Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Метод Ex Vivo для оценки спонтанной подвижности репродуктивных путей мыши и алгоритмотслеживания движения uterus на основе MATLAB для анализа данных

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/59848
* These authors contributed equally

Summary

Сокращения матки имеют важное значение для благополучия женщин. Однако, патологически повышенная контрактильность может привести к дисменорея, особенно у молодых женщин. Здесь мы описываем простой препарат ex vivo, позволяющий быстро оценить эффективность гладких миорелаксантов, которые могут быть использованы для лечения дисменореии.

Abstract

Dysmenorrhea, или болезненные судороги, является наиболее распространенным симптомом, связанным с менцами у женщин и его тяжесть может препятствовать повседневной жизни женщин. Здесь мы представляем простой и недорогой метод, который будет играть важную роль для тестирования новых препаратов снижения контрактности матки. Этот метод использует уникальную способность всего репродуктивных путей мыши проявлять спонтанную подвижность при поддержании ex vivo в чашке Петри, содержащей кислородом буфер Кребс. Эта спонтанная подвижность напоминает волноподобную миометрийную активность матки человека, называемую эндометрийными волнами. Чтобы продемонстрировать эффективность метода, мы использовали известный релаксант матки, эпинефрин. Мы демонстрируем, что спонтанная подвижность всего репродуктивных путей мыши может быть быстро и обратимо ингибируется 1 мкм эпинефрина в этой модели блюда Петри. Документирование изменений подвижности матки можно легко сделать с помощью обычного смартфона или сложной цифровой камеры. Мы разработали алгоритм на основе MATLAB, позволяющий отслеживать движение для количественной оценки спонтанных изменений подвижности матки путем измерения скорости движений рогов матки. Основным преимуществом этого подхода ex vivo является то, что репродуктивный тракт остается нетронутым на протяжении всего эксперимента, сохраняя все внутренние внутриутробные клеточные взаимодействия. Основным ограничением этого подхода является то, что до 10-20% матки не может проявлять спонтанной подвижности. До сих пор это первый количественный метод ex vivo для оценки спонтанной подвижности матки в модели блюда Петри.

Introduction

Как основной женский орган, матка имеет решающее значение для размножения и имеет важное значение для питания плода1. Матка состоит из трех слоев: периметрия, миометрия и эндометрия. Миометрий является основным сократительный слой матки и играет ключевую роль в родах. Эндометрий является самым внутренним слоем, выстилающими полость матки, и необходим для имплантации эмбриона. У небеременных женщин репродуктивного возраста, слой эндометрия сбрасывается ежемесячно в начале менструального цикла. Миометрий помогает в этом процессе пролития путем поддержания спонтанных сокращений миометрия, необходимых для очистки ткани некротической эндометрия из матки1.

К сожалению, повышенная контрактильность миометрии может привести к негативным побочным эффектам, таким как дисменорея, или болезненные менструальные спазмы. Это особенно наблюдается у молодых женщин и nulliparous женщин2. Тем не менее, дисменорея отличается для каждой женщины и зависит от силы их миометрических сокращений; более сильные сокращения часто связаны с ощущением тяжелых судорог3. Миометрия контрактильность может быть визуализирована с помощью УЗИ матки и часто признается как эндометрия волн. Повышенное высвобождение простагландинов во время менструации4 в матке, переживающей эдометрия, как полагают, способствует увеличению гиперконтрактильности миометрии, что приводит к ишемии и гипоксии мышц матки и, таким образом, увеличивается боль3.

Тяжелая дисменорея может препятствовать повседневной деятельности некоторых женщин и от 3 до 33% женщин имеют очень сильную боль, которая может привести к женщине быть прикован к постели в течение 1 до 3 дней каждый менструальный цикл5. Дисменорея является основной причиной гинекологической заболеваемости у женщин репродуктивного возраста независимо от возраста, национальности и экономического положения5. По оценкам, распространенность дисменореи является как высокой, так и переменной, в диапазоне от 45% до 93% у женщин репродуктивного возраста5.  Дисменорея связанных боль оказывает влияние на повседневную жизнь женщин и может привести к плохой успеваемости у подростков, более низкое качество сна, ограничение повседневной деятельности, и изменения настроения5.

Многие женщины, которые испытывают серьезные дисменорея прибегают к внебиржевой лекарства, чтобы облегчить их боль. Такие безрецептурные препараты содержат ингибиторы циклооксигеназы (КОКС),которые предотвращают образование простагландинов 6. Тем не менее, ингибиторы COX связаны с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями, и около 18% женщин с дисменореей не реагируют на эти ингибиторы7. Таким образом, существует необходимость в новых лекарствах для уменьшения менструальных спазмов. В виду того что над contractility uterus способствует к pathogenesis dysmenorrhea, одной по возможности стратегией может быть польза утробных релаксантов.

Полезно количественно овоздействии потенциальных релаксантов в модели естественных спонтанных миометрийных волнообразных сокращений. Однако, до сих пор, не эффективный метод ex vivo для тестирования мышечно-расслабляющие препараты в нетронутой матки не было описано. В настоящее время изометрические измерения напряжения используются для оценки эффектов релаксантных препаратов. Во время таких измерений мышечная полоса матки поддерживается на постоянной длине при предварительной нагрузке в тканевой ванне, в то время как сила сокращения мышц матки регистрируется до и после стимуляции окситоцина в присутствии или отсутствии релаксанта препарата. Хотя этот подход очень полезен, он требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, изометрические сокращения не похожи на спонтанные волнообразные сокращения миометрия, которые естественным образом происходят в нетронутой матке. Уникально, маточные волны миометрия у грызунов могут быть визуализированы как подвижность рога матки, когда весь репродуктивный тракт (яичники, яидуки, матка и влагалище) поддерживается в буферном растворе. Здесь мы представляем метод ex vivo для мониторинга спонтанной подвижности нетронутой мышиной матки, помещенной в чашку Петри, содержащую кислородом буфер Кребса. Мы также описываем алгоритм количественной оценки подвижности с использованием трекера движения MATLAB. Этот новый подход обеспечивает легкую и менее дорогую альтернативу для проверки релаксант потенциал естественных средств правовой защиты и синтетических соединений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Медицинской школе Университета Индианы (Индианаполис, IN). В исследовании использовались 2-5-месячные F2-129S-C57BL/6 сексуально зрелых самок мышей.

ПРЕДЕКТО: Обеспечьте безопасность, надев лабораторное пальто, маску и перчатки при работе с животными и биоопасными материалами.

1. Подготовка решения

  1. Подготовка Кребс буфер, который содержит: 130 мм NaCl, 5 мм KCl, 2 мМ CaCl2, 1,2 мМ2PO4, 0,56 мМ MgCl2, 25 мм NaHCO3, и 5 мм глюкозы, рН 7,4. Непрерывно окисляйте буфер Кребса смесью сжатых газов, содержащих 5% CO2 и 95% O2 при сохранении температуры буфера при температуре 37 градусов по Цельсию с помощью циркулирующей водяной ванны.
  2. Подготовка Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS), который содержит: 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 136,89 мм NaCl, и 8,1 мм Na2HPO4, рН 7,4.

2. Подготовка животных

  1. Анестезия мышей с использованием ингаляции изофлуран (3%) с очисткой ототходы газа. Обеспечить адекватную анестезию, оценивая рефлексы вывода. Pinch задний нос, чтобы подтвердить никаких движений не вызываются, что свидетельствует о потере рефлекторной реакции. После достижения глубокой анестезии, эвтаназии животное путем обезглавливания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран может вызвать плавное расширение мышц. Таким образом, подготовка репродуктивного тракта должна быть широко промывают и инкубируются в буфере Кребс, по крайней мере 15-30 минут до начала экспериментов ex vivo. Изофлуран может вызвать раздражение и дискомфорт при контакте с кожей, поэтому будьте осторожны.
  2. Поместите тело на большой взвешивании лодки выстроились с бумажным полотенцем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные женщины-лаборанты не должны участвовать в экспериментах с изофлураном, поскольку он может уменьшить вес плода, уменьшить околению скелета плода, и увеличить риск спонтанного аборта8,9. Вдыхание CO2 может быть использовано в качестве замены для эвтаназии мышей.

3. Определение эструсического цикла Этап

  1. С небольшими щипцы, поднимите клитор, чтобы получить доступ к вагинальный остюй и медленно вставьте микропайпет отзыв, содержащий 10 ЗлЛ DPBS во влагалище.
    1. Убедитесь, что наконечник micropipette вставляется через остиу под углом от 10 до 30 ", чтобы избежать прокола стенки влагалища. После вставки жидкость все еще должна быть видна в наконечнике. Если жидкость не видна, кончик был вставлен слишком далеко во влагалище, и парацервикаальной области влагалища, возможно, были перфорированы.
    2. Слегка потяните вниз на мышцы влагалища остюя с кончиком микропипетты, чтобы воздух, чтобы выйти из влагалища.
  2. Медленно промыть вагинальной полости, пипетка вверх и вниз 2-3 раза с 10 ЗЛ DPBS и поместите нарисованную подвеску клетки на стеклянную горку.
  3. Используйте перевернутый фазовый контрастный микроскоп для определения стадии эструсического цикла с помощью цитологического анализа. Процедура выполняется, как описано в другом месте10,11. Убедитесь, что суспензия клеток не высохнет до проведения цитологического анализа. При необходимости подвеска может быть разбавлена свежим DPBS.

4. Мышь репродуктивного тракта Ddissection

  1. Упорядочить мышь в положении на спине и распространение его конечностей, чтобы разоблачить абдоминопелевич области.
  2. Спрей с 70% этанола для увлажнения и дезинфекции области абдоминопеля.
  3. Используя щипцы, осторожно поднимите кожу, расположенную выше клитора. Сделайте небольшие поперечные разрезы на боковые аспекты нижней области живота, вплоть до верхних конечностей, чтобы разоблачить брюшной полости(рисунок 1А). Во время этого процесса образуется внешний лоскут. Как небольшие разрезы постоянно делаются, лоскут будет увеличиваться в размерах.
  4. Тщательно прорезать брюненее, чтобы разоблачить желудочно-кишечного тракта(Рисунок 1B). Важно отметить, что рога матки часто могут быть расположены непосредственно под перитонеум, так что делать разрезы осторожно и не прикасаться к рогам, как это может повлиять на подвижность матки.
  5. Используя щипц, удалите фасцию и жировую ткань, покрывающую желудочно-кишечный тракт. Удалите следующие сегменты желудочно-кишечного тракта из брюшной полости: двенадцатиперстную кише, джеджунум, илеум, секум, восходящую и поперечную толстую кишку(рисунок 1С).
  6. Чтобы найти репродуктивные органы, сначала определить мочевого пузыря(рисунок 1С, "4"), которые могут иметь спущенный вид из-за аннулирования после эвтаназии. Влагалище будет прямо под мочевым пузырем.
  7. Найдите лобковый симфиза при слиянии лобковых костей (каудально в мочевой пузырь).
  8. Используя ножницы, удалить лобковой симфиза, тщательно делая разрезы на боковых сторонах через межпубные фиброкартилагинной ткани, чтобы получить доступ к и обеспечить маршрут для извлечения влагалища (Рисунок 1D).
  9. Вырезать через промежности, расположенных между анусом и нижней части вульвы.
  10. Используя щипцы, поднимите влагалище и медленно акциз прямой кишки.
  11. Определите два рога матки, которые раздвоены в вилку, ростокаль новагин. Найдите запутанный яйц и яичник в конце каждого рога, которые могут быть скрыты под оставшимися сегментами желудочно-кишечного тракта. Используйте небольшие рассекающие ножницы для удаления любых связок, которые соединяются с рогами, яичницами и яичниками в брюшной полости.
  12. Удалить репродуктивного тракта, который включает в себя влагалище, матка, яйточки, и яичники, из брюшной полости.
  13. Перенесите изолированный репродуктивный тракт(рисунок 1E) в 100 мм чашку Петри, наполненную 10 мл DPBS. Не сжимайте рога матки, чтобы избежать повреждения миометрия.
  14. Используйте щипцы и хирургические ножницы, чтобы удалить любые соединительные и жировые ткани, окружающие рога матки и влагалище, а также любой мех в лобковой области, которые могут помешать качеству изображения. Удалить широкую связку, чтобы подвижность рогов матки.
  15. Вымойте изолированный репродуктивный тракт свежим DPBS два раза и перенесите его в 35-мм чашку Петри, наполненную 3 мл насыщенного кислородом раствора Кребса.

5. Тканевая визуализация

  1. Поместите чашку Петри, содержащую репродуктивный тракт, в кислородизированный буфер Кребса на черной поверхности. Поддерживайте блюдо при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать инфракрасную прокладку для поддержания ткани при 37 градусах Цельсия.
  2. Разрешить 15-30 мин для спонтанных сокращений, чтобы начать. Запись спонтанной мотылеки матки в течение 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видеооборудования.
  3. Перенесите препарат в чашку Петри, содержащую кислородированный буфер Кребса, дополненный испытательным соединением. Запись спонтанной мотылеки матки в течение примерно 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видео оборудования.
  4. Вымойте весь репродуктивный тракт в 100 мм Петри блюдо с 10 мл DPBS для оценки обратимости лечения.
  5. Перенесите препарат в чашку Петри со свеженасыщенным буфером Кребса. Запись спонтанной мотылеки матки в течение примерно 10 минут от осевой плоскости с использованием любого типа цифрового видео оборудования.
  6. Перенесите препарат в еще 35-мм чашку Петри, наполненную кислородом кребс-буфером, дополненный транспортным средством для испытательного соединения, чтобы не было механически индуцированных изменений в спонтанной подвижности матки. Это важный контроль.
  7. Перенесите видеоматериалы на жесткий диск компьютера.

6. Анализ данных

  1. Делайте клипы с использованием любого программного обеспечения для редактирования видео из оригинальных видеоматериалов, содержащих эпизоды управления, лечения и мытья.
  2. Используйте программное обеспечение MATLAB и предоставленный скрипт (см. онлайн Дополнительный материал) для количественной оценки спонтанной подвижности матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнение Computer Vision Toolbox для MATLAB должно быть установлено, чтобы сценарий был полностью функциональным.
    1. Откройте сценарий MATLAB, перейдите на вкладку редактора и нажмите Run.
    2. Выберите первый видеофайл и нажмите Open.
    3. Введите этикетку для видеофайла в всплывающем диалоговом окне и нажмите OK.
    4. Введите временной интервал (ы), необходимый для расчета скорости движения рога (евклидовское расстояние / кс).
    5. Используйте курсор мыши, чтобы выбрать две точки на первом кадре видео. Всплывающее окно попросит подтвердить, что выбранные точки должны использоваться для отслеживания. Нажмите "Начать", чтобы инициировать процесс отслеживания в реальном времени, который будет отображаться в всплывающем окне. Кроме того, нажмите Reselect Points, чтобы пересмотреть эти две точки.
    6. Следите за точностью процесса отслеживания на всплывающем окне.
    7. Обратите внимание на скорость по сравнению с графиком рассеяния времени и расстоянием против участка рассеяния времени в новом всплывающем окне. Сохранить эти две цифры, выбрав файл (ru) Сохранить как в том же окне для документирования данных.
    8. Найдите папку с названием PointTrackerData,автоматически созданную MATLAB, в том же каталоге, где находится сценарий MATLAB. Определите файл Excel под названием label-Data, содержащий точки данных, собранные из видео, в двух отдельных вкладок листа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое альтернативное программное обеспечение для отслеживания движения может быть использовано для количественной оценки спонтанной подвижности матки.
  3. Для выполнения статистического анализа используйте соответствующее программное обеспечение (например, Excel или SigmaPlot 13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показаны репрезентативные изображения, сделанные в течение всей процедуры изоляции репродуктивного тракта, которые описаны в этом протоколе. Чтобы избежать загрязнения буфера мехом, что уменьшит качество видео, мы увлажнили тело мыши 70% этанола. Основным ориентиром для вскрытия раздел протокола является поиск мочевого пузыря. Матка и влагалище будут расположены ниже мочевого пузыря.

Чтобы проверить протокол, мы обработали весь репродуктивный тракт эпинефрином. Эпинефрин, как известно, вызывают мышечной гладкой мышечной релаксации. Этот гормон эндогенно вырабатывается в надпочечнике медулла и служит гормоном стресса у млекопитающих. Мы использовали 1 мкм эпинефрина в наших экспериментах. Это насыщенная концентрация, как известно, вызывают максимальную реакцию12. Была проведена серия из четырех экспериментов. Во всех исследованиях, 1 ММ эпинефрин обратимо ингибируется спонтанно подвижности матки(рисунок 2).

Для количественной оценки спонтанной подвижности репродуктивного тракта мы разработали алгоритм, позволяющий оценить среднюю скорость изменения евклидов между двумя выбранными точками на репродуктивных трактах мыши. Точечные позиции отслеживаются с помощью модуля отслеживания движения программного обеспечения MATLAB. Соответствующий скрипт для MATLAB, который мы использовали для расчета евклидов, содержится в дополнительном материале онлайн. Положение точек имеет решающее значение для успешной процедуры отслеживания движения. Тщательное внимание следует принимать в отношении качества видео, потому что световые отражения от стены чашки Петри может отвлечь движение трекер, и это может остановить отслеживание движения рога при повторном назначении точки на один из света Отражения. Мы решили разместить один из точек в середине рога, чтобы гарантировать, что это было достаточно далеко от отражений стены чашки Петри. Второй момент, как правило, выбран на влагалище, поскольку он не проявляет спонтанной подвижности. На рисунке 3 приведена выборка анализа данных, а на дополнительной диаграмме 1 показаны репрезентативные изображения, полученные во время отслеживания движения.

Figure 1
Рисунок 1 : Шаги всей изоляции репродуктивного тракта. (A) Разрез в коже был сделан и абдоминопелевич области был выставлен выше перитонеума (1). (B) Серозная мембрана была медленно открыта, чтобы разоблачить желудочно-кишечного тракта (2). (C) желудочно-кишечного тракта был перемещен, чтобы разоблачить рога матки (3). Мочевой пузырь (4) может быть визуализирован вблизи соединения рога. (D) рога матки были освобождены и порезы были сделаны на боковых сторонах лобковой симфизии (5), чтобы разоблачить влагалище (6). (E) Удаление изолированного репродуктивного тракта и размещение в раствор DPBS. Любой избыток меха или соединительной ткани был удален. (F) Глубокий отступ можно увидеть на влагалище (справа) после удаления прямой кишки (слева, 7). (G) Окружающая соединительная ткань удаляется. Цифровая камера и программное обеспечение Application Suite (версия 3.7.0) использовались для получения изображений в реальном времени во время вскрытия (настройка камеры: оттенок 20/насыщенность 80). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Показано репрезентативное эксперимент со всем изолированным репродуктивным трактом. Изображения были приняты 15 с отделяется до (A), во время (B), и после (C) применение 1 мкм эпинефрина. Подготовка репродуктивного тракта продемонстрировала высокую подвижность в панелях А и С при отсутствии эпинефрина, но она покоилась в панели B с наличием 1 мкм эпинефрина. Неотредактированные видеоматериалы предоставляются как дополнительные видео 1-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Анализ данных в эксперименте ex vivo, описанном в Рисунок 2. (A) Показан временной курс скорости изменения расстояния Евклидов. Точки отсчета, между которыми было определено расстояние при спонтанной мотыльке матки, отображаются как зеленые точки в вшивке. Точки были выбраны в проксимальной части влагалища и среднего сегмента рога матки, как показано. Синие заполненные круги показывают значения спонтанной скорости подвижности перед добавлением эпинефрина, красные круги показывают спонтанные скорости подвижности в присутствии 1 м/м эпинефрина, а зеленые заполненные круги показывают спонтанные скорости подвижности после вымывания. (B) Сравнение средних евклидов скорость изменения расстояния (пиксели / с) до добавления эпинефрина (синий бар), в присутствии 1 мкм эпинефрина (красный бар), и после вымывания (зеленый бар). Программное обеспечение MATLAB использовалось для количественной оценки подвижности матки. Интервал t был установлен на уровне 5 s. «Расстояние» рассчитывается как разница между начальной дистанцией кадра и расстоянием кадра 5 s более поздно. Статистический анализ был выполнен с использованием Kruskal-Wallis One Way Анализ дисперсии на рангах следуют все парные процедуры множественного сравнения в соответствии с методом Данна с использованием SigmaPlot 13. Звездочка указывает на набор данных, который значительно отличался от других экспериментальных наборов данных (P q lt;0.001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplemental Movie 1
Дополнительный фильм 1: Замедленное видеоклип, показывающий спонтанную мотоутику матки, прежде чем добавить 1 мкм эпинефрина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Supplemental Movie 2
Дополнительный фильм 2: Покадровая видеоклип, показывающий спонтанную мотоутику матки, когда буфер Кребса был дополнен 1 эпинефрином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Supplemental Movie 3
Дополнительный фильм 3: Замедленное видеоклип, показывающий спонтанную мотоутику матки после вымывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Supplemental Figure 1
Дополнительная диаграмма 1: Представитель изображения, сделанные каждые 15 с во время отслеживания движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

The MATLAB-based tracking algorithm script
Дополнительный материал: сценарий алгоритма отслеживания на основе MATLAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описали метод оценки спонтанной контрактности всего репродуктивного тракта грызунов, который включает в себя яичники, яидуки, рога матки и влагалище. Мы использовали аналогичный метод, чтобы продемонстрировать релаксант эффект фенилэфрин на спонтанной мотыльки матки13, однако, в прошлом мы были не в состоянии обеспечить количественный анализ данных. В этой работе мы разработали алгоритм количественного анализа данных подвижности с помощью модуля отслеживания движения MATLAB. Это полезный метод для тестирования новых препаратов, которые регулируют сократителимать утробную способность независимо от того, расслабляют сядеки или сужают гладкие мышцы матки. Основным преимуществом этой модели является то, что репродуктивный тракт не поврежден, сохраняя все внутренние внутриутробные клеточные взаимодействия. Примечательно, что этот протокол не требует специального оборудования. Изоляция матки может быть сделано с помощью простого увеличительного стекла и нет никаких требований для любого сложного оборудования для видеозаписи. Если цифровая камера высокого разрешения недоступна для визуализации, в качестве альтернативы может использоваться персональная камера мобильного телефона.

Наиболее важным шагом протокола для оценки подвижности репродуктивного тракта является получение жизнеспособной ткани матки. Миометрий, в рогах матки, является motile элемент репродуктивного тракта. Поэтому во время изоляции важно избегать перенапряжения или сжатия рогов. Важно также обеспечить, чтобы ткани матки хорошо оксигенированы на протяжении всего эксперимента для поддержания подвижности матки. Лучший способ предотвратить любое повреждение рога матки, чтобы установить контакт только с прилегающими соединительной ткани при очистке матки или перемещение репродуктивного тракта. Так как влагалище не сокращается спонтанно во время эксперимента, допустимо сжимать его щипками при перемещении репродуктивного тракта из одной тарелки в другое. Все эксперименты репродуктивного тракта могут быть выполнены в сочетании с изометрическим натяжным натиском записей, которые оценивают преднагрузку и/или окситоцин-индуцированной маточной контрактности. Тем не менее, проволочный миограф является дорогостоящим оборудованием, которое не всегда доступно в общей лабораторной среде.

Описанный метод имеет несколько ограничений. Так как миометрий очень чувствителен к сжатию или тянет, это усложняет процесс вскрытия репродуктивного тракта. Если рога повреждены во время вскрытия, не спонтанное соотношения не будет наблюдаться. Это является одним из основных ограничений протокола, поскольку неясно, являются ли сократительные гладкие мышечные клетки были неосознанно повреждены, несмотря на использование надлежащего ухода и осторожности, или же они не хватало подвижности из-за естественной причины. Действительно, мы не наблюдали подвижности в 10-20% препаратов репродуктивного тракта в этом исследовании. Важно, чтобы вагинальный сегмент репродуктивного тракта оставался нетронутым, потому что удаление влагалища заметно снижает спонтанную подвижность рогов матки. В отличие от этого, отсутствие яичников и /или яйчий не ухудшает всю подвижность репродуктивного тракта. Кроме того, следует отметить, что некоторые соединения чувствительны к окислению. Например, эпинефрин можно легко окислять. Проверка воздействия таких соединений потребует более короткого времени инкубации, предотвращающего чрезмерное окисление. Однако более короткое время инкубации может помешать способности препарата эффективно проникать в толщу стенки матки. Дальнейшее ограничение метода включает оценку трехмерных движений рогов. Рога имеют врожденный характер керлинга в трехмерную плоскость, усложняя анализ. Чтобы преодолеть эту проблему, можно уменьшить объем буфера Krebs в чашке Петри до 2 мл.

Мы обнаружили, что оптимальный возрастной диапазон для самок мышей составляет 2-5 месяцев. Мы указали, что анестезия с изофлуран может привести к снижению подвижности и дополнительные стираны могут быть необходимы для предотвращения этого изофлуран индуцированного осложнения. Кроме того, можно использовать углекислый газ для эвтаназии мышей. Если трудности возникают во время вскрытия, сосредоточиться на ориентиры, такие как мочевой пузырь, может помочь. Для количественной оценки полученных данных о подвижности мы использовали программное обеспечение MATLAB. Основная проблема с отслеживанием движения в MATLAB было то, что трекер был не в состоянии должным образом найти рога, когда они переехали возле стены чашки Петри. Adobe Premier Element был использован для обрезки видеоматериалов и уменьшения размера видеофайлов. Хотя это выдающийся пакет программного обеспечения, он не всегда может быть доступен в типичной обстановке лаборатории. Альтернативным вариантом может быть использование свободного модуля отслеживания движения программного обеспечения ImageJ или даже простой ручной оценки изображений, сделанных с одинаковыми интервалами и сравнения положения рогов матки на сетке сегментации. На рисунке 2 показан пример простой оценки спонтанной подвижности матки и содержится сравнение движений репродуктивного тракта в течение 15-си.

До сих пор не сообщалось о простом методе оценки подвижности матки в постановке блюда Петри. Ультразвуковые и внутриматочные датчики давления могут быть использованы для мониторинга сложности матки человека14. Тем не менее, трудно изучить основные механизмы в нетронутой человеческой матки. Таким образом, использование животных моделей для исследования спонтанной сложности матки имеет важное значение. В женском репродуктивном тракте проявляются спонтанные сокращения миометрия, которые имеют решающее значение для благополучия женщины, включая ее фертильность и труд15. Эти сокращения могут быть визуализированы как эндометрия волны во время ультразвукового исследования. Однако, во время менструации, над contractility uterus может создать дискомфорт и привести к дисменорея, или менструальные спазмы. Чтобы облегчить некоторые симптомы дисменореии, новые препараты, направленные на расслабление гладких мышц матки необходимы. Наш простой метод предоставляет способ оценки влияния различных соединений на сахарность матки.

В этом исследовании, мы использовали нашу легкую модель блюда Петри, чтобы подтвердить эффективность эпинефрина, релаксанта матки гормон12, чтобы предотвратить спонтанную моточность матки изолированных репродуктивных путей мыши. Наш метод также может быть использован для тестирования таких соединений, которые могут увеличить состоимость матки. Важно отметить, что этот метод может иметь потенциал для обновления для пропускной связи скрининга наркотиков с использованием шести-колодского формата пластины. Таким образом, метод, который мы представляем здесь, может иметь возможность быть оптимизированным для процедур скрининга промышленных масштабов. Мы не пытались проводить подобные эксперименты на крупных грызунах, но ожидаем, что аналогичная спонтанная подвижность будет присутствовать в изолированных крысиных умных. Более крупный репродуктивный тракт крыс может проявлять более выраженную моточность матки. Мы обнаружили, что беременные мыши uteri также может быть оценена с помощью этого ex vivo маточных мотыльки Петри блюдо модели. Как и ожидалось, спонтанная подвижность беременной матки была уменьшена, потому что она находится в состоянии покоя. Однако, увеличение веса, добавленного ткани плода может также способствовать обструкции подвижности. Это все еще может быть полезно для дальнейшего изучения пригодности всей этой модели репродуктивного тракта для оценки эффекта токолитик (релаксант) или утеротонных (стимулятор) соединений в контексте беременности и родов. Таким образом, здесь мы представили легкую модель ex vivo для оценки спонтанной подвижности нетронутого репродуктивного тракта. Этот подход может быть принят для скрининга наркотиков и быть использован для новых открытий наркотиков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана внутренними фондами МЕ. AGO задумал исследование. XC и AGO были вовлечены в разработку описанных экспериментов.  FL и AGO проанализировали и интерпретировали данные. KLL, JOB, FL выполнили все эксперименты ex vivo. FL написал сценарий MATLAB. Рукопись написали KLL, JOB и AGO.  Все авторы прочитали и утвердили окончательный вариант рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epinephrine hydrochloride Sigma-Aldrich  E4642 
Dulbecco's PBS Fisher Sceintific  17-512Q
Ethanol 200 PROOF Decon Laboratories 2701
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glucose Sigma-Aldrich G7528
KCl Sigma-Aldrich P9333
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C5080
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
MgCl2  · 6H2O Sigma-Aldrich M9272
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Isoflurane, USP Patterson Veterinary 07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps Fisher Sceintific 13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope Leica MZ6 
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system Leica  DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources Fisher Sceintific  12-562-21
Weigh Boat Fisher Sceintific  WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown  Cardinal Health  9515 Small, Medium or Large
Gloves McKesson Corporation 20-1080 Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
 Petri Dish Corning Falcon 351029 100 mm
 Petri Dish Corning Falcon 353001 35 mm
95% O2- 5% CO2 gas mixture Praxair  MM OXCD5-K
Ear-loop Masks Valumax International 5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera Canon EOS Rebel T6i
MATLAB MathWorks N/A version 2019 or later

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
  2. Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
  3. Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
  4. Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
  5. Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
  6. Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
  7. Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
  8. Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
  9. Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
  10. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
  11. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
  12. Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
  13. Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
  14. Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
  15. Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).

Tags

Биология Выпуск 151 матка спонтанная мотоучесть матки эпинефрин репродуктивный тракт мыши модель ex vivo
Метод Ex Vivo для оценки спонтанной подвижности репродуктивных путей мыши и алгоритмотслеживания движения uterus на основе MATLAB для анализа данных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, K. L., Bursova, J. O., Lam,More

Liang, K. L., Bursova, J. O., Lam, F., Chen, X., Obukhov, A. G. Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis. J. Vis. Exp. (151), e59848, doi:10.3791/59848 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter