Summary
התכווצויות הרחם חשובים לרווחתם של הנקבות. עם זאת, באופן פתולוגי הגדילה הפתולוגית עלולה לגרום לדיסנוריאה, במיוחד לנשים צעירות. כאן, אנו מתארים הכנה vivo ex פשוטה המאפשרת הערכה מהירה של היעילות של מרפה שרירים חלקה שניתן להשתמש בהם לטיפול בדינוריאה.
Abstract
דימננוריאה, או התכווצויות כואבות, הוא הסימפטום השכיח ביותר הקשורים מיעוט בנקבות וחומרת שלה יכול להפריע חיי היומיום של נשים. כאן, אנו מציגים שיטה קלה וזולה שתהיה אינסטרומנטלית לבדיקת תרופות חדשות היורדת מתגובת הרחם. שיטה זו מנצלת את היכולת הייחודית של מערכת הרבייה של העכבר כולו כדי להפגין תנועתיות ספונטנית כאשר מתוחזק לשעבר vivo בצלחת פטרי המכילה מאגר קרבס מחמצן. התנועתיות הספונטנית הזאת דומה לפעילות הניסיונית של הרחם האנושי, המכונה גלי רירית-רחם. כדי להדגים את יעילות השיטה, העסקנו סם להרפיית רחם מוכר, אפינפרין. אנו מדגימים כי התנועתיות הספונטנית של מערכת הרבייה של העכבר כולו יכולה להיות מהירה והפיך מעכבות על ידי 1 μM אדרנלין במודל זה פטרי צלחת. תיעוד שינויי תנועתיות הרחם ניתן לבצע בקלות באמצעות טלפון חכם רגיל או מצלמה דיגיטלית מתוחכמת. פיתחנו אלגוריתם מבוסס MATLAB המאפשר מעקב תנועה לכמת שינויי תנועתיות הרחם ספונטנית על ידי מדידת שיעור של תנועות קרן הרחם. היתרון העיקרי של גישה זו vivo ex היא כי מערכת הרבייה נשאר שלם לאורך כל הניסוי כולו, שמירה על כל אינטראקציה הסלולר הפנימית בתוך רחמי. המגבלה העיקרית של הגישה הזאת היא כי עד 10-20% של שטרן עלול להפגין תנועתיות ספונטנית. עד כה, זוהי השיטה הvivo לשעבר הכמותית הראשונה להערכת תנועתיות הרחם הספונטנית במודל צלחת פטרי.
Introduction
כאיבר הנשי העיקרי, הרחם הוא חיוני לרבייה וחיוני להזנה של העובר1. הרחם מורכב משלוש שכבות: הפריטרינום, myometrium ו רירית. Myometrium הוא שכבת הקונקטילה הגדולה של הרחם וממלא תפקיד מפתח במסירה העובר. רירית הרחם היא השכבה הפנימית ביותר בטנה חלל רחמי והוא חיוני עבור השתלת העובר. בנשים שאינן בהריון של גיל הרבייה, שכבת רירית הרחם היא לשפוך חודשי בתחילת מחזור המחזור. Myometrium מסייע בתהליך זה לשפוך על ידי שמירה על התכווצויות myomeמשפטו ספונטנית הדרושים לניקוי רקמת רירית הרחם נמק מהרחם1.
למרבה הצער, הגדילה הגוברת של משפט העצמי עלולה לגרום לתופעות לוואי שליליות כגון דינוריאה, או כאבי וסת כואבים. הדבר נראה במיוחד אצל נשים צעירות וביטול נשים מפרנות2. עם זאת, הדברת שונה עבור כל אישה תלוי בחוזק של הצירים myometrial שלהם; התכווצויות חזק יותר משויכים לעתים קרובות עם התחושה של התכווצויות חמורות3. שימוש באולטרסאונד של הרחם יכול להיות מזוהה בדרך כלל כגלים של רירית הרחם. שחרור משופר של פרוסטגלנדינים במהלך הווסת4 ברחם שעברו sl, רירית הרחם הוא האמין לתרום להגדלת מבחן היתר משפט, וכתוצאה מכך איסכמיה ו היפוקסיה של שריר הרחם וכך גדל . כאב3
חוסר מעשה חמור יכול לעכב את הפעילות היום יומית של נשים מסוימות ו 3 כדי 33% של נשים יש כאב חמור מאוד, אשר יכול לגרום לאישה להיות מרותק למיטה עבור 1 עד 3 ימים כל מחזור הווסת5. דימננוריאה היא הגורם המוביל לתחלואה גינקולוגית בנשים בגיל הרבייה, ללא קשר לגיל, ללאום ולמעמד הכלכלי5. השכיחות המשוערת של חוסר הדברת הוא גבוה ומשתנה, החל מ 45% עד 93% אצל נשים בגיל הרבייה5. דימננוריאה-כאבים משויכים יש השפעה על חיי היומיום של נשים עלול לגרום לביצועים אקדמיים עניים אצל מתבגרים, איכות נמוכה יותר של שינה, הגבלה של פעילויות יומיומיות, ואת מצב הרוח משתנה5.
הרבה נשים שחווים האתר מהווה מקום לטיפול בתרופות מנוגדות לדלפק כדי להקל על כאבם. תרופות כאלה מעל לדלפק מכילות מעכבי ציקלוחמצן (קוקס) אשר מונעים היווצרות של פרוסטגלנדינים6. עם זאת, מעכבי קוקס קשורים לאירועים וכלי דם לוואי, ועל כ -18% מהנשים עם הדידון אינם מגיבים למעכבי האלה7. לכן, יש צורך בתרופות חדשות כדי להפחית את התכווצויות הווסת. כיוון שמעל הרחם תורם לפתוגנזה של הדינוריאה, אסטרטגיה אפשרית אחת יכולה להיות השימוש בהרפיית הרחם.
מועיל לכמת את ההשפעות של תרופות מרפה פוטנציאלי במודל של באופן טבעי המתרחשים הצירים myometrial שפט ספונטנית כמו גל. עם זאת, עד כה, לא יעיל vivo שיטה לשעבר לבדיקת תרופות מרגיעות שרירים ברחם שלמים תוארה. כיום, מדידות מתח איזומטרי משמשות כדי להעריך את ההשפעות של תרופות להרפדלות. במהלך מדידות כאלה, רצועת שריר הרחם נשמרת באורך קבוע תחת מראש באמבט רקמה בעוד הכוח של התכווצויות שריר הרחם נרשם לפני ואחרי גירוי אוקסיטוצין בנוכחות או העדר של סם מרפה. למרות שגישה זו מועילה מאוד, היא דורשת ציוד יקר. יתר על כן, התכווצויות איזומטרי לא דומה הצירים הספונטאני הספונטנית כמו גל שמתרחשים באופן טבעי ברחם שלם. באופן ייחודי, גלי הרחם myometrial שפט במכרסמים יכול להיות מדומה כמו קרן הרחם לתנועתיות כאשר מערכת הרבייה כולה (שחלות, ההטלה, הרחם, והנרתיק) נשמרת בפתרון מאגר. כאן, אנו מציגים שיטה vivo ex לניטור התנועתיות הספונטנית של רחם העכבר ללא שינוי הממוקם בצלחת פטרי המכילה מאגר קרבס מחמצן. כמו כן, אנו מתארים אלגוריתם כימות תנועתיות ניצול מעקב MATLAB תנועה. גישה זו מספקת חלופה קלה וזולה פחות לבדיקת הפוטנציאל ההרפייתי של תרופות ותרכובות סינתטיות טבעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים עם בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה (אינדיאנפוליס, IN). 2-5 חודשים-129S-C57BL/6 עכברים בוגרים מינית שימשו במחקר.
זהירות: להבטיח בטיחות על ידי לבישת חלוק מעבדה, מסכה, וכפפות כאשר עובדים עם בעלי חיים וחומרים ביו-מסוכנים.
1. הכנה לפתרון
- הכינו את מאגר Krebs, אשר מכיל: 130 מ"מ היאl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl2, 1.2 mm נה2PO4, 0.56 mm Mgcl2, 25 מ"מ נחקו3, ו 5 מ"מ גלוקוז, pH 7.4. ברציפות חמצן מאגר Krebs עם תערובת של גזים דחוסים המכילים 5% CO2 ו 95% O2 תוך שמירה על טמפרטורת החוצץ ב 37 ° צ' באמצעות אמבטיה מים במחזור.
- הכנת מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS), אשר מכיל: 2.68 Mm kcl, 1.47 mm KH2PO4, 136.89 mm הנאקל, ו 8.1 mM Na2hpo4, pH 7.4.
2. הכנה לבעלי חיים
- שאיפת עכברים (3%) עם ניקוי הגז בפסולת. להבטיח הרדמה נאותה על ידי הערכת רפלקסים נסיגה. לצבוט את הבוהן האחורי כדי לאשר שום תנועות לא מעורר, המציין אובדן תגובות רפלקס. לאחר שההרדמה העמוקה מושגת, המתת את החיה על ידי עריפת ראשו.
הערה: איזואופלוראן עלול לגרום. להתרחבות שרירים חלקה לכן, הכנת מערכת הרבייה צריך להיות שטף בהרחבה מודבטים במאגר Krebs לפחות 15-30 דקות לפני תחילת ניסויים vivo ex. איזואופלוראן עלול לגרום לגירוי ואי נוחות כאשר הוא במגע עם העור, לכן המשיכו בזהירות. - מניחים את הגוף על סירת שקילה גדולה מרופדת במגבת נייר.
הערה: אנשי המעבדה לנשים בהריון לא צריך להיות מעורב בניסויים עם isofלאנה כי זה יכול להקטין את משקל העובר, להקטין את להתקשות השלד העוברי, ולהגדיל את הסיכון של הפלה ספונטנית8, 9. שאיפת CO2 ניתן להשתמש כתחליף עכברים המתת חסד.
3. קביעת שלב המחזור האסטתי
- עם מלקחיים קטנים, להרים את הדגדגן כדי לקבל גישה ostium הנרתיק לאט להוסיף טיפ מיקרופיפטה המכיל 10 μL של DPBS לתוך הנרתיק.
- ודא שתיאור המיקרופיפטה מוכנס דרך האוסטינום בזווית של 10-30 °, כדי להימנע מלחדור את קיר הנרתיק. הנוזל עדיין צריך להיות גלוי בטיפ לאחר הכניסה. אם הנוזל אינו נראה לעין, הטיפ הוכנס רחוק מדי לתוך הנרתיק, והאזור הפאראפראני של הנרתיק עשוי להיות מחורר.
- משוך בקלילות על השרירים הוואסטסיים הנרתיק עם קצה המיקרופיפטה כדי לאפשר לאוויר לצאת מהנרתיק.
- לאט לשטוף את חלל הנרתיק על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2-3 פעמים עם 10 μL של DPBS ולמקם את ההשעיה התא צייר על שקופית זכוכית.
- השתמש במיקרוסקופ בניגוד לשלב ההפוך כדי לקבוע את שלב המחזור האסטרולוגי באמצעות ניתוח ציטוג'יק. ההליך מתבצע כמתואר במקום אחר10,11. ודא שההשעיה של התא אינה יבשה לפני שניתן לבצע ניתוח ציטולוגי. ההשעיה עשויה להיות מדולל עם DPBS טרי, במידת הצורך.
4. העכבר בדרכי הרבייה ניתוח
- לסדר את העכבר במצב פרקדן ולפזר את הגפיים שלו כדי לחשוף את האזור הבטן האטימות.
- רסס עם 70% אתנול כדי להרטיב ולחטא את אזור הבטן האופטית.
- באמצעות מלקחיים, להרים בזהירות את העור ממוקם מעולה לדגדגן. הפוך חתכים רוחבי קטנים על ההיבטים הצדדיים של אזור הבטן התחתונה, עד לגפיים העליונות כדי לחשוף את הצפק (איור 1א). במהלך תהליך זה, יופיע כנף חיצוני. כמו חתכים קטנים נעשים ללא הרף, הכנף יגדל בגודל.
- חותכים בזהירות דרך צפק לחשוף את מערכת העיכול (איור 1B). חשוב לציין כי הקרניים הרחם ניתן לעתים קרובות להיות ממוקם ישירות מתחת צפק, כך לעשות חתכים בזהירות לא לגעת קרניים כמו זה יכול להשפיע על תנועתיות הרחם.
- באמצעות מלקחיים, להסיר את fascia ואת רקמת השומן המכסה את מערכת העיכול. להסיר את הקטעים הבאים בדרכי העיכול מן חלל הבטן: התריסריון, jejunum, ileum, cecum, בסדר עולה ורוחבי המעי הגס (איור 1ג).
- כדי לאתר את איברי הרבייה, תחילה לזהות את שלפוחית השתן (איור 1C, "4"), אשר עשוי להיות מראה מנוכה בשל הבוצמה לאחר המתת חסד. . הנרתיק יהיה ממש מתחת לשלפוחית השתן
- אתר את סימטרי הערווה במפגש של עצמות הערווה (הרטבה אל שלפוחית השתן).
- באמצעות מספריים, להסיר את סימטרי הערווה על ידי בזהירות לעשות חתכים על הצדדים לרוחב שלה דרך רקמת העור הבין הערווה כדי לקבל גישה ולספק מסלול להפקת וגינה (איור 1ד).
- חותכים את הנקבים הנמצאים בין פי הטבעת לחלק התחתון של הפות.
- באמצעות מלקחיים, להרים את הנרתיק ולאט לאט בבלו את הרקטום.
- זיהוי שתי קרניים של רחם שיתקרנה לתוך מזלג, rostrally אל הנרתיק. אתרו צינור ההטלה מפותל ושחלה בסוף כל קרן, אשר עשוי להיות חבוי תחת מקטעי דרכי העיכול הנותרים. השתמש במספריים לניתוח קטן כדי להסיר את כל הרצועות המחברות ותומכות בקרניים, בהטלה ובשחלות בתוך חלל הבטן.
- הסירו את מערכת הרבייה, הכוללת את הנרתיק, הרחם, ההטלה והשחלות, מחלל הבטן.
- להעביר את מערכת הרבייה מבודדת (איור 1E) לתוך צלחת פטרי 100 Mm מלא 10 מ ל של dpbs. לא לדחוס את קרני הרחם כדי למנוע נזק myometrium.
- השתמש מלקחיים ומספריים כירורגיים כדי להסיר כל החיבור והאדיפוז מסביב קרני הרחם והנרתיק, כמו גם כל פרווה באזור הערווה שיכול לעכב את איכות התמונה. הסר את הרצועה הרחבה כדי לאפשר תנועתיות של קרני הרחם.
- לשטוף את מערכת הרבייה מבודדת עם DPBS טרי פעמיים ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ מלא 3 מ ל של פתרון קרבס מחמצן.
5. רקמת הדמיה
- מניחים את צלחת פטרי המכילה את מערכת הרבייה במאגר קרבס מחמצן על משטח שחור. שמרו על המנה בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן להשתמש במשטח מחמם אינפרא אדום כדי לשמור על הרקמה ב 37 ° c. - אפשר 15-30 מינימום עבור התכווצויות ספונטניות להתחיל. הקלטת תנועתיות רחם ספונטנית במשך 10 דקות ממישור צירית באמצעות כל סוג של ציוד וידאו דיגיטלי.
- העברת ההכנה לצלחת פטרי המכילה את מאגר קרבס החמצון בתוספת מתחם ניסוי. הקלטת תנועתיות רחם ספונטנית במשך כ -10 דקות ממישור צירית באמצעות כל סוג של ציוד וידאו דיגיטלי.
- רוחצים את כל מערכת הרבייה בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 10 מ ל של DPBS כדי להעריך את התהודה של הטיפול.
- העבר את ההכנה לצלחת פטרי עם מאגר קרבס טרי. הקלטת תנועתיות רחם ספונטנית במשך כ -10 דקות ממישור צירית באמצעות כל סוג של ציוד וידאו דיגיטלי.
- להעביר את ההכנה 35 מילימטר אחר צלחת פטרי מלא מאגר קרבס מחמצן בתוספת עם הרכב למתחם הבדיקה כדי להבטיח כי אין שינויים מכנית המושרה בתנועתיות הרחם הספונטנית. . זה שליטה חשובה
- העבר את סרטון הווידאו לכונן קשיח של מחשב.
6. ניתוח נתונים
- ליצור קליפים באמצעות כל תוכנה לעריכת וידאו מתוך קטעי וידאו המקורי המכיל את השליטה, טיפול, ולשטוף פרקים.
- השתמש בתוכנת MATLAB ובקובץ ה-script שסופק (ראה מקוון חומר משלים) כדי לכמת תנועתיות רחם ספונטנית.
הערה: ההרחבה של ארגז הכלים לראיית מחשב עבור MATLAB חייבת להיות מותקנת כדי שקובץ ה-script יהיה פונקציונלי לחלוטין.- פתח את קובץ ה-script MATLAB, עבור אל הכרטיסיה עורך ולחץ על הפעל.
- בחרו בקובץ הווידאו הראשון ולחצו על ' פתח'.
- הזינו תווית לקובץ הווידאו בתיבת הדו הנפתחת ולחצו על הלחצן ' אשר'.
- הזן את מרווחי הזמן הדרושים לחישוב קצב תנועת הקרן (מרחק Δ אוקלידית/Δs).
- השתמש בסמן העכבר כדי לבחור שתי נקודות על המסגרת הראשונה של הווידאו. חלון מוקפץ יבקש לאשר שהנקודות הנבחרות ישמשו למעקב. לחץ על התחל כדי ליזום את תהליך מעקב הזמן האמיתי שיוצג בחלון המוקפץ. לחלופין, לחץ על בחירה חוזרת של נקודות כדי לבחור משוב את שתי הנקודות.
- נטר את הדיוק של תהליך המעקב בחלון המוקפץ.
- שים לב לעומת פיזור הזמן של התוויה ומרחק לעומת פיזור זמן בחלון מוקפץ חדש. שמור את שתי הדמויות על ידי בחירת קובץ | שמירה בשם באותו חלון כדי לתעד את הנתונים.
- חפש תיקיה בשם ' הפוינטארירנתונים', שנוצרה באופן אוטומטי על-ידי MATLAB, באותה ספריה שבה ממוקם קובץ ה-SCRIPT של MATLAB. זהה קובץ Excel בשם label_Data המכיל נקודות נתונים שנאספו מהווידאו בשתי כרטיסיות גליון עבודה נפרדות.
הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנת מעקב אחר תנועה חלופית לכמת תנועתיות רחם ספונטנית.
- השתמש בתוכנה מתאימה (לדוגמה, Excel או SigmaPlot 13) כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מראה תמונות מייצגות שצולמו במהלך הליכי הבידוד של דרכי הרבייה המתוארים בפרוטוקול זה. כדי להימנע מזיהום מאגר עם פרווה, אשר יקטין את איכות הווידאו, הלחלח את גוף העכבר עם 70% אתנול. בחינת הסדר העיקרית עבור סעיף הניתוח של הפרוטוקול היא למצוא את שלפוחית השתן. הרחם והנרתיק יהיה ממוקם נחות לשלפוחית השתן.
כדי לבדוק את הפרוטוקול, הגענו. למערכת הרבייה כולה בעזרת אפינפרין אדרנלין ידוע כגורם הרפיה שרירים חלקה הרחם. הורמון זה מופק באופן שורש ליבת יותרת הכליה ומשמש הורמון הלחץ יונקים. השתמשנו ב-1 μM אפינפרין. בניסויים שלנו זהו ריכוז מכסימלי הידוע כגורם לתגובה מקסימלית12. בוצעו סדרה של ארבעה ניסויים. בכל המבחנים, 1 μM אדרנלין הפיך מעכבות באופן ספונטני לתנועתיות הרחם (איור 2).
כדי לכמת את התנועתיות הספונטנית של מערכת הרבייה, עיצבנו אלגוריתם המאפשר לנו להעריך את שיעור השינוי הממוצע במרחק האוקלידית בין שתי נקודות נבחרות על מערכת הרבייה של העכבר. מיקומי הנקודות מסומנים באמצעות מודול מעקב אחר התנועה של תוכנת MATLAB. הסקריפט המתאים לMATLAB, בו נהגנו לחשב את מרחקים אוקלידית, מסופק באופן מקוון בחומר המשלים. המיקום של נקודות הוא קריטי לפרוצדורה מוצלחת של מעקב אחר תנועה. יש לנקוט בשיקול דעת בנוגע לאיכות הסרטונים, משום שההשתקפות האור מהקיר של צלחת פטרי עלולה להסיח את הדעת של התנועה, והיא עלולה להפסיק לעקוב אחר תנועת הצופר תוך הקצאת מחדש של הנקודה לאחד האור שתקפויות. בחרתי למקם את אחת הנקודות באמצע הקרן כדי להבטיח שהיא הייתה רחוקה מספיק מההשתקפות של הקיר בצלחת פטרי. הנקודה השנייה נבחרה בדרך כלל על הנרתיק, שכן היא לא הציגה תנועתיות ספונטנית. איור 3 מספק דגימה של ניתוח נתונים, ואיור משלים 1 מציג את התמונות הייצוגיות שנרכשו במהלך מעקב אחר תנועה.
איור 1 : שלבים של בידוד כולו מערכת הרבייה. (א) חתך בעור נעשה ואזור הבטן החיצוני נחשף מעל לצפק (1). (ב) קרום נסיובי נפתח באיטיות כדי לחשוף את מערכת העיכול (2). (ג) מערכת העיכול הועברה לחשוף את קרני הרחם (3). שלפוחית השתן (4) ניתן לדמיין ליד הקישור של הקרניים. (ד) קרני הרחם שוחררו, חתכים נעשו על הצדדים לרוחב של סימטרי הערווה (5) כדי לחשוף את הנרתיק (6). (ה) הסרת מערכת הרבייה המבודדת וההשמה לפתרון dpbs. כל הפרווה או רקמת החיבור העודפים הוסרו. (ו) כניסה עמוקה ניתן לראות על הנרתיק (מימין) לאחר הסרת הרקטום (שמאל, 7). (G) רקמת החיבור שמסביב מוסרת. מצלמה דיגיטלית ותוכנה חבילת יישום (גירסה 3.7.0) שימש לרכישת תמונות בזמן אמת במהלך הניתוח (הגדרת המצלמה: גוון 20/רוויה 80). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : ניסוי מייצג עם כל מערכת הרבייה המבודדת מוצג. התמונות נלקחו 15 בנפרד לפני (א), במהלך (ב), ואחרי (ג) היישום של 1 μm אפינפרין. הכנת מערכת הרבייה הציגה לתנועתיות גבוהה פאנלים A ו-C בהעדר אפינפרין, אבל זה השקט בפאנל B עם נוכחות של 1 μM אפינפרין. קטעי וידאו לא ערוך מסופק כמו קטעי וידאו משלימים 1-3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : ניתוח נתונים בניסוי vivo ex המתואר ב איור 2. (א) מוצג קורס זמן של שיעור שינוי המרחק האוקלידי. נקודות ההתייחסות שבין המרחק נקבע במהלך תנועתיות הרחם הספונטנית מוצגות כנקודות ירוקות בכניסה. הנקודות נבחרו בחלק הקדום ביותר של הנרתיק ובקטע האמצעי של קרן הרחם כפי שתוארה. העיגולים הכחולים מציגים את ערכי התנועתיות הספונטנית לפני הוספת אפינפרין, העיגולים האדומים מראים את שיעורי התנועה הספונטניים בנוכחות של 1 μM אפינפרין, והעיגולים הירוקים המלאים מראים את קצב התנועתיות הספונטני לאחר כשלון. (ב) השוואה בין שיעורי שינוי המרחק הממוצע האוקלידית (פיקסלים/s) לפני הוספת אפינפרין (בר כחול), בנוכחות של 1 μm אפינפרין (בר אדום), ואחרי כשלון (בר ירוק). התוכנה MATLAB שימש לכמת את תנועתיות הרחם. מרווח Δt הוגדר ב-5 s. "ΔDistance" מחושב כהפרש בין מרחק המסגרת ההתחלתית לבין מרחק המסגרת 5 s מאוחר יותר. הניתוח הסטטיסטי התבצע באמצעות הניתוח של קרוקל-ווליס בדרך אחת של שונות בדרגות ואחריו כל זיווגים ושיטות השוואה מרובות בהתאם לשיטה של דאן באמצעות SigmaPlot 13. הכוכבית מציינת את ערכת הנתונים שהייתה שונה באופן משמעותי מערכות הנתונים הנסיוניות האחרות (P = < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים סרט 1: זמן-פקיעה וידאו קליפ מראה תנועתיות הרחם ספונטנית לפני הוספת 1 μm אפינפרין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
סרט משלים 2: זמן-פקיעה וידאו קליפ מציג תנועתיות הרחם ספונטנית כאשר מאגר krebs היה בתוספת עם 1 μm אפינפרין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
סרט משלים 3: זמן-פקיעה וידאו קליפ מראה לתנועתיות הרחם ספונטנית לאחר כשלון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
משלים איור 1: תמונות ייצוגית שצולמו כל 15 במהלך מעקב אחר תנועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
חומר משלים: קובץ אלגוריתם המעקב המבוסס על MATLAB. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, תיארנו שיטה להערכת כמובן ספונטני של כל מערכת הרבייה המכרסמים, הכוללת את השחלות, ההטלה, קרניים הרחם והנרתיק. השתמשנו בשיטה דומה כדי להדגים את השפעת ההרפטית של הphenylephrine על תנועתיות הרחם הספונטנית13, עם זאת, בעבר לא יכולנו לספק ניתוח כמותי של הנתונים. בעבודה זו, פיתחנו אלגוריתם לטיפול כמותי בניתוח נתונים באמצעות מודול מעקב תנועה MATLAB. זוהי טכניקה שימושית לבדיקת תרופות חדשות המווסתים התכווצויות הרחם ללא קשר אם הסמים להירגע או ליישר השרירים החלק הרחם. היתרון העיקרי של מודל זה הוא כי מערכת הרבייה היא שלמה, שמירה על כל אינטראקציה הסלולר הפנימית בתוך רחמי. בעיקר, פרוטוקול זה אינו דורש שום ציוד מיוחד. בידוד הרחם ניתן לעשות עם זכוכית מגדלת פשוטה אין דרישה עבור כל ציוד וידאו מתוחכם הקלטות. אם מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה אינה זמינה לדימות, מצלמת טלפון נייד אישית עשויה לשמש כחלופה.
הצעד הקריטי ביותר של הפרוטוקול להערכת התנועתיות בדרכי הרבייה הוא להשיג רקמת הרחם קיימא. Myometrium, בתוך קרני הרחם, הוא אלמנט מורצפת של מערכת הרבייה. לכן, בזמן הבידוד חשוב להימנע ממתיחת יתר או לדחוס את הקרניים. חשוב גם להבטיח כי רקמת הרחם היא מחמצן היטב לאורך הניסוי כדי לשמור על תנועתיות הרחם. הדרך הטובה ביותר למנוע כל נזק לקרני הרחם היא ליצור קשר עם רקמת החיבור הסמוכה בלבד תוך ניקוי הרחם או הזזת מערכת הרבייה. מאחר והנרתיק אינו חוזה באופן ספונטני במהלך הניסוי, מקובל לדחוס אותו עם מלקחיים בעת הזזת מערכת הרבייה ממנה אחת לאחרת. ניתן לבצע את כל הניסויים במערכת הרבייה בשילוב עם הקלטות מתח איזומטריות הבדקות הערכת העיכול הנגרמת מטעינת הרחם ו/או אוקסיטוצין. עם זאת, מיוגרף התיל הוא פיסת ציוד יקר שאינו זמין תמיד בסביבת מעבדה משותפת.
השיטה המתוארת כוללת מספר מגבלות. מאז myometrium רגיש מאוד לחיצות או מושך, זה מסבך את תהליך הניתוח של מערכת הרבייה. , אם הקרניים ניזוקו במהלך הניתוח. לא ניתן יהיה לצפות בשום כיתה ספונטנית זוהי הגבלה גדולה של הפרוטוקול כי זה לא ברור אם התאים השריר החלקה השרירים נפגעו ביודעין למרות השימוש בטיפול הנכון וזהירות או אם הם לא היתה לתנועתיות בשל מטרה טבעית. אכן, לא הבחנו בשום תנועתיות ב-10-20% מההכנות למערכת הרבייה במחקר זה. חשוב להבטיח כי קטע הנרתיק של מערכת הרבייה נשאר שלם משום שהסרת הנרתיק מפחיתה את התנועתיות הספונטנית של קרני הרחם. לעומת זאת, העדר השחלות ו/או ההטלה אינו מפגוע בתנועתיות מערכת הרבייה כולה. בנוסף, יש לציין כי כמה תרכובות רגישות חמצון. לדוגמה, ניתן לתחמוצת בקלות על אפינפרין. בדיקת ההשפעות של תרכובות כאלה ידרוש זמן דגירה קצר יותר מניעת חמצון מופרז. עם זאת, זמני דגירה קצרים עלול לעכב את היכולת של תרופה לחדור ביעילות את עובי של קיר הרחם. הגבלה נוספת של השיטה כוללת הערכת התנועות התלת-ממדיות של הקרניים. לקרניים יש אופי מטבעו של סלסול לתוך מטוס תלת מימדי, מסבך את הניתוח. כדי להתגבר על בעיה זו, אפשר להקטין את נפח האגירה של קרבס בצלחת פטרי ל -2 מ ל.
מצאנו שטווח הגילאים האופטימלי לעכברים נשיים הוא 2-5 חודשים. ציינו כי הרדמה עם isofהלביאן עלול לגרום לתנועתיות מופחתת ושוטף נוסף עשוי להיות נחוץ כדי למנוע את זה סיבוך של הנגרמת. לחילופין, אפשר להשתמש בפחמן דו-חמצני כדי להרדים את העכברים. אם הקשיים מופיעים במהלך הניתוח, התמקד בציוני דרך, כגון שלפוחית השתן, עשוי לעזור. כדי לכמת את נתוני התנועתיות שהושגו, השתמשנו בתוכנת MATLAB. הבעיה העיקרית עם מעקב התנועה ב MATLAB היה כי הגשש לא היה מסוגל לאתר כראוי את הקרניים כאשר הם עברו ליד הקיר של צלחת פטרי. רכיב Adobe Premier שימש לחיתוך קטעי וידאו ולהפחתת הגודל של קבצי וידאו. למרות שזוהי חבילת תוכנה יוצאת דופן, ייתכן שהוא לא תמיד יהיה זמין במסגרת מעבדה טיפוסית. אפשרות חלופית עשויה להיות להשתמש במודול מעקב תנועה חינם של התוכנה ImageJ או אפילו הערכה ידנית פשוטה של תמונות שצולמו עם מרווחי זמן זהים והשוואת המיקום של קרניים הרחם על רשת פילוח. איור 2 מציג דוגמה של הערכה פשוטה של תנועתיות הרחם הספונטנית וכולל השוואת תנועות בדרכי הרבייה בתוך מרווח של 15 דקות.
אין שיטה פשוטה להערכת תנועתיות הרחם במסגרת צלחת פטרי שדווחו עד כה. ניתן להשתמש בחיישנים לניטור. הרחם האנושי14 עם זאת, קשה לחקור את המנגנונים הבסיסיים ברחם האנושי השלם. לכן, השימוש במודלים של בעלי חיים לחקירת התכווצויות הרחם הספונטנית הוא חשוב. מערכת הרבייה הנשית מציגה התכווצויות משפט ספונטני myometrial כי הם קריטיים לרווחתם של אישה, כולל הפוריות שלה ואת העבודה15. התכווצויות אלה ניתן לדמיין כמו גלי רירית הרחם במהלך בדיקת אולטרסאונד. עם זאת, במהלך הווסת, על פני כריתת הרחם יכול ליצור אי נוחות ולגרום לחוסר הדברת, או התכווצויות הווסת. כדי לסייע להקל כמה סימפטומים של חוסר הדברת, תרופות חדשות ממוקדות השרירים החלקים מרגיע הרחם נחוצים. השיטה הפשוטה שלנו מספקת דרך להערכת ההשפעות של תרכובות שונות על כיוון הרחם.
במחקר זה, השתמשנו מודל קל צלחת פטרי שלנו כדי לאשר את האפקטיביות של אדרנלין, הורמון להרפיית הרחם12, כדי למנוע תנועתיות הרחם הספונטנית של מבודד הרבייה של העכבר. השיטה שלנו יכולה לשמש גם לבדיקת תרכובות כאלה שעשויות להגביר את כריתת הרחם. חשוב לעשות זאת, ייתכן ששיטה זו תהיה בעלת הפוטנציאל לשדרוג לסינון של העברת תרופות באמצעות תבנית של שש הצלחות. לפיכך, השיטה שאנו מציגים כאן עשויה להיות ממוטבת להליכי סינון בקנה מידה תעשייתי. לא ניסינו לבצע ניסויים דומים במכרסמים גדולים יותר, אך אנו מצפים שתנועתיות ספונטנית דומה תהיה נוכחת בידי חולדה מבודדת. מערכת הרבייה גדול יותר של חולדות עשוי להפגין תנועתיות הרחם בולטת יותר. מצאנו כי עכבר בהריון טרנאני עשוי גם להיות מוערך באמצעות זו תנועתיות הרחם vivo לשעבר מודל צלחת פטרי. כצפוי, התנועתיות הספונטנית של הרחם ההרה הופחתה משום שהיא נמצאת במצב שקט. עם זאת, משקל מוגבר שנוסף על ידי הרקמה העוברית עשוי גם לתרום לחסימת תנועתיות. זה יכול להיות עדיין מועיל לחקור עוד לבחון את ההתאמה של מודל זה כולו מערכת הרבייה כדי להעריך את ההשפעה של טוקוליטיקה (להרפאנט) או טרנאוטוניק (ממריץ) תרכובות בהקשר של הריון ועבודה. כך, כאן הצגנו מודל קל לשעבר vivo להערכת התנועתיות הספונטנית של מערכת הרבייה ללא פגע. גישה זו עשויה להיות מאומצת לסינון סמים ולהיות מנוצל לגילוי סמים הרומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על-ידי קרנות IU פנימיות. . לפני שהוא תכנן את המחקר XC ו-AGO היו מעורבים בעיצוב הניסויים המתוארים. FL ו-AGO ניתחו ופרשו את הנתונים. KLL, איוב, חליל ביצע את כל הניסויים vivo ex . חליל כתב את ה-MATLAB. . כתבתי את כתב היד כל המחברים קראו ואישרו את הגרסה הסופית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
- Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
- Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
- Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
- Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
- Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
- Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
- Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
- Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
- Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
- Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
- Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
- Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).
