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Biology

마우스 생식 기관 자발적 운동성 및 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 자궁 운동 추적 알고리즘을 평가하기 위한 Ex Vivo 방법

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/59848
* These authors contributed equally

Summary

자궁 수축은 여성의 복지에 중요합니다. 그러나 병리학적으로 수축성이 증가하면 월경불순, 특히 젊은 여성에게 발생할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 월경경 치료에 사용될 수 있는 평활근 이완제의 효능의 빠른 평가를 허용하는 간단한 생체 내 준비를 기술한다.

Abstract

월경기, 또는 고통스러운 경련은, 여성의 월성과 관련된 가장 흔한 증상이며, 그 심각성은 여성의 일상 생활을 방해 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 자궁 수축을 감소시키는 새로운 약 시험을 위한 중요한 역할을 할 것입니다 쉽고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 방법은 산소화 된 Krebs 버퍼를 포함하는 페트리 접시에서 생체 내 생체를 유지 했을 때 자발적인 운동성을 나타내는 전체 마우스 생식 기관의 독특한 능력을 활용합니다. 이 자발적인 운동성은 자궁내막파로 불리는 인간 자궁의 파도와 같은 근심 활성과 유사합니다. 이 방법의 효과를 입증하기 위해 잘 알려진 자궁 이완제 약물 인 피네프린을 사용했습니다. 우리는 전체 마우스 생식 기관의 자발적인 운동성이 이 페트리 접시 모델에서 1 μM 에피네프린에 의해 신속하고 가역적으로 억제될 수 있음을 입증합니다. 자궁 운동성의 변화를 문서화하는 것은 일반 스마트 폰 이나 정교한 디지털 카메라를 사용하여 쉽게 수행 할 수 있습니다. 우리는 모션 트래킹이 자궁 경적 운동의 속도를 측정하여 자발적인 자궁 운동성 변화를 정량화할 수 있도록 MATLAB 기반 알고리즘을 개발했습니다. 이 ex vivo 접근법의 주요 장점은 생식 기관이 전체 실험 전반에 걸쳐 그대로 유지되어 모든 본질적인 자궁 내 세포 상호 작용을 보존한다는 것입니다. 이 접근의 중요한 한계는 자궁의 10-20%까지 자발적인 운동성을 전시할 수 없다는 것입니다. 지금까지, 이것은 페트리 접시 모델에서 자발적인 자궁 운동성을 평가하기 위한 최초의 정량적 생체 내 방법이다.

Introduction

주요 여성 기관으로서 자궁은 태아의 영양을 위해 생식에 매우 중요하며필수적입니다 1. 자궁은 3 개의 층으로 구성됩니다 : 회막, 근막 및 자궁 내막. myometrium는 자궁의 중요한 수축층이고 태아 납품에 있는 중요한 역할을 합니다. 자궁 내막은 자궁 구멍을 안감하는 가장 안쪽 층이고 태아 이식을 위해 필수적입니다. 생식 연령의 임신하지 않은 여성에서 자궁 내막 층은 월경 주기의 시작 부분에 매달 흘린다. 근막은 자궁에서 괴사 자궁 내막 조직을 지우는 데 필요한 자발적인 근심 수축을 유지함으로써이흘리기 과정에서 보조합니다 1.

불행 하 게도, 증가 근심 수축 월 경 질 등 부정적인 부작용귀 착될 수 있습니다., 또는 고통 스러운 생리 경련. 이것은 특히 젊은 여성과 nulliparous 여성2에서 볼 수 있습니다. 그러나, 월경기는 모든 여성을 위해 다르며 근심 수축의 강도에 따라 다릅니다. 강한 수축은 종종 심한 경련의 감각과연관3. 근위축성은 자궁초음파를 사용하여 가시화될 수 있으며 자궁내막파로 인식되기도 합니다. 자궁내막 슬루핑을 겪고 있는 자궁에서 생리 중 프로스타글란딘의 향상된 방출4은 근심시험 과수축성 증가에 기여하여 자궁 근육의 허혈 및 저산소증을 초래하고, 따라서 증가시키는 것으로 여겨진다. 통증3.

심한 월경불순은 일부 여성의 일상 적인 활동을 방해 할 수 있으며 여성의 3 ~ 33 %는 매우 심한 통증을 가지고 있으며, 이는 여성이 각 생리 주기5일 동안 침대에 누워있을 수 있습니다. 월경불협은 연령, 국적,경제상태에관계없이 생식연령여성의 부인과이병의 주요 원인5. 월경불순의 추정 된 보급은 생식 연령5의여성에서 45 %에서 93 %까지 높고 가변적입니다.  월경불경 관련 통증은 여성의 일상 생활에 영향을 미치며 청소년의 학업 성적 저하, 수면의 질 저하, 일상 활동의 제한 및 기분 변화5.

가혹한 월경불위를 경험하는 많은 여자는 그들의 고통을 구호하기 위하여 창구 판매 약물에 의지합니다. 이러한 창구 판매 약물은 프로스타글란딘의 형성을 방지하는 사이클로옥시게나제 (COX) 억제제를 함유하고있습니다6. 그러나 COX 억제제는 불리한 심혈관 사건과 관련이 있으며, 월경불경을 가진 여성의 약 18%는이러한 억제제 7에 반응하지 않습니다. 따라서 생리통을 줄이기 위해 새로운 약물이 필요합니다. 자궁의 수축성 이상이 월경불허의 발병기전에 기여하기 때문에 한 가지 가능한 전략은 자궁 이완제의 사용일 수 있습니다.

그것은 자연스럽 게 발생 하는 자발적인 심근 파 같은 수축의 모델에서 잠재적인 이완 제 약물의 효과 정량화 하는 것이 도움이. 그러나, 지금까지, 온전한 자궁에서 근육 이완 약물을 시험하기 위한 효율적인 생체 내 생체 내 방법은 설명되지 않았다. 현재, 아이소메트릭 장력 측정은 이완제 약물 효과를 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 측정 동안, 자궁 근육 스트립은 조직 목욕에서 예압하에 일정한 길이로 유지되며 자궁 근육 수축의 힘은 이완제 약물의 존재 또는 부재 에서 옥시토신 자극 전후로 기록됩니다. 이 방법은 매우 유용하지만, 그것은 비싼 장비가 필요합니다. 또한, 등각부종 수축은 자연그대로 자궁에서 자연적으로 발생하는 자발적인 근심파와 유사한 수축과 유사하지 않습니다. 유일하게, 설치류에 있는 자궁 근심파는 전체 생식 기관 (난소, 난관, 자궁 및 질)가 완충액에서 유지될 때 자궁 혼 운동성으로 구상될 수 있습니다. 여기서, 우리는 산소화 된 크렙스 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 배치 된 그대로 마우스 자궁의 자발적인 운동성을 모니터링하기위한 생체 내 방법을 제시한다. 또한 MATLAB 모션 트래커를 활용한 운동성 정량화 알고리즘에 대해서도 설명합니다. 이 새로운 접근 방식은 자연적으로 발생하는 치료법과 합성 화합물의 이완 잠재력을 테스트하기 위한 쉽고 저렴한 대안을 제공합니다.

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Protocol

동물을 가진 모든 절차는 인디애나 대학 의과 대학 (인디애나 폴리스, IN)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 2-5개월 된 F2-129S-C57BL/6 성적으로 성숙한 암컷 마우스를 연구에 사용하였다.

주의 사항: 동물 및 생체 유해 물질로 작업할 때 실험실 코트, 마스크 및 장갑을 착용하여 안전을 보장합니다.

1. 솔루션 준비

  1. 포함 크렙스 버퍼를 준비, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2,1.2 mM NaH2PO4,0.56 mM MgCl2,25 mM NaHCO3,및 5 mM 포도당, pH 7.4. 순환 수조를 사용하여 37°C에서 완충온도를 유지하면서 5% CO2 및 95% O2를 함유하는 압축 가스의 혼합물로 크렙스 완충액을 연속하여 산소화한다.
  2. 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4,136.89 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO 4, pH 7.4를포함하는 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)를 준비한다.

2. 동물 준비

  1. 이소플루란 흡입을 사용하여 마우스를 마취 (3%) 폐 가스 청소와 함께. 철수 반사를 평가하여 적절한 마취를 보장하십시오. 뒤쪽 발가락을 꼬집어 움직임이 없음을 확인하여 반사 반응의 손실을 나타냅니다. 깊은 마취가 달성 된 후, 참수에 의해 동물을 안락사.
    참고: 이소플루란은 평활근 팽창을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 생식 기관 제제는 생체 내 실험을 시작하기 전에 적어도 15-30 분 동안 크렙스 완충제에서 광범위하게 세척되고 배양되어야 한다. 이소플루란은 피부에 닿을 때 자극과 불편함을 유발할 수 있으므로 주의해서 진행하십시오.
  2. 종이 타월이 늘어선 큰 계량 보트에 몸을 놓습니다.
    참고: 임신 한 여성 실험실 직원은 태아의 체중을 감소시키고 태아 골격 골화를 감소시키고 자발적 낙태의 위험을 증가시킬 수 있기 때문에 isoflurane을 가진 실험에 관여해서는 안됩니다8,9. CO2 흡입은 마우스를 안락사시키는 대용품으로서 사용될 수 있다.

3. 에스트로스 사이클 스테이지 의 결정

  1. 작은 집게로 클리토리스를 들어 올려 질 오슘에 접근하고 10 μL의 DPBS를 함유 한 마이크로 파이펫 팁을 천천히 질에 삽입하십시오.
    1. 마이크로파이펫 팁이 질 벽에 구멍을 뚫지 않도록 10- 30°의 각도로 오슘을 통해 삽입되었는지 확인합니다. 액체는 삽입 후에도 팁에 계속 표시되어야 합니다. 액체가 보이지 않는 경우에, 끝은 질로 너무 멀리 삽입되고, 질의 paracervical 지역은 천포되었을 지도 모릅니다.
    2. 마이크로파이펫 끝으로 질 오슘 근육을 가볍게 잡아당겨 공기가 질에서 빠져나올 수 있도록 합니다.
  2. DPBS 10 μL로 2-3회 위아래로 파이펫팅하여 질 구멍을 천천히 세척하고 유리 슬라이드에 그려진 셀 현탁액을 놓습니다.
  3. 반전된 상 대비 현미경을 사용하여 세포학적 분석을 통해 에스트로스 주기 단계를 결정합니다. 절차는 다른 곳에서 설명 한 대로 수행10,11. 세포 학적 분석을 수행하기 전에 세포 현탁액이 건조되지 않았는지 확인하십시오. 서스펜션은 필요한 경우 신선한 DPBS로 희석될 수 있다.

4. 마우스 생식 기관 Ddissection

  1. 마우스를 척추 위치에 배치하고 사지를 확산하여 복부 골반 부위를 노출시하십시오.
  2. 70% 에탄올로 스프레이하여 복부를 적시고 소독합니다.
  3. 포셉을 사용하여 클리토리스보다 우수한 피부를 조심스럽게 들어 올립니다. 복막을 노출하기 위해 상지까지 하복부 영역의 측면 측면에 작은 횡절개를 합니다 (그림1A). 이 과정에서 외부 플랩이 형성됩니다. 작은 절개가 지속적으로 만들어지면 플랩의 크기가 증가합니다.
  4. 조심스럽게 위장관을 노출하는 각막을 잘라 (그림1B). 자궁 경적 종종 peritoneum 의 밑에 직접 위치 할 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다, 그래서 조심스럽게 절개를하고이 자궁 운동성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 뿔을 만지지 마십시오.
  5. 집게를 사용하여 위장관을 덮는 근막과 지방 조직을 제거하십시오. 복강에서 다음 위장관 세그먼트를 제거: 십이지장, jejunum, 장, 장, 요양, 오름차순 및 횡결장 (그림1C).
  6. 생식 기관을 찾으려면 먼저 안락사 후 무효로 인해 수축 된 외관을 가질 수있는 오줌 방광 (그림1C, "4")을 식별하십시오. 질은 오줌 방광의 밑에 있을 것입니다.
  7. 음모 뼈의 합류에서 음모 심포지엄을 찾습니다 (방광에 가시적으로).
  8. 가위를 사용하여, 신중하게 간 섬유 판염 조직을 통해 측면에 절개를함으로써 음모 심경을 제거하고 질을 추출하기위한 경로를 제공하고 (그림1D).
  9. 외음부의 항문과 하부 사이에위치한 회음부를 통해 잘라.
  10. 집게를 사용하여 질을 들어 올리고 천천히 직장을 절제하십시오.
  11. 질에 장밋빛 포크로 분기 두 자궁 뿔을 식별합니다. 각 뿔의 끝에 복잡한 난관과 난소를 찾아, 이는 나머지 위장관 세그먼트 아래에 숨길 수 있습니다. 작은 해부 가위를 사용하여 복강 내의 뿔, 난관 및 난소를 연결하고 지지하는 인대를 제거하십시오.
  12. 복강에서 질, 자궁, 난관 및 난소를 포함하는 생식 기관을 제거하십시오.
  13. 단리된 생식 기관(그림1E)을 100 mm 페트리 접시에 DPBS 10 mL로 채워진 다. 자궁 경적을 압축하여 근중세균을 손상시키지 않도록 하십시오.
  14. 집게와 외과 가위를 사용하여 자궁 뿔과 질을 둘러싼 결합 및 지방 조직뿐만 아니라 음부 부위의 모피를 제거하여 이미지 품질을 방해할 수 있습니다. 자궁 경적의 운동성을 허용하기 위해 넓은 인대를 제거하십시오.
  15. 분리된 생식 기관을 신선한 DPBS로 두 번 세척하고 3mL의 산소 로고된 크렙스 용액으로 채워진 35mm 페트리 접시로 옮니다.

5. 조직 화상 진찰

  1. 산소화된 크렙스 버퍼에 생식기관을 함유한 페트리 접시를 검은 표면에 놓습니다. 접시를 실온에서 유지합니다.
    참고: 적외선 온난화 패드를 사용하여 37°C에서 조직을 유지할 수 있습니다.
  2. 자발적인 수축이 시작될 수 있도록 15-30분 간 허용하십시오. 모든 유형의 디지털 비디오 장비를 사용하여 축 평면에서 10 분 동안 자발적인 자궁 운동성을 기록하십시오.
  3. 시험 화합물로 보충된 산소화 된 크렙스 완충제를 함유한 페트리 접시로 제제를 옮김. 디지털 비디오 장비의 모든 유형을 사용하여 축 평면에서 약 10 분 동안 자발적인 자궁 운동성을 기록합니다.
  4. 치료의 가역성을 평가하기 위해 DPBS의 10mL로 100mm 페트리 접시에 전체 생식 기관을 세척합니다.
  5. 갓 산소를 공급받은 크렙스 버퍼로 페트리 접시에 준비를 옮김. 디지털 비디오 장비의 모든 유형을 사용하여 축 평면에서 약 10 분 동안 자발적인 자궁 운동성을 기록합니다.
  6. 자발적인 자궁 운동성에 기계적으로 유도된 변화가 없도록 시험 화합물을 위한 비히클과 함께 보충된 산소화 된 Krebs 버퍼로 채워진 다른 35 mm 페트리 접시로 준비를 옮김. 이것은 중요한 제어입니다.
  7. 비디오 푸티지를 컴퓨터 하드 드라이브로 전송합니다.

6. 데이터 분석

  1. 컨트롤, 처리 및 세척 에피소드가 포함된 원본 비디오 푸티지의 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 클립을 만듭니다.
  2. MATLAB 소프트웨어와 제공된 스크립트(온라인 보충 자료 참조)를 사용하여 자발적인 자궁 운동성을 정량화합니다.
    참고: 스크립트가 완벽하게 작동하려면 MATLAB용 컴퓨터 비전 도구 상자 추가 기능을 설치해야 합니다.
    1. MATLAB 스크립트를 열고 편집기 탭으로 이동한 다음 실행 을클릭합니다.
    2. 첫 번째 비디오 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
    3. 팝업 대화 상자에 비디오 파일에 대한 레이블을 입력하고 확인을 클릭합니다.
    4. 경적 이동 속도를 계산하는 데 필요한 시간 간격(들)을 입력합니다(Δ 유클리드 거리 /Δs).
    5. 마우스 커서를 사용하여 비디오의 첫 번째 프레임에서 두 점을 선택합니다. 팝업 창에서 선택한 포인트를 추적에 사용해야 하는지 확인하라는 요청이 표시됩니다. 시작을 클릭하여 팝업 창에 표시되는 실시간 추적 프로세스를 시작합니다. 또는 점 재선택을 클릭하여 두 점을 다시 선택합니다.
    6. 팝업 창에서 추적 프로세스의 정확도를 모니터링합니다.
    7. 새 팝업 창에서 속도 대 시간 산란도표 및 거리 와 시간 분산도를 관찰합니다. FILE |을 선택하여 두 그림을 저장합니다. 데이터를 문서화하려면 동일한 창에서 와 같이 저장합니다.
    8. MATLAB 스크립트가 있는 동일한 디렉토리에서 MATLAB에서 자동으로 만든 PointTrackerData라는폴더를 찾습니다. 두 개의 별도 워크시트 탭에서 비디오에서 수집된 데이터 요소가 포함된 label_Data라는 Excel 파일을 식별합니다.
      참고 : 모든 대체 모션 추적 소프트웨어는 자발적인 자궁 운동성을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 적절한 소프트웨어(예: Excel 또는 SigmaPlot 13)를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.

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Representative Results

도 1은 본 프로토콜에 기재된 전체 생식관 격리 절차 동안 촬영된 대표적인 이미지를 나타낸다. 비디오 품질을 저하시킬 수 있는 모피로 버퍼를 오염시키는 것을 방지하기 위해 마우스 본체를 70% 에탄올로 적십시켰습니다. 프로토콜의 해부 섹션에 대한 주요 벤치 마크는 오줌 방광을 찾는 것입니다. 자궁과 질은 오줌 방광에 열등하게 위치할 것입니다.

프로토콜을 테스트하기 위해, 우리는 에피네프린으로 전체 생식 기관을 치료했습니다. 피 네 프 린 은 자 두 근 이완을 일으키는 원인이 되는 잘 알려져 있다. 이 호르몬은 내 생 부 신 수 질에서 생산 하 고 포유류에서 스트레스 호르몬 역. 우리는 실험에서 1 μM 에피네프린을 사용했습니다. 이는 최대 반응을 유발하는 것으로 알려진 포화농도(12)이다. 4개의 실험의 시리즈를 수행하였다. 모든 시험에서, 1 μM 피네프린가 자발적으로 자궁 운동성을 가역적으로억제하였다(그림 2).

생식 기관의 자발적인 운동성을 정량화하기 위해 마우스 생식 기관에서 선택한 두 지점 사이의 유클리드 거리의 평균 변화 속도를 평가할 수 있는 알고리즘을 설계했습니다. 포인트 위치는 MATLAB 소프트웨어의 모션 트래킹 모듈을 사용하여 추적됩니다. 유클리드 거리를 계산하는 데 사용한 MATLAB의 해당 스크립트는 온라인 보충 자료에 제공됩니다. 포인트의 위치는 성공적인 모션 트래킹 절차에 매우 중요합니다. Petri 접시 의 벽에서 빛 반사가 모션 트래커를 방해 할 수 있기 때문에 비디오의 품질에 대해 신중하게 고려해야하며, 라이트 중 하나에 점을 다시 할당하는 동안 경적 움직임 추적을 중지 할 수 있습니다. 반사. 우리는 페트리 접시 벽 반사에서 충분히 멀리 있는지 확인하기 위해 경적 의 중간에 포인트 중 하나를 배치하기로 결정했습니다. 두 번째 점은 일반적으로 자발적인 운동성을 나타내지 않았기 때문에 질에서 선택되었습니다. 그림 3은 데이터 분석 샘플을 제공하고, 보충 그림 1은 모션 추적 중에 획득한 대표 이미지를 보여 주다.

Figure 1
그림 1 : 전체 생식기관 분리단계. (A) 피부에 절개가 이루어졌고 복부 골반 부위가 복막 (1) 위에 노출되었습니다. (B) 장액막을 천천히 열어 위장관을 노출하였다(2). (C) 위장관은 자궁경적을 노출시키기 위해 이동하였다(3). 오줌 방광 (4)는 뿔의 결합 의 가까이에 구상될 수 있습니다. (D) 자궁경적항이 풀려나 음부(5)의 측면측에 상처가 되어 질을 노출시켰다(6). (E) 분리된 생식기관을 제거하고 DPBS 용액에 배치한다. 임의의 과잉 모피 또는 결합 조직을 제거시켰다. (F) 직장을 제거 한 후 질 (오른쪽)에서 깊은 들여 쓰기를 볼 수 있습니다 (왼쪽, 7). (G) 주변 결합 조직이 제거됩니다. 디지털 카메라 및 애플리케이션 스위트 소프트웨어(버전 3.7.0)는 해부(카메라 설정: 색조 20/채도 80)동안 실시간 이미지를 획득하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : 전체 분리된 생식기관을 위한 대표적인 실험이 표시됩니다. 이미지는 1μM 피네프린을 적용하기 전(A), (B) 및 후(C) 적용 전 15s를 촬영하였다. 생식 기관 제제는 에피네프린이 없는 패널 A 및 C에서 높은 운동성을 나타내었지만, 1 μM 에피네프린이 존재하는 패널 B에서 정지하다. 편집되지 않은 비디오 푸티지는 보충 비디오 1-3으로제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : 생체외 실험에서 데이터 분석 그림 2. (A) 유클리드 거리 변화율의 시간 과정이 표시됩니다. 자발적인 자궁 운동성 동안 거리가 결정된 기준점은 인세트에 녹색 점으로 표시됩니다. 포인트는 묘사 된 바와 같이 질의 근위 부분과 자궁 경적의 중간 세그먼트에서 선택되었다. 청색 채워진 원은 에피네프린을 추가하기 전에 자발적인 운동성 비율 값을 보여주고, 빨간색 원은 1 μM 에피네프린이 있는 경우 자발적인 운동률을 나타내고, 녹색 으로 채워진 원은 세척 후 자발적인 운동률을 보여준다. (B) 에피네프린(blue bar)을 첨가하기 전의 평균 유클리드 거리 변화율(픽셀/s)의 비교, 1 μM 에피네프린(빨간 막대)의 존재, 및 세척 후(녹색 막대) MATLAB 소프트웨어는 자궁 운동성을 정량화하는 데 사용되었습니다. Δt 간격은 5s. "ΔDistance"로 설정되었고 초기 프레임 거리와 5초 후프레임 거리 사이의 차이로 계산된다. 통계 분석은 SigmaPlot 13을 사용하는 던의 방법에 따라 모든 쌍으로 여러 비교 절차가 다음 순위에 분산의 Kruskal-Wallis 편도 분석을 사용하여 수행되었다. 별표는 다른 실험 데이터 세트와 크게 다른 데이터 집합을 나타냅니다(P = <0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental Movie 1
보충 영화 1: 1 μM 피네프린을 추가하기 전에 자발적인 자궁 운동성을 보여주는 타임 랩스 비디오 클립. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

Supplemental Movie 2
보충 영상 2: 크렙스 완충제가 1 μM 에피네프린으로 보충되었을 때 자발적인 자궁 운동성을 보여주는 타임랩스 비디오 클립. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

Supplemental Movie 3
보충 영화 3: 세척 후 자발적인 자궁 운동성을 보여주는 타임 랩스 비디오 클립. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

Supplemental Figure 1
추가 그림 1: 모션 추적 중에 15s마다 찍은 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

The MATLAB-based tracking algorithm script
보충 자료: MATLAB 기반 추적 알고리즘 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에서, 우리는 난소, oviducts, 자궁 뿔 및 질을 포함하는 전체 설치류 생식 기관의 자발적인 수축성을 평가하기 위한 방법을 기술했습니다. 우리는 자발적인 자궁 운동성13에페닐레프린의 이완 효과를 입증하기 위해 유사한 방법을 사용했지만, 과거에는 데이터의 정량적 분석을 제공할 수 없었습니다. 이 작품에서는 MATLAB 모션 트래킹 모듈을 사용하여 정량적 운동성 데이터 분석을 위한 알고리즘을 개발했습니다. 이것은 약이 자궁 경활한 근육을 이완하거나 수축하는지 여부에 관계없이 자궁 수축을 조절하는 새로운 약물을 테스트하기위한 유용한 기술입니다. 이 모델의 주요 장점은 생식 기관이 손상되지 않고 모든 본질적인 자궁 내 세포 상호 작용을 보존한다는 것입니다. 특히,이 프로토콜은 특별한 장비를 필요로하지 않습니다. 자궁 격리는 간단한 돋보기로 수행 할 수 있으며 정교한 비디오 녹화 장비에 대한 요구 사항은 없습니다. 고해상도 디지털 카메라를 이미징에 사용할 수 없는 경우 개인 용 휴대 전화 카메라를 대안으로 사용할 수 있습니다.

생식 기관 운동성을 평가하기위한 프로토콜의 가장 중요한 단계는 실행 가능한 자궁 조직을 얻는 것입니다. 자궁 경적 내의 근중질은 생식 기관의 운동성 요소입니다. 따라서 격리 중에 경적을 과도하게 스트레칭하거나 압축하지 않는 것이 중요합니다. 또한 자궁 운동성을 유지하기 위해 실험 전반에 걸쳐 자궁 조직이 잘 산소화되도록하는 것이 중요합니다. 자궁 경적에 손상을 방지하는 가장 좋은 방법은 자궁을 청소하거나 생식 기관을 이동하는 동안 인접한 결합 조직과 접촉하는 것입니다. 질은 실험 중에 자발적으로 수축하지 않기 때문에 생식 기관을 한 접시에서 다른 접시로 옮길 때 집게로 압축하는 것이 허용됩니다. 전체 생식 기관 실험은 프리로드 및/또는 옥시토신 유도 자궁 수축성을 평가하는 등각 부도기록과 함께 수행될 수 있다. 그러나 와이어 심근 계피는 일반적인 실험실 환경에서 항상 사용할 수 있는 고가의 장비입니다.

설명된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 근중계는 압축이나 당기기에 매우 민감하기 때문에 생식 기관의 해부 과정을 복잡하게합니다. 해부 중에 뿔이 손상되면 자발적인 수축이 관찰되지 않습니다. 이것은 수축성 평활근 세포가 적절한 관리및 주의의 사용에도 불구하고 무의식적으로 손상되었는지 또는 자연적인 원인으로 인한 운동성이 결여되었는지 여부가 불확실하기 때문에 프로토콜의 주요 제한사항입니다. 실제로, 우리는이 연구에서 생식 기관 제제의 10-20 %에서 운동성을 관찰하지 않았습니다. 질 제거가 자궁 경적의 자발적인 운동성을 현저하게 감소시키기 때문에 생식 기관의 질 세그먼트가 그대로 유지되도록하는 것이 중요합니다. 대조적으로, 난소 및/또는 난관의 부재는 전체 생식 기관 운동성을 손상시키지 않습니다. 또한 일부 화합물은 산화에 민감합니다. 예를 들어, 에피네프린은 쉽게 산화될 수 있다. 이러한 화합물의 효과 테스트 하 여 과도 한 산화를 방지 하는 짧은 배양 시간이 필요 합니다. 그러나, 짧은 배양 시간은 효과적으로 자궁 벽의 두께를 관통하는 약물의 능력을 방해 할 수있다. 이 방법의 추가 제한은 뿔의 3차원 움직임을 평가하는 것을 포함한다. 뿔은 3 차원 평면으로 컬링의 타고난 성격을 가지고, 복잡한 분석. 이 문제를 극복하기 위해, 하나는 2 mL에 페트리 접시에 크렙스 버퍼 볼륨을 감소 시킬 수 있습니다.

우리는 암컷 마우스를 위한 최적 나이 범위가 2-5 달이다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리는 이소플루란을 가진 마취가 감소된 운동성 귀착될 수 있고 추가 세정이 이소플루란 유도한 합병증을 방지하기 위하여 필요할 지도 모르다는 것을 표시했습니다. 양자택일로, 마우스를 안락사시키기 위하여 이산화탄소를 사용할 수 있습니다. 해부 도중 어려움이 생기는 경우에, 오줌 방광과 같은 랜드마크에 집중하는 것은, 도움이 될 수 있습니다. 얻은 운동성 데이터를 정량화하기 위해 MATLAB 소프트웨어를 사용했습니다. MATLAB의 모션 트래킹의 가장 큰 문제점은 트래커가 페트리 접시의 벽 근처로 이동할 때 경적을 제대로 찾을 수 없다는 것이었습니다. Adobe Premier Element는 비디오 푸티지를 클립하고 비디오 파일의 크기를 줄이는 데 사용되었습니다. 뛰어난 소프트웨어 패키지이지만 일반적인 실험실 환경에서 항상 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 다른 옵션은 ImageJ 소프트웨어의 자유 모션 트래킹 모듈 또는 동일한 간격으로 촬영한 이미지의 간단한 수동 평가를 사용하고 세분화 그리드에서 자궁 경적의 위치를 비교하는 것입니다. 2는 자발적인 자궁 운동성에 대한 간단한 평가의 예를 나타내고 15s 간격 내에서 생식 기관 운동의 비교를 포함한다.

페트리 접시 설정에서 자궁 운동성을 평가하는 간단한 방법은 지금까지보고되지 않았습니다. 초음파 및 자궁 내 압력 센서는 인간의 자궁 수축성14를모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 그대로 인간 자궁에 있는 근본적인 기계장치를 공부하는 것은 어렵습니다. 따라서 자발적인 자궁 수축을 조사하기 위한 동물 모델의 사용이 중요합니다. 여성 생식 기관 전시 자발적인 근심 수축 여성의 복지에 대 한 중요 한, 그녀의 불 임 및 노동을 포함 하 여15. 이 수축은 초음파 검사 도중 자궁내막파로 가시화될 수 있습니다. 그러나, 월경 도중, 자궁의 수축을 통해 불편을 만들고 월경 불경, 또는 월경 경련으로 이끌어 낼 수 있습니다. 월경불순의 증상을 완화하기 위해 자궁 경부 근육을 이완시키는 새로운 약물이 필요합니다. 우리의 간단한 방법은 자궁 수축에 대한 다양한 화합물의 효과를 평가하는 방법을 제공합니다.

이 연구에서는, 우리는 고립된 마우스 생식 기관의 자발적인 자궁 운동성을 방지하기 위하여, 자궁 이완제 호르몬12의에피네프린의 효과를 확인하기 위하여 우리의 쉬운 페트리 접시 모형을 이용했습니다. 우리의 방법은 또한 자궁의 수축성을 증가시킬 수 있는 그 같은 화합물을 시험하기 위해 이용될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 방법은 6웰 플레이트 포맷을 사용하여 처리량 약물 스크리닝을 위해 업그레이드될 가능성이 있을 수 있다. 따라서, 우리가 여기에 제시하는 방법은 산업 규모의 스크리닝 절차에 최적화 될 수있는 능력을 가질 수있다. 우리는 더 큰 설치류에 있는 유사한 실험을 능력을 발휘하는 것을 시도하지 않았습니다, 그러나 우리는 유사한 자발적인 운동성이 고립된 쥐 자궁에서 나타나기를 기대합니다. 쥐의 더 큰 생식 기관 더 뚜렷한 자 두 동력을 전시할 수 있습니다. 우리는 임신 한 마우스 자궁이 또한이 전 생체 자궁 운동성 페트리 접시 모델을 사용하여 평가 될 수 있음을 발견했다. 예상대로, 임신 한 자궁의 자발적인 운동성은 정지 상태에 있기 때문에 감소되었습니다. 그러나, 태아 조직에 의해 추가된 증가한 무게는 또한 운동성 방해에 기여할 수 있습니다. 그것은 여전히 더 임신과 노동의 맥락에서 tocolytic (이완제) 또는 자궁 (자극제) 화합물의 효과를 평가하기 위해이 전체 생식 기관 모델의 적합성을 탐구하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 따라서, 여기서 우리는 그대로 생식 기관의 자발적인 운동성을 평가하기 위한 쉬운 생체 내 모델을 제시했다. 이 접근법은 약물 스크리닝을 위해 채택될 수 있고 새로운 약물 발견을 위해 이용될 수 있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 내부 IU 기금에 의해 지원되었다. AGO는 연구를 구상했다. XC 및 AGO는 기재된 실험의 설계에 관여하였다.  FL 및 AGO는 데이터를 분석하고 해석했습니다. KLL, JOB, FL은 모든 생체 내 실험을 수행하였다. FL은 MATLAB 스크립트를 작성했습니다. KLL, JOB, 그리고 AGO는 원고를 썼다.  모든 저자는 원고의 최종 버전을 읽고 승인했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epinephrine hydrochloride Sigma-Aldrich  E4642 
Dulbecco's PBS Fisher Sceintific  17-512Q
Ethanol 200 PROOF Decon Laboratories 2701
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glucose Sigma-Aldrich G7528
KCl Sigma-Aldrich P9333
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C5080
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
MgCl2  · 6H2O Sigma-Aldrich M9272
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Isoflurane, USP Patterson Veterinary 07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps Fisher Sceintific 13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope Leica MZ6 
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system Leica  DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources Fisher Sceintific  12-562-21
Weigh Boat Fisher Sceintific  WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown  Cardinal Health  9515 Small, Medium or Large
Gloves McKesson Corporation 20-1080 Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
 Petri Dish Corning Falcon 351029 100 mm
 Petri Dish Corning Falcon 353001 35 mm
95% O2- 5% CO2 gas mixture Praxair  MM OXCD5-K
Ear-loop Masks Valumax International 5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera Canon EOS Rebel T6i
MATLAB MathWorks N/A version 2019 or later

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References

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생물학 문제 151 자궁 자발적인 자궁 운동성 에피네프린 생식 기관 마우스 생체 외 모델
마우스 생식 기관 자발적 운동성 및 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 자궁 운동 추적 알고리즘을 평가하기 위한 Ex Vivo 방법
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Liang, K. L., Bursova, J. O., Lam,More

Liang, K. L., Bursova, J. O., Lam, F., Chen, X., Obukhov, A. G. Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis. J. Vis. Exp. (151), e59848, doi:10.3791/59848 (2019).

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