Summary
गर्भाशय संकुचन महिलाओं की भलाई के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, रोग रूप से बढ़ी हुई संकुचन के परिणामस्वरूप डिस्मेनोरिया हो सकता है, विशेष रूप से युवा महिलाओं में। यहाँ, हम चिकनी मांसपेशियों relaxants कि dysmenorrhea के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की प्रभावकारिता के त्वरित मूल्यांकन की अनुमति एक सरल पूर्व vivo तैयारी का वर्णन.
Abstract
Dysmenorrhea, या दर्दनाक ऐंठन, महिलाओं में menses के साथ जुड़े सबसे आम लक्षण है और इसकी गंभीरता महिलाओं के रोजमर्रा के जीवन में बाधा कर सकते हैं. यहाँ, हम एक आसान और सस्ती विधि है कि नई दवाओं गर्भाशय अनुबंध को कम करने के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण होगा प्रस्तुत करते हैं. इस विधि पूरे माउस प्रजनन पथ की अद्वितीय क्षमता का इस्तेमाल सहज गतिशीलता प्रदर्शन जब oxygenated Krebs बफर युक्त एक पेट्री डिश में ex vivo बनाए रखा. यह सहज गतिशीलता मानव गर्भाशय की लहर की तरह मायोमेटिक गतिविधि जैसा दिखता है, जिसे एंडोमेट्रियल तरंगों के रूप में जाना जाता है। विधि की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, हम एक प्रसिद्ध गर्भाशय आराम दवा, एपिनेफ्रिन कार्यरत थे। हम प्रदर्शित करते हैं कि पूरे माउस प्रजनन पथ की सहज गतिशीलता जल्दी और reversibly इस पेट्री डिश मॉडल में 1 डिग्री एम epinephrine द्वारा बाधित किया जा सकता है. गर्भाशय गतिशीलता के परिवर्तन का दस्तावेजीकरण आसानी से एक साधारण स्मार्ट फोन या एक परिष्कृत डिजिटल कैमरे का उपयोग किया जा सकता है. हम एक MATLAB आधारित एल्गोरिथ्म गति ट्रैकिंग गर्भाशय सींग आंदोलनों की दर को मापने के द्वारा सहज गर्भाशय गतिशीलता परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति विकसित की है. इस पूर्व vivo दृष्टिकोण का एक प्रमुख लाभ यह है कि प्रजनन पथ पूरे प्रयोग भर में बरकरार रहता है, सभी आंतरिक intrauterine सेलुलर बातचीत के संरक्षण. इस दृष्टिकोण की प्रमुख सीमा यह है कि अप करने के लिए 10-20% यूरी कोई सहज गतिशीलता प्रदर्शित कर सकते हैं. इस प्रकार अब तक, यह एक पेट्री डिश मॉडल में सहज गर्भाशय गतिशीलता का आकलन करने के लिए पहली मात्रात्मक पूर्व vivo विधि है।
Introduction
एक प्रमुख मादा अंग के रूप में, गर्भाशय प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण है और भ्रूण1के पोषण के लिए आवश्यक है। गर्भाशय में तीन परतें होती हैं: पेरिमेट्रियम, मायोमेट्रियम और एंडोमेट्रियम। मायोमेट्रियम गर्भाशय की प्रमुख संकुचन परत है और भ्रूण वितरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंडोमेट्रियम गर्भाशय गुहा की परत वाली भीतरी परत है और भ्रूण प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक है। प्रजनन आयु की गैर-गर्भवती महिलाओं में, एंडोमेट्रियल परत मासिक मासिक धर्म चक्र की शुरुआत में बहा दी जाती है। गर्भाशय1से नेक्रोटिक एंडोमेट्रियल ऊतक को साफ करने के लिए आवश्यक सहज मायोमेट्रियल संकुचन को बनाए रखने के द्वारा इस बहा प्रक्रिया में मायोमेट्रियम एड्स .
दुर्भाग्य से, बढ़ी हुई मायोमेटरियल संकुचन नकारात्मक पक्ष प्रभाव जैसे डिस्मेनोरिया, या दर्दनाक मासिक धर्म ऐंठन में परिणाम कर सकते हैं। यह विशेष रूप से युवा महिलाओं और शून्यपराश महिलाओं2में देखा जाता है . हालांकि, डिस्मेनोरिया हर महिला के लिए अलग है और उनके मायोमेटिक संकुचन की ताकत पर निर्भर करता है; मजबूत संकुचन अक्सर गंभीर ऐंठन3की अनुभूति के साथ जुड़े रहे हैं . मायोमेटिक संकुचन गर्भाशय अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है और अक्सर एंडोमेट्रियल तरंगों के रूप में मान्यता प्राप्त है। एक गर्भाशय में मासिक धर्म के दौरान प्रोस्टाग्लैंडिन की बढ़ी रिहाई4 एंडोमेट्रियल sloughing के दौर से गुजर रहा माना जाता है कि वृद्धि हुई मायोमेटरियल हाइपरकॉन्ट्रेक्टिलिटी में योगदान करने के लिए, गर्भाशय की मांसपेशियों के इस्किमिया और हाइपोक्सिया में जिसके परिणामस्वरूप और इस प्रकार वृद्धि हुई दर्द3|
गंभीर डिस्मेनोरिया कुछ महिलाओं के दिन-प्रतिदिन की गतिविधि में बाधा डाल सकता है और 3 से 33% महिलाओं को बहुत गंभीर दर्द होता है, जिससे एक महिला को प्रत्येक मासिक धर्म चक्र5में 1 से 3 दिनों के लिए बिस्तर पर पड़ा हो सकता है। Dysmenorrhea उम्र, राष्ट्रीयता, और आर्थिक स्थिति5की परवाह किए बिना प्रजनन उम्र की महिलाओं में स्त्री रोग रुग्णता का प्रमुख कारण है. डिस्मेनोरिया की अनुमानित व्याप्तता उच्च और परिवर्तनीय दोनों है, जो प्रजनन आयु5की महिलाओं में 45% से 93% तक है। Dysmenorrhea संबद्ध दर्द महिलाओं के दैनिक जीवन पर एक प्रभाव है और किशोरों में खराब शैक्षिक प्रदर्शन में परिणाम हो सकता है, नींद की कम गुणवत्ता, दैनिक गतिविधियों के प्रतिबंध, और मूड में परिवर्तन5.
कई महिलाओं को जो गंभीर डिस्मेनोरिया का अनुभव उनके दर्द को दूर करने के लिए ओवर-द-काउंटर दवाओं का सहारा लेते हैं। ऐसी ओवर-द-काउंटर दवाओं में साइक्लोऑक्सीजनेज (कोक्स) अवरोधक होते हैं जो प्रोस्टाग्लैंडिन6के गठन को रोकते हैं। हालांकि, कॉक्स inhibitors प्रतिकूल हृदय घटनाओं के साथ जुड़े रहे हैं, और डिस्मेनोरिया के साथ महिलाओं के बारे में 18% इन inhibitors7के लिए अप्रतिसादी हैं. इसलिए, मासिक धर्म ऐंठन को कम करने के लिए नई दवाओं की आवश्यकता है। चूंकि गर्भाशय की अधिक संकुचन डिस्मेनोरिया के रोगजनन में योगदान देता है, इसलिए एक संभावित रणनीति गर्भाशय आराम करने वालों का उपयोग हो सकती है।
यह स्वाभाविक रूप से होने वाली सहज मायोमेट्रियल लहर की तरह संकुचन के एक मॉडल में संभावित आराम दवाओं के प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए फायदेमंद है। हालांकि, इस प्रकार अब तक, बरकरार गर्भाशय में मांसपेशियों को आराम देने वाली दवाओं के परीक्षण के लिए कोई कुशल पूर्व विवो विधि का वर्णन नहीं किया गया है। वर्तमान में, आइसोमेट्रिक तनाव माप relaxant दवा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस तरह के माप के दौरान, एक गर्भाशय मांसपेशी पट्टी एक ऊतक स्नान में preload के तहत एक निरंतर लंबाई में बनाए रखा है, जबकि गर्भाशय मांसपेशियों में संकुचन के बल से पहले और एक आराम दवा की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ऑक्सीटोसिन उत्तेजना के बाद दर्ज की गई है. हालांकि इस दृष्टिकोण बहुत उपयोगी है, यह महंगा उपकरण की आवश्यकता है. इसके अलावा, आइसोमेट्रिक संकुचन सहज मायोमेटिक तरंग की तरह संकुचन के समान नहीं होते हैं जो स्वाभाविक रूप से बरकरार गर्भाशय में होते हैं। विशेष रूप से, कृन्तकों में गर्भाशय मायोमेटिक तरंगों को गर्भाशय सींग गतिशीलता के रूप में कल्पना की जा सकती है जब पूरे प्रजनन पथ (ओवेरी, अंडवाहिनी, गर्भाशय, और योनि) को बफर समाधान में बनाए रखा जाता है। यहाँ, हम अक्षत माउस गर्भाशय की सहज गतिशीलता की निगरानी के लिए एक पूर्व vivo विधि पेश ऑक्सीजनयुक्त Krebs बफर युक्त एक पेट्री डिश में रखा. हम भी MATLAB गति ट्रैकर का उपयोग एक गतिशीलता परिमाणीकरण एल्गोरिथ्म का वर्णन. इस उपन्यास दृष्टिकोण स्वाभाविक रूप से होने वाली उपचार और सिंथेटिक यौगिकों की आरामदायक क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक आसान और कम महंगा विकल्प प्रदान करता है.
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Protocol
जानवरों के साथ सभी प्रक्रियाओं को इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (इंडियापोलिस, IN) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। 2-5 महीने पुराने F2-129S-C57BL/6 यौन परिपक्व मादा चूहों अध्ययन में इस्तेमाल किया गया.
चेतावनी: जानवरों और biohazardous सामग्री के साथ काम करते समय एक प्रयोगशाला कोट, मुखौटा, और दस्ताने पहनकर सुरक्षा सुनिश्चित करें।
1. समाधान तैयारी
- क्रिब्स बफर तैयार करें, जिसमें 130 एमएम नैकल, 5 एमएम केसीएल, 2 एमएम केसीएल2,1.2 एमएम नाएच2पीओ4, 0.56 एमएम एमजीसीएल2, 25 एमएम नाहको3, और 5 एमएम ग्लूकोज, पीएच 7.4। लगातार एक घूम पानी स्नान का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर तापमान को बनाए रखने, जबकि 5% सीओ2 और 95% हे2 युक्त संपीड़ित गैसों के मिश्रण के साथ Krebs बफर oxygenate।
- तैयार Dulbecco के फॉस्फेट-बफर्ड लवण (DPBS), जिसमें शामिलहैं: 2.68 एम एम KCl, 1.47 mKH2पीओ4, 136.89 एमएम NaCl, और 8.1 एमएम ना2एचपीओ4, पीएच 7.4.
2. पशु तैयारी
- इस्सोफ्लुरेन के इनहेलेशन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें (3%) अपशिष्ट गैस अपमार्जन के साथ. वापसी सजगता का आकलन करके पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करें। कोई आंदोलनों प्रकाश में लाया जाता है पुष्टि करने के लिए पीछे के बाएँ चुटकी, पलटा प्रतिक्रियाओं के नुकसान का संकेत. गहरी संज्ञाहरण हासिल करने के बाद, decapitation द्वारा जानवर euthanize.
नोट: Isoflurane चिकनी मांसपेशियों के फैलाव का कारण बन सकता है. इसलिए, प्रजनन पथ की तैयारी को पूर्व विवो प्रयोगों की शुरुआत से पहले कम से कम 15-30 मिनट के लिए क्रेब्स बफर में बड़े पैमाने पर धोया और इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। Isoflurane जलन और परेशानी का कारण हो सकता है जब यह त्वचा के साथ संपर्क में है, तो सावधानी के साथ आगे बढ़ना. - एक बड़े वजन नाव एक कागज तौलिया के साथ लाइन में खड़ा पर शरीर प्लेस.
नोट: गर्भवती महिला प्रयोगशाला कर्मियों isoflurane के साथ प्रयोगों में शामिल नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह भ्रूण वजन कम कर सकते हैं, भ्रूण कंकाल osification कम, और सहज गर्भपात के जोखिम में वृद्धि8,9. सीओ2 साँस लेना चूहों इच्छामृत्यु के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. एस्ट्रोस साइकिल स्टेज का निर्धारण
- छोटे संदंश के साथ, योनि ओस्टियम तक पहुंच प्राप्त करने के लिए भगशेफ को उठाएं और धीरे-धीरे योनि में डीपीबीएस के 10 डिग्री सेल्सियस युक्त माइक्रोपिपेट टिप डालें।
- सुनिश्चित करें कि योनि दीवार को puncturing से बचने के लिए माइक्रोपिपेट टिप को ऑस्टियम के माध्यम से 10 - 30 डिग्री के कोण पर डाला जाता है। तरल अभी भी प्रविष्टि के बाद टिप में दिखाई देना चाहिए. यदि तरल दिखाई नहीं देता है, टिप बहुत दूर योनि में डाला गया था, और योनि के पैरासर्विक क्षेत्र छिद्रित किया गया हो सकता है.
- हल्के micropipette की नोक के साथ योनि ऑस्टियम की मांसपेशियों पर नीचे खींच हवा योनि से बाहर निकलने के लिए अनुमति देने के लिए.
- धीरे-धीरे डीपीबीएस के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ 2-3 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा योनि गुहा को फ्लश करें और तैयार सेल निलंबन को कांच की स्लाइड पर रखें।
- साइटोलॉजिक विश्लेषण के माध्यम से ज्वारचक्र अवस्था का निर्धारण करने के लिए एक उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इस प्रक्रिया को कहीं और10,11के अनुसार किया जाता है . सुनिश्चित करें कि कोशिका निलंबन साइटोलॉजिक विश्लेषण किए जाने से पहले सूख नहीं जाता है। यदि आवश्यक हो तो निलंबन को ताजा डीपीएस के साथ पतला किया जा सकता है।
4. माउस प्रजनन ट्रैक्ट डिसेक्शन
- माउस को एक सुपाच्य स्थिति में व्यवस्थित करें और अपने हिस्सों को फैलाएं ताकि एबडोमिनोपेलविक क्षेत्र को बेनकाब किया जा सके।
- एब्डोमिनोपेलविक क्षेत्र को गीला और कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
- संदंश का उपयोग करना, ध्यान से भगशेफ से बेहतर स्थित त्वचा उठा. निचले उदर क्षेत्र के पार्श्व पहलुओं पर छोटे अनुप्रस्थ चीरों को ऊपरी बाह्य भागतक बनाकर उपवाक्य का पर्दाफाश करना (चित्र 1क)। इस प्रक्रिया के दौरान, एक बाहरी फ्लैप बन जाएगा। के रूप में छोटे चीरों लगातार बना रहे हैं, फ्लैप आकार में वृद्धि होगी.
- जठरांत्र संबंधी मार्ग का पर्दाफाश करने के लिए peritoneum के माध्यम से सावधानी से कटौती (चित्र 1बी)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि गर्भाशय सींग अक्सर सीधे peritoneum के नीचे स्थित हो सकते हैं, इसलिए सावधानी से चीरे बनाते हैं और सींगों को स्पर्श नहीं करते हैं क्योंकि यह गर्भाशय की गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है।
- संदंश का उपयोग करना, जठरांत्र संबंधी मार्ग को कवर करने वाले फासिया और वसा ऊतक को हटा दें। पेट की गुहा से निम्नलिखित जठरांत्र संबंधी मार्ग खंडों को निकालें: ग्रहणी, जेजुनम, इलेयम, सीकम, आरोही और अनुप्रस्थ बृहदान्त्र (चित्र 1C)।
- प्रजनन अंगों का पता लगाने के लिए, पहले मूत्राशय की पहचान करें (चित्र 1ब्यूर , "4"), जो इच्छामृत्यु के बाद शून्य होने के कारण एक खराब उपस्थिति हो सकती है। योनि मूत्राशय के नीचे सही हो जाएगा.
- जघन हड्डियों के संगम पर जघन सिम्फिसिस का पता लगाएँ (मूत्राशय के लिए)।
- कैंची का उपयोग करना, ध्यान से interpubic फाइब्रोकार्टिलाजिनस ऊतक के माध्यम से अपने पार्श्व पक्षों पर चीरों बनाने के द्वारा जघन symphysis को हटाने के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए और योनि निष्कर्षण के लिए एक मार्ग प्रदान (चित्र 1डी) .
- योनी और योनी के निचले हिस्से के बीच स्थित मूलाक्रम के माध्यम से कट.
- संदंश का उपयोग करना, योनि उठा और धीरे-धीरे मलाशय उत्पाद.
- दो गर्भाशय सींग ों की पहचान करें जो एक कांटा में विभाजित करते हैं, योनि के लिए रोस्टली। प्रत्येक सींग के अंत में एक जटिल अंडाणु और अंडाशय का पता लगाएँ, जो शेष जठरांत्र संबंधी मार्ग क्षेत्रों के नीचे छिपा हो सकता है। पेट की गुहा के भीतर सींग, अंडवाहिनी, और अंडाशय से कनेक्ट होने वाले किसी भी स्नायुबंधन को हटाने के लिए छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
- प्रजनन पथ निकालें, जिसमें पेट की गुहा से योनि, गर्भाशय, अंडवाहिनी और अंडाशय शामिल हैं।
- अलग-अलग प्रजनन पथ (चित्र 1ई) को 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें डी पी बी एस के 10 एमएल से भरा हुआ है। मायोमेट्रियम को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए गर्भाशय के सींगों को संपीड़ित न करें।
- गर्भाशय सींग और योनि के आसपास किसी भी संयोजी और वसा ऊतक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जघन क्षेत्र है कि छवि की गुणवत्ता में बाधा सकता है में किसी भी फर को दूर करने के लिए संदंश और शल्य कैंची का प्रयोग करें। गर्भाशय सींग की गतिशीलता की अनुमति देने के लिए व्यापक स्नायु निकालें।
- दो बार ताजा DPBS के साथ अलग प्रजनन पथ धो लें और यह एक 35 मिमी पेट्री dish में स्थानांतरित ऑक्सीजनयुक्त Krebs समाधान के 3 एमएल से भरा.
5. ऊतक इमेजिंग
- पेट्री डिश रखें जिसमें प्रजनन पथ को एक काली सतह पर ऑक्सीजनयुक्त क्रेब्स बफर में रखें। कमरे के तापमान पर पकवान बनाए रखें।
नोट: यह 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक को बनाए रखने के लिए एक अवरक्त वार्मिंग पैड का उपयोग करने के लिए संभव है। - सहज संकुचन के लिए 15-30 मिनट की अनुमति दें शुरू करने के लिए. डिजिटल वीडियो उपकरण के किसी भी प्रकार का उपयोग कर एक अक्षीय विमान से 10 मिनट के लिए सहज गर्भाशय गतिशीलता रिकॉर्ड।
- एक परीक्षण यौगिक के साथ पूरक oxygenated Krebs बफर युक्त एक पेट्री डिश में तैयारी स्थानांतरण. डिजिटल वीडियो उपकरण के किसी भी प्रकार का उपयोग कर एक अक्षीय विमान से लगभग 10 मिनट के लिए सहज गर्भाशय गतिशीलता रिकॉर्ड।
- उपचार की प्रतिक्रमणता का आकलन करने के लिए डीबीएस के 10 एमएल के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में पूरे प्रजनन पथ को धोएं।
- ताजा oxygenated Krebs बफर के साथ एक पेट्री डिश में तैयारी स्थानांतरण. डिजिटल वीडियो उपकरण के किसी भी प्रकार का उपयोग कर एक अक्षीय विमान से लगभग 10 मिनट के लिए सहज गर्भाशय गतिशीलता रिकॉर्ड।
- एक और 35 मिमी पेट्री डिश oxygenated Krebs बफर के साथ भरा करने के लिए तैयारी स्थानांतरण परीक्षण यौगिक के लिए वाहन के साथ पूरक सुनिश्चित करें कि सहज गर्भाशय गतिशीलता में कोई यंत्रवत् प्रेरित परिवर्तन कर रहे हैं. यह एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है।
- वीडियो फुटेज को कंप्यूटर हार्ड ड्राइव पर स्थानांतरित करें.
6. डेटा विश्लेषण
- नियंत्रण, उपचार, और धोने एपिसोड युक्त मूल वीडियो फुटेज से किसी भी वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर क्लिप बनाओ.
- सहज गर्भाशय गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए MATLAB सॉफ्टवेयर और प्रदान की गई स्क्रिप्ट (ऑनलाइन पूरक सामग्री देखें) का उपयोग करें।
नोट: कंप्यूटर विजन Toolbox ऐड-ऑन MATLAB के लिए स्क्रिप्ट पूरी तरह कार्यात्मक होने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए।- MATLAB स्क्रिप्ट खोलें, संपादक टैब पर जाएँ, और चलाएँक्लिक करें.
- पहली वीडियो फ़ाइल का चयन करें और खोलेंक्लिक करें.
- पॉप-अप संवाद बॉक्स में वीडियो फ़ाइल के लिए कोई लेबल दर्ज करें और ठीकक्लिक करें.
- सींग आंदोलन की दर की गणना के लिए आवश्यक समय अंतराल (ओं) दर्ज करें ([यूक्लिडीय दूरी ]s).
- वीडियो के पहले फ़्रेम पर दो बिंदुओं का चयन करने के लिए माउस कर्सर का उपयोग करें. एक पॉप-अप विंडो यह पुष्टि करने के लिए पूछेगी कि चयनित बिंदुओं का उपयोग ट्रैकिंग के लिए किया जाना चाहिए. पॉप-अप विंडो में प्रदर्शित की जाने वाली रीयल-टाइम ट्रैकिंग प्रक्रिया प्रारंभ करने के लिए क्लिक करें. वैकल्पिक रूप से, दो बिंदुओं का चयन करने के लिए बिंदु पुन: चयन करें क्लिक करें.
- पॉप-अप विंडो पर ट्रैकिंग प्रक्रिया की सटीकता की निगरानी करें।
- एक नई पॉप-अप विंडो में एक दर बनाम समय तितर बितर साजिश और दूरी बनाम समय तितर बितर साजिश का निरीक्षण करें। फ़ाइल का चयन करके दो आंकड़े सहेजें ] डेटा दस्तावेज़ करने के लिए समान विंडो में इस रूप में सहेजें.
- PointTrackerDataनाम का एक फ़ोल्डर खोजें, स्वचालित रूप से MATLAB द्वारा बनाई गई, एक ही निर्देशिका में जहां MATLAB स्क्रिप्ट स्थित है। दो अलग कार्यपत्रक टैब में वीडियो से एकत्रित डेटा बिंदुओं वाले लेबल-डेटा नामक Excel फ़ाइल की पहचान करें.
नोट: किसी भी वैकल्पिक गति ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर सहज गर्भाशय गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए किसी उपयुक्त सॉफ़्टवेयर (उदा., Excel या सिग्माPlot 13) का उपयोग करें.
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Representative Results
चित्र 1 इस प्रोटोकॉल में वर्णित संपूर्ण प्रजनन पथ पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान ली गई प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है. फर के साथ बफर contaminating से बचने के लिए, जो वीडियो की गुणवत्ता में कमी होगी, हम 70% इथेनॉल के साथ माउस शरीर गीला. प्रोटोकॉल के विच्छेदन अनुभाग के लिए प्रमुख बेंचमार्क मूत्राशय को खोजने के लिए है। गर्भाशय और योनि मूत्राशय से कम स्थित होगा।
प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए, हमने पूरे प्रजनन पथ को एपिनेफ्रिन के साथ व्यवहार किया। एपिनेफ्रिन गर्भाशय चिकनी मांसपेशियों में छूट पैदा करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। यह हार्मोन अंतर्जात अधिवृक्क मेडुला में उत्पादित है और स्तनधारियों में एक तनाव हार्मोन के रूप में कार्य करता है. हमने अपने प्रयोगों में 1 डिग्री एम एपिनेफ्रिन का उपयोग किया। यह एक संतृप्त एकाग्रता है जो अधिक से अधिक प्रतिक्रिया12के कारण ज्ञात होती है। चार प्रयोगों की एक श्रृंखला प्रदर्शन किया गया. सभी परीक्षणों में, 1 डिग्री एम एपिनेफ्रिन उत्क्रमणीय रूप से स्वतः ही गर्भाशय गतिशीलता को बाधित करता है (चित्र 2)।
प्रजनन पथ की सहज गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने एक एल्गोरिथ्म तैयार किया है जो हमें माउस प्रजनन पथ पर दो चयनित बिंदुओं के बीच यूक्लिडियन दूरी में परिवर्तन की औसत दर का आकलन करने की अनुमति देता है। बिंदु पदों MATLAB सॉफ्टवेयर की गति ट्रैकिंग मॉड्यूल का उपयोग कर ट्रैक कर रहे हैं. MATLAB के लिए इसी स्क्रिप्ट, जो हम यूक्लिडीय दूरी की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया, पूरक सामग्री ऑनलाइन में प्रदान की जाती है. अंक की स्थिति एक सफल गति ट्रैकिंग प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है. सावधानी से विचार वीडियो की गुणवत्ता के विषय में लिया जाना चाहिए क्योंकि पेट्री डिश की दीवार से प्रकाश प्रतिबिंब गति ट्रैकर विचलित हो सकता है, और यह सींग आंदोलन पर नज़र रखने बंद हो सकता है, जबकि फिर से प्रकाश में से एक को बात असाइन प्रतिबिंब. हम एक सींग के बीच में अंक में से एक जगह करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह पेट्री डिश दीवार प्रतिबिंब से काफी दूर था चुना. दूसरा बिंदु आमतौर पर योनि पर चुना गया था क्योंकि यह सहज गतिशीलता का प्रदर्शन नहीं किया था. चित्र 3 डेटा विश्लेषण का एक नमूना प्रदान करता है, और पूरक चित्र 1 गति ट्रैकिंग के दौरान प्राप्त प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है.
चित्र 1 : पूरे प्रजनन पथ अलगाव के कदम. ((ए) त्वचा में एक चीरा बनाया गया था और abdominopelvic क्षेत्र peritoneum (1 ) के ऊपर उजागर किया गया था. (ख) सीरस झिल्ली धीरे धीरे जठरांत्र संबंधी मार्ग का पर्दाफाश करने के लिए खोला गया था (2). (ग) गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट गर्भाशय के सींगों को उजागर करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है (3 ) मूत्राशय (4) सींग के संयोजन के पास कल्पना की जा सकती है. (घ) गर्भाशय के सींगों को मुक्त कर दिया गया है और योनि को उजागर करने के लिए जघन सिम्फिसिस (5) के पार्श्व पक्षों पर कटौती की गई है (6 ) (ई) अलग-अलग प्रजनन पथ और डी पीएसबी समाधान में स्थान को हटाना। किसी भी अतिरिक्त फर या संयोजी ऊतक हटा दिया गया था. (च) मलाशय को हटाने के बाद योनि (दाएं) पर एक गहरी इंडेंटेशन देखा जा सकता है (बाएं, 7) । (जी) आस-पास के संयोजी ऊतक को हटा दिया जाता है। एक डिजिटल कैमरा और अनुप्रयोग सुइट सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.7.0) विच्छेदन के दौरान वास्तविक समय छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (कैमरा सेटिंग: रंग 20/ कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : पूरे अलग प्रजनन पथ के साथ एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है. छवियों से पहले 15 s अलग लिया गया (ए), के दौरान (बी), और बाद (सी) 1 डिग्री एम एपिनेफ्रिन के आवेदन . प्रजनन पथ की तैयारी में एपिनेफ्रिन की अनुपस्थिति में पैनल ए और सी में उच्च गतिशीलता का प्रदर्शन किया गया, लेकिन यह पैनल बी में 1 डिग्री सेल्सियस एपिनेफ्रिन की उपस्थिति के साथ शांत है। अप्रकाशित वीडियो फुटेज पूरक वीडियो 1-3के रूप में प्रदान की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : पूर्व vivo प्रयोग में डेटा विश्लेषण में वर्णित चित्र 2| (क) यूक्लिडीय दूरी परिवर्तन दर का एक समय पाठ्यक्रम दिखाया गया है। संदर्भ बिंदु जिसके बीच दूरी सहज गर्भाशय गतिशीलता के दौरान निर्धारित किया गया था इनसेट में हरे रंग के डॉट्स के रूप में दिखाया गया है। अंक योनि के निकट भाग और चित्रित के रूप में एक गर्भाशय सींग के मध्य खंड में चुना गया. नीले भरे हलकों एपिनेफ्रिन जोड़ने से पहले सहज गतिशीलता दर मूल्यों को दिखाने के लिए, लाल हलकों 1 $M epinephrine की उपस्थिति में सहज गतिशीलता दर दिखाने के लिए, और हरे भरे हलकों एक washout के बाद सहज गतिशीलता दर दिखा। (ख) एपिनेफ्रिन (नीले बार) के अलावा, 1 डिग्री एम एपिनेफ्रिन (लाल पट्टी) की उपस्थिति में और वॉशआउट (ग्रीन बार) के बाद एवरेज यूक्लिडियन दूरी परिवर्तन दरों (पिक्सेल/एस) की तुलना। MATLAB सॉफ्टवेयर गर्भाशय गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। [t अंतराल 5 s पर सेट किया गया था. "[दूरी" प्रारंभिक फ्रेम दूरी और फ्रेम दूरी 5 s बाद के बीच अंतर के रूप में गणना की है. सांख्यिकीय विश्लेषण Kruskal-वालिस एक ही रास्ता विश्लेषण के रैंक पर भिन्नता का उपयोग कर सभी pairwise कई तुलना प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था डन की विधि के अनुसार SigmaPlot 13 का उपयोग कर. तारांकन चिह्न वह डेटा सेट इंगित करता है जो अन्य प्रयोगात्मक डेटा सेट से काफी भिन्न था (P ] lt;0.001). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फिल्म1: समय चूक वीडियो क्लिप 1 $M epinephrine जोड़ने से पहले सहज गर्भाशय गतिशीलता दिखा. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
पूरक फिल्म2: समय चूक वीडियो क्लिप सहज गर्भाशय गतिशीलता दिखा जब Krebs बफर के साथ पूरक किया गया था 1 $M epinephrine. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
पूरक फिल्म 3: समय चूक वीडियो क्लिप washout के बाद सहज गर्भाशय गतिशीलता दिखा. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
पूरक चित्र1: प्रस्ताव ट्रैकिंग के दौरान हर 15 s लिया प्रतिनिधि छवियों. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक सामग्री: MATLAB आधारित ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म स्क्रिप्ट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ, हम पूरे कृंतक प्रजनन पथ है, जो अंडाशय, oviducts, गर्भाशय सींग, और योनि भी शामिल है की सहज संकुचन का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया. हम सहज गर्भाशय गतिशीलता13पर फेनिलफ्रिन के आराम प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए एक समान विधि का इस्तेमाल किया, हालांकि, अतीत में हम डेटा की मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करने में असमर्थ थे. इस काम में, हम मात्रात्मक गतिशीलता डेटा विश्लेषण MATLAB गति ट्रैकिंग मॉड्यूल का उपयोग करने के लिए एक एल्गोरिथ्म विकसित की है. यह नई दवाओं है कि गर्भाशय संकुचन को विनियमित कि दवाओं आराम या गर्भाशय चिकनी मांसपेशियों को संकुचित की परवाह किए बिना परीक्षण के लिए एक उपयोगी तकनीक है. इस मॉडल का एक प्रमुख लाभ यह है कि प्रजनन पथ बरकरार है, सभी आंतरिक इंट्रायूटरिन सेलुलर बातचीत के संरक्षण. विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है. गर्भाशय अलगाव एक सरल आवर्धक कांच के साथ किया जा सकता है और किसी भी परिष्कृत वीडियो रिकॉर्डिंग उपकरण के लिए कोई आवश्यकता नहीं है। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिजिटल कैमरा इमेजिंग के लिए उपलब्ध नहीं है, तो एक व्यक्तिगत मोबाइल फोन कैमरा एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रजनन पथ गतिशीलता का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्य गर्भाशय ऊतक प्राप्त करने के लिए है। गर्भाशय सींग के भीतर मायोमेट्रियम, प्रजनन पथ का गतिशील तत्व है। इसलिए, अलगाव के दौरान यह overstretching या सींग compressing से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि गर्भाशय ऊतक गर्भाशय गतिशीलता बनाए रखने के लिए प्रयोग के दौरान अच्छी तरह से oxygenated है। गर्भाशय सींग के लिए किसी भी क्षति को रोकने के लिए सबसे अच्छा तरीका गर्भाशय की सफाई या प्रजनन पथ चलती है, जबकि केवल आसन्न संयोजी ऊतक के साथ संपर्क बनाने के लिए है। चूंकि योनि प्रयोग के दौरान स्वतः अनुबंध नहीं करती है, इसलिए प्रजनन पथ को एक डिश से दूसरे में ले जाते समय इसे संदंश के साथ संपीड़ित करना स्वीकार्य है। संपूर्ण प्रजनन पथ प्रयोग आइसोमेट्रिक तनाव रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन के रूप में किए जा सकते हैं जो प्रीलोड और/या ऑक्सीटोसिन प्रेरित गर्भाशय संकुचन का आकलन करते हैं। हालांकि, एक तार मायोग्राफ उपकरण है कि हमेशा एक आम प्रयोगशाला वातावरण में उपलब्ध नहीं है की एक महंगी टुकड़ा है.
वर्णित विधि में कई सीमाएँ हैं. चूंकि मायोमेट्रियम संपीड़न या पुल के प्रति बहुत संवेदनशील होता है, यह प्रजनन पथ की विच्छेदन प्रक्रिया को जटिल बनाता है। यदि विच्छेदन के दौरान सींग क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, तो कोई सहज संकुचन नहीं मनाया जाएगा। यह प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा है क्योंकि यह अनिश्चित है कि क्या ठेला चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं अनजाने में उचित देखभाल और सावधानी के उपयोग के बावजूद क्षतिग्रस्त हो गया था या कि क्या वे एक प्राकृतिक कारण के कारण गतिशीलता की कमी है. वास्तव में, हम इस अध्ययन में प्रजनन पथ की तैयारी के 10-20% में कोई गतिशीलता मनाया. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रजनन पथ का योनि खंड बरकरार रहता है क्योंकि योनि को हटाने से गर्भाशय के सींगों की सहज गतिशीलता कम हो जाती है। इसके विपरीत, अंडाशय और/या अंडवाहिनी की अनुपस्थिति पूरे प्रजनन पथ गतिशीलता को बाधित नहीं करती है। इसके अलावा, एक ध्यान दें कि कुछ यौगिकों ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील हैं चाहिए. उदाहरण के लिए, एपिनेफ्रिन को आसानी से ऑक्सीकरण किया जा सकता है। ऐसे यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अत्यधिक ऑक्सीकरण को रोकने के लिए कम ऊष्मायन समय की आवश्यकता होगी। हालांकि, कम ऊष्मायन समय गर्भाशय की दीवार की मोटाई को कुशलतापूर्वक घुसने के लिए दवा की क्षमता में बाधा डाल सकता है। विधि की एक और सीमा सींग के 3 आयामी आंदोलनों का आकलन भी शामिल है. सींग एक 3 आयामी विमान में कर्लिंग की एक सहज प्रकृति है, जटिल विश्लेषण. इस समस्या को दूर करने के लिए, एक पेट्री डिश में Krebs बफ़र वॉल्यूम 2 एमएल करने के लिए कम हो सकता है।
हमने पाया है कि मादा चूहों के लिए इष्टतम आयु सीमा 2-5 महीने है. हमने संकेत दिया कि आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण कम गतिशीलता में परिणाम हो सकता है और अतिरिक्त washes इस isoflurane प्रेरित जटिलता को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक चूहों euthanize करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर सकते हैं. यदि विच्छेदन के दौरान मुश्किलें उत्पन्न होती हैं, तो मूत्राशय जैसे स्थलों पर ध्यान केंद्रित करने से मदद मिल सकती है। प्राप्त गतिशीलता डेटा की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हम MATLAB सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया. MATLAB में गति ट्रैकिंग के साथ प्रमुख समस्या यह थी कि ट्रैकर ठीक से सींग का पता लगाने में असमर्थ था जब वे पेट्री डिश की दीवार के पास चले गए. एडोब प्रीमियर तत्व वीडियो फुटेज क्लिप करने के लिए और वीडियो फ़ाइलों के आकार को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि यह एक उत्कृष्ट सॉफ्टवेयर पैकेज है, यह हमेशा एक ठेठ प्रयोगशाला सेटिंग में उपलब्ध नहीं हो सकता है. एक वैकल्पिक विकल्प ImageJ सॉफ्टवेयर या समान अंतराल के साथ लिया छवियों की भी सरल मैनुअल मूल्यांकन के मुक्त गति ट्रैकिंग मॉड्यूल का उपयोग करें और एक विभाजन ग्रिड पर गर्भाशय सींग की स्थिति की तुलना करने के लिए हो सकता है. चित्र 2 सहज गर्भाशय गतिशीलता के सरल मूल्यांकन का एक उदाहरण से पता चलता है और एक 15 के अंतराल के भीतर प्रजनन पथ आंदोलनों की तुलना भी शामिल है.
पेट्री डिश सेटिंग में गर्भाशय गतिशीलता का आकलन करने वाली अब तक कोई सरल विधि सूचित नहीं की गई है। अल्ट्रासाउंड और इंट्रायूटरिन दबाव सेंसर का उपयोग मानव गर्भाशय अनुबंध की निगरानी के लिए किया जा सकताहै 14. हालांकि, बरकरार मानव गर्भाशय में अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करना मुश्किल है। इसलिए, सहज गर्भाशय संकुचन की जांच के लिए पशु मॉडल का उपयोग महत्वपूर्ण है। मादा प्रजनन पथ सहज मायोमेट्रियल संकुचन दर्शाती है जो एक महिला की भलाई के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें उसकी प्रजनन क्षमता और श्रम15शामिल हैं। इन संकुचन एक अल्ट्रासाउंड परीक्षा के दौरान एंडोमेट्रियल तरंगों के रूप में कल्पना की जा सकती है। हालांकि, मासिक धर्म के दौरान, गर्भाशय की अधिक संकुचन असुविधा पैदा कर सकती है और डिस्मेनोरिया, या मासिक धर्म ऐंठन का कारण बन सकती है। डिस्मेनोरिया के कुछ लक्षणों को दूर करने में मदद करने के लिए, गर्भाशय चिकनी मांसपेशियों को आराम करने के लिए लक्षित नई दवाओं की आवश्यकता है। हमारी सरल विधि गर्भाशय अनुबंध पर विभिन्न यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है।
इस अध्ययन में, हमने अलग-थलग माउस प्रजनन पथ के सहज गर्भाशय गतिशीलता को रोकने के लिए एपिनेफ्रिन, एक गर्भाशय रिलैक्सेंट हार्मोन12की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए अपने आसान पेट्री डिश मॉडल का उपयोग किया। हमारी विधि भी ऐसे यौगिकों कि गर्भाशय की संकुचन में वृद्धि हो सकती है परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात, इस विधि एक छह अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप का उपयोग कर थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए उन्नत किया जा करने की क्षमता हो सकती है. इस प्रकार, विधि हम यहाँ मौजूद औद्योगिक पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं के लिए अनुकूलित किया जा करने की क्षमता हो सकती है. हम बड़े कृन्तकों में इसी तरह के प्रयोगों प्रदर्शन करने का प्रयास नहीं किया, लेकिन हम उम्मीद करते हैं कि इसी तरह सहज गतिशीलता अलग चूहे गर्भाशय में मौजूद हो जाएगा. चूहों के बड़े प्रजनन पथ अधिक स्पष्ट गर्भाशय गतिशीलता प्रदर्शित कर सकते हैं. हमने पाया है कि गर्भवती माउस यूटेरी भी इस पूर्व vivo गर्भाशय गतिशीलता पेट्री डिश मॉडल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. जैसा कि उम्मीद थी, गर्भवती गर्भाशय की सहज गतिशीलता कम हो गई थी क्योंकि यह एक शांत अवस्था में है। हालांकि, भ्रूण के ऊतकों द्वारा जोड़ा वजन में वृद्धि भी गतिशीलता बाधा के लिए योगदान कर सकते हैं. यह अभी भी आगे गर्भावस्था और श्रम के संदर्भ में tocolytic (आराम) या uterotonic (उत्तेजक) यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस पूरे प्रजनन पथ मॉडल की उपयुक्तता का पता लगाने के लिए फायदेमंद हो सकता है. इस प्रकार, यहाँ हम बरकरार प्रजनन पथ की सहज गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक आसान पूर्व vivo मॉडल प्रस्तुत किया. इस दृष्टिकोण दवा स्क्रीनिंग के लिए अपनाया जा सकता है और उपन्यास दवा की खोज के लिए उपयोग किया जा.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम आंतरिक आईयू फंड द्वारा समर्थित किया गया था। AGO अध्ययन की कल्पना की. XC और AGO वर्णित प्रयोगों के डिजाइन में शामिल थे. FL और AGO विश्लेषण और डेटा की व्याख्या की. KLL, JOB, FL ने सभी पूर्व विवो प्रयोगों का प्रदर्शन किया। FL MATLAB स्क्रिप्ट लिखी थी। KLL, JOB, और AGO पांडुलिपि लिखा था. सभी लेखकों को पढ़ने और पांडुलिपि के अंतिम संस्करण को मंजूरी दे दी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
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