Summary
Somatische mutatie patronen in cellen weerspiegelen de eerdere mutagene blootstelling en kunnen ontwikkelings relaties met de afstamming onthullen. Hier gepresenteerd is een methodologie voor het catalogiseren en analyseren van somatische mutaties in individuele hematopoietische stam-en voorlopercellen.
Abstract
Hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) accumuleren geleidelijk DNA-mutaties tijdens een levensduur, wat kan bijdragen aan leeftijdsgebonden ziekten zoals leukemie. Karakteriseren mutatie accumulatie kan het begrip van de etiologie van leeftijdsgebonden ziekten verbeteren. Hier gepresenteerd is een methode om somatische mutaties in individuele Hspc's te catalogiseren, die is gebaseerd op Whole-genoom sequencing (WGS) van klonale primaire celculturen. Mutaties die in de oorspronkelijke cel aanwezig zijn, worden door alle cellen in de klonale cultuur gedeeld, terwijl mutaties die in vitro zijn verworven na het sorteren van cellen aanwezig zijn in een subset van celwaarden. Daarom zorgt deze methode voor een nauwkeurige detectie van somatische mutaties die aanwezig zijn in de genomen van individuele hspc's, die zich tijdens het leven ophopen. Deze catalogi van somatische mutaties kunnen waardevolle inzichten bieden in mutationele processen die actief zijn in het hematopoietische weefsel en hoe deze processen bijdragen aan leukemogenese. Bovendien kunnen door het beoordelen van somatische mutaties die worden gedeeld tussen meerdere Hspc's van hetzelfde individu, klonale Lineage relaties en populatiedynamiek van bloed populaties worden bepaald. Aangezien deze aanpak afhankelijk is van in vitro expansie van enkelvoudige cellen, is de methode beperkt tot hematopoietische cellen met voldoende replicatief potentieel.
Introduction
Blootstelling van hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) aan endogene of extrinsieke mutagene bronnen draagt bij tot de geleidelijke accumulatie van mutaties in het DNA gedurende een levensduur1. Geleidelijke mutatie accumulatie in hspcs1 kan resulteren in leeftijdsgebonden klonale hematopoiese (arch)2,3, wat een niet-symptomatische aandoening is die wordt aangedreven door hspc's die leukemie-driver mutaties dragen. Aanvankelijk, men dacht dat individuen met boog een verhoogd risico op leukemie2,3. Echter, recente studies hebben aangetoond een incidentie van 95% van de boog in oudere individuen4, waardoor de associatie met maligniteiten minder duidelijk en het verhogen van de vraag waarom sommige individuen met Arch uiteindelijk doen of niet maligniteiten ontwikkelen. Niettemin kunnen somatische mutaties in Hspc's ernstige gezondheidsrisico's inhouden, aangezien myelodysplastische stoornissen en leukemie worden gekenmerkt door de aanwezigheid van specifieke mutaties in de kanker-driver.
Om de mutationele processen te identificeren en bloed clonaliteit te bestuderen, moet mutatie accumulatie in individuele Hspc's worden gekarakteriseerd. Mutationele processen laten karakteristieke patronen achter in het genoom, zogenaamde mutationele handtekeningen, die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd in Genome-brede verzamelingen van mutaties5. Zo zijn blootstelling aan UV-licht, alkylerende middelen en defecten in DNA-herstel trajecten elk geassocieerd met een andere mutationele handtekening van6,7. Bovendien, als gevolg van de stochastische aard van mutatie ophopingen, zijn de meeste (zo niet alle) verworven mutaties uniek tussen de cellen. Als mutaties worden gedeeld tussen meerdere cellen van dezelfde persoon, geeft dit aan dat deze cellen een gemeenschappelijke voorouder8delen. Daarom, door het beoordelen van gedeelde mutaties, kunnen Lineage relaties worden bepaald tussen cellen en een ontwikkelings Lineage boom kan worden geconstrueerd tak per tak. Het catalogeren van zeldzame somatische mutaties in fysiologisch normale cellen is echter technisch uitdagend vanwege het polyklonale karakter van gezonde weefsels.
Hier wordt gepresenteerd is een methode voor het nauwkeurig identificeren en bepalen van somatische mutaties in de genomen van individuele hspc's. Dit omvat de isolatie en klonale expansie van Hspc's in vitro. Deze klonale culturen weerspiegelen de genetische make-up van de oorspronkelijke cel (d.w.z. mutaties in de oorspronkelijke cel zullen worden gedeeld door alle andere cellen in de cultuur). Deze aanpak stelt ons in staat om voldoende DNA te verkrijgen voor gehele genoom sequencing (WGS). We hebben eerder aangetoond dat mutaties die in vitro zijn opgebouwd tijdens de klonale cultuur zullen worden gedeeld door een subset van cellen. Dit maakt het filteren van alle in vitro mutaties mogelijk, aangezien deze in een kleinere fractie van leesbewerkingen zullen voorkomen in vergelijking met in vivo verworven mutaties9. Eerdere methoden hebben voldoende DNA verkregen uit een enkele cel voor WGS met behulp van Whole-Genome Amplification (WGA)10. Het belangrijkste nadeel van WGA is echter de relatief foutgevoelige en onevenwichtige versterking van het genoom, wat kan resulteren in allel dropouts11. Niettemin, aangezien deze aanpak afhankelijk is van in vitro expansie van enkelvoudige cellen, is het beperkt tot bloedcellen met voldoende replicatief potentieel, wat niet het geval is voor WGA-afhankelijke methoden. Eerdere inspanningen in de sequentie van klonale culturen vertrouwden op het gebruik van feederlagen om te zorgen voor een klonale versterking van enkele Hspc's12. DNA van de feederlagen kan het DNA van de klonale culturen echter mogelijk verontreinigen, wat de daaropvolgende mutatie roeping en filtering verrichtte. De hier gepresenteerde methode is uitsluitend gebaseerd op gespecificeerde middellange tot klonaal uitbreiding van enkelvoudige hspc's, en vermijdt daarom het probleem van DNA-besmetting. Tot nu hebben we deze methode met succes toegepast op menselijk beenmerg, snoer bloed, goed bevroren beenmerg en perifeer bloed.
Protocol
Monsters moeten worden verkregen in overeenstemming met de juiste ethische protocollen en donoren moeten voorafgaand aan de procedure geïnformeerde toestemming geven.
1. bereiding van het monster materiaal
Opmerking: Bij het werken met vers verkregen materiaal, begin met stap 1,1. Bij het werken met bevroren materiaal begint u met stap 1,2.
-
Voorbereiding van vers beenmerg, snoer bloed of perifeer bloed
- Isoleer de mononucleaire Fractie van het monster met behulp van scheiding van dichtheidsgradiënt door de instructies van de fabrikant te volgen (Zie tabel met materialen) en Tel de mononucleaire cellen met behulp van een hemocytometer. Na isolatie van de mononucleaire cellen gaat u verder met stap 1,3.
- Optioneel: het aanbevolen aantal cellen dat nodig is om een volledige 384 goed plaat van Hspc's te sorteren is 1 – 2 x 107. Als meer cellen zijn geïsoleerd tijdens het centrifugeren van dichtheidsgradiënt, bewaar het overtollige cellen in vloeibare stikstof.
- Respendeer cellen in 500 μL IMDM + 10% FBS per 1 x 107 cellen, en voeg drop-by-drop toe een gelijk volume imdm + 30% FBS + 20% DMSO om een suspensie van 1 x 107 cellen te bereiken in 1 ml IMDM + 20% FBS + 10% DMSO.
- Breng de mononucleaire cellen onmiddellijk over naar 1 mL cryogene flesjes en vriescellen bij-80 °C in een cel met gecontroleerde snelheid die 's nachts bevriest. Breng de cellen de volgende dag over naar een vloeibare stikstof opslag bij verdere verwerking.
-
Het klaarmaken van bevroren mononucleaire cellen uit het beenmerg, bloed snoer of perifeer bloed
- Bereid 50 mL celontdooien met 45 mL van Iscove gemodificeerd Eagle's medium (IMDM) en 5 mL foetaal runderserum (FBS) en warm in een waterbad van 37 °C.
- Neem de injectieflacon met het monster uit de opslag van vloeibare stikstof, breng het monster over naar droogijs en ontdooit zo snel mogelijk in een waterbad van 37 °C.
- Wanneer het monster bijna ontdooid is, veeg de injectieflacon dan met 70% ethanol en breng de inhoud over in een conische buis van 50 mL. Spoel de injectieflacon af met 1 ml voorverwarmde imdm + 10% FBS om de resterende cellen te verzamelen en voeg deze oplossing druppelsgewijs (5 s per druppel) toe aan het ontdooide monster terwijl de buis zachtjes wordt gezwenpt.
- Voeg een extra voorverwarmde 15 ml imdm + 10% FBS druppelsgewijs toe aan het monster terwijl de buis zachtjes wordt gezwenpt.
- Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min bij 350 x g.
- Verwijder alles maar ± 3 mL van het supernatant. Rebreng de cellen in de overgebleven supernatant en Verdun door 20 mL IMDM + 10% FBS drop-by-drop toe te voegen terwijl de buis zachtjes wordt geschud.
- Neem 10 μL celsuspensie voor het tellen van cellen. Verdun deze 10 μL door 20 μL 0,4% trypeen blauwe oplossing toe te voegen en de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer. Het celnummer kan afnemen bij ontdooien, met tot 50% celverlies na ontdooien. De levensvatbaarheid van de cellen moet tussen 70% en 90% liggen.
- Als u werkt met bloedcellen van het beenmerg of de navelstreng, neem dan 5 x 106 mononucleaire cellen in voor MSC-cultuur (stap 2,1). Bij het werken met perifeer bloed, nemen 2 – 5 x 106 cellen voor T-cel isolatie (stap 2,2)
- Pellet overgebleven cellen 5 min bij 350 x g en respenderen in 3 ml FACS buffer (0,05% BSA + 1 mm EDTA in PBS).
- Breng 1 x 105 cellen over naar een microtube gevuld met 200 ΜL FACS buffer, die zal dienen als een negatieve controle voor Flowcytometrie (stap 3,8), en blijf op ijs.
2. celcultuur
Opmerking: Om catalogi van somatisch verworven mutaties te verkrijgen, moet de donor-specifieke kiembaan variatie worden uitgefilterd. Wanneer u begint met beenmerg biopsieën of navelstreng bloed, kunnen mesenchymale stromale cellen (MSCS) worden gebruikt als afgestemde controle om te filteren op kiembaan variatie. In dit geval volgt u paragraaf 2,1. Bij gebruik van (gemobiliseerd) perifeer bloed volgt u stap 2,2 om T-cellen te isoleren en te gebruiken als overeenkomend controlemonster om te filteren op kiembaan variatie (Figuur 1). De bulk T-Cell populatie zal dezelfde Lineage relatie als Hspc's delen.
-
MSC Culture
- Bereid 50 mL MSC medium met 45 mL DMEM/F12 medium, 10% FBS, 500 μL trypsine of trypsine Alternative, en 500 μL penicillaire/streptomycine oplossing.
- Plaat ongeveer 5 x 105 mononucleaire cellen in 1,5 ml MSC medium per put. Plaats de cellen in een bevoficeerde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Vervang het medium na 24 h, en vervolgens vervangen medium elke 3 dagen om ervoor te zorgen dat alle hematopoietische cellen worden weggespoeld. Ga verder naar cultuur tot de confluentie 100% is.
- Als de MSCs Confluent zijn, wassen cellen met 1 mL PBS en oogst de MSCs door toevoeging van 200 μL trypsine of trypsine alternatief per put. Incuberen cellen gedurende 5 min bij 37 °C. Voeg 800 μL MSC-medium toe en Pipet de cellen omhoog en omlaag om cellen los te maken van de goed plaat.
- Breng MSCs over naar de microcentrifuge buis en pellet de cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 350 x g. Verwijder het supernatant en ga door met DNA-isolatie of bewaar de pellet bij-20 °C voor latere DNA-isolatie (rubriek 4).
-
T-cel isolatie
Opmerking: Bij gebruik van (gemobiliseerd) perifeer bloed kunnen T-cellen worden geïsoleerd en gebruikt als kiembaan-controle.- Respendeer de celpellet in 100 μL anti-CD3 kleurings oplossing (1:100 verdunning van anti-CD antilichaam in FACS buffer).
- Was de cellen door 1 mL FACS buffer toe te voegen. Pellet de cellen door centrifugeren voor 5 min bij 350 x g en respenderen in 300 ΜL FACS buffer.
- Isoleer ten minste 5 x 105 CD3 + cellen met behulp van een FACS-sorteerder in een 5 ml polystyreen buis die vooraf is gevuld met 1 ml FBS.
- Pellet de gesorteerde cellen met centrifugeren gedurende 5 minuten bij 350 x g, verwijder het supernatant en ga direct verder met DNA-isolatie (rubriek 4) of bewaar de pellet bij-20 °c voor latere DNA-isolatie.
3. HSPC isolatie, sortering en cultuur
- Spin naar beneden bij 1 – 2 x 107 mononucleaire cellen gedurende 5 minuten bij 350 x g en reanimatie in 50 ΜL van de FACS buffer (zie stap 2.2.1). Breng de cellen over naar een micro centrifugebuis.
Opmerking: Bij het sorteren met > 2 x 107 cellen, verhogen de antilichaammix en FACS buffer volumes dienovereenkomstig. - Bereid 50 μL van 2x HSC kleurenmix volgens het recept in tabel 1.
| Antilichaam | volume [μL] |
| BV421-CD34 | 5 |
| FITC-Lineage mix (CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC-CD90 | 0,5 |
| PerCP/CY 5.5-CD45RA | 5 |
| PE/Cy7-CD49f | 1 |
| FITC-CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| FACS-buffer | 25,5 |
Tabel 1: HSC Sorteer combinatie. Weergegeven is een tabel met de verdunningen van antilichamen die worden gebruikt om de HSCs te sorteren.
- Meng 50 μL celoplossing met de bereide HSC-kleurenmix en inincuberen de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) of 1 uur op ijs voor de antilichamen die binden.
- Was de cellen door 1 mL FACS buffer en pellet toe te voegen door 5 min centrifugeren bij 350 x g.
- Respendeer de cellen in 300 μL FACS buffer en filtreer de celsuspensie door een 35 μm cel met zeef-afgetopte 5 mL polystyreen buis om celklonten te verwijderen vóór fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
- Bereid 25 mL HSPC kweekmedium, bestaande uit 1x SFEM medium aangevuld met 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, en 100 ng/mL antibioticum formulering (Zie tabel van de materialen).
- Vul een 384 well Cell Culture Plate met 75 μL HSPC kweekmedium in elke put.
Opmerking: Om verdamping van het medium in de buitenste putten te voorkomen, vult u de buitenste putjes met 75 μL steriel water of PBS en gebruikt u deze putten niet voor het sorteren van cellen. -
Sorteren van enkele Hspc's
- Stel de poorten in voor de HSPC-sortering op basis van een onbevlekt besturingselement (stap 1,9) en 10.000 cellen uit het bevlekt monster. Een representatief resultaat voor het instellen van poorten is afgebeeld in Figuur 1. Poort enkele cellen door het tekenen van een hek rond de lineaire FSC-hoogte versus FSC-gebied Fractie. Gebruik de Onbevlekte controle Fractie om de poort voor de Lineage- fractie te tekenen. Teken poorten voor CD34+ cellen en karakteriseren deze subset verder door een specifieke poort voor CD38- CD45RA- cellen in te stellen.
- Laad de 384 well plate op de FACS machine en sorteer enkele cellen.
Opmerking: Indien van toepassing op de FACS-machine, schakelt u de optie in om index sorteer gegevens te behouden zodat de gesorteerde cellen opnieuw kunnen worden getraceerd.
-
Culturing afzonderlijk gesorteerde HSCs
- Breng de 384 well plate direct over naar een bevoficeerde 37 °C incubator met 5% CO2.
Opmerking: Om verdamping tijdens de kweek te voorkomen, wikkel de 384 well Culture Plate (met deksel) in transparante polyethyleen wrap. - Houd de 384 goed in de incubator voor een 3 – 4 weken totdat er zichtbare klonen verschijnen. Representatieve beelden van de klonale cultuur worden afgebeeld in Figuur 2. Op basis van de conditie van het ingangs materiaal zal 5% – 30% van gesorteerde cellen klonen.
- Breng de 384 well plate direct over naar een bevoficeerde 37 °C incubator met 5% CO2.
4. het oogsten van HSPC-klonen
- Na 4 weken van culturing, bepalen welke putten hebben een confluentie van 30% of hoger.
- Pre-Fill (voor elke klonale uitgroei) 1,5 mL microbuisjes met 1 mL 1% BSA in PBS en label de buis volgens de corresponderende put.
- Bevochtig een pipetpunt vooraf met 1% BSA in PBS om het aantal cellen dat aan de pipetpunt blijft kleven te minimaliseren.
- Pipetteer het medium in het fel (minstens 5 keer) met een pipet van 200 μL (ingesteld op 75 μL) en schrael de bodem van de put om cellen in de put los te maken en de celsuspensie in de gelabelde micro buis te verzamelen die overeenkomt met de put.
- Neem 75 μL verse 1% BSA in PBS en herhaal pipetteren in de put om de maximale opname van cellen te garanderen.
Opmerking: Clonally gekweekte cellen kunnen vasthouden aan de bodem van goed. Inspecteer de putten met behulp van een standaard omgekeerde lichtmicroscoop om te controleren of alle cellen zijn verzameld. - Als alle putten met > 30% confluentie zijn geoogst, plaats de 384 goed plaat terug in de incubator. Klonale culturen kunnen zich tot 5 weken vermenigvuldigen.
- Draai de celsuspensie gedurende 5 minuten op 350 x g. Een kleine pellet moet zichtbaar zijn.
- Verwijder voorzichtig alle, maar ongeveer 5 μL supernatant. Celpellets kunnen worden bevroren bij-20 °C en gedurende meerdere maanden vóór de DNA-isolatie worden bewaard.
5. DNA-isolatie
-
Isoleer HSPC en MSC/T-Cell DNA met behulp van een micro-schaal DNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant met de volgende aanpassingen:
- Voeg 2 μL RNase A toe na toevoeging van buffer AL tijdens rubriek 2. Inincuberen gedurende 2 minuten voordat proteïinase K wordt toegevoegd.
- Inincuberen gedurende 30 minuten bij 56 °C in plaats van 10 min.
- Elute het DNA door het laden van de kolom met 50 μL TE buffer met lage EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). Voor een optimale elutie laadt u het eluaat opnieuw op de kolom en draait u opnieuw.
- Bepaal de DNA-concentratie met een DNA van 2 μL per kloon. De DNA-opbrengst varieert meestal tussen 0,5 – 3 ng/μL.
6. sequentiëren
- Voer DNA-sequencing uit zoals beschreven door jager et al.13
7. Mapping en somatische mutatie bellen
- Wijs de uitvoer van sequentiëren (FASTQ-bestanden) toe aan het referentie-genoom en noem mutaties zoals beschreven in jager et al.13
- Inspecteer de gegevens op afwijkende karyotypische wijzigingen in gesequentieerde kloon-en bulkgegevens met behulp van een Kopieer nummeranalyse tool, zoals Control-FreeC14. Tot nu hebben we geen Hspc's met karyotypic aberrances gerapporteerd.
- Genereer een zwarte lijst, die bestaat uit een panel van ongeëvenaarde normale monsters voor filter doeleinden uit een eigen set van monsters, zoals eerder beschreven13, of gebruik de volgende geüploade blacklist: < https://data.mendeley.com/datasets/9y4yhwt5rp/3 >.
- Filter enkele nucleotide variaties met behulp van SNVFI < https://-github.com/toolsvanbox/snvfi >.
- Vooraf ingesteld SNVFI. config-bestand, zodat alle paden naar helper-functies correct zijn.
- Voer SNVFI uit met het. ini-bestand dat is geconfigureerd volgens de instellingen in aanvullend bestand 1 (snvfi. ini). Om in vitro geïnduceerde mutaties uit te sluiten, filteren we op een VAF ≥ 0,39.
- Controleer de variant allel-breuk (VAF)-uitgang van SNVFI (Figuur 4). Controleer of de piek van het dichtheids perceel in de buurt van 0,5 is, wat aangeeft dat het monster klonale is.
-
Optioneel: Om het deel van het genoom te bepalen dat tijdens het filteren wordt bedekt, bepaalt u de te bepalen regio's langs kiembaan en Control met behulp van callableloci van gatk (genoom Analysis Toolkit):
java-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T CallableLoci \
-R referentie. fasta \
-I mylees. BAM \
-overzicht Table. txt \
-o callable_status. bed -
Optioneel: Haal de te callableloci-uitvoerbare regio's op en voer Pairwise kruispunten uit tussen de voorbeelden en de bulk met behulp van het python-script CallableLoci_processor. py aanwezig op https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . De resulterende bedbestanden kunnen worden gebruikt om de uitvoer van SNVFI verder te filteren en om het mutationele profiel in sectie 9 te inspecteren:
CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – samples sample1 sample2 sample3
8. Indel bellen
- Selecteer alle inserties en verwijderingen (indels) in het bestand raw_variants. vcf met behulp van GATK Selectvarianten:
Java-Xmx12G \
-jar GenomeAnalysisTK. jar \
-T Selectvarianten \
-R reference_genome. fasta \
-V raw_variants. vcf \
-o raw_INDELs. vcf \
-selectType INDEL - Filter raw_INDELS. vcf lijst met behulp van INDELFI < https://-github.com/toolsvanbox/indelfi >:
perl INDELFI.pl-i input. vcf (vanaf stap 8,1) \
-s kolom test sample \
-c kolom controlemonster
9. inspectie van het mutational profiel
- Gebruik de resulterende. vcf-bestanden van snvfi-uitvoer van stap 7,6 (of van stap 7,9 met optionele Callable loci-analyse) voor het analyseren van het genomische mutatie profiel, mutatie typen en handtekening analyse met behulp van het R-pakket mutationalpatterns15: < http://Bioconductor.org/packages/release/bioc/HTML/mutationalpatter> Voor representatieve uitvoer die kan worden geproduceerd met het resulterende. VCF-bestand, zoals een 96-trinucleotide-mutationspectrum, Zie Figuur 5.
10. bouw van een ontwikkelings afstamming met behulp van basis vervangingen
- Om een ontwikkelings afstamming te construeren, detecteert u gedeelde mutaties tussen klonen. Mutaties die aanwezig zijn in de eerste takken van de Lineage tree kunnen ook subclonaal aanwezig zijn in het bulk monster (MSCs/T-cellen). Latere vertakkings lijnen zullen worden gedefinieerd door mutaties die alleen door HSPC-klonen worden gedeeld.
- Voer de volgende stappen uit om mutaties te identificeren die aanwezig zijn in een subset van de klonen en subclonaal aanwezig zijn in de bulk.
- Om te filteren op somatische mutaties die worden gedeeld tussen klonen, voert u het script filterSomatic.py uit in een op UNIX gebaseerde terminal. Het script kan worden gevonden op https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Voordat u dit script uitvoert, bewerkt u het bestand filterSomatic. ini (Zie aanvullend bestand 2) om de paden in te stellen en de andere parameters aan te passen.
- Voer filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i filterSomatic. ini).
- Filter op mutaties die subclonaal aanwezig zijn in de bulk met behulp van de Determine_lowVAF_bulk. R-script in een op UNIX gebaseerde terminal. Het script kan worden gevonden op https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Hierdoor worden afzonderlijke vcf-bestanden gegenereerd voor gedeelde en unieke Snv's:
Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
--VCF pad/naar/Filter_somatic_output. vcf
--bulk bulk_name
--sample_name sample-naam
--geslacht [M | F
--out_dir out_dir - Bepaal alle mutaties die worden gedeeld tussen klonen die niet aanwezig zijn in het bulk monster door alle mutatie posities te overlappen (aaneenschakeling van kolom 1 en 2 van SNVFI-uitvoer).
- Uitsluiten van valse positieven verkregen tijdens de stappen 10,5 en 10,6 door handmatige inspectie met behulp van IGV16. Mutaties worden als vals beschouwd wanneer ze niet aanwezig zijn, wanneer de mutatie aanwezig is in de kiembaan of indien aanwezig in slecht toegewezen gebieden, Zie Figuur 7.
Opmerking: We raden ten zeerste aan om alle gedeelde loci onafhankelijk van elkaar te sequentiëren met behulp van gerichte of Sanger--sequencing. - Gebruik de gedeelde mutaties verkregen tijdens de stappen 10,1 en 10,2 om een binaire tabel van mutaties versus gesequentieerde klonen te bouwen, waarbij 0 aangeeft dat de mutatie niet aanwezig is en 1 de aanwezigheid van de mutatie aangeeft.
- Uitvoer de mutatie binaire tabel zoals in een heatmap samen met een dendrogram dat de Lineage relaties tussen cellen met behulp van R aangeeft. De heatmap geeft de mutatie status voor elke cel aan. Zie de uitvoer van deze functie (Figuur 6).
Klonen <-lezen. table ("pad/naar/BinaryTable")
my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)
col_breaks <-c (0, 0,5, 1)
heatmap. 2 (klonen, distfun = functie (x) dist (x, method = ' binary '),
hclustfun = functie (x) hclust (x, methode = gemiddelde),
Dendrogram = "kolom", Rowv = F,
Col = my_palette, Breaks = col_breaks,
Trace = "none", dichtheid. info = "geen")
Representative Results
Experimentele procedure
De experimentele werkstroom wordt afgebeeld in Figuur 1. Op basis van het type invoer materiaal moeten verschillende stappen worden gevolgd. In Figuur 2 wordt een Flow cytometrische uitgang van een bloedcel sortering van het snoer afgebeeld. Eerst worden alle monocytische cellen geselecteerd door losjes een hek rond deze populatie te trekken. Vervolgens worden onderhemden geïsoleerd door te selecteren voor cellen met een lineaire FSC-h/FSC-a ratio, als een lagere FSC-h/FSC-a ratio inclusief wambuizen of Cell clumps. Het onbevlekte controlemonster wordt gebruikt om de celsorteer poorten voor Lineage-, CD34+, CD38-, CD45RA-te definiëren. Daarnaast kunnen CD90 en CD49f worden gebruikt om onderscheid te maken tussen voorlopercellen of zelf-vernieuwende stamcellen17 (Figuur 2). Index sortering maakt het opnieuw traceren van afzonderlijke cellen mogelijk en de gesorteerde cellen worden afgebeeld als bruine stippen. Tijdens de celkweek kunnen individuele klonen in een ander tempo groeien, waarbij sommige klonen binnen 3 weken worden uitgebreid, terwijl andere klonen pas volledig worden uitgebreid tot de vijfde week van de cultuur. Zie afbeelding 3a, B voor representatieve kolonie-uitgroei. Een representatief beeld wordt getoond van een bijna confluente MSC bulk cultuur op 11 dagen na het beplating (figuur 3c).
Kwaliteit controleren na sequentiëren en mutatieanalyse
Weergegeven is een voorbeelduitvoer van de kopie-nummeranalyse gegenereerd door Control-FreeC14 om te controleren op kopie nummer wijzigingen (Figuur 4). Karyotypische informatie kan aangeven welke chromosomen uit te sluiten tijdens een SNVFI run (stap 7,6). Het VAF plot gemaakt door SNVFI (Figuur 5) is een histogram van variant allel frequenties in het monster. Een piek in het dichtheids perceel op 0,5 geeft aan dat het monster klonale is. Om meer inzicht te krijgen in de onderliggende biologische oorzaken achter mutaties, kunnen deze worden geanalyseerd met behulp van het R-pakket MutationalPatterns15. Hier afgebeeld is een typische analyse die een 96-trinucleotide plot produceert (Figuur 6). Naast de kwantificering van verschillende mutatie typen kan ook handtekening extractie met deze tool worden uitgevoerd.
Het opbouwen van een ontwikkelings Lineage tree
Mutaties die worden gedeeld tussen klonen of aanwezig zijn in een kloon (en bij lage VAF) in het besturingselement kiembaan worden gevalideerd met behulp van igv. Mutaties worden als waar beschouwd wanneer ze in het monster aanwezig zijn en niet op hoge VAF-niveaus in de kiembaan (figuur 7A). Mutaties worden als vals beschouwd wanneer ze niet aanwezig zijn in IGV, wat kan gebeuren in slecht toegewezen gebieden (figuur 7b). In andere gevallen, gebeurtenissen gedetecteerd door snvfi worden gemist kiembaan mutaties (figuur 7C). Onafhankelijke hersequencing van mutaties door gerichte re-sequencing wordt ten zeerste aanbevolen voor deze mutaties in geselecteerde klonen. Na detectie van gedeelde somatische mutaties tussen klonen wordt een binaire matrix gegenereerd (stap 10,8). Een heatmap is opgebouwd met cellen met en zonder de gedeelde mutaties A-M. Boven deze heatmap wordt de ontwikkelings Lineage boom aangegeven (Figuur 8).
Figuur 1: stroomdiagram met een experimentele procedure op basis van input materiaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Sorteer strategie voor cellen. Eerst wordt gating uitgevoerd op kleine mononucleaire cellen. Ten tweede worden enkele cellen afgeschermd door selectie van de lineaire breuk. Lineage negatieve cellen worden afgesloten. Alle CD34+ CD38- CD45- cellen zijn eencellige gesorteerd. De Fractie van de cellen in bruin moet worden genoteerd, welke zijn de gesorteerde cellen gemarkeerd door de optie "index Sorteren". Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve celcultuurresultaten. Representatieve HSPC klonen in een 384 goed plaat op (a) 2 weken na het beplating en (B) 4 weken na het beplating. C) MSC-cultuur na 2 weken gemiddelde vervanging. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Karyotypen. A) KLONALE hspc-cultuur en (B) MSC-bulk monster. De karyotypes werden bepaald door een lees diepteanalyse. Beide grafieken duiden op een karyotypisch normaal monster. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: histogram van variant allel-frequenties. Histogram van variant allel frequenties van de varianten in een kloon vóór de laatste filterstap van SNVFI (VAF > 0.3). Een piek bij VAF = 0,5 geeft aan dat het monster klonale is. De subclonal mutaties met lage VAF zijn uitgesloten tijdens de laatste filterstap van SNVFI (VAF > 0.3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: representatieve mutatie spectrum analyse van somatische mutaties in een hspc-monster. Afgebeeld is de relatieve bijdrage van elke trinucleotide-verandering (waarvan de middelste basis is gemuleerd) tot het totale spectrum. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: manuele inspectie van mutaties met behulp van IGV16. A) mutaties worden als waar beschouwd wanneer zij in de kloon aanwezig zijn en niet in het bulk monster. B) mutaties worden als vals-positieven beschouwd wanneer ze in een slecht toegewezen gebied aanwezig zijn. C) mutaties worden als vals-positieven beschouwd als ze in een kiembaan-controle aanwezig zijn. De verticale lijn geeft de positie van een zogenaamde mutatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: bouw van een boom van de ontwikkelings afstamming. Afgebeeld is een dendrogram dat de ontwikkelingslijn aangeeft die tijdens de ontwikkeling afsplitst. De heatmap onder het dendrogram duidt op de aanwezigheid van mutaties in verschillende klonen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Hier gepresenteerd is een methode om mutaties op te sporen die zich tijdens het leven in individuele Hspc's hebben verzameld en om een vroege ontwikkelings stamboom te construeren met behulp van deze mutatiegegevens.
Er moet aan verschillende kritieke vereisten worden voldaan om deze tests met succes te kunnen uitvoeren. Ten eerste moet de levensvatbaarheid van de steekproef worden gewaarborgd. Snelle hantering van het monster is essentieel om de efficiëntie van de procedure te garanderen. Ten tweede, verlies van groeifactor potentie zal negatieve invloed hebben op de klonale expansie van Hspc's. Om te zorgen voor een hoge groeifactor potentie, het is belangrijk om te voorkomen dat bevriezen-ontdooien cycli en bereiden voor eenmalig gebruik aliquots. Ten derde, na het uitvoeren van WGS, mutatie bellen en filteren, is het cruciaal om de clonaliteit van de klonale cultuur te valideren. Om de clonaliteit van de cultuur te bevestigen, moet de VAF van de mutaties rond de 0,5 in een karyotypisch normaal monster worden geclusteren (Figuur 3). In cellen met een lage mutationele belasting, zoals bloedarm Hspc's, is het moeilijker om de clonaliteit te bepalen als gevolg van de lage mutatie aantallen.
Onze aanpak is gebaseerd op in vitro uitbreiding van afzonderlijke cellen om WGS mogelijk te maken. Daarom is onze aanpak beperkt tot cellen die het replicatieve potentieel hebben om klonen uit te breiden, zoals Hspc's. In onze handen zijn ongeveer 5%-30% van alle enkelvoudige gesorteerde cellen in staat om voldoende uit te breiden. Gereduceerde uitgroei percentages kunnen mogelijk resulteren in een selectie bias. Zoals eerder besproken, methoden met behulp van WGA kunnen overwinnen deze selectie bias als deze techniek is niet afhankelijk van de uitbreiding van cellen. WGA heeft echter zijn eigen tekortkomingen, en van klonen Amplification blijft de enige methode om nauwkeurig het aantal mutaties in het hele genoom te bepalen zonder allel dropouts en gelijke dekking langs het genoom, vooral in monsters met lage echte somatische Mutatie nummers.
De gegevens die worden gegenereerd met behulp van deze aanpak kan worden gebruikt om te bepalen van de fylogenies van het hematopoietische systeem, als de mutaties gedetecteerd in enkele cellen kunnen worden gebruikt om te ontleden celkilometer standen, zoals afgebeeld in Figuur 6. Normaalgesproken kunnen een of twee mutaties elke tak in een gezonde donor1definiëren. Sinds het begin van de bevruchting van de lijn, zullen mutaties die deze eerste takken definiëren ook aanwezig zijn met een lage VAF in het overeenkomende normale monster dat werd gebruikt voor het filteren van de kiembaan varianten1,18,19. In dit geval, het gebruik van niet-hematopoietische cellen, zoals MSCs, hebben de voorkeur omdat ze worden verwacht zeer vroeg scheiden tijdens de ontwikkeling van het hematopoietische systeem. Aangezien T-cellen van hematopoietische oorsprong zijn, kon het gebruik van deze cellen als een overeenkomend normaal monster om kiembaan-varianten te filteren, daarom de bouw van de vroegste vertakking van de ontwikkelings Lineage-boom verbeelden. Subklonale aanwezigheid van branchespecifieke mutaties in bepaalde volwassen bloed populaties, die kunnen worden gemeten door gerichte diepe sequentiëren, geeft aan dat de nakomelingen van dat filiaal aanleiding kunnen geven tot dat volwassen celtype. Daarnaast maakt onze aanpak het mogelijk om de mutationele gevolgen van mutagene blootstelling in vivo te beoordelen en uiteindelijk hoe dit kan bijdragen aan leukemie ontwikkeling.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door een a VIDI Grant van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) (No. 016. Vidi. 171.023) naar R. v. B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
- Osorio, F. G., et al. Somatic Mutations Reveal Lineage Relationships and Age-Related Mutagenesis in Human Hematopoiesis. Cell Reports. 25, 2308-2316 (2018).
- Genovese, G., et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer Risk Inferred from Blood DNA Sequence. New England Journal of Medicine. 371, 2477-2487 (2014).
- Jaiswal, S., et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes. New England Journal of Medicine. 371, 2488-2498 (2014).
- Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. Nature Communications. 7, 1-7 (2016).
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., Wedge, D. C., Campbell, P. J., Stratton, M. R. Deciphering Signatures of Mutational Processes Operative in Human Cancer. Cell Reports. 3, 246-259 (2013).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500, 415-421 (2013).
- Alexandrov, L., et al. The Repertoire of Mutational Signatures in Human Cancer. bioRxiv. , (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. 513, 422-425 (2014).
- Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538, 260-264 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: Current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17, 175-188 (2016).
- Dong, X., et al. Accurate identification of single-nucleotide variants in whole-genome-amplified single cells. Nature Methods. 14, 491-493 (2017).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150, (2012).
- Jager, M., et al. Measuring mutation accumulation in single human adult stem cells by whole-genome sequencing of organoid cultures. Nature Protocols. 13, 59-78 (2018).
- Boeva, V., et al. Control-FREEC: A tool for assessing copy number and allelic content using next-generation sequencing data. Bioinformatics. 28, 423-425 (2012).
- Blokzijl, F., Janssen, R., van Boxtel, R., Cuppen, E. MutationalPatterns: Comprehensive genome-wide analysis of mutational processes. Genome Medicine. 10, 1-11 (2018).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): High-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192 (2013).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. , (2011).
- Lee-Six, H., et al. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations. Nature. 561, 473-478 (2018).
- Behjati, S., et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature. , (2014).
