knappa, särskilt från försökspersoner. Denna artikel beskriver ett protokoll för att använda insamlade hjärnvävnad från levande mänskliga givare lämnas till resektiv hjärnkirurgi för att förbereda fritt flytande segment kulturer. Förfaranden för att underhålla och utföra biokemiska och cellbiologi analyser med hjälp av dessa kulturer är detaljerade. Detta protokoll har visat sig värdefullt för att analysera livskraft och neuronala funktion i utredningar om mekanismerna för neuropatologier kopplade till vuxen ålder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Levande vuxna hjärnvävnader erhölls från patienter som genomgick resektiv neurokirurgi för behandling av farmakoresistent tinningloben epilepsi (figur 1A). Alla procedurer godkändes av etikkommittén från kliniker sjukhuset på Ribeirão Preto Medical School (17578/2015), och patienter (eller deras juridiska ansvariga person) enades om och undertecknade villkoren för informerat samtycke. Insamling av vävnaden utfördes av neurokirurgi team vid epilepsi kirurgi Center (cirep-kliniker sjukhuset i Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brasilien).

1. sterilisering av material

Anmärkning: allt material och alla lösningar måste steriliseras före användning.

  1. Sterilisera alla kirurgiska verktyg och vibratome skivning material (knivhållare, preparat disk, buffert bricka) i en torr steriliserande ugn för 4 h vid 180 ° c.
  2. Sterilisera temperaturkänsligt material eller utrustning med UV-eller gammastrålning.
  3. Sterilisera media och lösningar genom autoklaverning eller filtrering genom pore membran på 0,22 μm.

2. beredning av lösningar

  1. Förbered 15-20 mL transport lösning: 50% v/v Hanks balanserad saltlösning (HBSS) pH 7,4, 50% v/v basala mediet för underhåll av postnatal och vuxna hjärnans neuroner (tabell över material), kompletterat med 10 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineetanesulfonic syra (Hepes), 3 mg/mL glukos och 33 μg/mL gentamicin.
    Anmärkning: transport lösning måste förvaras i kylskåp och syras (bubblar med carbogengas) i minst 20 minuter före prov insamlingen.
  2. Bered 300 mL av skivning lösning (HBSS kompletteras med 10 mM HEPES och 3 mg/mL glukos) och kyla ner i en frys till den punkt av inledande kristall bildning.
  3. Förbered 20 mL odlingssubstrat: basala mediet för underhåll av post-Natal och vuxna hjärnans neuroner (tabell över material) kompletteras med 1% L-glutamin derivat (tabell över material), 2% tillägg för neural kultur (tabell över Material), 1% penicillin/streptomycin och 0,25 μg/ml amfotericin B.

3. ställa in skivning apparaten

Obs: detta protokoll är idealiskt utförs med hjälp av en kollega på grund av logistiken av provsamling i operationssalen.

  1. I en hink med salttillsats, låt skivning lösningen vila under carbogen blandning bubblande (95% O2,5% Co2) i minst 20 min före användning.
  2. Förbered ett block på 3% Agreste (ca 2 cm x 2 cm x 2 cm) och superlim det till vibratome prov skivan för att skapa ytterligare mekaniskt stöd till vävnadsprovet under skivning (figur 1E).
  3. Ställ in vibratome för skivning: snittjocklek på 200 μm, vibrationsfrekvens på 100 Hz och hastighet för skivning mellan 0,5-1,0 mm/s.
  4. Lås vibratome-buffertbrickan till vibratome-basen och Lägg till is för att hålla den kyld innan du får skivning lösningen och provet, och under hela skivning förfarande.

4. provtagning

Anmärkning: i detta protokoll, mänskliga neokortikala vävnad samlades i operationssalen och transporteras till laboratoriet.

FÖRSIKTIGHET: vid hantering av Human prover, Följ de lämpliga säkerhetsprotokoll som fastställts av institutionen.

  1. Ställ in transport apparaten (figur 1C) som består av: en portabel gascylinder med carbogen blandning ansluten till en tryck/Flux-ventil som styr gas utgången ansluten till en kisel slang som förbinder gasproduktionen med transport fartyg ett transportkärl, vanligtvis ett 50 mL koniskt centrifugrör med perforerat lock för gas inmatning, som innehåller transport lösningen. och is för prov kylning under transporten.
  2. Samla och transportera preparatet (figur 1B) omedelbart till labbet. Submerse preparatet i kall transport lösning (ständigt bubblade med carbogen blandning).

5. skivning

  1. Överför preparatet till en petriskål (100 mm x 20 mm) som innehåller skivning och, med fina kirurgiska verktyg, ta försiktigt bort så mycket som möjligt av de kvarvarande hjärnhinnorna i provet (figur 1D).
  2. Välj den bästa preparat orienteringen för att producera skivor med de särskilda egenskaperna hos den experimentella designen, och med ett nr 24 skalpell, trimma en plan yta för att vara basen limmad till Preparatskivan.
  3. Med hjälp av en disponibel plastsked och fina penslar, samla fragment från petriskål och torra överskott lösning med hjälp av filtrerpapper (torr genom kapillaritet och undvika att röra vävnaden fragment med papper).
  4. Använd superlim för att fästa vävnaden på den vibratome Preparatskivan tills den sitter ordentligt fast på disken och i kontakt med agarblocket (figur 1E).
  5. Placera den vibratome Preparatskivan (med vävnad ordentligt fastsatt) i vibratome buffertbrickan fylld med skivning lösning som måste bubblar under hela processen.
  6. Lås knivhållaren på plats med knivbladet stadigt fast.
  7. Skivning lösningen måste täcka både preparatet och bladet, först sedan börja skivning (figur 1F).
  8. Skär preparatet i 200 μm skivor.
    Obs: även om vissa vibratomes klippa proverna automatiskt, kan nära observation och smärre justeringar i skivning hastighet under processen bidra till att producera bättre skivor. Kassera initiala oregelbundna segment.
  9. Överför skivorna från buffertbrickan till en petriskål med skivning lösning och trimma lösa kanter och överskott vita mater till en andel av cirka 70% cortex/30% vit materia.

6. kultur

Anmärkning: utför detta steg i ett laminärt flöde skåp under steril miljö.

  1. Tillsätt 600 μL odlingssubstrat per brunn (i en 24-brunn platta) och inkubera i minst 20 min vid 36 ° c och 5% CO2 innan skivorna bordläggs.
  2. Platta en skiva per brunn med en pensel (figur 1G).
  3. Om det finns några oanvända brunnar i plattan, Fyll dem med 400 μL sterilt vatten.
  4. Inkubera plattan vid 36 ° c, 5% CO2.
    Anmärkning: första medium ersättare måste göras mellan 8-16 h efter plätering beroende på storleken på segmentet.
  5. Komplettera 10 mL av det tidigare beredda odlingsmediet med 50 ng/mL Brain härledd neurotrofisk faktor (BDNF).
    Anm.: under den första 8-16 h inkuberas skivorna i 600 μL medium för att undvika näringsbrist och försurning, eftersom medelkonsumtionen i denna fas accelereras. Från nästa steg justeras volymen av medel per brunn till 400 μL.
  6. Ta bort 333 μL av det konditionerade mediet från varje brunn och tillsätt 133 μL färskt BDNF-kompletterat medium.
  7. Upprepa processen för medelstora ersättare var 24 h genom att ersätta en tredjedel av det konditionerade mediet med färskt BDNF-kompletterat medium.

7. utvärdering av hälsa, morfologi och funktion i odlade skivor

Anmärkning: för att framkalla celldöd i illustrativt syfte i de representativa resultaten lämnades vissa skivor till en 24 h behandling med den oxidativa stress inducerare H2O2. Steg 7.1.2 och 7.1.3 beskriver användningen av H2O2 för att inducera celldöd.

  1. Cellernas lönsamhet
    Anmärkning: en enkel, okomplicerad metod för att utvärdera neurotoxiska/neuroprotection i utmanade slice kulturer är 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium (MTT) assay36, som mäter andelen metaboliska aktiva celler under normala förhållanden jämfört med behandlade prover.
    1. I laminärt flöde skåpet, ersätta en tredjedel av mediet med färskt medium.
    2. Från en 30% h 2o2 stamlösning, tillsätt en volym av h2o2 per brunn för att nå den avsedda slutkoncentrationen (30 mm eller 300 mm).
      Anmärkning: H2O2 lades till efter den dagliga förändringen av mediet för att garantera korrekt tillförsel av färska näringsämnen före utmaningen.
    3. Inkubera plattan i 24 h vid 36 ° c, 5% CO2.
      Anmärkning: efter H2O2 behandling (eller annan giftig stimulans av intresse), följande steg beskriver cellernas genomförbarhet bestämning av MTT analysen.
    4. Tillsätt 40 μL MTT-lösning till en slutlig koncentration på 0,5 mg/mL till varje brunn i plattan.
    5. Inkubera plattan vid 36 ° c, 5% CO2 för 3 h.
    6. Tvätta skivorna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och överför till en MicroTube.
    7. Ta försiktigt bort eventuell kvarvarande lösning genom pipettering.
    8. Väg mikrorören som innehåller skivorna för att bestämma massan av varje segment (detta är nyckeln för att normalisera absorbansvärdena som erhålls).
      Anmärkning: vid behov kan proverna frysas (-20 ° c) i detta skede för senare bearbetning.
    9. Homogenisera skivorna i 200 μL isopropanol/HCl med hjälp av en motoriserad mortelstöt.
    10. Centrifugera vid rumstemperatur (RT) i 2 min vid 2600 x g.
    11. Samla supernatanten och Mät absorbansen vid 540 nm.
  2. KCl-inducerad neuronala depolarisering
    Anmärkning: fosforylering av mitogen aktiverat proteinkinas (MAPK) signalering kaskad protein ERK, följt av Western blotting, kan användas för kvantifiering av neuronala svar på KCl-inducerad depolarisering37 .
    1. Vid flödes skåpet, Byt ut odlingsmediet mot 300 μL av HBSS som tidigare har jämställas med 36 ° c.
    2. Byt ut HBSS mot 300 μL färsk HBSS som tidigare har jämställas med 36 ° c.
    3. Inkubera plattan vid 36 ° c, 5% CO2 för 15 min.
    4. Byt ut HBSS med antingen Fresh HBSS eller med 80 mM KCl depolariserande lösning (båda vid 36 ° c) och inkubera vid 36 ° c, 5% CO2 i 15 min.
    5. Överför skivorna från plattan till mikrorör. I detta steg kan skivorna lagras vid-20 ° c för senare bearbetning.
    6. Förbered vävnads extrakt i 150 μL av en RIPA-buffert (radioimmunoprecipitation) (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% nonioniskt ytaktivt ämne; 0,1% natriumdodecylsulfat; pH 7,5). Centrifugera extrakt vid 4 ° c i 10 min vid 16000 x g, samla supernatanten, och bestämma totalprotein koncentration med hjälp av Bradford metoden.
    7. Ladda 30 μg totalt protein på en 12% natriumdodecylsulfat polyakrylamid gel elektrofores (SDS-sida).
    8. Efter elektrofores, överför gelhalten till ett nitrocellulosamembran.
    9. Efter blockering av membranet med 5% fettfri torrmjölk i TBS plus 0,1% Tween, inkubera med mus anti-pERK (1:1000) för 16 h vid 4 ° c. Efter tvättning, inkubera i 2 timmar vid RT med kanin anti-ERK1/2 (1:1000).
    10. Inkubera med lämplig HRP-konjugerad sekundär antikropp vid RT för 1 h.
    11. Visa med önskat HRP-substrat.
  3. Morfologisk utvärdering
    Notera: förutom cellöverlevnad och funktionella utvärderingar är det viktigt att analysera vävnadens morfologi. Var medveten om att resektionering av det odlade segmentet är ett viktigt steg för att producera så mycket högkvalitativt material som möjligt för Morfologisk analys.
    1. Fixering, kryoskydd och omskärning av skivorna
      1. Överför skivorna från brunnarna med odlingssubstrat till en ny 24-plattplatta som innehåller PBS.
      2. Ta bort PBS och tillsätt 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Det är viktigt att skivorna hålls Plant innan du lägger till PFA. Inkubera över natten vid 4 ° c.
      3. Ta försiktigt bort PFA-lösningen och tillsätt 1 mL 30% sackaroslösning. Inkubera i 48 h vid 4 ° c.
      4. Ställ in frys mikrotomen till-40 ° c.
      5. Bered en sackarosebas på mikrotomen där skivorna ska placeras (figur 2a). Låt den frysa helt och försiktigt skära en del av fryst sackaros för att producera en plan yta där segmentet kommer att placeras.
      6. Placera varje skiva över en utsträckt plastfilm och använda en pensel för att platta vävnaden.
      7. Överför den utsträckta biten till den frusna sackaroshalten i ett enda drag.
        Anm: det går inte att flytta segmentet när det är över den frusna sackaroshalten. Utför detta överföringssteg noggrant.
      8. Låt slice vila för 5-10 min för korrekt frysning.
      9. Skär segmentet i 30 μm sektioner.
      10. Överför de 30 μm-sektionerna till en petriskål som innehåller PBS.
      11. Fortsätt till histologiprotokollet mer adekvat till experimentell design.
        Obs: de 30 μm sektionerna kan lätt användas för fritt flytande immunohistokemi, monterad på mikroskopi diabilder för ytterligare histologi eller lagras i frostskyddsvätska lösning vid-20 ° c.
    2. Immunohistokemi
      Obs: immunohistokemi och immunofluorescensstandard protokoll varierar mellan laboratorier. För en detaljerad version av det protokoll som används här hänvisas till Horta et al.38. Primära antikroppar som används för immunostainings som presenteras i figur 2 inkluderar neuronala kärnor (Neun), friska mogna neuron markör, gliaceller hjärn sura protein (gfap), astorcyter markör, joniserad kalcium bindning adapter (IBA-1), och mikroglia Markör.
      1. Inkubera skivorna i blockerande lösning (t. ex. 2% normalt åsna serum i PBS) för 40 min.
      2. Inkubera över natten med primär antikropp under mild agitation vid 4 ° c.
      3. Efter tvättning med PBS, inkubera i 120 min med biotinylerad sekundär antikropp under mild agitation vid RT.
      4. Efter tvättning med PBS, inkubera vid RT för 120 min med Avidin-peroxidaskonjugat (tabell över material).
      5. Avslöja med DAB + 0,04% nickel ammonium.
      6. Montera de färgade sektionerna på gelatin belagda mikroskopi diabilder och låt dem lufttorka. Torka i etanol, diaphanize i xylen, avsluta med monteringsmedel (tabell över material), täck med en täckslip, och bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En kritisk aspekt för att utvärdera kvalitet och hälsa av odlade skivor är närvaron och typiska morfologi av de förväntade neurala celltyper, nervceller, och gliaceller. Den typiska arkitekturen av den mänskliga kortikala laminering observerades i en skiva på DIV4, som framgår av neuronala immunolabeling (figur 2D). Dessutom observerades även den förväntade närvaron av mikroglia och astroglia (figur 2B, C). Dessa resultat visar att vävnads arkitekturen inte påverkas nämnvärt vare sig av det kirurgiska ingreppet/prov bearbetningen eller av den kortsiktiga perioden in vitro. I enlighet med tidigare fynd visades att NeuN immunoreaktivitet inte ändrades mellan DIV0 och DIV432. Baserat på dessa resultat, den fritt flytande kultur format, i samband med den reducerade tjockleken på segmentet till 200 μm (jämfört med de allmänt använda 300-400 μm när membran skär används), bidrog till bättre spridning av syre och näringsämnen till inre cellskikt i skivor, som tidigare har visat sig vara avgörande för hälsan hos odlade skivor39,40.

Kvantifiering av celldöd i skivor är också en värdefull metod i ex vivo-modeller av neuropatier, såsom segment kulturer (granskad av Lossi et al.41). I en tidigare studie använde vi MTT-analysen för att bestämma celldöd nivåer längs perioden i kultur32. Förutom lönsamhet, samma studie visade också att odlade skivor (upp till DIV4) bevarade förmågan att frigöra signalsubstanser vid KCl-inducerad depolarisering32. Här, dessa fynd utökades genom att undersöka neuronala svar på KCL-inducerad depolarisering på erk fosforylering, en central Kinas inblandade i processer såsom synaptisk plasticitet och minne42,43. Intressant, en tydlig ökning av ERK fosforylering sågs i KCl-behandlade skivor på DIV4 (figur 3a, B).

Slutligen, svaret av skivor på DIV4 till en toxisk utmaning utvärderades med en känd oxidativ stress inducerare, H2O2. Skälet var att omfattningen av celldöd bör stå i proportion till nivån på cellernas lönsamhet i de odlade skivorna. Som visas i figur 3C, utsätta skivorna till 300 mm H2O2 för 24 H ledde till en kraftig minskning av MTT minskning. Sammantaget, den massiva celldöd observerades i DIV5 efter H2O2 Challenge och KCL-inducerad depolarisering resultat indikerar att den bevarade allmänna hälsan hos skivor vid DIV4 reagerar adekvat på en toxisk stimulans såsom oxidativ Stress.

Figure 1
Figur 1: provtagning, transport, skivning och odling av kortikal vävnad från vuxna människor. Förfarandet börjar vid operationssalen med insamling av kortikal vävnad från temporala lobektomi för behandling av farmakoresistent epilepsi (A, B). (C) vävnads fragmentet (n = 1) överförs omedelbart till ett rör som innehåller iskall oxygenerat transportmedium (se nedan). (D) i labbet, hjärnhinnorna avlägsnas med hjälp av fina oftalmologiska pincett. Överflödig vätska torkas med filterpapper, och fragmentet är överlimmad (E) till vibratome preparatskiva med den vita substansen vänd nedåt och Arvika yta uppåt. (F) med hjälp av en kommersiell rakhyvel skärs preparatet in i 200 μm skivor som samlas med en delikat pensel och överförs tillbaka till petriskål för ytterligare trimning av överflödig vit substans och lösa ändar (visas inte) före (G) och odling i ett fritt flytande format. (H) segment kulturer hålls livskraftiga i flera dagar och kan användas i en mängd olika experimentella protokoll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Morfologisk analys av neurala celler i segment kulturer från vuxna mänskliga hjärnan. Skivor fastställdes vid den fjärde dagen in vitro. (a, B, C) Representativa steg av snittnings proceduren före immunohistokemi. Vävnad var digitalt färgad för att förbättra visualisering. D) normal fördelning av nervceller i kortikala skikt (romerska siffror). E) mikroglia och (F) astrocyter observerades också tydligt (n = 1 skiva per cell typs märkning). Alla skivor erhölls från vävnad från en enda givare. Skalstreck = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: funktionella och cell viabilitet analyser i vuxna mänskliga hjärnan slice kulturer. Neuronal aktivitet utvärderades i skivor på dag in vitro-5 (DIV5) av KCl-inducerad depolarisering och åtföljande ökning av ERK fosforylering. Aenrepresentativ immunoblot resultat erhålls med homogena från en skiva. Band som motsvarar ämnesomsättningphosphoen Erk (Perk) och sammanlagd Erk (terk) indikeras. Bkvantifiering av förhållandet mellan Perk och terk i tre oberoende sektorer från en enda Human givare. C) toxiciteten för väteperoxid (H2O2) utvärderades genom MTT-analysen i skivor vid div 5. De erhållna optiska densitetsvärdena normaliserades av massan av varje skiva. Skivor utmanades med H2o2 vid de angivna koncentrationerna (nr h2o2; 30 mm h2o2; 300 mm h2o2) för 24 H. bilder av representativa skivor efter inkubering med MTT visas ovanför staplarna. Resultaten presenteras i genomsnitt ± standardfel från data som erhållits från tre oberoende skivor från en enda givare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll för produktion av fritt flytande, kortvariga segment kulturer är en alternativ metod för odling av vuxna humana neokortikala skivor. Ett sådant protokoll för segment kulturer kan vara mottagligt för studier på (men inte begränsat till) optogenetik1,44,45, elektrofysiologi2,3,4,5 , kortfristig plasticitet46,47, långsiktig plasticitet48,49, neurotoxicitet/neuroprotection10,11,12, 13, cellterapi14, Drug screening15,16,17, cancer50,51, genetik, och genredigering12,18 ,19,20.

Användningen av prover från vuxna mänsklig vävnad är särskilt viktigt att förstå mänskliga neuropatiologier, på grund av unika egenskaper som är typiska för den mänskliga hjärnan saknas i skivor som produceras från gnagare nervvävnad52. Dessutom är segment kulturer från gnagare hjärnor vanligen beredda från neonatal, omogna hjärnor, som är mycket plast och innehåller migrera celler som kan förändra den ursprungliga segmentet cytoarchitecture att anpassa sig till in vitro-miljö26, 53,54,55. Sådana plast händelser leder till förändringar i kretsar som bör undvikas när målet är att efterlikna in vivo villkoret, som anges av ting et al.30: "Vi valde att fokusera på kulturer på mindre än en vecka, där strukturella och funktionella egenskaper är rimligt underhålls med minimal störning, för att vara så jämförbar som möjligt med mätningar som erhållits med hjälp av guld-standardpreparat av akut skär ". Även om en metod som ägnas åt kortsiktig odling inledningsvis kan ses som begränsad, behövs inte långsiktig odling för att ge relevanta resultat i många experimentella konstruktioner32,33,34 ,35,56,57.

Två kritiskt kliver av protokollet är den förminskade tjockleken av skivorna (200 μm) och komplettering av kultur medlet med BDNF. I tidigare arbete32, har vi visat bevarandet av cellernas lönsamhet upp till 4 div och diskuterade sannolika bidraget av minskningen av slice tjocklek till 200 μm jämfört med de oftare använda 300-400 μm skivor12,29. I grund och botten, minska skivor tjocklek kan bidra till en bättre syresättning och näringsämnen upptag i fritt flytande skivor, minskar risken för kärn hypoxi och neurodegeneration31,32,57, 58,59,60,61. Dessutom rekommenderas att hålla vävnaden i kallt, syrade medier från operationssalen till skivning steg på vibratome, med tanke på den höga efterfrågan på O2 av den vuxna mänskliga centralanervsystemet. Tillskott av medium med BNDF har tidigare setts att något öka lönsamheten i vuxna mänskliga hjärn skivor odlade fritt flytande32, i linje med rekommendationer för medelstora tillskott med neurotrofiska faktorer av andra författare 62,63.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll metoder för att förbereda och köra analyser med kortsiktiga, fritt flytande segment kulturer från vuxna mänskliga hjärnor. Denna modell bör vara mottaglig för utredningar om mekanismerna för toxicitet/neuroskydd som är relevanta för åldersrelaterade hjärnsjukdomar. Användningen av mänsklig resected vävnad ger fördelen av att bevara hjärnans cytoarchitecture och lokala kretsar, lägga translationell effekt till erhållna fynd. Dessutom, spricker användningen av Human-härledda prover från neurokirurgi i neurovetenskap kan bidra till att minska behovet av djurförsök. Även om detta protokoll är centrerad kring användningen av vävnad som samlats in från patienter som lämnats in till neurokirurgi för farmakoresistent epilepsi behandling, det föreslås att vävnad som samlats in från andra regioner i hjärnan/villkor också betraktas som källor för producera segment kulturer på ett enkelt och kostnadseffektivt sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doktors stipendium PNPD/INCT-HSM till AF och pre-doktors stipendium till N.D.M.) och FAEPA. G.M.A. innehar ett Masterstipendium från FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. innehar ett CNPq Research Fellowship. Vi tackar patienterna och deras familjer för att ha donerat de resected vävnaderna för denna studie. Vi vill erkänna stöd av boende, sjuksköterskor, tekniker och CIREP team, från det kliniska sjukhuset i Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, som hjälpte i olika skeden av processen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 - VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 - ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20 (2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103 (2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002 (2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

Tags

Neurovetenskap fråga 153 histoculture neocortex ex vivo neurodegeneration epilepsi Alzheimers
Kortsiktiga fritt flytande segment kulturer från den vuxna mänskliga hjärnan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, A., Mendes, N. D.,… More

Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter