Summary
Baarmoeder contracties zijn belangrijk voor het welzijn van vrouwen. Echter, pathologisch verhoogde contractiliteit kan leiden tot dysmenorroe, vooral bij jongere vrouwtjes. Hier beschrijven we een eenvoudige ex vivo voorbereiding waardoor een snelle beoordeling van de werkzaamheid van glad Spierrelaxantia die kunnen worden gebruikt voor de behandeling van dysmenorroe.
Abstract
Dysmenorroe, of pijnlijke krampen, is het meest voorkomende symptoom geassocieerd met menstruatie bij vrouwtjes en de ernst ervan kan het dagelijks leven van vrouwen belemmeren. Hier presenteren we een eenvoudige en goedkope methode die instrumentaal zou zijn voor het testen van nieuwe medicijnen die de contractiliteit van de baarmoeder verminderen. Deze methode maakt gebruik van het unieke vermogen van het hele muis voortplantingsstelsel om spontane beweeglijkheid te vertonen bij het onderhouden van ex vivo in een Petri schaaltje met zuurstofhoudende Krebs-buffer. Deze spontane beweeglijkheid lijkt op de golfachtige myometriale activiteit van de menselijke baarmoeder, aangeduid als endometriale golven. Om de effectiviteit van de methode te demonstreren, we werkten een bekende baarmoeder spierverslapper drug, adrenaline. We tonen aan dat de spontane beweeglijkheid van het hele muis voortplantingskanaal snel en omkeerbaar kan worden geremd door 1 μM epinefrine in dit Petri schaalmodel. Het documenteren van de veranderingen van de beweeglijkheid van de baarmoeder kan gemakkelijk worden gedaan met behulp van een gewone smartphone of een geavanceerde digitale camera. We ontwikkelden een op MATLAB gebaseerd algoritme dat bewegingsregistratie mogelijk maakt om spontane baarmoeder motiliteits veranderingen te kwantificeren door de snelheid van baarmoeder hoorn bewegingen te meten. Een groot voordeel van deze ex vivo-benadering is dat het voortplantingskanaal gedurende het hele experiment intact blijft, met behoud van alle intrinsieke intra-uteriene cellulaire interacties. De belangrijkste beperking van deze aanpak is dat tot 10-20% van de uteri geen spontane beweeglijkheid kan vertonen. Tot nu toe is dit de eerste kwantitatieve ex vivo -methode voor het beoordelen van de spontane baarmoeder beweeglijkheid in een Petri schaalmodel.
Introduction
Als een groot vrouwelijk orgaan is de baarmoeder cruciaal voor de voortplanting en essentieel voor de voeding van de foetus1. De baarmoeder bestaat uit drie lagen: het perimetrium, myometrium en endometrium. Het myometrium is de belangrijkste contractiele laag van de baarmoeder en speelt een sleutelrol bij de levering van foetus. Het endometrium is de binnenste laag die de baarmoederholte binnenvalt en is essentieel voor de implantatie van embryo's. Bij niet-zwangere vrouwen in de reproductieve leeftijd wordt de endometrium laag maandelijks vergoten aan het begin van de menstruatiecyclus. Het myometrium helpt bij dit afslijmingsproces door de spontane myometriale contracties te handhaven die nodig zijn voor het verwijderen van het necrotische baarmoederslijmvlies van de baarmoeder1.
Helaas, verhoogde myometriale contractiliteit kan resulteren in negatieve bijwerkingen zoals dysmenorroe, of pijnlijke menstruele krampen. Dit is vooral te zien bij jonge vrouwtjes en nullipareuze vrouwen2. Echter, dysmenorroe is verschillend voor elke vrouw en hangt af van de sterkte van hun myometriale contracties; sterkere contracties worden vaak geassocieerd met het gevoel van ernstige kramp3. Myometriale contractiliteit kan worden gevisualiseerd met behulp van baarmoeder echografie en wordt vaak herkend als endometriale golven. Verbeterde afgifte van prostaglandinen tijdens de menstruatie4 in een baarmoeder die endometrium verjering ondergaat, wordt verondersteld om bij te dragen aan verhoogde myometriale hypercontractiliteit, resulterend in ischemie en hypoxie van de baarmoeder spier en aldus verhoogd pijn3.
Ernstige dysmenorroe kan belemmeren de dagelijkse activiteit van sommige vrouwen en 3 aan 33% van de vrouwen hebben zeer ernstige pijn, die kan leiden tot een vrouw te bedlegerig voor 1 aan 3 dagen elke menstruele cyclus5. Dysmenorroe is de belangrijkste oorzaak van gynaecologische morbiditeit bij vrouwen in de reproductieve leeftijd ongeacht leeftijd, nationaliteit, en economische status5. De geschatte prevalentie van dysmenorroe is zowel hoog als variabel, variërend van 45% tot 93% bij vrouwen in de reproductieve leeftijd5. Dysmenorroe-geassocieerde pijn heeft een effect op het dagelijks leven van vrouwen en kan resulteren in slechte academische prestaties bij adolescenten, lagere kwaliteit van de slaap, beperking van de dagelijkse activiteiten, en stemmingswisselingen5.
Veel vrouwen die ervaren ernstige dysmenorroe Resort om over-the-counter medicatie om hun pijn te verlichten. Dergelijke over-the-counter medicatie bevatten cyclooxygenase (COX) remmers die de vorming van prostaglandinen6voorkomen. Echter, COX-remmers worden geassocieerd met ongewenste cardiovasculaire voorvallen, en ongeveer 18% van vrouwen met dysmenorroe zijn niet reageren op deze remmers7. Daarom is er behoefte aan nieuwe medicijnen om menstruele krampen te verminderen. Aangezien over contractiliteit van de baarmoeder bijdraagt aan de pathogenese van dysmenorroe, kan een mogelijke strategie het gebruik van uteriene relaxants zijn.
Het is gunstig om de effecten van potentiële spierverslapper drugs te kwantificeren in een model van natuurlijk voorkomende spontane myometriale golf-achtige contracties. Tot dusver is echter geen efficiënte ex vivo-methode voor het testen van spier-ontspannende geneesmiddelen in de intacte baarmoeder beschreven. Op dit moment, isometrische spanning metingen worden gebruikt voor het evalueren van spierverslapper drug effecten. Tijdens dergelijke metingen, een baarmoeder spier strip wordt gehandhaafd op een constante lengte onder voorladen in een weefsel Bad terwijl de kracht van baarmoeder spiercontracties wordt geregistreerd voor en na oxytocine stimulatie in de aanwezigheid of afwezigheid van een spierverslapper drug. Hoewel deze aanpak is zeer nuttig, het vereist dure apparatuur. Bovendien lijken isometrische contracties niet op de spontane myometriale golfachtige contracties die van nature voorkomen in de intacte baarmoeder. Op unieke wijze kunnen de uteriene myometriale golven bij knaagdieren worden gevisualiseerd als de beweeglijkheid van de baarmoeder hoorn wanneer het gehele voortplantingskanaal (eierstokken, baarmoeder en vagina) in een bufferoplossing wordt gehandhaafd. Hier presenteren we een ex vivo-methode voor het monitoren van de spontane beweeglijkheid van de intacte muis baarmoeder geplaatst in een Petri schaaltje met een zuurstof buffer. We beschrijven ook een motiliteits kwantificerings algoritme met behulp van de MATLAB Motion tracker. Deze nieuwe aanpak biedt een eenvoudig en goedkoper alternatief voor het testen van het spierverslapper potentieel van natuurlijk voorkomende remedies en synthetische verbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met dieren zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité aan de Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 maand-oude F2-129S-C57BL/6 seksueel volwassen vrouwelijke muizen werden gebruikt in de studie.
Let op: Zorg voor veiligheid door het dragen van een Labcoat, masker en handschoenen bij het werken met dieren en biogevaarlijke materialen.
1. voorbereiding van de oplossing
- Bereid de Krebs-buffer, die bevat: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mm Nah2po4, 0,56 mM MgCl2, 25 mm NaHCO3, en 5 mm glucose, pH 7,4. De Krebs-buffer continu oxygeneren met een mengsel van samengeperste gassen met 5% CO2 en 95% O2 met behoud van de buffer temperatuur bij 37 °c met behulp van een circulerend waterbad.
- Bereid Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), die bevat: 2,68 mm KCl, 1,47 mmKH 2po4, 136,89 mM NaCl, en 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4.
2. voorbereiding van dieren
- Anesthetize muizen met inhalatie van Isofluraan (3%) met afvalgas opruiming. Zorg voor adequate anesthesie door het beoordelen van terugtrekking reflexen. Knijp de achterste teen om te bevestigen dat er geen bewegingen worden opgewekt, wat het verlies van reflex reacties aangeeft. Na de diepe verdoving wordt bereikt, euthanitatie van het dier door onthoofding.
Opmerking: Isofluraan kan een gladde spier verwijding veroorzaken. Daarom moet de bereiding van het voortplantingskanaal grondig worden gewassen en geïnincubeerd in de Krebs-buffer gedurende ten minste 15-30 minuten voordat de ex vivo-experimenten worden begonnen. Isoflurane kan irritatie en ongemak veroorzaken wanneer het in aanraking komt met de huid, dus ga voorzichtig te werk. - Plaats het lichaam op een grote weeg boot bekleed met een papieren handdoek.
Opmerking: Zwangere vrouwelijke laboratoriumpersoneel mag niet worden betrokken bij experimenten met Isofluraan, omdat het foetaal gewicht kan afnemen, de foetale skelet ossificatie vermindert en het risico opspontane abortus verhoogt. CO2 inademing kan worden gebruikt als vervanger voor het euthaniseren van muizen.
3. bepaling van de Estrous cyclus fase
- Met kleine Tang, til de clitoris om toegang te krijgen tot het vaginale buurt en breng langzaam een micropipet punt met 10 μL dpbs in de vagina.
- Zorg ervoor dat de micropipet punt via het buurt onder een hoek van 10-30 ° wordt ingebracht om te voorkomen dat de vaginale wand prikken. De vloeistof moet nog steeds zichtbaar zijn in de tip na het inbrengen. Als de vloeistof niet zichtbaar is, werd de punt te ver in de vagina ingebracht en was het paracervicale gebied van de vagina mogelijk geperforeerd.
- Trek de vaginale ostiumspieren lichtjes naar beneden met de punt van de micropipet om lucht uit de vagina te laten verlaten.
- Spoel de vaginale holte langzaam door het pipetteren op en neer 2-3 keer met 10 μL DPBS en plaats de getekende celsuspensie op een glazen glijbaan.
- Gebruik een omgekeerde fase contrast Microscoop om te bepalen van de fase van de oestrische cyclus door middel van cytologische analyse. De procedure wordt uitgevoerd zoals elders beschreven10,11. Zorg ervoor dat de celsuspensie niet uitdroogt voordat cytologische analyse kan worden uitgevoerd. De suspensie kan indien nodig worden verdund met verse DPBS.
4. muis voortplantingskanaal Ddissectie
- Rangschik de muis in rugligging en spreid de extremiteiten uit om de abdominopelvic-regio bloot te leggen.
- Spray met 70% ethanol om het abdominopelvic-gebied te bevochtigen en te ontsmetten.
- Met behulp van Tang, voorzichtig til de huid superieur aan de clitoris. Maak kleine dwarse incisies op de laterale aspecten van de onderste buikstreek, tot aan de bovenste ledematen om het peritoneum bloot te leggen (Figuur 1A). Tijdens dit proces wordt een externe flap vormgegeven. Als kleine incisies voortdurend worden gemaakt, de flap zal toenemen in grootte.
- Snijd voorzichtig door het peritoneum om het maagdarmkanaal bloot te leggen (Figuur 1B). Het is belangrijk op te merken dat de baarmoeder hoorns kunnen vaak direct onder het peritoneum, dus Maak incisies voorzichtig en raak de hoorns niet als dit kan invloed hebben op de beweeglijkheid van de baarmoeder.
- Gebruik de Tang, verwijder de fascia en vetweefsel die het maagdarmkanaal bedekken. Verwijder de volgende maagdarmkanaal segmenten uit de buikholte: de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum, de blindedarm, de stijgende en dwarse Colon (Figuur 1C).
- Om de voortplantingsorganen te lokaliseren, identificeert u eerst de urineblaas (Figuur 1C, "4"), die een leeg uiterlijk kan hebben als gevolg van het vernietigen na euthanasie. De vagina zal recht onder de urineblaas.
- Lokaliseer de schaam-symphyse bij de samenvloeiing van de schaambeenderen (caudally naar de blaas).
- Met behulp van een schaar, verwijder de schaam symphyse door het zorgvuldig maken van incisies op de laterale zijden door de interpubic fibrokraakbeen weefsel om toegang te krijgen tot en het verstrekken van een route voor de vagina extractie (Figuur 1D).
- Snijd door het perineum gelegen tussen de anus en het onderste deel van de vulva.
- Met behulp van de Tang, til de vagina en langzaam accijnzen het rectum.
- Identificeer twee baarmoeder hoorns die bifurcate in een vork, rostrally naar de vagina. Zoek een ingewikkelde eileider en eierstok aan het einde van elke hoorn, die kan worden verborgen onder de overgebleven gastro-intestinale tractus segmenten. Gebruik een kleine Ontkoppel schaar om eventuele ligamenten te verwijderen die verbinding maken met en de hoorns, oviducts en eierstokken in de buikholte ondersteunen.
- Verwijder het voortplantingskanaal, waaronder de vagina, baarmoeder, oviducts en eierstokken, uit de buikholte.
- Breng het geïsoleerde voortplantingskanaal (Figuur 1E) over in een Petri schaaltje van 100 mm gevuld met 10 ml dpbs. Comprimeer de baarmoeder hoorns niet om beschadiging van het myometrium te voorkomen.
- Gebruik een tang en een chirurgische schaar om een BIND-en vetweefsel rond de baarmoeder hoorns en de vagina te verwijderen, evenals elke vacht in de schaamstreek die de beeldkwaliteit zou kunnen belemmeren. Verwijder het brede ligament om de beweeglijkheid van de baarmoeder hoorns mogelijk te maken.
- Was het geïsoleerde voortplantingsstelsel met verse DPBS twee keer en breng het over in een 35 mm Petri schaaltje gevuld met 3 mL zuurstofrijke Krebs-oplossing.
5. weefsel Imaging
- Plaats de Petri schaal met het voortplantingskanaal in zuurstofrijk Krebs-buffer op een zwart oppervlak. Houd het Gerecht bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het is mogelijk om een infrarood verwarmend pad te gebruiken om het weefsel op 37 °C te houden. - Toestaan 15-30 min voor spontane contracties te beginnen. Record spontane uteriene motiliteit voor 10 min van een axiaal vlak met behulp van elk type van digitale video-apparatuur.
- Breng het preparaat over in een Petri schaaltje met de zuurstof buffer, aangevuld met een teststof. Record spontane uteriene motiliteit voor ongeveer 10 min van een axiaal vlak met behulp van elk type van digitale video-apparatuur.
- Was het gehele voortplantingsstelsel in 100 mm Petri schaaltje met 10 mL DPBS om de reversibiliteit van de behandeling te beoordelen.
- Breng het preparaat over in een Petri schaaltje met de vers zuurstof achtige Krebs-buffer. Record spontane uteriene motiliteit voor ongeveer 10 min van een axiaal vlak met behulp van elk type van digitale video-apparatuur.
- Breng het preparaat over naar een ander 35 mm Petri schaaltje gevuld met zuurstofrijk Krebs-buffer aangevuld met het voertuig voor de teststof om ervoor te zorgen dat er geen mechanisch veroorzaakte veranderingen in de spontane baarmoeder beweeglijkheid zijn. Dit is een belangrijke controle.
- Breng de videobeelden over naar de harde schijf van een computer.
6. gegevensanalyse
- Maak clips met behulp van videobewerkingssoftware van de originele videobeelden met de afleveringen besturing, behandeling en Wash.
- Gebruik de MATLAB-software en het meegeleverde script (zie online aanvullend materiaal) om de spontane baarmoeder beweeglijkheid te kwantificeren.
Opmerking: Computer vision Toolbox add-on voor MATLAB moet zijn geïnstalleerd om het script volledig functioneel te maken.- Open het MATLAB-script, ga naar het tabblad Editor en klik op uitvoeren.
- Selecteer het eerste videobestand en klik op openen.
- Voer in het pop-upvenster een label in voor het videobestand en klik op OK.
- Voer het tijdsinterval (s) in dat nodig is voor de berekening van de snelheid van de hoorn beweging (Δ Euclidische afstand/Δs).
- Gebruik de muiscursor om twee punten te selecteren op het eerste frame van de video. Een pop-upvenster zal u vragen om te bevestigen dat de geselecteerde punten moeten worden gebruikt voor het bijhouden. Klik op Start om het real-time tracerings proces te starten dat wordt weergegeven in het pop-upvenster. U ook op punten opnieuw selecteren klikken om de twee punten opnieuw te selecteren.
- Controleer de nauwkeurigheid van het tracking proces in het pop-upvenster.
- Houd rekening met een koers versus tijd spreidings plot en afstand versus tijd spreidings plot in een nieuw pop-upvenster. Sla de twee cijfers op door bestand te selecteren | Opslaan als in hetzelfde venster om de gegevens te documenteren.
- Zoek een map met de naam Pointtrackerdata, automatisch gemaakt door MATLAB, in dezelfde map waar het MATLAB-script zich bevindt. Identificeer een Excel-bestand met de naam label_Data met gegevenspunten die zijn verzameld van de video in twee afzonderlijke werkbladtabs.
Opmerking: elke alternatieve bewegings tracerings software kan worden gebruikt om de beweeglijkheid van de spontane baarmoeder te kwantificeren.
- Gebruik een geschikte software (bijvoorbeeld Excel of Sigmaplot 13) om de statistische analyse uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont representatieve beelden die zijn genomen tijdens de gehele isolatie procedure voor het voortplantingsstelsel die in dit protocol wordt beschreven. Om besmetting van de buffer met bont, die de videokwaliteit zou afnemen, te voorkomen, bevochtigd we het muis lichaam met 70% ethanol. De belangrijkste benchmark voor het dissectie gedeelte van het protocol is het vinden van de urineblaas. De baarmoeder en de vagina zullen lager liggen dan de urineblaas.
Om het protocol te testen, behandelden we het hele voortplantingsstelsel met epinefrine. Adrenaline is bekend om te veroorzaken van de baarmoeder glad spierontspanning. Dit hormoon is endogeen geproduceerd in de bijnier Medulla en dient als een stress hormoon in zoogdieren. We gebruikten 1 μM epinefrine in onze experimenten. Dit is een verzagende concentratie waarvan bekend is dat deze de maximale respons12veroorzaakt. Er werd een reeks van vier experimenten uitgevoerd. In alle onderzoeken, 1 μM epinefrine reversibel geremd spontaan baarmoeder beweeglijkheid (Figuur 2).
Om de spontane motiliteit van het voortplantingsstelsel te kwantificeren, ontwierpen we een algoritme waarmee we de gemiddelde veranderingssnelheid van de Euclidische afstand tussen twee geselecteerde punten op het voortplantingskanaal van de muis kunnen beoordelen. De punten posities worden bijgehouden met behulp van de motion tracking-module van MATLAB-software. Het bijbehorende script voor MATLAB, dat we gebruikten om de Euclidische afstanden te berekenen, is beschikbaar in het aanvullende materiaal online. De positie van punten is van cruciaal belang voor een geslaagde procedure voor het bijhouden van bewegingen. Er moet zorgvuldig rekening worden gehouden met de kwaliteit van de Video's, omdat de lichtreflecties van de muur van de Petri schaaltje de bewegings tracker kunnen afleiden, en het kan stoppen met het volgen van de hoorn beweging terwijl het punt opnieuw wordt toegewezen aan een van de licht Reflecties. We kozen ervoor om een van de punten in het midden van een hoorn te plaatsen om er zeker van te zijn dat het ver genoeg was van de Petri schaalwand reflecties. Het tweede punt werd meestal geselecteerd op de vagina omdat het geen spontane beweeglijkheid vertonen. Afbeelding 3 biedt een voorbeeld van gegevensanalyse en aanvullende afbeelding 1 toont de representatieve afbeeldingen die tijdens het bijhouden van de beweging zijn verkregen.
Figuur 1 : Stappen van volledige isolatie van het voortplantingsstelsel. A) erwerd een incisie in de huid gemaakt en het abdominopelvic-gebied werd boven het peritoneum blootgesteld (1). (B) het sereuze membraan werd langzaam geopend om het maagdarmkanaal bloot te leggen (2). C) het maagdarmkanaal is verplaatst om de baarmoeder hoorns bloot te leggen (3). De urineblaas (4) kan worden gevisualiseerd in de buurt van de combinatie van de hoorns. D) de baarmoeder hoorns zijn bevrijd en er zijn bezuinigingen aangebracht aan de zijkanten van de schaam symphyse (5) om de vagina bloot te leggen (6). E) verwijdering van het geïsoleerde voortplantingsstelsel en de plaatsing in dpbs-oplossing. Overtollig bont of bindweefsel is verwijderd. (F) een diepe inkeping kan worden gezien op de vagina (rechts) na verwijdering van het rectum (links, 7). G) het omringende bindweefsel wordt verwijderd. Een digitale camera en applicatie suite software (versie 3.7.0) werd gebruikt om real-time beelden te verwerven tijdens dissectie (camera-instelling: Hue 20/verzadiging 80). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Er wordt een representatief experiment met het volledige geïsoleerde voortplantingsstelsel getoond. De beelden werden genomen 15 s uit elkaar vóór (a), tijdens (B), en na (C) de toepassing van 1 μM epinefrine. De voorbereiding van het voortplantingskanaal tentoongesteld hoge beweeglijkheid in panelen A en C in de afwezigheid van adrenaline, maar het is stilaan in paneel B met de aanwezigheid van 1 μM epinefrine. De niet-bewerkte videobeelden worden geleverd als aanvullende video's 1-3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Gegevensanalyse in het ex vivo-experiment beschreven in Figuur 2. A) erwordt een tijdsverloop van de Euclidische afstandsveranderings snelheid weergegeven. De referentiepunten waartussen de afstand werd bepaald tijdens de spontane baarmoeder beweeglijkheid worden weergegeven als groene stippen in de inzet. De punten werden geselecteerd in het proximale deel van de vagina en het middelste segment van een baarmoeder hoorn zoals afgebeeld. De blauwe gevulde cirkels tonen de spontane motiliteits waarden voor het toevoegen van adrenaline, de rode cirkels tonen de spontane motiliteits percentages in de aanwezigheid van 1 μM epinefrine, en de groene gevulde cirkels tonen de spontane motiliteits percentages na een washout. B) een vergelijking van de gemiddelden van de Euclidische afstand (pixels/s) voor de toevoeging van epinefrine (blauwe balk), in aanwezigheid van 1 μM epinefrine (rode balk), en na een wegwassende werking (groene balk). De MATLAB-software werd gebruikt om de baarmoeder beweeglijkheid te kwantificeren. Het Δt-interval is ingesteld op 5 s. "ΔDistance" wordt berekend als het verschil tussen de initiële frame afstand en de frame afstand 5 s later. De statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Kruskal-Wallis One Way analyse van variantie op gelederen gevolgd door alle Pairwise meervoudige vergelijkings procedures volgens de Dunn's methode met behulp van Sigmaplot 13. Het sterretje geeft de gegevensset aan die significant verschilt van de andere experimentele gegevenssets (P = < 0,001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende film 1: time-lapse videoclip met spontane baarmoeder beweeglijkheid voor het toevoegen van 1 μM epinefrine. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende film 2: time-lapse videoclip die spontane baarmoeder beweeglijkheid toont wanneer de Krebs-buffer werd aangevuld met 1 μM epinefrine. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende film 3: time-lapse videoclip met spontane uteriene beweeglijkheid na het washout. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullend figuur 1: representatieve beelden die elke 15 s worden genomen tijdens het volgen van bewegingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend materiaal: het op MATLAB gebaseerde Tracking algoritme script. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor het beoordelen van de spontane contractiliteit van het gehele voortplantingsstelsel van knaagdieren, dat de eierstokken, oviducts, baarmoeder hoorns en de vagina omvat. We gebruikten een soortgelijke methode om aan te tonen van de spierverslapper effect van fenylefrine op spontane uteriene motiliteit13, echter, in het verleden waren we niet in staat om kwantitatieve analyse van de gegevens te verstrekken. In dit werk ontwikkelden we een algoritme voor kwantitatieve motiliteits gegevensanalyse met behulp van de MATLAB motion tracking-module. Dit is een nuttige techniek voor het testen van nieuwe geneesmiddelen die de contractiliteit van de baarmoeder reguleren, ongeacht of de drugs ontspannen of constrikte baarmoeder gladde spieren. Een groot voordeel van dit model is dat het voortplantingskanaal intact is, behoud van alle intrinsieke intra-uteriene cellulaire interacties. Met name dit protocol vereist geen speciale apparatuur. De baarmoeder isolatie kan worden gedaan met een eenvoudig Vergrootglas en er is geen vereiste voor een geavanceerde video-opnameapparatuur. Als er geen digitale camera met hoge resolutie beschikbaar is voorbeeld vorming, kan een persoonlijke camera van een mobiele telefoon als alternatief worden gebruikt.
De meest kritieke stap van het protocol voor het beoordelen van de beweeglijkheid van het voortplantingsstelsel is het verkrijgen van levensvatbaar baarmoeder weefsel. Het myometrium, binnen de baarmoeder hoorns, is het motiel element van het voortplantingsstelsel. Daarom is het bij isolatie belangrijk om de hoorns niet te overrekken of te comprimeren. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het baarmoeder weefsel goed zuurstof is gedurende het experiment om de beweeglijkheid van de baarmoeder te handhaven. De beste manier om schade aan de baarmoeder hoorns te voorkomen is om contact te maken met alleen het aangrenzende bindweefsel tijdens het schoonmaken van de baarmoeder of het verplaatsen van het voortplantingsstelsel. Omdat de vagina niet spontaan tijdens het experiment contracteert, is het aanvaardbaar om het te comprimeren met de Tang bij het verplaatsen van het voortplantingsstelsel van het ene gerecht naar het andere. De hele voortplantings tractus experimenten kunnen worden uitgevoerd in combinatie met isometrische spannings opnames die de contractiliteit van preload en/of oxytocine-geïnduceerde baarmoeder beoordelen. Een draad myograaf is echter een kostbaar stuk apparatuur dat niet altijd beschikbaar is in een gemeenschappelijke laboratoriumomgeving.
De beschreven methode kent verschillende beperkingen. Omdat het myometrium zeer gevoelig is voor compressies of trek trekkingen, compliceert dit het dissectie proces van het voortplantingskanaal. Als de hoorns tijdens het dissectie beschadigd zijn, zal er geen spontane contractiliteit worden waargenomen. Dit is een belangrijke beperking van het Protocol, omdat het onzeker is of de contractiele gladde spiercellen onbewust werden beschadigd ondanks het gebruik van de juiste verzorging en voorzichtigheid of of ze miste motiliteit als gevolg van een natuurlijke oorzaak. Sterker nog, we observeerden geen motiliteit in 10-20% van de voortplantings wegen preparaten in deze studie. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het vaginale segment van het voortplantingsstelsel intact blijft omdat het verwijderen van de vagina duidelijk de spontane beweeglijkheid van de baarmoeder hoorns vermindert. De afwezigheid van eierstokken en/of en doet daarentegen geen afbreuk aan de beweeglijkheid van het gehele voortplantingsstelsel. Bovendien, men moet er rekening mee dat sommige verbindingen zijn gevoelig voor oxidatie. Bijvoorbeeld, adrenaline kan gemakkelijk worden geoxideerd. Het testen van de effecten van dergelijke verbindingen zou vereisen kortere incubatietijd voorkomen van overmatige oxidatie. Kortere incubatie tijden kunnen echter het vermogen van een medicijn belemmeren om efficiënt door de dikte van de baarmoederwand te dringen. Een verdere beperking van de methode omvat het beoordelen van de 3-dimensionale bewegingen van de hoorns. De hoorns hebben een aangeboren aard van curling in een 3-dimensionaal vlak, complicerende analyse. Om dit probleem te overwinnen, kan men het Krebs buffervolume in de Petri schaal verlagen tot 2 mL.
We constateerden dat het optimale leeftijdsbereik voor vrouwelijke muizen 2-5 maanden is. We hebben aangegeven dat anesthesie met Isofluraan kan resulteren in verminderde beweeglijkheid en extra wassingen kan noodzakelijk zijn om deze Isofluraan-geïnduceerde complicatie te voorkomen. Als alternatief kan men koolstofdioxide gebruiken om muizen te euthaniëren. Als zich moeilijkheden voordoen tijdens het dissectie, kan de focus op bezienswaardigheden, zoals de urineblaas, helpen. Om de verkregen motiliteits gegevens te kwantificeren, gebruikten we MATLAB-software. Het grote probleem met motion tracking in MATLAB was dat de tracker niet in staat was om de hoorns goed te lokaliseren toen ze in de buurt van de muur van de Petri schaal verhuisden. Adobe Premier element is gebruikt om de videobeelden te knippen en de grootte van videobestanden te verkleinen. Hoewel het een uitstekend softwarepakket is, is het mogelijk niet altijd beschikbaar in een typische laboratoriumomgeving. Een alternatieve optie kan zijn om de Free motion tracking-module van ImageJ-software te gebruiken of zelfs eenvoudige handmatige beoordeling van beelden die met identieke intervallen zijn genomen en de positie van de baarmoeder hoorns op een segmentatie rooster te vergelijken. Figuur 2 toont een voorbeeld van een eenvoudige beoordeling van de spontane baarmoeder beweeglijkheid en omvat een vergelijking van voortplantings bewegingen binnen een interval van 15 sec.
Tot dusver is er geen eenvoudige methode voor het beoordelen van de beweeglijkheid van de baarmoeder in een Petri schaaltje gerapporteerd. Echografie en intra-uteriene druksensoren kunnen worden gebruikt voor het bewaken van de menselijke baarmoeder contractiliteit14. Het is echter moeilijk om onderliggende mechanismen in de intacte menselijke baarmoeder te bestuderen. Daarom is het gebruik van diermodellen voor het onderzoeken van spontane uteriene contractiliteit belangrijk. Het vrouwelijke voortplantingskanaal vertoont spontane myometriale contracties die van cruciaal belang zijn voor het welzijn van een vrouw, waaronder haar vruchtbaarheid en arbeid15. Deze contracties kunnen worden gevisualiseerd als endometrium golven tijdens een ultrasoon onderzoek. Echter, tijdens de menstruatie, over contractiliteit van de baarmoeder kan ongemak te creëren en leiden tot dysmenorroe, of menstruele krampen. Om te helpen verlichten sommige symptomen van dysmenorroe, nieuwe drugs gericht op ontspannen baarmoeder gladde spieren nodig zijn. Onze eenvoudige methode biedt een manier voor het beoordelen van de effecten van verschillende verbindingen op de contractiliteit van de baarmoeder.
In deze studie, we gebruikten onze Easy Petri schaalmodel om de effectiviteit van epinefrine te bevestigen, een baarmoeder spierverslapper hormoon12, om te voorkomen dat spontane baarmoeder motiliteit van geïsoleerde muis voortplantings tracten. Onze methode kan ook worden gebruikt voor het testen van dergelijke verbindingen die de contractiliteit van de baarmoeder kunnen verhogen. Belangrijk is dat deze methode kan het potentieel hebben om te worden geüpgraded voor doorvoer drug screening met behulp van een zes-goed plaat formaat. De methode die wij hier presenteren kan dus de mogelijkheid hebben om te worden geoptimaliseerd voor screeningprocedures op industriële schaal. We hebben niet geprobeerd om soortgelijke experimenten uit te voeren bij grotere knaagdieren, maar we verwachten dat vergelijkbare spontane beweeglijkheid aanwezig zal zijn in geïsoleerde rat uteri. Het grotere voortplantingskanaal van ratten kan meer uitgesproken baarmoeder beweeglijkheid vertonen. We ontdekten dat zwangere muis uteri ook kan worden beoordeeld met behulp van dit ex vivo baarmoeder motiliteit Petri schaalmodel. Zoals verwacht, de spontane motiliteit van de zwangere baarmoeder werd verlaagd omdat het in een rusttoestand. Echter, toegenomen gewicht toegevoegd door het foetale weefsel kan ook bijdragen tot obstructie van de beweeglijkheid. Het kan nog steeds nuttig zijn om de geschiktheid van dit hele voortplantingskanaal model verder te onderzoeken om het effect van tocolytische (RELAXANT) of uterotone (stimulerende) verbindingen in de context van zwangerschap en arbeid te beoordelen. Zo presenteerden we hier een eenvoudig ex vivo model voor het beoordelen van de spontane beweeglijkheid van het intacte voortplantingskanaal. Deze aanpak kan worden aangenomen voor drug screening en worden gebruikt voor nieuwe Drug Discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door interne IE-fondsen. GELEDEN bedacht de studie. XC en AGO waren betrokken bij het ontwerp van de beschreven experimenten. FL en AGO analyseerden en interpreteerden de gegevens. KLL, JOB, FL voerde alle ex vivo experimenten uit. FL schreef het MATLAB-script. KLL, JOB en AGO schreven het manuscript. Alle auteurs lezen en keuren de definitieve versie van het manuscript goed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
- Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
- Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
- Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
- Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
- Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
- Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
- Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
- Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
- Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
- Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
- Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
- Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).
