Summary
تقلصات الرحم مهمة لرفاه الإناث. ومع ذلك، قد تؤدي زيادة الانقباض المرضية إلى عسر الطمث، وخاصة في الإناث الأصغر سنا. هنا، ونحن نصف إعداد خارج الجسم الحي بسيطة تسمح بتقييم سريع لفعالية مرخيات العضلات الملساء التي يمكن استخدامها لعلاج عسر الطمث.
Abstract
عسر الطمث، أو التشنج المؤلم، هو الأعراض الأكثر شيوعا المرتبطة الحيض في الإناث وشدته يمكن أن تعوق الحياة اليومية للمرأة. هنا، نقدم طريقة سهلة وغير مكلفة من شأنها أن تكون مفيدة لاختبار أدوية جديدة تقلل من انقباض الرحم. تستخدم هذه الطريقة القدرة الفريدة للجهاز التناسلي للماوس بأكمله لإظهار الحركة العفوية عند الحفاظ على الجسم الحي السابق في طبق بيتري الذي يحتوي على عازل كريبس المؤكس. تشبه هذه الحركة العفوية النشاط العضلي الشبيه بالموجات في الرحم البشري، الذي يشار إليه باسم موجات بطانة الرحم. لإثبات فعالية هذه الطريقة، وظفنا دواء مهدئ للرحم معروف، ادرينالين. نحن نثبت أن الحركة العفوية للجهاز التناسلي الماوس بأكمله يمكن أن تمنع بسرعة وعكسها من قبل 1 μM ادرينالين في هذا النموذج طبق بيتري. توثيق التغيرات في حركية الرحم يمكن أن يتم بسهولة باستخدام الهاتف الذكي العادي أو كاميرا رقمية متطورة. قمنا بتطوير خوارزمية تعتمد على MATLAB تسمح لتتبع الحركة بتحديد كمية التغيرات التلقائية في حركية الرحم من خلال قياس معدل حركات قرن الرحم. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج خارج الجسم الحي في أن الجهاز التناسلي لا يزال سليما طوال التجربة بأكملها، مع الحفاظ على جميع التفاعلات الخلوية داخل الرحم. الحد الرئيسي من هذا النهج هو أن ما يصل إلى 10-20٪ من الرحم قد تظهر أي حركية عفوية. حتى الآن، وهذا هو أول طريقة كمية من الجسم الحي لتقييم حركية الرحم العفوية في نموذج طبق بيتري.
Introduction
كعضو أنثوي رئيسي، الرحم أمر بالغ الأهمية للتكاثروضروري لتغذية الجنين 1. يتكون الرحم من ثلاث طبقات: البيريميتيوم، وعضلة القلب، وبطانة الرحم. وmyometrium هو الطبقة العقدية الرئيسية من الرحم ويلعب دورا رئيسيا في ولادة الجنين. بطانة الرحم هي الطبقة الأعمق بطانة تجويف الرحم وهو ضروري لزرع الجنين. في الإناث غير الحوامل في سن الإنجاب ، يتم إلقاء طبقة بطانة الرحم شهريا في بداية الدورة الشهرية. يساعد myometrium في هذه العملية ذرف من خلال الحفاظ على تقلصات عضلة القلب العفوية اللازمة لإزالة أنسجة بطانة الرحم نخرية من الرحم1.
لسوء الحظ, زيادة الانقباض عضلة العين يمكن أن يؤدي إلى آثار جانبية سلبية مثل عسر الطمث, أو تشنجات الحيض المؤلمة. وينظر هذا خاصة في الإناث الشابات والنساء nulliparous2. ومع ذلك، عسر الطمث يختلف عن كل امرأة ويعتمد على قوة تقلصات عضلة اللوم. وغالبا ما ترتبط تقلصات أقوى مع الإحساس بالتشنج الشديد3. يمكن تصور الانقباض عضلة الرحم باستخدام الموجات فوق الصوتية الرحم وغالبا ما يتم التعرف على موجات بطانة الرحم. ويعتقد أن تعزيز الإفراج عن البروستاجلاندين أثناء الحيض4 في الرحم الذي يخضع للجرف بطانة الرحم يساهم في زيادة فرط الإنتعقدا العضلي، مما أدى إلى نقص تروية الدم ونقص الأكسجة في عضلة الرحم، وبالتالي زيادة ألم3.
يمكن أن يعوق عسر الطمث الشديد النشاط اليومي لبعض النساء و 3 إلى 33٪ من النساء لديهم ألم شديد جدا، مما يمكن أن يسبب للمرأة أن تكون طريح الفراش لمدة 1 إلى 3 أيام كل دورة الحيض5. عسر الطمث هو السبب الرئيسي للاعتلال النسائي لدى النساء في سن الإنجاب بغض النظر عن العمر والجنسية والوضع الاقتصادي5. والانتشار التقديري لعسر الطمث مرتفع ومتغير على حد سواء، يتراوح بين 45 في المائة و 93 في المائة للمرأة في سنالإنجاب 5سنوات. الألم المرتبط بعسر الطمث له تأثير على الحياة اليومية للمرأة وقد يؤدي إلى ضعف الأداء الأكاديمي في المراهقين، وانخفاض نوعية النوم، وتقييد الأنشطة اليومية، والتغيرات المزاجية5.
يلجأ العديد من النساء اللواتي يعانين من عسر الطمث الحاد إلى الأدوية التي تُصرف دون وصفة طبية لتخفيف آلامهن. هذه الأدوية دون وصفه طبية تحتوي على مثبطات سيكلوأوكسجينيز (كوكس) التي تمنع تشكيل البروستاجلاندين6. ومع ذلك، ترتبط مثبطات كوكس مع أحداث القلب والأوعية الدموية السلبية، وحوالي 18٪ من النساء مع عسر الطمث لا تستجيب لهذه المثبطات7. لذلك، هناك حاجة إلى أدوية جديدة للحد من تشنجات الحيض. منذ أكثر من انقباض الرحم يساهم في مسببات الأمراض من عسر الطمث، قد تكون إحدى الاستراتيجيات الممكنة استخدام مرخيات الرحم.
من المفيد تحديد آثار الأدوية المهدئة المحتملة في نموذج من الانقباضات التلقائية الشبيهة بالموجات العضلة العضلة العضلة الانفسية. ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم وصف أي طريقة فعالة من الجسم الحي السابق لاختبار الأدوية استرخاء العضلات في الرحم سليمة. حاليا، يتم استخدام قياسات التوتر متساوي القياس لتقييم آثار المخدرات الاسترخاء. خلال هذه القياسات ، يتم الحفاظ على شريط عضلة الرحم على طول ثابت تحت الحمل المسبق في حمام الأنسجة في حين يتم تسجيل قوة تقلصات عضلة الرحم قبل وبعد تحفيز الأوكسيتوسين في وجود أو عدم وجود دواء مهدئ. وعلى الرغم من أن هذا النهج مفيد جدا، فإنه يتطلب معدات باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، فإن تقلصات متساوي القياس لا تشبه الانقباضات التلقائية الشبيهة بالموجة التي تحدث بشكل طبيعي في الرحم السليم. بشكل فريد، يمكن تصور موجات مُموّلالرحم في القوارض على أنها حركية قرن الرحم عندما يتم الحفاظ على الجهاز التناسلي بأكمله (المبيضين، أوفيدوك، الرحم، والمهبل) في محلول عازل. هنا، نقدم طريقة الجسم الحي السابق لرصد الحركة العفوية من رحم الماوس سليمة وضعت في طبق بيتري يحتوي على العازلة كريبس المؤكّض. كما نقوم بوصف خوارزمية تحديد كمية الحركة باستخدام متتبع الحركة MATLAB. هذا النهج الجديد يوفر بديلا ً سهلاً وأقل تكلفة لاختبار الإمكانات المهدئة للعلاجات الطبيعية والمركبات الاصطناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب بجامعة إنديانا (إنديانابوليس، إن). تم استخدام الفئران الإناث الناضجة جنسيا ً F2-129S-C57BL/6 البالغة من العمر 2-5 أشهر في الدراسة.
تحذير: ضمان السلامة من خلال ارتداء معطف المختبر، قناع، والقفازات عند العمل مع الحيوانات والمواد الخطرة بيولوجيا.
1. إعداد الحلول
- إعداد العازلة كريبس، الذي يحتوي على: 130 مل كل أكسجين باستمرار العازلة كريبس مع خليط من الغازات المضغوطة التي تحتوي على 5٪ CO2 و 95٪ O2 مع الحفاظ على درجة حرارة العازلة في 37 درجة مئوية باستخدام حمام المياه المتداولة.
- إعداد دولبيكو الفوسفات المخزنة المالحة (DPBS)، والذي يحتوي على: 2.68 مليون متر ككل، 1.47 م ك2بو4،136.89 م نام، و 8.1 مليون متر Na2HPO4،درجة الحموضة 7.4.
2. إعداد الحيوانات
- تخدير الفئران باستخدام استنشاق الإيسوفيلوران (3٪) مع مسح النفايات الغاز. ضمان التخدير الكافي من خلال تقييم ردود الفعل الانسحاب. قرصة اصبع القدم الخلفي لتأكيد عدم وجود حركات يتم الحصول عليها، مما يدل على فقدان الردود المنعكسة. بعد تحقيق التخدير العميق ، قتل الحيوان بقطع الرأس.
ملاحظة: قد يسبب الإيسوفلوران توسع العضلات الملساء. لذلك، ينبغي غسل إعداد الجهاز التناسلي على نطاق واسع واحتضانه في العازلة كريبس لمدة 15-30 دقيقة على الأقل قبل البدء في تجارب الجسم الحي السابق. Isoflurane قد يسبب تهيج وعدم الراحة عندما يكون على اتصال مع الجلد، لذلك المضي قدما بحذر. - ضع الجسم على قارب وزن كبير مبطن بمنشفة ورقية.
ملاحظة: يجب أن لا تشارك موظفات المختبرات الحوامل في التجارب مع isoflurane لأنه يمكن أن يقلل من وزن الجنين، وانخفاض تحجر الهيكل العظمي الجنيني، وزيادة خطر الإجهاض التلقائي8،9. يمكن استخداماستنشاق ثاني أكسيد الكربون كبديل لقتل الفئران.
3. تحديد مرحلة دورة استروس
- مع ملقط صغيرة، ورفع البظر للوصول إلى ostium المهبلية وببطء إدراج طرف micropipette التي تحتوي على 10 ميكرولتر من DPBS في المهبل.
- تأكد من إدخال طرف micropipette من خلال ostium بزاوية من 10 - 30 درجة لتجنب ثقب جدار المهبل. يجب أن يظل السائل مرئيًا في الطرف بعد الإدراج. إذا كان السائل غير مرئي، تم إدخال الطرف بعيدا جدا في المهبل، ومنطقة الفقرة عنق الرحم من المهبل قد تكون مثقبة.
- سحب طفيفة إلى أسفل على عضلات ostium المهبل مع غيض من micropipette للسماح للهواء للخروج من المهبل.
- ببطء دافق تجويف المهبل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 2-3 مرات مع 10 درجة مئوية من DPBS ووضع تعليق الخلية تعادل على شريحة زجاجية.
- استخدم مجهر تباين المرحلة المقلوب لتحديد مرحلة الدورة الأسرع من خلال التحليل السيتولوجي. يتم الإجراء كما هو موضح في مكان آخر10،11. تأكد من عدم جفاف تعليق الخلية قبل إجراء التحليل الخلوي. ويمكن تخفيف التعليق مع DPBS جديدة، إذا لزم الأمر.
4. الفأر ة الجهاز التناسلي قسم
- ترتيب الماوس في موقف supine ونشر أطرافه لفضح منطقة abdominopelvic.
- رش مع الإيثانول 70٪ لترطيب وتطهير منطقة أبدومينوالحوض.
- باستخدام ملقط، رفع بعناية الجلد تقع متفوقة على البظر. إجراء شقوق عرضية صغيرة على الجوانب الجانبية لمنطقة البطن السفلى، حتى الأطراف العليا لفضح العبية (الشكل1A). خلال هذه العملية، سوف تشكل رفرف خارجي. كما يتم إجراء شقوق صغيرة باستمرار، وسوف تزيد رفرف في الحجم.
- قطع بعناية من خلال اقصاطيء لفضح الجهاز الهضمي (الشكل1B). من المهم أن نلاحظ أن قرون الرحم يمكن في كثير من الأحيان أن تقع مباشرة تحت الشبي، لذلك جعل الشقوق بحذر ولا تلمس القرون لأن هذا يمكن أن تؤثر على حركية الرحم.
- باستخدام الملقط، قم بإزالة اللفافة والأنسجة الدهنية التي تغطي الجهاز الهضمي. إزالة أجزاء الجهاز الهضمي التالية من تجويف البطن: الاثني عشر، جيجونوم، اللفائفي، cecum، القولون الصاعد والعرضي (الشكل1ج).
- لتحديد موقع الأعضاء التناسلية ، أولا تحديد المثانة البولية (الشكل1C، "4")، والتي قد يكون لها مظهر منتفخ بسبب الباطل بعد القتل الرحيم. سيكون المهبل تحت المثانة البولية.
- حدد موقع التناظر العانة عند التقاء عظام العانة (إلى المثانة).
- باستخدام مقص، وإزالة symphysis العانة عن طريق إجراء شقوق بعناية على الجانبين الجانبي من خلال الأنسجة الليفية بين العانة للوصول إلى وتوفير طريق لاستخراج المهبل (الشكل1D).
- قطع من خلال اجانال يقع بين فتحة الشرج والجزء السفلي من الفرج.
- باستخدام ملقط، ورفع المهبل واستئصال ببطء المستقيم.
- تحديد اثنين من قرون الرحم التي تتقرن في شوكة، rostrally إلى المهبل. حدد موقع قناة أوفيدوكت والمبيض الملتوية في نهاية كل قرن، والتي قد تكون مخفية تحت أجزاء الجهاز الهضمي المتبقية. استخدام مقص تشريح صغيرة لإزالة أي الأربطة التي تتصل ودعم القرون، oviducts، والمبايض داخل تجويف البطن.
- إزالة الجهاز التناسلي، والذي يتضمن المهبل والرحم والقنوات الأوفيكتية والمبايض، من تجويف البطن.
- نقل الجهاز التناسلي المعزول (الشكل1E)إلى طبق بيتري 100 ملم مليئة 10 مل من DPBS. لا تضغط على قرون الرحم لتجنب الإضرار بعضلة القلب.
- استخدام ملقط ومقص الجراحية لإزالة أي الأنسجة الضامة والدهنية المحيطة قرون الرحم والمهبل، فضلا عن أي الفراء في منطقة العانة التي يمكن أن تعوق جودة الصورة. إزالة الرباط العريض للسماح بحركية قرون الرحم.
- غسل الجهاز التناسلي المعزول مع DPBS الطازجة مرتين وتحويله إلى طبق بيتري 35 ملم مليئة 3 مل من محلول كريبس المؤكسد.
5. تصوير الأنسجة
- ضع طبق بيتري الذي يحتوي على الجهاز التناسلي في حاجز كريبس المؤكس على سطح أسود. الحفاظ على الطبق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: من الممكن استخدام وسادة الاحترار بالأشعة تحت الحمراء للحفاظ على الأنسجة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. - السماح 15-30 دقيقة للتقلصات العفوية للبدء. تسجيل حركة الرحم العفوية لمدة 10 دقائق من طائرة محورية باستخدام أي نوع من معدات الفيديو الرقمية.
- نقل التحضير إلى طبق بيتري يحتوي على العازلة كريبس المؤكّضة مع مركب اختبار. تسجيل حركة الرحم العفوية لحوالي 10 دقائق من طائرة محورية باستخدام أي نوع من معدات الفيديو الرقمية.
- اغسل الجهاز التناسلي بأكمله في طبق بيتري 100 مم مع 10 مل من DPBS لتقييم قابلية عكس مسار العلاج.
- نقل التحضير إلى طبق بيتري مع العازلة كريبس المؤكّد حديثا. تسجيل حركة الرحم العفوية لحوالي 10 دقائق من طائرة محورية باستخدام أي نوع من معدات الفيديو الرقمية.
- نقل التحضير إلى آخر 35 ملم طبق بيتري مليئة العازلة كريبس المؤكسدة تستكمل مع السيارة لمجمع الاختبار لضمان عدم وجود تغييرات المستحثة ميكانيكيا في حركية الرحم العفوية. هذا هو عنصر تحكم مهم.
- نقل لقطات الفيديو إلى قرص صلب للكمبيوتر.
6- تحليل البيانات
- قم بإجراء مقاطع باستخدام أي برنامج لتحرير الفيديو من لقطات الفيديو الأصلية التي تحتوي على حلقات التحكم والعلاج والغسيل.
- استخدم برنامج MATLAB والنص المقدم (انظر المواد التكميلية على الإنترنت) لتحديد حركة الرحم العفوية.
ملاحظة: يجب تثبيت الوظيفة الإضافية "أدوات رؤية الكمبيوتر" لـ MATLAB لكي يعمل البرنامج النصي بشكل كامل.- افتح البرنامج النصي MATLAB، انتقل إلى علامة التبويب محرر، وانقر فوق تشغيل.
- حدد ملف الفيديو الأول وانقر فوق فتح.
- أدخل تسمية لملف الفيديو في مربع الحوار المنبثق وانقر فوق موافق.
- أدخل الفاصل الزمني (ق) اللازمة لحساب معدل حركة القرن (Δ مسافة إقليدس / Δs).
- استخدم مؤشر الماوس لتحديد نقطتين في الإطار الأول من الفيديو. ستطلب النافذة المنبثقة تأكيد استخدام النقاط المحددة للتتبع. انقر فوق ابدأ لبدء عملية التتبع في الوقت الحقيقي التي سيتم عرضها في النافذة المنبثقة. بدلاً من ذلك، انقر فوق إعادة تحديد نقاط لإعادة تحديد النقطتين.
- مراقبة دقة عملية التتبع على النافذة المنبثقة.
- لاحظ رسم ًا مبعثرًا للوقت مقابل رسم ًا مبعثرًا للوقت مقابل رسم ًا مبعثرًا للوقت في إطار منبثق جديد. حفظ الرقمين عن طريق تحديد ملف | حفظ باسم في نفس الإطار لتوثيق البيانات.
- ابحث عن مجلد باسم PointTrackerData، تم إنشاؤه تلقائيًا بواسطة MATLAB، في نفس الدليل حيث يوجد البرنامج النصي MATLAB. تعريف ملف Excel باسم label_Data يحتوي على نقاط بيانات تم تجميعها من الفيديو في علامتي تبويب ورقة عمل منفصلتين.
ملاحظة: يمكن استخدام أي برنامج تتبع الحركة البديلة لتحديد حركة الرحم العفوية.
- استخدم برنامجًا مناسبًا (على سبيل المثال، Excel أو SigmaPlot 13) لإجراء التحليل الإحصائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الصور التمثيلية التي التقطت أثناء إجراء عزل المسالك التناسلية بأكمله الوارد وصفه في هذا البروتوكول. لتجنب تلويث العازلة مع الفراء، والتي من شأنها أن تقلل من جودة الفيديو، ونحن بلل الجسم الماوس مع الإيثانول 70٪. المعيار الرئيسي لقسم تشريح البروتوكول هو العثور على المثانة البولية. سيتم تحديد موقع الرحم والمهبل دون مستوى المثانة البولية.
لاختبار البروتوكول، عالجنا الجهاز التناسلي بأكمله بالادرينالين. ادرينالين هو معروف جيدا أن يسبب استرخاء العضلات الملساء الرحم. يتم إنتاج هذا الهرمون داخليا في النخاع الكظري ويعمل كهرمون الإجهاد في الثدييات. استخدمنا 1 ميكرومتر ادرينالين في تجاربنا. هذا هو تركيز المشبعة المعروف أن يسبب استجابة قصوى12. وأجريت سلسلة من أربع تجارب. في جميع التجارب، 1 μM ادرينالين تثبيط عكسي تلقائياحركية الرحم (الشكل 2).
ولتحديد الحركة العفوية للجهاز التناسلي، قمنا بتصميم خوارزمية تسمح لنا بتقييم متوسط معدل التغير في المسافة الإقليدية بين نقطتين مختارتين على الجهاز التناسلي للماوس. يتم تعقب مواضع النقاط باستخدام وحدة تتبع الحركة من برنامج MATLAB. يتم توفير النص المقابل لMATLAB، الذي استخدمناه لحساب المسافات الإقليدية، في المواد التكميلية على الإنترنت. موقف النقاط أمر بالغ الأهمية لإجراء تتبع الحركة الناجحة. وينبغي النظر بعناية فيما يتعلق بنوعية أشرطة الفيديو لأن انعكاسات الضوء من جدار طبق بيتري قد يصرف تعقب الحركة، وأنها قد تتوقف عن تتبع حركة القرن في حين إعادة تعيين نقطة إلى واحد من الضوء انعكاسات. اخترنا وضع واحدة من النقاط في منتصف القرن للتأكد من أنه كان بعيدا بما فيه الكفاية من تأملات جدار طبق بيتري. وعادة ما يتم اختيار النقطة الثانية على المهبل لأنها لم تظهر الحركة العفوية. ويقدم الشكل 3 عينة من تحليل البيانات، ويبين الشكل التكميلي 1 الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها أثناء تتبع الحركة.
الشكل 1 خطوات عزل كامل للجهاز التناسلي. (أ) تم إجراء شق في الجلد وتعرضت منطقة أبدومينوحوض فوق الشبي (1). (ب) تم فتح الغشاء المصلي ببطء لفضح الجهاز الهضمي (2). (ج) تم نقل الجهاز الهضمي لفضح قرون الرحم (3). يمكن تصور المثانة البولية (4) بالقرب من اقتران القرون. (د) تم تحرير قرون الرحم وتخفيضات على الجانبين الجانبي من symphysis العانة (5) لفضح المهبل (6). (هـ)إزالة الجهاز التناسلي المعزول ووضعه في محلول DPBS. تمت إزالة أي فرو زائد أو النسيج الضام. (F) يمكن رؤية المسافة البادئة العميقة على المهبل (يمين) بعد إزالة المستقيم (يسار، 7). (G) تتم إزالة النسيج الضام المحيطة بها. تم استخدام كاميرا رقمية وبرنامج تطبيق جناح (الإصدار 3.7.0) للحصول على الصور في الوقت الحقيقي أثناء تشريح (إعداد الكاميرا: هوى 20/التشبع 80). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 يتم عرض تجربة تمثيلية مع كامل الجهاز التناسلي المعزول. وقد اتخذت الصور 15 قبصرف النظر قبل (أ)، خلال (ب)، وبعد (C) تطبيق 1 μM ادرينالين. أظهر إعداد الجهاز التناسلي حركية عالية في اللوحتين A و C في غياب الادرينالين، ولكنه هادئ في اللوحة B مع وجود 1 ميكرومتر ادرينالين. يتم توفير لقطات الفيديو غير المحررة كأشرطة الفيديو التكميلية 1-3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تحليل البيانات في تجربة الجسم الحي السابق الموصوفة في: الشكل 2 (أ) يتم عرض مسار زمني لمعدل تغيير المسافة الإقليدية. وتظهر النقاط المرجعية التي تم تحديد المسافة بينها أثناء حركية الرحم العفوية كنقاط خضراء في الدخول. تم اختيار النقاط في الجزء القريب من المهبل والجزء الأوسط من قرن الرحم كما هو موضح. تظهر الدوائر الزرقاء المملوءة قيم معدل الحركة العفوية قبل إضافة الادرينالين، وتظهر الدوائر الحمراء معدلات الحركة العفوية في وجود 1 ميكرومتر ادرينالين، وتظهر الدوائر الخضراء المليئة معدلات الحركة العفوية بعد الغسل. (ب) مقارنة بين متوسط معدلات تغيير المسافة الإقليدية (بكسل / ثانية) قبل إضافة ادرينالين (شريط أزرق)، في وجود 1 ميكرومتر ادرينالين (شريط أحمر)، وبعد غسل (شريط أخضر). تم استخدام برنامج MATLAB لتحديد حركة الرحم. تم تعيين الفاصل الزمني Δt في 5 s. يتم حساب "ΔDistance" كالفرق بين مسافة الإطار الأولي ومسافة الإطار 5 s لاحقاً. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام Kruskal-Wallis تحليل طريقة واحدة من التباين في الرتب تليها جميع إجراءات المقارنة متعددة ثنائية وفقا لطريقة دان باستخدام SigmaPlot 13. تشير العلامة النجمية إلى مجموعة البيانات التي كانت مختلفة بشكل ملحوظ عن مجموعات البيانات التجريبية الأخرى (P = <0.001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم تكميلي 1: مقطع فيديو بفاصل زمني يظهر حركية الرحم العفوية قبل إضافة 1 ميكرومتر ادرينالين. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيلم إضافي 2: مقطع فيديو الفاصل الزمني يظهر حركية الرحم العفوية عندما تم استكمال العازلة كريبس مع 1 μM ادرينالين. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيلم تكميلي 3: مقطع فيديو بفاصل زمني يظهر حركية الرحم العفوية بعد الغسل. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الشكل التكميلي1: الصور التمثيلية التي يتم التقاطها كل 15 ق أثناء تتبع الحركة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المواد التكميلية: البرنامج النصي خوارزمية تتبع المستندة إلى MATLAB. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، وصفنا طريقة لتقييم الانقباض التلقائي لكامل الجهاز التناسلي القوارض، والتي تشمل المبيضين، أوفيدوك، قرون الرحم، والمهبل. استخدمنا طريقة مماثلة لإثبات تأثير مريح من فينيل إيفرين على حركية الرحم العفوية13، ومع ذلك ، في الماضي لم نتمكن من تقديم تحليل كمي للبيانات. في هذا العمل، قمنا بتطوير خوارزمية لتحليل بيانات الحركة الكمية باستخدام وحدة تتبع الحركة MATLAB. هذا هو تقنية مفيدة لاختبار الأدوية الجديدة التي تنظم انقباض الرحم بغض النظر عما إذا كانت الأدوية الاسترخاء أو تضيق عضلات الرحم الملساء. ميزة رئيسية من هذا النموذج هو أن الجهاز التناسلي سليمة، والحفاظ على جميع التفاعلات الخلوية داخل الرحم الجوهرية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول لا يتطلب أي معدات خاصة. يمكن أن يتم عزل الرحم مع عدسة مكبرة بسيطة وليس هناك حاجة لأي معدات تسجيل الفيديو المتطورة. إذا لم تكن الكاميرا الرقمية عالية الدقة متوفرة للتصوير، فقد يتم استخدام كاميرا هاتف محمول شخصية كبديل.
الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول لتقييم حركية الجهاز التناسلي هي الحصول على أنسجة الرحم القابلة للحياة. وmyometrium، داخل قرون الرحم، هو العنصر motile من الجهاز التناسلي. لذلك، أثناء العزلة من المهم تجنب الإفراط في الضغط أو ضغط القرون. من المهم أيضًا التأكد من أن أنسجة الرحم مُسنتفخة بشكل جيد طوال التجربة للحفاظ على حركية الرحم. أفضل طريقة لمنع أي ضرر لقرون الرحم هو إجراء اتصال مع الأنسجة الضامة المجاورة فقط أثناء تنظيف الرحم أو تحريك الجهاز التناسلي. وبما أن المهبل لا يتقلص تلقائيا ً أثناء التجربة ، فمن المقبول ضغطه مع الملقط عند نقل الجهاز التناسلي من طبق إلى آخر. ويمكن إجراء تجارب المسالك التناسلية بأكملها بالاقتران مع تسجيلات التوتر متساوي القياس التي تقيّم انقباض الرحم المستحث بالحمولة المسبقة و/أو الأوكسيتوسين. ومع ذلك، myograph الأسلاك هو قطعة مكلفة من المعدات التي لا تتوفر دائما في بيئة مختبر ية مشتركة.
الأسلوب الموضح له عدة قيود. منذ myometrium حساسة جدا لضغط أو تسحب، وهذا يعقد عملية تشريح الجهاز التناسلي. إذا تضررت القرون أثناء تشريح، لن يلاحظ أي انقباض عفوي. هذا هو قيد كبير على البروتوكول لأنه من غير المؤكد ما إذا كانت خلايا العضلات الملساء العقدية تضررت عن غير علم على الرغم من استخدام الرعاية المناسبة والحذر أو ما إذا كانت تفتقر إلى الحركة بسبب سبب طبيعي. في الواقع، لاحظنا أي حركية في 10-20٪ من الاستعدادات الجهاز التناسلي في هذه الدراسة. من المهم التأكد من أن الجزء المهبلي من الجهاز التناسلي لا يزال سليما لأن إزالة المهبل يقلل بشكل ملحوظ من الحركة العفوية لقرون الرحم. وعلى النقيض من ذلك، فإن غياب المبيضين و/أو القنوات الأوفيكتية لا يضعف حركة الجهاز التناسلي بأكمله. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء أن يلاحظ أن بعض المركبات حساسة للأكسدة. على سبيل المثال، يمكن أكسدة الادرينالين بسهولة. وسيتطلب اختبار آثار هذه المركبات وقتاً أقصر للحضانة لمنع الأكسدة المفرطة. ومع ذلك ، قد تعوق أوقات الحضانة القصيرة قدرة الدواء على اختراق سمك جدار الرحم بكفاءة. ومن القيود الأخرى على هذه الطريقة تقييم الحركات ثلاثية الأبعاد للقرون. القرون لها طبيعة فطرية من الشباك في طائرة ثلاثية الأبعاد، مما يعقد التحليل. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن تقليل حجم المخزن المؤقت كريبس في طبق بيتري إلى 2 مل.
وجدنا أن النطاق العمري الأمثل للفئران الإناث هو 2-5 أشهر. أشرنا إلى أن التخدير مع الأيسوفلوران قد يؤدي إلى انخفاض الحركة وقد يكون من الضروري استخدام المزيد من الإذاد لمنع هذه المضاعفات الناجمة عن الأيسوفلوران. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يستخدم ثاني أكسيد الكربون لقتل الفئران. إذا نشأت صعوبات أثناء التشريح، قد يساعد التركيز على المعالم، مثل المثانة البولية. لتحديد كمية بيانات الحركة التي تم الحصول عليها، استخدمنا برنامج MATLAB. كانت المشكلة الرئيسية مع تتبع الحركة في MATLAB أن تعقب كان غير قادر على تحديد موقع القرون بشكل صحيح عندما انتقلت بالقرب من جدار طبق بيتري. تم استخدام Adobe Premier Element لقص لقطات الفيديو وتقليل حجم ملفات الفيديو. على الرغم من أنها حزمة برامج متميزة، إلا أنها قد لا تكون متوفرة دائمًا في إعداد مختبري نموذجي. قد يكون الخيار البديل هو استخدام وحدة تتبع الحركة الحرة من برنامج ImageJ أو حتى تقييم يدوي بسيط للصور التي تم التقاطها مع فترات متطابقة ومقارنة موقف قرون الرحم على شبكة تجزئة. ويبين الشكل 2 مثالاً على التقييم البسيط لحركية الرحم العفوية ويتضمن مقارنة بين حركات الجهاز التناسلي في غضون فترة 15 ق.
لم يتم الإبلاغ حتى الآن عن طريقة بسيطة لتقييم حركية الرحم في إعداد طبق بيتري. يمكن استخدام أجهزة استشعار الضغط بالموجات فوق الصوتية وداخل الرحم لمراقبة انقباض الرحم البشري14. ومع ذلك، من الصعب دراسة الآليات الكامنة في الرحم البشري السليم. ولذلك، فإن استخدام النماذج الحيوانية للتحقيق في انقباض الرحم التلقائي أمر مهم. يعرض الجهاز التناسلي الأنثوي تقلصات عضلية عفوية حاسمة بالنسبة لرفاه المرأة، بما في ذلك خصوبتها والمخاض15. ويمكن تصور هذه الانقباضات على أنها موجات بطانة الرحم أثناء الفحص بالموجات فوق الصوتية. ومع ذلك، أثناء الحيض، أكثر من انقباض الرحم يمكن أن تخلق عدم الراحة ويؤدي إلى عسر الطمث، أو تشنجات الحيض. للمساعدة في تخفيف بعض أعراض عسر الطمث، هناك حاجة إلى أدوية جديدة تستهدف استرخاء عضلات الرحم الملساء. لدينا طريقة بسيطة توفر وسيلة لتقييم آثار المركبات المختلفة على انقباض الرحم.
في هذه الدراسة، استخدمنا نموذج طبق بيتري السهل لتأكيد فعالية الادرينالين، وهو هرمون مريح الرحم12، لمنع حركية الرحم العفوية من المسالك التناسلية الماوس معزولة. ويمكن أيضا أن تستخدم طريقتنا لاختبار مثل هذه المركبات التي قد تزيد من انقباض الرحم. والأهم من ذلك، قد يكون لهذه الطريقة القدرة على الترقية لفحص المخدرات الإنتاجية باستخدام شكل لوحة من ست آبار. وبالتالي، فإن الطريقة التي نقدمها هنا قد تكون قادرة على تحسين إجراءات الفرز على النطاق الصناعي. لم نحاول إجراء تجارب مماثلة في القوارض أكبر، ولكننا نتوقع أن الحركة العفوية مماثلة سوف تكون موجودة في الأوتري الفئران معزولة. قد يظهر الجهاز التناسلي الأكبر للفئران حركية الرحم الأكثر وضوحاً. وجدنا أن الحوامل الماوس الرحم يمكن أيضا تقييم باستخدام هذا الجسم الحي السابق الرحم الحركة بيتري نموذج الطبق. كما هو متوقع ، تم تقليل الحركة العفوية للرحم الحوامل لأنه في حالة هادئة. ومع ذلك، قد تساهم زيادة الوزن المضافة من قبل أنسجة الجنين أيضا في انسداد الحركة. قد يكون لا يزال من المفيد مواصلة استكشاف ملاءمة هذا النموذج كامل الجهاز التناسلي لتقييم تأثير المركبات tocolytic (الاسترخاء) أو الرحم (المنشطات) في سياق الحمل والعمل. وهكذا، قدمنا هنا نموذج من السهل من الجسم الحي لتقييم الحركة العفوية للجهاز التناسلي سليمة. ويمكن اعتماد هذا النهج لفحص المخدرات واستخدامه في اكتشاف جديد للمخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل بصناديق داخلية من الوحدة. تصور AGO الدراسة. وقد شاركت XC وAGO في تصميم التجارب الموصوفة. قامت FL وAGO بتحليل البيانات وتفسيرها. KLL, JOB, FL أجرى جميع التجارب فيف السابقين. كتب FL السيناريو MATLAB. كال، جوب، وأغو كتبالمخطوطة. قرأ جميع المؤلفين النسخة النهائية من المخطوطة ووافقوا عليها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
- Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
- Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
- Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
- Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
- Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
- Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
- Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
- Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
- Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
- Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
- Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
- Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).
