Summary
Somatische Mutationsmuster in Zellen spiegeln die vorherige mutagene Exposition wider und können Entwicklungslinienbeziehungen aufzeigen. Hier wird eine Methodik zum Katalogisieren und Analysieren somatischer Mutationen in einzelnen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen vorgestellt.
Abstract
Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) akkumulieren während einer Lebensdauer allmählich DNA-Mutationen, die zu altersassoziierten Krankheiten wie Leukämie beitragen können. Die Charakterisierung der Mutationsakkumulation kann das Verständnis der Ätiologie altersassoziierter Krankheiten verbessern. Hier wird eine Methode vorgestellt, um somatische Mutationen in einzelnen HSPCs zu katalogisieren, die auf der Ganzgenomsequenzierung (WGS) klonaler Primärzellkulturen basiert. Mutationen, die in der ursprünglichen Zelle vorhanden sind, werden von allen Zellen in der Klonkultur geteilt, während Mutationen, die in vitro nach der Zellsortierung erworben wurden, in einer Teilmenge von Zellen vorhanden sind. Daher ermöglicht diese Methode den genauen Nachweis somatischer Mutationen in den Genomen einzelner HSPCs, die sich im Laufe des Lebens ansammeln. Diese Kataloge somatischer Mutationen können wertvolle Einblicke in mutationsaktive Mutationsprozesse im hämatopoetischen Gewebe liefern und wie diese Prozesse zur Leukemogenese beitragen. Darüber hinaus können durch die Bewertung somatischer Mutationen, die zwischen mehreren HSPCs desselben Individuums geteilt werden, klonale Abstammungsbeziehungen und populationsische Dynamiken von Blutpopulationen bestimmt werden. Da dieser Ansatz auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen beruht, ist die Methode auf hämatopoetische Zellen mit ausreichendem replizierendem Potenzial beschränkt.
Introduction
Die Exposition hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) gegenüber endogenen oder extrinsischen mutagenen mutagenen erbgutverändernden Quellen trägt zur allmählichen Ansammlung von Mutationen in der DNA während einer Lebensdauer1bei. Die allmähliche Mutationsakkumulation in HSPCs1 kann zu altersbedingter klonaler Hämatopoese (ARCH)2,3führen, was ein nicht symptomatischer Zustand ist, der von HSPCs angetrieben wird, die Leukämie-Treibermutationen tragen. Anfangs wurde angenommen, dass Personen mit ARCH ein erhöhtes Risiko für Leukämie haben2,3. Jedoch, neuere Studien haben gezeigt, dass eine Inzidenz von 95% der ARCH bei älteren Menschen4, so dass die Assoziation mit bösartigenErkrankungen weniger klar und wirft die Frage, warum einige Personen mit ARCH schließlich tun oder nicht entwickeln Malignitäten. Dennoch können somatische Mutationen in HSPCs ernste Gesundheitsrisiken darstellen, da myelodysplastische Störungen und Leukämie durch das Vorhandensein spezifischer Krebstreibermutationen gekennzeichnet sind.
Um die Mutationsprozesse zu identifizieren und die Klonalität des Blutes zu untersuchen, muss die Mutationsakkumulation in einzelnen HSPCs charakterisiert werden. Mutationsprozesse hinterlassen charakteristische Muster im Genom, sogenannte Mutationssignaturen, die in genomweiten Mutationssammlungen identifiziert und quantifiziert werden können5. Zum Beispiel wurden die Exposition gegenüber UV-Licht, Alkylierungsmitteln und Defekten in DNA-Reparaturwegen jeweils mit einer anderen Mutationssignatur in Verbindung gebracht6,7. Darüber hinaus sind aufgrund der stochastischen Natur von Mutationsakkumulationen die meisten (wenn nicht alle) der erworbenen Mutationen zwischen den Zellen einzigartig. Wenn Mutationen zwischen mehreren Zellen desselben Individuums geteilt werden, bedeutet dies, dass diese Zellen einen gemeinsamen Vorfahr e. Werthaben 8. Daher können durch die Bewertung gemeinsamer Mutationen Linienbeziehungen zwischen Zellen bestimmt werden, und ein Entwicklungslinienbaum kann verzweigt nach Zweig enzaust erstellt werden. Die Katalogisierung seltener somatischer Mutationen in physiologisch normalen Zellen ist jedoch aufgrund der polyklonalen Natur gesunder Gewebe technisch eine Herausforderung.
Hier wird eine Methode vorgestellt, um somatische Mutationen in den Genomen einzelner HSPCs genau zu identifizieren und zu bestimmen. Dies beinhaltet die Isolierung und klonale Expansion von HSPCs in vitro. Diese klonalen Kulturen spiegeln die genetische Zusammensetzung der ursprünglichen Zelle wider (d. h., Mutationen in der ursprünglichen Zelle werden von allen anderen Zellen in der Kultur geteilt). Dieser Ansatz ermöglicht es uns, genügend DNA für die gesamte Genomsequenzierung (WGS) zu erhalten. Wir haben bereits gezeigt, dass Mutationen, die sich in vitro während der klonalen Kultur angesammelt haben, von einer Teilmenge von Zellen geteilt werden. Dies ermöglicht die Filterung aller In-vitro-Mutationen, da diese in einem kleineren Bruchteil der Lesevorgänge im Vergleich zu in vivo erworbenen Mutationen9vorhanden sein werden. Frühere Methoden haben ausreichende DNA aus einer einzelzelle für WGS mit Vollgenom-Amplifikation (WGA)10erhalten. Der Hauptnachteil von WGA ist jedoch seine relativ fehleranfällige und unausgewogene Verstärkung des Genoms, die zu Allele-Aussetzern führen kann11. Da dieser Ansatz jedoch auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen beruht, ist er auf Blutzellen mit ausreichendem replizitivem Potenzial beschränkt, was bei WGA-abhängigen Methoden nicht der Fall ist. Frühere Bemühungen, klonale Kulturen zu sequenzieren, haben sich auf die Verwendung von Feederschichten verlassen, um die klonale Verstärkung einzelner HSPCs zu gewährleisten12. DNA aus den Feederschichten kann jedoch potenziell die DNA der Klonkulturen kontaminieren und die anschließende Mutationsaufruf und -filterung verwirren. Die hier vorgestellte Methode beruht ausschließlich auf spezifizierten Datenträgern, um einzelne HSPCs klonal zu erweitern, und vermeidet somit das Problem der DNA-Kontamination. Bisher haben wir diese Methode erfolgreich auf menschliches Knochenmark, Nabelschnurblut, viably gefrorenes Knochenmark und peripheres Blut angewendet.
Protocol
Die Proben müssen in Übereinstimmung mit den entsprechenden Ethikprotokollen gewonnen werden, und die Spender müssen vor dem Verfahren eine informierte Einwilligung geben.
1. Herstellung von Probenmaterial
HINWEIS: Wenn Sie mit frisch gewonnenem Material arbeiten, beginnen Sie mit Schritt 1.1. Wenn Sie mit gefrorenem Material arbeiten, beginnen Sie mit Schritt 1.2.
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Vorbereitung von frischem Knochenmark, Nabelschnurblut oder peripherem Blut
- Isolieren Sie den mononuklearen Anteil aus der Probe unter Verwendung der Dichtegradiententrennung, indem Sie den Anweisungen der Hersteller folgen (siehe Tabelle der Materialien), und zählen Sie die mononukleären Zellen mit einem Hämozytometer. Nach der Isolierung der mononukleären Zellen mit Schritt 1.3 fortfahren.
- OPTIONAL: Die empfohlene Anzahl von Zellen, die erforderlich sind, um eine vollständige 384 Well-Platte von HSPCs zu sortieren, beträgt 1–2 x 107. Wenn mehr Zellen während der Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden, speichern Sie den Überschuss der Zellen in flüssigem Stickstoff.
- Resuspend Zellen in 500 L IMDM + 10% FBS pro 1 x 107 Zellen, und fügen Drop-by-Drop ein gleiches Volumen von IMDM + 30% FBS + 20% DMSO, um eine Suspension von 1 x 107 Zellen in 1 ml IMDM + 20% FBS + 10% DMSO zu erreichen.
- Übertragen Sie die mononukleären Zellen sofort über Nacht in einem kontrollierten Zellgefrierbehälter auf 1 ml kryogene Durchstechflaschen und Gefrierzellen bei -80 °C. Übertragen Sie die Zellen am nächsten Tag nach der Weiterverarbeitung in eine Flüssigstickstoffspeicherung.
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Vorbereitung gefrorener mononuklefreier Zellen aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder peripherem Blut
- Bereiten Sie 50 ml Zellauftaumedium mit 45 ml Iscove es Modified Eagle es Medium (IMDM) und 5 ml fetales Rinderserum (FBS) vor und erwärmen Sie sich im 37 °C Wasserbad.
- Nehmen Sie die Durchstechflasche, die die Probe enthält, aus der Flüssigkeitsstickstoffspeicherung, übertragen Sie die Probe in Trockeneis und tauen Sie so schnell wie möglich in einem 37 °C-Wasserbad auf.
- Wenn die Probe fast aufgetaut ist, wischen Sie die Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab und übertragen Sie ihren Inhalt in ein 50 ml konisches Rohr. Spülen Sie die Durchstechflasche mit 1 ml vorgewärmtem IMDM + 10% FBS, um die verbleibenden Zellen zu sammeln, und fügen Sie diese Lösung tropfenweise (5 s pro Tropfen) zur aufgetauten Probe hinzu, während sie das Rohr sanft wirbeln.
- Fügen Sie der Probe eine zusätzliche vorgewärmte 15 ml IMDM + 10% FBS tropfenweise in die Probe hinzu, während Sie das Rohr sanft wirbeln.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 350 x g.
- Entfernen Sie alle bis auf 3 ml des Überstandes. Setzen Sie die Zellen im verbleibenden Überstand wieder aus und verdünnen Sie sie, indem Sie 20 ml IMDM + 10% FBS Drop-by-Drop hinzufügen, während das Rohr sanft geschüttelt wird.
- Nehmen Sie 10 l der Zellsuspension für die Zellzählung. Verdünnen Sie diese 10 l, indem Sie 20 l 0,4% Trypan-Blaulösung hinzufügen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Die Zellzahl kann beim Auftauen abnehmen, mit bis zu 50% Zellverlust nach dem Auftauen. Die Zelllebensfähigkeit sollte zwischen 70 % und 90 % liegen.
- Wenn Sie mit Knochenmark oder Nabelschnurblutzellen arbeiten, nehmen Sie 5 x 106 mononukleäre Zellen für die MSC-Kultur auf (Schritt 2.1). Wenn Sie mit peripherem Blut arbeiten, nehmen Sie 2–5 x 106 Zellen für die T-Zell-Isolierung auf (Schritt 2.2)
- Pellet restliche Zellen 5 min bei 350 x g und Resuspend in 3 ml FACS Puffer (0,05% BSA + 1 mM EDTA in PBS).
- Übertragen Sie 1 x 105 Zellen in ein Mikrorohr, das mit 200 L FACS-Puffer gefüllt ist, was als negative Kontrolle für die Durchflusszytometrie dient (Schritt 3.8), und auf Eis bleibt.
2. Zellkultur
HINWEIS: Um Kataloge somatisch erworbener Mutationen zu erhalten, muss die spenderspezifische Keimbahnvariation herausgefiltert werden. Beim Beginn mit Knochenmarkbiopsien oder Nabelschnurblut können mesenchymale Stromalzellen (MSCs) als abgestimmte Steuerung verwendet werden, um nach Keimbahnvariationen zu filtern. Folgen Sie in diesem Fall Abschnitt 2.1. Bei Verwendung von (mobilisiertem) peripherem Blut folgen Sie Schritt 2.2, um T-Zellen als übereinstimmende Kontrollprobe zu isolieren und zu verwenden, um nach Keimbahnvariation zu filtern (Abbildung 1). Die Massen-T-Zellen-Population hat dieselbe Abstammungsbeziehung wie HSPCs.
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MSC-Kultur
- Bereiten Sie 50 ml MSC-Medium vor, das 45 ml DMEM/F12 medium, 10% FBS, 500 l Trypsin oder Trypsin-Alternative und 500 l Penicillin/Streptomycin-Lösung enthält.
- Platte ca. 5 x 105 mononukleäre Zellen in 1,5 ml MSC-Medium pro Brunnen. Legen Sie die Zellen in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2.
- Ersetzen Sie das Medium nach 24 h, und ersetzen Sie anschließend Medium alle 3 Tage, um sicherzustellen, dass alle hämatopoetischen Zellen abgewaschen werden. Fahren Sie mit der Kultur fort, bis die Konfluenz 100% beträgt.
- Wenn die MSCs konfluent sind, waschen Sie Zellen mit 1 ml PBS und ernten Sie die MSCs, indem Sie pro Brunnen 200 l Trypsin oder Trypsin-Alternative hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen für 5 min bei 37 °C. Fügen Sie 800 l MSC-Medium hinzu und pipet die Zellen nach oben und unten, um die Zellen von der Brunnenplatte zu lösen.
- Übertragen Sie MSCs auf Mikrozentrifugenrohr und pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 350 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die DNA-Isolierung fort oder lagern Sie das Pellet bei -20 °C für eine spätere DNA-Isolierung (Abschnitt 4).
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T-Zell-Isolierung
HINWEIS: Bei Verwendung von (mobilisiertem) peripherem Blut können T-Zellen isoliert und als Keimbahnkontrolle verwendet werden.- Setzen Sie das Zellpellet in 100 l Anti-CD3-Färbungslösung (1:100 Verdünnung des Anti-CD-Antikörpers im FACS-Puffer) wieder auf.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml FACS-Puffer hinzufügen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 350 x g und resuspendieren in 300 l FACS Puffer.
- Isolieren Sie mindestens 5 x 105 CD3+ Zellen mit einem FACS-Sortierer in einem 5 ml Polystyrolrohr, das mit 1 ml FBS vorgefüllt ist.
- Pellet die sortierten Zellen mit Zentrifugation für 5 min bei 350 x g, entfernen Sie den Überstand, und fahren Sie direkt mit DNA-Isolierung (Abschnitt 4) oder speichern Sie das Pellet bei -20 °C für eine spätere DNA-Isolierung.
3. HSPC-Isolierung, Sortierung und Kultur
- Drehen Sie bei 1–2 x 107 mononukleären Zellen für 5 min bei 350 x g nach unten und suspendieren Sie in 50 l FACS-Puffer (siehe Schritt 2.2.1). Übertragen Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr.
HINWEIS: Erhöhen Sie beim Sortieren mit >2 x 107 Zellen den Antikörpermix und die FACS-Puffervolumen entsprechend. - Bereiten Sie 50 l 2x HSC Färbung Mischung nach dem Rezept in Tabelle 1gesehen .
| antikörper | Volumen [L] |
| BV421-CD34 | 5 |
| FITC-Lineage Mix (CD3/14/19/20/56) | 5 |
| PE-CD38 | 2 |
| APC- CD90 | 0,5 |
| PerCP/Cy5.5 - CD45RA | 5 |
| PE/Cy7- CD49f | 1 |
| FITC -CD16 | 1 |
| FITC-CD11 | 5 |
| FACS-Puffer | 25,5 |
Tabelle 1: HSC-Sortiermischung. Gezeigt wird eine Tabelle, die die Verdünnungen von Antikörpern angibt, die zum Sortieren der HSCs verwendet werden.
- Mischen Sie 50 l Zelllösung mit der vorbereiteten HSC-Färbungsmischung und inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur (RT) oder für 1 h auf Eis, damit die Antikörper binden.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugieren für 5 min bei 350 x ghinzufügen.
- Setzen Sie die Zellen in 300 L FACS-Puffer wieder auf und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 35 m großes Zellsieb-capped 5 ml Polystyrol-Rohr, um Zellklumpen vor der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) zu entfernen.
- Bereiten Sie 25 ml HSPC-Kulturmedium vor, bestehend aus 1x SFEM Medium, ergänzt mit 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL- 6 und 100 ng/mL Antibiotikaformulierung (siehe Tabelle).
- Füllen Sie eine 384 Well-Zell-Kulturplatte mit 75 l HSPC-Kulturmedium in jedem Brunnen.
HINWEIS: Um eine Verdunstung des Mediums in den äußeren Brunnen zu verhindern, füllen Sie die äußeren Brunnen mit 75 l sterilem Wasser oder PBS und verwenden Sie diese Brunnen nicht für die Zellsortierung. -
Sortieren einzelner HSPCs
- Stellen Sie Tore für die HSPC-Sortierung basierend auf einer ungefärbten Steuerung (Schritt 1.9) und 10.000 Zellen aus der gebeizten Probe ein. Ein repräsentatives Ergebnis zum Setzen von Toren ist in Abbildung 1dargestellt. Tor einzelne Zellen durch Zeichnen eines Tores um die lineare FSC-Höhe vs. FSC-Flächenfraktion. Verwenden Sie ungefärbte Kontrollfraktion, um Tor für Linie zu zeichnen- Fraktion. Zeichnen Sie Tore für CD34+ Zellen und charakterisieren Sie diese Teilmenge weiter, indem Sie ein bestimmtes Gate für CD38- CD45RA- Zellen festlegen.
- Laden Sie die 384 Wellplatte auf die FACS-Maschine und sortieren Sie einzelne Zellen.
HINWEIS: Wenn für den FACS-Computer zutreffend, schalten Sie die Option zum Beibehalten von Indexsortierdaten ein, um eine erneute Verfolgung der sortierten Zellen zu ermöglichen.
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Kultivieren von singly sortierten HSCs
- Die 384 Wellplatte direkt auf einen befeuchteten 37°C-Inkubator mit 5% CO2 übertragen.
HINWEIS: Um Verdunstung während der Kultur zu verhindern, wickeln Sie die 384 Brunnenkulturplatte (mit Deckel) in transparente Polyethylenfolie. - Bewahren Sie die 384-Well-Platte 3–4 Wochen im Inkubator auf, bis sichtbare Klone erscheinen. Repräsentative Bilder der klonalen Kultur sind in Abbildung 2dargestellt. Basierend auf dem Zustand des Eingangsmaterials werden 5%–30% der sortierten Zellen klonal erweitert.
- Die 384 Wellplatte direkt auf einen befeuchteten 37°C-Inkubator mit 5% CO2 übertragen.
4. Ernte von HSPC-Klonen
- Bestimmen Sie nach 4 Wochen Kultivierung, welche Brunnen eine Konfluenz von 30% oder höher haben.
- Vorbefüllen (für jedes klonale Auswuchs) 1,5 ml Mikroröhren mit 1 ml 1% BSA in PBS und beschriften sie das Rohr entsprechend dem entsprechenden Brunnen.
- Vorbefeuchten einer Pipettenspitze mit 1% BSA in PBS, um die Anzahl der Zellen zu minimieren, die an der Pipettenspitze kleben.
- Das Medium im Brunnen heftig (mindestens 5-mal) mit einer 200-L-Pipette (auf 75 l) nach oben/unten pfeifen und den Boden des Brunnens kratzen, um Zellen im Brunnen zu lösen, und die Zellsuspension in dem beschrifteten Mikrorohr entsprechend dem Brunnen sammeln.
- Nehmen Sie 75 l frische 1% BSA in PBS auf und wiederholen Sie die Pipettierung im Brunnen, um eine maximale Aufnahme der Zellen zu gewährleisten.
HINWEIS: Klonal kultivierte Zellen können am Boden des Brunnens kleben. Prüfen Sie die Brunnen mit einem standardinvertierten Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden. - Wenn alle Brunnen mit >30% Konfluenz geerntet wurden, legen Sie die 384 WellPlatte wieder in den Inkubator. Klonkulturen können sich bis zu 5 Wochen lang ausbreiten.
- Drehen Sie die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g. Ein kleines Pellet sollte sichtbar sein.
- Entfernen Sie sorgfältig alle bis auf ca. 5 l Überstand. Zellpellets können bei -20 °C eingefroren und mehrere Monate vor der DNA-Isolierung gelagert werden.
5. DNA-Isolation
-
Isolieren Sie HSPC und MSC/T-Zell-DNA mit einem Mikro-DNA-Isolationskit gemäß der Anweisung des Herstellers mit den folgenden Anpassungen:
- Fügen Sie 2 L RNase A nach Zugabe von Puffer AL während Abschnitt 2 hinzu. 2 min inkubieren, bevor Sie Proteinase K hinzufügen.
- 30 min bei 56 °C statt 10 min inkubieren.
- Elute die DNA durch Laden der Säule mit 50 L TE Puffer mit niedrigem EDTA (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA). Für eine optimale Elution das Eluat erneut auf die Säule laden und wieder drehen.
- Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einer DNA von 2 l pro Klon. Die DNA-Ausbeute schwankt in der Regel zwischen 0,5–3 ng/l.
6. Sequenzierung
- Durchführung einer DNA-Sequenzierung, wie von Jager et al.13 beschrieben
7. Mapping und somatische Mutationsaufrufe
- Zuordnen der Ausgabe von Sequenzierungen (FASTQ-Dateien) zum Referenzgenom und Aufrufmutationen, wie in Jager et al.13 beschrieben
- Überprüfen Sie die Daten auf abnorme karyotypische Änderungen in sequenzierten Klon- und Massendaten mithilfe eines Werkzeugs zur Analyse der Kopiennummer, z. B. Control-FreeC14. Bis jetzt haben wir keine HSPCs mit karyotypischen Aberrancen gemeldet.
- Generieren Sie eine schwarze Liste, die aus einem Panel mit nicht übereinstimmenden normalen Beispielen zu Filterzwecken aus einem eigenen Satz von Samples besteht, wie zuvorbeschrieben 13, oder verwenden Sie die folgende hochgeladene Blacklist:
- Filtern Sie einzelne Nukleotidvariationen mit SNVFI
- Voreingestellte SNVFI.config-Datei, sodass alle Pfade zu Hilfsfunktionen korrekt sind.
- Führen Sie SNVFI mit der .ini-Datei aus, die gemäß den Einstellungen in der zusatzen Datei 1 (SNVFI.ini) konfiguriert ist. Um in vitro induzierte Mutationen auszuschließen, filtern wir nach einem VAF 0,39.
- Prüfen Sie den Varianten-Allel-Bruch (VAF) Ausgang von SNVFI (Abbildung 4). Überprüfen Sie, ob der Spitzenwert des Dichtediagramms nahe 0,5 liegt, was darauf hinweist, dass die Probe klonal ist.
-
OPTIONAL: Um den Teil des Genoms zu bestimmen, der während der Filterung abgedeckt wird, bestimmen Sie die kalkulierbaren Regionen entlang der Keimbahn und steuern Sie mit CallableLoci von GATK (Genome Analysis ToolKit):
java -jar GenomeAnalysisTK.jar
-T CallableLoci
-R-Referenz.fasta
-Ich myreads.bam
-Zusammenfassung table.txt
-o callable_status.bed -
OPTIONAL: Rufen Sie die aufrufbaren Bereiche aus der CallableLoci-Ausgabe ab, und führen Sie paarweise Schnittmengen zwischen den Samples und der Masse mithilfe des Python-Skripts CallableLoci_processor.py aus, das auf https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Die resultierenden Bettdateien können verwendet werden, um die Ausgabe von SNVFI weiter zu filtern und das Mutationsprofil in Abschnitt 9 zu überprüfen:
CallableLoci_processor.py dir_in dir_out sample_name bulk_name –sample sample1 sample2 sample3
8. Indel Calling
- Wählen Sie alle Einfügungen und Löschungen (Indels) in der Datei raw_variants.vcf mit GATK SelectVariants aus:
java -Xmx12G
-jar GenomeAnalysisTK.jar
-T SelectVariants
-R reference_genome.fasta
-V raw_variants.vcf
-o raw_INDELs.vcf
-selectType INDEL - Filtern der raw_INDELS.vcf-Liste mit INDELFI
perl INDELFI.pl -i input.vcf (ab Schritt 8.1)
-s-Spaltentestbeispiel
-c Spaltenkontrollbeispiel
9. Mutationsprofilinspektion
- Verwenden Sie die resultierenden .vcf-Dateien aus der SNVFI-Ausgabe aus Schritt 7.6 (oder aus Schritt 7.9 mit optionaler aufrufbarer Loci-Analyse), um das genomische Mutationsprofil, Mutationstypen und Signaturanalyse mit dem R-Paket MutationalPatterns15zu analysieren:
10. Bau eines Entwicklungslinienbaums mit Basissubstitutionen
- Um einen Entwicklungslinienbaum zu erstellen, erkennen Sie gemeinsame Mutationen zwischen Klonen. Mutationen, die in den ersten Zweigen des Linienbaums vorhanden sind, können auch subklonal in der Massenprobe (MSCs/T-Zellen) vorhanden sein. Spätere Verzweigungslinien werden durch Mutationen definiert, die nur von HSPC-Klonen gemeinsam genutzt werden.
- Führen Sie die folgenden Schritte aus, um Mutationen zu identifizieren, die in einer Teilmenge der Klone vorhanden und subklonal in der Masse vorhanden sind.
- Um nach somatischen Mutationen zu filtern, die von Klonen gemeinsam genutzt werden, führen Sie das skript filterSomatic.py in einem Unix-basierten Terminal aus. Das Skript finden Sie unter https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Bevor Sie dieses Skript ausführen, bearbeiten Sie die Datei filterSomatic.ini (siehe Ergänzungsdatei 2), um die Pfade festzulegen und die anderen Parameter anzupassen.
- Führen Sie filterSomatic.py aus (python3 filterSomatic.py -i filterSomatic.ini).
- Filter nach Mutationen, die subklonal in der Masse vorhanden sind, mit dem Determine_lowVAF_bulk. R-Skript in einem Unix-basierten Terminal. Das Skript finden Sie unter https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Dadurch werden separate .vcf-Dateien für freigegebene und eindeutige SNVs generiert:
Rscript Determine_lowVAF_bulk. R
--vcf Pfad/To/Filter_somatic_output.vcf
--bulk bulk_name
--sample_name Beispielname
--Geschlecht [M| F]
--out_dir out_dir - Bestimmen Sie alle Mutationen, die zwischen Klonen geteilt werden, die nicht in der Massenstichprobe vorhanden sind, indem Sie alle Mutationspositionen überlappen (koncatenate Spalte 1 und 2 der SNVFI-Ausgabe).
- Schließen Sie falsche Positivmeldungen aus, die in den Schritten 10.5 und 10.6 durch manuelle Inspektion mit IGV16erzielt wurden. Mutationen gelten als falsch, wenn sie nicht vorhanden sind, wenn die Mutation in der Keimbahn vorhanden ist oder wenn sie in schlecht zugeordneten Regionen vorhanden sind, siehe Abbildung 7.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, alle gemeinsam genutzten Loci unabhängig mit gezielter oder sanger-Sequenzierung neu zu sequenzieren. - Verwenden Sie die gemeinsamen Mutationen, die während der Schritte 10.1 und 10.2 erhalten wurden, um eine binäre Tabelle von Mutationen im Vergleich zu sequenzierten Klonen zu erstellen, wobei 0 darauf hinweist, dass die Mutation nicht vorhanden ist, und 1, was auf das Vorhandensein der Mutation hinweist.
- Geben Sie die Mutationsbinärtabelle wie in einer Heatmap zusammen mit einem Dendrogramm aus, das Linienbeziehungen zwischen Zellen mit R angibt. Die Heatmap zeigt den Mutationsstatus für jede Zelle an. Siehe Ausgabe dieser Funktion (Abbildung 6).
Klonen <- read.table("Path/To/BinaryTable")
my_palette <- colorRampPalette(c("#cccccc", "#333333"))(n = 2)
col_breaks <- c(0,0.5,1)
heatmap.2(Klone, distfun=function(x) dist(x,method = 'binary'),
hclustfun=funktion(x) hclust(x,Methode = Durchschnitt),
dendrogram = "spalte", Rowv = F,
col=my_palette, breaks=col_breaks,
trace="none", density.info="none")
Representative Results
Experimentelles Verfahren
Der experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt. Je nach Art des Eingabematerials müssen verschiedene Schritte befolgt werden. In Abbildung 2 wird eine zytometrische Durchflussausgabe einer Nabelschnurblutzellsortierung dargestellt. Erstens werden alle monozytäre Zellen ausgewählt, indem lose ein Tor um diese Population gezeichnet wird. Dann werden Singlets isoliert, indem für Zellen mit einem linearen FSC-H/FSC-A-Verhältnis ausgewählt wird, da ein niedrigeres FSC-H/FSC-A-Verhältnis Doublets oder Zellklumpen enthält. Das unbefleckte Steuerbeispiel wird verwendet, um Zellsortierungsgates für Abstammung-, CD34+, CD38-, CD45RA-zu definieren. Zusätzlich können CD90 und CD49f verwendet werden, um zwischen Vorläuferzellen oder sich selbst erneuernden Stammzellen17 (Abbildung 2) zu unterscheiden. Die Indexsortierung ermöglicht die Nachverfolgung einzelner Zellen, und die sortierten Zellen werden als braune Punkte dargestellt. Während der Zellkultur können sich einzelne Klone in einem anderen Tempo ausdehnen, wobei sich einige Klone innerhalb von 3 Wochen ausdehnen, während andere Klone nur bis zur fünften Kulturwoche vollständig erweitert werden. Siehe Abbildung 3A,B für repräsentatives Koloniewachstum. Ein repräsentatives Bild einer nahezu konfluenten MSC-Massenkultur wird 11 Tage nach der Beschichtung gezeigt (Abbildung 3C).
Qualitätsprüfung nach Sequenzierung und Mutationsanalyse
Gezeigt wird eine Beispielausgabe der von Control-FreeC14 generierten Kopiernummernanalyse, um nach Änderungen der Kopiernummer zu suchen (Abbildung 4). Karyotypische Informationen können angeben, welche Chromosomen während eines SNVFI-Laufs ausgeschlossen werden sollen (Schritt 7.6). Das von SNVFI erstellte VAF-Diagramm (Abbildung 5) ist ein Histogramm variantenr Allelfrequenzen in der Probe. Ein Spitzenwert im Dichtediagramm bei 0,5 gibt an, dass die Probe klonal ist. Um mehr Einblick in die zugrunde liegenden biologischen Ursachen hinter Mutationen zu erhalten, können diese mit dem R-Paket MutationalPatterns15analysiert werden. Hier ist eine typische Analyse dargestellt, die eine 96-Trinukleotid-Diagramm erzeugt (Abbildung 6). Neben der Quantifizierung verschiedener Mutationstypen kann mit diesem Werkzeug auch die Signaturextraktion durchgeführt werden.
Bau eines Entwicklungsstammbaums
Mutationen, die unter Klonen geteilt werden oder in einem Klon (und bei niedrigem VAF) in der Keimbahnkontrolle vorhanden sind, werden mit IGV validiert. Mutationen gelten als wahr, wenn sie in der Probe vorhanden sind, und nicht bei hohen VAF-Werten in der Keimbahn (Abbildung 7A). Mutationen gelten als falsch, wenn sie in der IGV nicht vorhanden sind, was in schlecht zugeordneten Regionen auftreten kann (Abbildung 7B). In anderen Fällen sind von SNVFI entdeckte Ereignisse verpasste Keimbahnmutationen (Abbildung 7C). Für diese Mutationen in ausgewählten Klonen wird eine unabhängige Neusequenzierung von Mutationen durch gezielte Re-Sequenzierung empfohlen. Nach dem Nachweis gemeinsamer somatischer Mutationen zwischen Klonen wird eine binäre Matrix erzeugt (Schritt 10.8). Eine Heatmap wird mit Zellen mit und ohne die gemeinsamen Mutationen A-M erstellt. Oberhalb dieser Heatmap ist der Entwicklungslinienbaum angegeben (Abbildung 8).
Abbildung 1: Flussdiagramm, das experimentelle Verfahren auf der Grundlage von Eingabematerial darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zellsortierungsstrategie. Zunächst wird das Gating an kleinen mononukleären Zellen durchgeführt. Zweitens werden einzelne Zellen durch Auswahl des linearen Bruchs abgegrenzt. Liniennegative Zellen sind abgegrenzt. Alle CD34+ CD38- CD45- Zellen sind einzelzellensortiert. Der Anteil der Zellen in Braun sollte beachtet werden, d. h. die sortierten Zellen, die durch die Option "Indexsortierung" hervorgehoben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Zellkulturergebnisse. Repräsentative HSPC-Klone in einer 384-Well-Platte bei (A) 2 Wochen nach der Beschichtung und (B) 4 Wochen nach der Beschichtung. (C) MSC-Kultur nach 2 Wochen mittlerer Ersetzung. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Karyotypen. (A) Klonale HSPC-Kultur und (B) MSC-Massenstichprobe. Die Karyotypen wurden durch Lesetiefenanalyse bestimmt. Beide Graphen weisen auf eine karyotypische normale Probe hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Histogramm der Variantenallelefrequenzen. Histogramm der Variantenallelefrequenzen der Varianten in einem Klon vor dem letzten Filterschritt von SNVFI (VAF >0.3). Ein Peak bei VAF = 0,5 gibt an, dass die Probe klonal ist. Die subklonalen Mutationen mit niedrigem VAF werden beim letzten Filterschritt von SNVFI (VAF >0.3) ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Mutationsspektrumanalyse somatischer Mutationen in einer HSPC-Probe. Dargestellt wird der relative Beitrag jeder Trinukleotid-Änderung (von der die mittlere Basis mutiert ist) zum Gesamtspektrum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Manuelle Inspektion von Mutationen mit IGV16. (A) Mutationen gelten als wahr, wenn sie im Klon und nicht in der Massenprobe vorhanden sind. (B) Mutationen werden als falsch positive Werte betrachtet, wenn sie in einer schlecht zugeordneten Region vorhanden sind. (C) Mutationen werden als falsch positive Werte betrachtet, wenn sie in einer Keimbahnkontrolle vorhanden sind. Die vertikale Linie gibt die Position einer aufgerufenen Mutation an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Bau eines Entwicklungsstammbaums. Dargestellt ist ein Dendrogramm, das auf entwicklungsfördernde Linien hinweist, die sich während der Entwicklung abspalten. Die Heatmap unter dem Dendrogramm zeigt das Vorhandensein von Mutationen in verschiedenen Klonen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Hier wird eine Methode vorgestellt, um Mutationen zu erkennen, die sich während des Lebens in einzelnen HSPCs angesammelt haben, und um einen frühen Entwicklungslinienbaum mit diesen Mutationsdaten zu konstruieren.
Für eine erfolgreiche Durchführung dieser Tests müssen mehrere kritische Anforderungen erfüllt werden. Erstens muss die Lebensfähigkeit der Probe sichergestellt werden. Die schnelle Handhabung der Probe ist der Schlüssel, um die Effizienz des Verfahrens zu gewährleisten. Zweitens wird sich der Verlust der Wachstumsfaktor-Potenz negativ auf die klonale Expansion von HSPCs auswirken. Um eine hohe Wirksamkeit des Wachstumsfaktors zu gewährleisten, ist es wichtig, Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden und Einweg-Aliquots vorzubereiten. Drittens ist es nach der Durchführung von WGS, Mutationsaufruf und Filterung von entscheidender Bedeutung, die Klonalität der Klonkultur zu validieren. Um die Klonalität der Kultur zu bestätigen, sollte sich der VAF der Mutationen in einer karyotypischen normalen Probe um 0,5 gruppieren (Abbildung 3). In Zellen mit geringer Mutationslast, wie Zabelschnurblut-HSPCs, ist es aufgrund der geringen Mutationszahlen schwieriger, die Klonalität zu bestimmen.
Unser Ansatz beruht auf der In-vitro-Expansion einzelner Zellen, um WGS zu ermöglichen. Daher ist unser Ansatz auf Zellen beschränkt, die das replikierende Potenzial haben, klonal zu erweitern, z. B. HSPCs. In unseren Händen sind etwa 5%-30% aller einsortierten Zellen in der Lage, sich angemessen auszudehnen. Reduzierte Auswuchsraten können möglicherweise zu einer Auswahlverzerrung führen. Wie bereits erläutert, können Methoden, die WGA verwenden, diese Selektionsverzerrung überwinden, da diese Technik nicht auf der Erweiterung von Zellen beruht. Allerdings hat WGA seine eigenen Mängel, und die klonale Amplifikation bleibt die einzige Methode, um die Anzahl der Mutationen im gesamten Genom ohne Allelic-Aussetzer und gleiche Abdeckung entlang des Genoms genau zu bestimmen, insbesondere in Proben mit niedrigem Mutationszahlen.
Die mit diesem Ansatz generierten Daten können verwendet werden, um Phylogenitäten des hämatopoetischen Systems zu bestimmen, da die in einzelnen Zellen erkannten Mutationen verwendet werden können, um Zelllinien zu sezieren, wie in Abbildung 6dargestellt. In der Regel können ein oder zwei Mutationen jeden Zweig in einem gesunden Spender definieren1. Da Linien früh nach der Empfängnis verzweigen, werden Mutationen, die diese ersten Zweige definieren, auch mit einem niedrigen VAF in der übereinstimmenden normalen Probe vorhanden sein, die zum Filtern der Keimbahnvarianten1,18,19verwendet wurde. In diesem Fall wird die Verwendung von nicht-hämatopoetischen Zellen, wie MSCs, bevorzugt, da erwartet wird, dass sie sich sehr früh während der Entwicklung vom hämatopoetischen System trennen. Da T-Zellen hämatopoetischen Ursprungs sind, könnte die Verwendung dieser Zellen als abgestimmte normale Probe zum Filtern von Keimbahnvarianten daher die Konstruktion der frühesten Verzweigung des Entwicklungslinienbaums verwirren. Das subklonale Vorhandensein von astspezifischen Mutationen in bestimmten reifen Blutpopulationen, die durch gezielte tiefe Sequenzierung gemessen werden können, wird darauf hindeuten, dass die Nachkommen dieses Zweigs zu diesem reifen Zelltyp führen kann. Darüber hinaus ermöglicht unser Ansatz die Bewertung der mutationsischen Folgen einer mutagenen Exposition in vivo und letztlich, wie dies zur Entwicklung der Leukämie beitragen kann.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch ein VIDI-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Nr. 016.Vidi.171.023) an R. v. B. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| 50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
| CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
| CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
| CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
| CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
| CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
| CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
| CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
| CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
| Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
| CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
| Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
| Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
| Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
| Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
| Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
| PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
| RNAse A | Qiagen | 19101 | |
| SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
| StemSpan SFEM, 500 mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
| TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |
References
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