Summary
Uteruskontraktionen sind wichtig für das Wohlbefinden von Frauen. Jedoch, pathologisch erhöhte Kontraktilität kann zu Dysmenorrhoe führen, vor allem bei jüngeren Frauen. Hier beschreiben wir eine einfache Ex-vivo-Zubereitung, die eine schnelle Beurteilung der Wirksamkeit von glatten Muskelrelaxantien ermöglicht, die zur Behandlung von Dysmenorrhoe verwendet werden können.
Abstract
Dysmenorrhoe, oder schmerzhafte Krämpfe, ist das häufigste Symptom mit Menses bei Frauen verbunden und seine Schwere kann frauenalltag behindern. Hier präsentieren wir eine einfache und kostengünstige Methode, die für die Erprobung neuer Medikamente zur Verringerung der Gebärmutterkontraktilität entscheidend wäre. Diese Methode nutzt die einzigartige Fähigkeit des gesamten Mausfortpflanzungstraktes, spontane Beweglichkeit zu zeigen, wenn sie ex vivo in einer Petrischale mit sauerstoffhaltigem Krebspuffer gepflegt wird. Diese spontane Beweglichkeit ähnelt der wellenartigen myometrialen Aktivität der menschlichen Gebärmutter, die als Endometriumwellen bezeichnet wird. Um die Wirksamkeit der Methode zu demonstrieren, verwendeten wir ein bekanntes Uterusrelaxant-Medikament, Adrenalin. Wir zeigen, dass die spontane Beweglichkeit des gesamten Mausfortpflanzungstraktes in diesem Petrischalenmodell schnell und reversibel durch 1 M Adrenalin gehemmt werden kann. Die Dokumentation der Veränderungen der Gebärmutterbeweglichkeit kann leicht mit einem gewöhnlichen Smartphone oder einer ausgeklügelten Digitalkamera durchgeführt werden. Wir entwickelten einen MATLAB-basierten Algorithmus, der bewegungstracking ermöglicht, um spontane Veränderungen der Gebärmuttermotilität zu quantifizieren, indem die Rate der Uterushornbewegungen gemessen wird. Ein großer Vorteil dieses ex vivo Ansatzes ist, dass der Fortpflanzungstrakt während des gesamten Experiments intakt bleibt und alle intrinsinininären zellulären Wechselwirkungen bewahrt. Die Hauptbeschränkung dieses Ansatzes ist, dass bis zu 10-20% der Uteri keine spontane Beweglichkeit aufweisen können. Bisher ist dies die erste quantitative Ex-vivo-Methode zur Beurteilung der spontanen Gebärmuttermotilität in einem Petrischalenmodell.
Introduction
Als wichtiges weibliches Organ ist die Gebärmutter entscheidend für die Fortpflanzung und für die Ernährung des Fötuswesentlich 1. Die Gebärmutter besteht aus drei Schichten: Perimetrium, Myometrium und Endometrium. Das Myometrium ist die Hauptkontraktile Schicht der Gebärmutter und spielt eine Schlüsselrolle bei der Fötuslieferung. Das Endometrium ist die innerste Schicht, die die Gebärmutterhöhle auskleidung und für die Embryoimplantation unerlässlich ist. Bei nicht schwangeren Frauen im reproduktiven Alter wird die Endometriumschicht monatlich zu Beginn des Menstruationszyklus vergossen. Das Myometrium hilft in diesem Vergießensprozess durch die Aufrechterhaltung der spontanen myometrialen Kontraktionen, die für die Reinigung des nekrotischen Endometriumgewebes aus der Gebärmutter benötigt werden1.
Leider, erhöhte myometriale Kontraktilität kann zu negativen Nebenwirkungen wie Dysmenorrhoe führen, oder schmerzhafte Menstruationskrämpfe. Dies ist insbesondere bei jungen Frauen und nulliparösen Frauen2zu beobachten. Jedoch, Dysmenorrhoe ist für jede Frau anders und hängt von der Stärke ihrer myometrialen Kontraktionen; stärkere Kontraktionen sind oft mit dem Gefühl von schweren Krämpfenverbunden 3. Myometriale Kontraktilität kann mit Gebärmutter-Ultraschall visualisiert werden und wird oft als Endometriumwellen erkannt. Verbesserte Freisetzung von Prostaglandinen während der Menstruation4 in der Gebärmutter unteren endometrialen Sloughing wird geglaubt, um zu einer erhöhten myometrialen Hyperkontraktilität beitragen, was zu Ischämie und Hypoxie der Gebärmuttermuskulatur und damit erhöhte Schmerzen3.
Schwere Dysmenorrhoe kann die tägliche Aktivität einiger Frauen behindern und 3 bis 33% der Frauen haben sehr starke Schmerzen, die dazu führen könnten, dass eine Frau für 1 bis 3 Tage jeden Menstruationszyklus bettlägerig ist5. Dysmenorrhoe ist die Hauptursache für gynäkologische Morbidität bei Frauen im reproduktiven Alter unabhängig von Alter, Nationalität und wirtschaftlichem Status5. Die geschätzte Prävalenz von Dysmenorrhoe ist sowohl hoch als auch variabel und reicht von 45 % bis 93 % bei Frauen im reproduktiven Alter5. Dysmenorrhoe-assoziierte Schmerzen hat einen Einfluss auf das tägliche Leben von Frauen und kann zu schlechten akademischen Leistungen bei Jugendlichen führen, niedrigere Qualität des Schlafes, Einschränkung der täglichen Aktivitäten, und Stimmungsschwankungen5.
Viele Frauen, die schwere Dysmenorrhoe erleben, greifen auf rezeptfreie Medikamente zurück, um ihre Schmerzen zu lindern. Solche rezeptfreien Medikamente enthalten Cyclooxygenase-Inhibitoren (COX), die die Bildung von Prostaglandinen verhindern6. Jedoch, COX-Hemmer sind mit unerwünschten kardiovaskulären Ereignissen verbunden, und etwa 18% der Frauen mit Dysmenorrhoe sind nicht auf diese Inhibitoren reagieren7. Daher gibt es einen Bedarf an neuen Medikamenten, um Menstruationskrämpfe zu reduzieren. Da die Kontraktilität der Gebärmutter zur Pathogenese der Dysmenorrhoe beiträgt, kann eine mögliche Strategie die Verwendung von Gebärmutterrelaxantien sein.
Es ist vorteilhaft, die Auswirkungen von potenziellen Entspannungsmedikamenten in einem Modell natürlich vorkommender spontaner myometrialer wellenähnlicher Kontraktionen zu quantifizieren. Bisher wurde jedoch keine effiziente Ex-vivo-Methode zum Testen von muskelentspannenden Medikamenten in der intakten Gebärmutter beschrieben. Derzeit werden isometrische Spannungsmessungen verwendet, um entspannende Arzneimitteleffekte zu bewerten. Während solcher Messungen wird ein Gebärmuttermuskelstreifen in einem Gewebebad in konstanter Länge unter Vorspannung gehalten, während die Kraft von Gebärmuttermuskelkontraktionen vor und nach der Oxytocin-Stimulation in Gegenwart oder Abwesenheit eines Relaxmittels aufgezeichnet wird. Obwohl dieser Ansatz sehr nützlich ist, erfordert er teure Ausrüstung. Darüber hinaus ähneln isometrische Kontraktionen nicht den spontanen myometrialen wellenartigen Kontraktionen, die natürlicherweise in der intakten Gebärmutter auftreten. Einzigartig ist, dass die uterine myometrialen Wellen bei Nagetieren als Gebärmutterhornmotilität visualisiert werden können, wenn der gesamte Fortpflanzungstrakt (Ovarien, Eileiter, Gebärmutter und Vagina) in einer Pufferlösung gehalten wird. Hier stellen wir eine ex vivo Methode zur Überwachung der spontanen Beweglichkeit der intakten Mausgebärmutter vor, die in einer Petrischale mit sauerstoffhaltigem Krebspuffer platziert wird. Wir beschreiben auch einen Motilitätsquantifizierungsalgorithmus, der den MATLAB Motion Tracker verwendet. Dieser neuartige Ansatz bietet eine einfache und kostengünstige alternative, um das Entspannungspotenzial natürlich vorkommender Heilmittel und synthetischer Verbindungen zu testen.
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Protocol
Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN) genehmigt. In der Studie wurden 2-5 Monate alte F2-129S-C57BL/6 geschlechtsreife weibliche Mäuse verwendet.
ACHTUNG: Sorgen Sie für Sicherheit, indem Sie einen Labormantel, eine Maske und Handschuhe bei der Arbeit mit Tieren und biogefährlichen Materialien tragen.
1. Lösungsvorbereitung
- Bereiten Sie den Krebs Puffer vor, der enthält: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.2 mM NaH2PO4, 0.56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3, und 5 mMM Glucose, pH 7.4. Kontinuierlich sauerstoffhaltigen den Krebspuffer mit einem Gemisch aus komprimierten Gasen, die 5% CO2 und 95% O2 enthalten, während die Puffertemperatur bei 37 °C mit einem zirkulierenden Wasserbad beibehalten wird.
- Dulbeccos Phosphat-Gepufferte Saline (DPBS), dieenthält: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,89 mM NaCl, und 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4.
2. Tierzubereitung
- Anästhesisieren von Mäusen mit Inhalation von Isofluran (3%) mit Abgasaufräumarbeiten. Gewährleisten Sie eine angemessene Anästhesie durch Bewertung der Entzugsreflexe. Drücken Sie den hinteren Zehen, um zu bestätigen, dass keine Bewegungen ausgelöst werden, was auf den Verlust von Reflexreaktionen hindeutet. Nach der tiefen Anästhesie erreicht ist, einschläfern Sie das Tier durch Enthauptung.
HINWEIS: Isofluran kann zu einer glatten Muskeldilatation führen. Daher sollte das Fortpflanzungstraktpräparat mindestens 15-30 min vor Beginn der Ex-vivo-Experimente ausgiebig gewaschen und im Krebspuffer inkubiert werden. Isofluran kann Reizungen und Beschwerden verursachen, wenn es in Kontakt mit der Haut ist, also gehen Sie mit Vorsicht vor. - Legen Sie den Körper auf ein großes Wägeboot, das mit einem Papiertuch ausgekleidet ist.
HINWEIS: Schwangere weibliche Labormitarbeiter sollten nicht in Experimente mit Isofluran beteiligt sein, weil es fetales Gewicht verringern, fetale Skelettverknöcherung verringern und das Risiko einer spontanen Abtreibung erhöhen kann8,9. CO2-Inhalation kann als Ersatz zur Einschläferne von Mäusen verwendet werden.
3. Bestimmung der Estrous-Zyklusstufe
- Heben Sie mit kleinen Zangen die Klitoris an, um Zugang zum vaginalen Ostium zu erhalten, und legen Sie langsam eine Mikropipettespitze mit 10 L DPBS in die Vagina ein.
- Stellen Sie sicher, dass die Mikropipettespitze in einem Winkel von 10 - 30° durch das Ostium eingeführt wird, um eine Punktion der Vaginalwand zu vermeiden. Die Flüssigkeit sollte nach dem Einsetzen noch in der Spitze sichtbar sein. Wenn die Flüssigkeit nicht sichtbar ist, wurde die Spitze zu weit in die Vagina eingeführt, und der parazervikale Bereich der Vagina könnte perforiert worden sein.
- Ziehen Sie leicht auf die vaginalen Ostiummuskeln mit der Spitze der Mikropipette nach unten, damit Luft aus der Vagina austritt.
- Spülen Sie die Vaginalhöhle langsam, indem Sie 2-3 Mal mit 10 l DPBS nach oben und unten pfeifen und die gezogene Zellsuspension auf einem Glasschlitten platzieren.
- Verwenden Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop, um die Estre-Zyklusphase durch zytologische Analyse zu bestimmen. Das Verfahren wird wie an anderer Stelle beschrieben10,11durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension nicht austrocknet, bevor eine zytologische Analyse durchgeführt werden kann. Die Suspension kann bei Bedarf mit frischem DPBS verdünnt werden.
4. Maus Reproductive Tract Ddissektion
- Ordnen Sie die Maus in einer Supine-Position und verbreiten Sie ihre Extremitäten, um die abdominopelvic Region auszusetzen.
- Sprühen Sie mit 70% Ethanol, um den Abdominopelzbereich zu befeuchten und zu desinfizieren.
- Mit Zangen, vorsichtig heben Sie die Haut, die der Klitoris überlegen ist. Machen Sie kleine Querschnitte auf den seitlichen Aspekten des unteren Bauchbereichs, bis zu den oberen Extremitäten, um das Peritoneum auszusetzen (Abbildung 1A). Während dieses Vorgangs bildet sich eine externe Klappe. Da ständig kleine Schnitte gemacht werden, wird die Klappe immer größer.
- Schneiden Sie vorsichtig durch das Peritoneum, um den Magen-Darm-Trakt zu belichten (Abbildung 1B). Es ist wichtig zu beachten, dass die Gebärmutterhörner oft direkt unter dem Peritoneum liegen können, also machen Schnitte vorsichtig und berühren Sie die Hörner nicht, da dies die Gebärmutterbeweglichkeit beeinflussen kann.
- Entfernen Sie mit Zangen die Faszien und das Fettgewebe, das den Magen-Darm-Trakt bedeckt. Entfernen Sie die folgenden Magen-Darm-Traktsegmente aus der Bauchhöhle: das Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Cecum, aufsteigender und querer Dickdarm (Abbildung 1C).
- Um die Fortpflanzungsorgane zu lokalisieren, identifizieren Sie zuerst die Harnblase (Abbildung 1C, "4"), die aufgrund der Voiding nach der Euthanasie ein deflationiertes Aussehen haben kann. Die Vagina wird direkt unter der Harnblase sein.
- Finden Sie die Schamsymphyse am Zusammenfluss der Schamknochen (caudally an der Blase).
- Entfernen Sie die Schamsymphyse mit Hilfe einer Schere, indem Sie vorsichtig Schnitte an den Seiten durch das interpubische Fibrocartilagingewebe machen, um Zugang zu erhalten und einen Weg für die Vagina-Extraktion zu bieten (Abbildung 1D).
- Schneiden Sie das Perineum zwischen dem Anus und dem unteren Teil der Vulva.
- Mit Zangen, heben Sie die Vagina und langsam verbrauchen das Rektum.
- Identifizieren Sie zwei Uterushörner, die sich in eine Gabel verzweiten, rostral zur Vagina. Suchen Sie ein verworrenes Eileiter und Eierstock am Ende jedes Horns, das unter den verbleibenden Magen-Darm-Traktsegmenten verborgen sein kann. Verwenden Sie kleine Sezieren Schere, um alle Bänder zu entfernen, die mit verbinden und unterstützen die Hörner, Eileiter, und Eierstöcke in der Bauchhöhle.
- Entfernen Sie den Fortpflanzungstrakt, der die Vagina, Gebärmutter, Eileiter und Eierstöcke umfasst, aus der Bauchhöhle.
- Übertragen Sie den isolierten Fortpflanzungstrakt (Abbildung 1E) in eine 100 mm Petrischale, gefüllt mit 10 ml DPBS. Komprimieren Sie die Uterushörner nicht, um eine Beschädigung des Myometriums zu vermeiden.
- Verwenden Sie Zangen und chirurgische Scheren, um jedes Binde- und Fettgewebe zu entfernen, das die Gebärmutterhörner und Vagina sowie jedes Fell im Schambereich umgibt, das die Bildqualität behindern könnte. Entfernen Sie das breite Band, um die Beweglichkeit der Gebärmutterhörner zu ermöglichen.
- Waschen Sie den isolierten Fortpflanzungstrakt zweimal mit frischem DPBS und übertragen Sie ihn in eine 35 mm Petrischale, die mit 3 ml sauerstoffhaltiger Krebslösung gefüllt ist.
5. Gewebe-Bildgebung
- Legen Sie die Petrischale mit dem Fortpflanzungstrakt in sauerstoffhaltigen Krebspuffer auf eine schwarze Oberfläche. Bewahren Sie das Gericht bei Raumtemperatur auf.
HINWEIS: Es ist möglich, ein Infrarot-Wärmepad zu verwenden, um das Gewebe bei 37 °C zu halten. - Lassen Sie 15-30 min für spontane Kontraktionen beginnen. Zeichnen Sie spontane Gebärmuttermotilität für 10 min von einer axialen Ebene mit jeder Art von digitalen Video-Ausrüstung.
- Übertragen Sie die Zubereitung in eine Petrischale mit dem sauerstoffhaltigen Krebspuffer, ergänzt durch eine Testverbindung. Zeichnen Sie die spontane Gebärmutterbeweglichkeit für ca. 10 min von einer axialen Ebene mit jeder Art von digitalen Videogeräten auf.
- Waschen Sie den gesamten Fortpflanzungstrakt in 100 mm Petrischale mit 10 ml DPBS, um die Reversibilität der Behandlung zu beurteilen.
- Die Zubereitung mit dem frisch sauerstoffhaltigen Krebspuffer in eine Petrischale geben. Zeichnen Sie die spontane Gebärmutterbeweglichkeit für ca. 10 min von einer axialen Ebene mit jeder Art von digitalen Videogeräten auf.
- Übertragen Sie die Zubereitung auf eine weitere 35 mm Petrischale, gefüllt mit sauerstoffhaltigem Krebspuffer, ergänzt mit dem Fahrzeug für die Testmasse, um sicherzustellen, dass es keine mechanisch induzierten Veränderungen der spontanen Gebärmutterbeweglichkeit gibt. Dies ist ein wichtiges Steuerelement.
- Übertragen Sie das Videomaterial auf eine Computerfestplatte.
6. Datenanalyse
- Erstellen Sie Clips mit einer beliebigen Videobearbeitungssoftware aus dem Ursprünglichen Videomaterial, das die Steuerungs-, Behandlungs- und Waschepisoden enthält.
- Verwenden Sie die MATLAB-Software und das bereitgestellte Skript (siehe Online-Ergänzungsmaterial), um die spontane Gebärmuttermotilität zu quantifizieren.
HINWEIS: Computer Vision Toolbox Add-on für MATLAB muss installiert werden, damit das Skript voll funktionsfähig ist.- Öffnen Sie das MATLAB-Skript, wechseln Sie zur Registerkarte Editor, und klicken Sie auf Ausführen.
- Wählen Sie die erste Videodatei aus, und klicken Sie auf Öffnen.
- Geben Sie im Popup-Dialogfeld eine Beschriftung für die Videodatei ein, und klicken Sie auf OK.
- Geben Sie das Zeitintervall (s) ein, das für die Berechnung der Hornbewegung erforderlich ist.
- Verwenden Sie den Mauszeiger, um zwei Punkte auf dem ersten Frame des Videos auszuwählen. In einem Popup-Fenster wird bestätigt, dass die ausgewählten Punkte für die Nachverfolgung verwendet werden sollen. Klicken Sie auf Start, um den Echtzeitverfolgungsprozess zu initiieren, der im Popupfenster angezeigt wird. Alternativ können Sie auf Punkte auswählen klicken, um die beiden Punkte erneut auszuwählen.
- Überwachen Sie die Genauigkeit des Tracking-Prozesses im Popupfenster.
- Beobachten Sie ein Rate vs. Zeitstreudiagramm und Entfernung vs. Zeitstreudiagramm in einem neuen Pop-up-Fenster. Speichern Sie die beiden Figuren, indem Sie Datei | Speichern Sie wie im selben Fenster, um die Daten zu dokumentieren.
- Suchen Sie einen Ordner mit dem Namen PointTrackerData, der automatisch von MATLAB erstellt wird, in demselben Verzeichnis, in dem sich das MATLAB-Skript befindet. Identifizieren Sie eine Excel-Datei mit dem Namen label_Data, die Datenpunkte enthält, die aus dem Video in zwei separaten Arbeitsblattregisterkarten gesammelt wurden.
HINWEIS: Jede alternative Motion-Tracking-Software kann verwendet werden, um spontane Gebärmuttermotilität zu quantifizieren.
- Verwenden Sie eine geeignete Software (z. B. Excel oder SigmaPlot 13), um die statistische Analyse durchzuführen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder, die während des gesamten Instandiverdisanzverfahrens aufgenommen wurden, das in diesem Protokoll beschrieben wird. Um eine Kontamination des Puffers mit Fell zu vermeiden, was die Videoqualität verringern würde, befeuchteten wir den Mauskörper mit 70% Ethanol. Der wichtigste Maßstab für den Abschnitt des Protokolls ist die Suche nach der Harnblase. Die Gebärmutter und Vagina wird niedriger als die Harnblase befinden.
Um das Protokoll zu testen, behandelten wir den gesamten Fortpflanzungstrakt mit Adrenalin. Epinephrin ist bekannt, Gebärmutter glatte Muskelentspannung verursachen. Dieses Hormon wird endogen in der Nebennieren-Medulla produziert und dient als Stresshormon bei Säugetieren. In unseren Experimenten haben wir 1 M Epinephrin verwendet. Dies ist eine Sättigungskonzentration, die bekanntermaßen maximale Reaktionverursacht 12. Es wurden vier Experimente durchgeführt. In allen Studien hemmte 1 'M Epinephrin reversibel die spontane Gebärmuttermotilität (Abbildung 2).
Um die spontane Beweglichkeit des Fortpflanzungstraktes zu quantifizieren, haben wir einen Algorithmus entwickelt, der es uns ermöglicht, die durchschnittliche Veränderungsrate im euklidischen Abstand zwischen zwei ausgewählten Punkten auf dem Fortpflanzungstrakt der Maus zu bewerten. Die Punktpositionen werden mit dem Motion Tracking Modul der MATLAB Software nachverfolgt. Das entsprechende Skript für MATLAB, mit dem wir die euklidischen Entfernungen berechnet haben, ist im Ergänzenden Material online verfügbar. Die Position der Punkte ist entscheidend für ein erfolgreiches Motion-Tracking-Verfahren. Es sollte sorgfältig über die Qualität der Videos nachgedacht werden, da die Lichtreflexionen von der Wand der Petrischale den Bewegungstracker ablenken können, und es kann aufhören, die Hornbewegung zu verfolgen, während der Punkt zu einem der Lichtverhältnisse neu zugewiesen wird. Reflexionen. Wir haben uns entschieden, einen der Punkte in die Mitte eines Horns zu stellen, um sicherzustellen, dass er weit genug von den Wandreflexionen der Petrischale entfernt ist. Der zweite Punkt wurde in der Regel auf der Vagina ausgewählt, da es keine spontane Beweglichkeit zeigte. Abbildung 3 enthält eine Stichprobe der Datenanalyse, und ergänzende Abbildung 1 zeigt die repräsentativen Bilder, die während der Bewegungsverfolgung aufgenommen wurden.
Abbildung 1 : Schritte der gesamten Isolation des Fortpflanzungstraktes. (A) Es wurde ein Schnitt in der Haut gemacht und der Abdominopelvic-Bereich wurde oberhalb des Peritoneums (1) freigelegt. (B) Die seröse Membran wurde langsam geöffnet, um den Magen-Darm-Trakt freizulegen (2). (C) Der Magen-Darm-Trakt wurde verschoben, um die Gebärmutterhörner freizulegen (3). Die Harnblase (4) kann in der Nähe der Konjunktion der Hörner visualisiert werden. (D) Die Uterushörner wurden befreit und an den Seiten der Schamsymphyse (5) Schnitte vorgenommen, um die Vagina (6) zu entblößen. (E) Entfernung des isolierten Fortpflanzungstraktes und Platzierung in DPBS-Lösung. Überschüssiges Fell oder Bindegewebe wurde entfernt. (F) Ein tiefer Einzug ist an der Vagina (rechts) nach Entfernung des Rektums (links, 7) zu sehen. (G) Das umgebende Bindegewebe wird entfernt. Eine Digitalkamera und eine Application Suite-Software (Version 3.7.0) wurden verwendet, um Echtzeitbilder während der Sezierung zu erfassen (Kameraeinstellung: Farbton 20/Sättigung 80). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Es wird ein repräsentatives Experiment mit dem gesamten isolierten Fortpflanzungstrakt gezeigt. Die Bilder wurden 15 s auseinander genommen, bevor (A), während (B) und nach (C) die Anwendung von 1 M Epinephrin. Die Präparation des Fortpflanzungstraktes zeigte eine hohe Beweglichkeit in den Paneelen A und C in Abwesenheit von Adrenalin, aber es ist still in Panel B mit der Anwesenheit von 1 M Epinephrin. Das unbearbeitete Videomaterial wird als Zusatzvideos 1-3zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Datenanalyse im Ex-vivo-Experiment, das in Abbildung 2. (A) Es wird ein Zeitverlauf der euklidischen Entfernungsänderungsrate angezeigt. Die Bezugspunkte, zwischen denen der Abstand während der spontanen Gebärmutterbeweglichkeit bestimmt wurde, werden als grüne Punkte im Einset dargestellt. Die Punkte wurden am proximalen Teil der Vagina und dem mittleren Segment eines Gebärmutterhorns, wie dargestellt, ausgewählt. Die blau gefüllten Kreise zeigen die spontanen Motilitätsrate-Werte vor dem Hinzufügen von Adrenalin, die roten Kreise zeigen die spontanen Motilitätsraten in Gegenwart von 1 M Epinephrin, und die grün gefüllten Kreise zeigen die spontanen Motilitätsraten nach einem Auswaschen. (B) Ein Vergleich der durchschnittlichen euklidischen Entfernungsänderungsraten (Pixel/s) vor Zugabe von Adrenalin (blauer Balken), in Gegenwart von 1 M Epinephrin (roter Balken) und nach einem Auswaschen (grüner Balken). Die MATLAB-Software wurde verwendet, um die Gebärmuttermotilität zu quantifizieren. Das Intervall wurde auf 5 s eingestellt. "Abstand" wird als Differenz zwischen dem anfänglichen Rahmenabstand und dem Rahmenabstand 5 s später berechnet. Die statistische Analyse wurde mit Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks durchgeführt, gefolgt von allen paarweise mehrfachen Vergleichsverfahren nach der Dunn-Methode mit SigmaPlot 13. Das Sternchen gibt den Datensatz an, der sich erheblich von den anderen experimentellen Datensätzen unterscheidet (P = <0.001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzender Film 1: Zeitraffer-Videoclip, der spontane Gebärmuttermotilität zeigt, bevor 1 M Adrenalin hinzugefügt wird. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzender Film 2: Zeitraffer-Videoclip, der spontane Gebärmuttermotilität zeigt, wenn der Krebs-Puffer mit 1 M Epinephrin ergänzt wurde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzender Film 3: Zeitraffer-Videoclip, der spontane Gebärmuttermotilität nach dem Auswaschen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Bilder, die alle 15 s während der Bewegungsverfolgung aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Material: Das MATLAB-basierte Tracking-Algorithmus-Skript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hier beschrieben wir eine Methode zur Beurteilung der spontanen Kontraktilität des gesamten Nagetier-Reproduktionstraktes, die die Eierstöcke, Eileiter, Gebärmutterhörner und die Vagina umfasst. Wir verwendeten eine ähnliche Methode, um die entspannende Wirkung von Phenylephrin auf die spontane Gebärmuttermotilität13zu demonstrieren, aber in der Vergangenheit waren wir nicht in der Lage, quantitative Analyse der Daten zu liefern. In dieser Arbeit haben wir einen Algorithmus für die quantitative Motilitätsdatenanalyse mit dem MATLAB Motion Tracking Modul entwickelt. Dies ist eine nützliche Technik zum Testen neuer Medikamente, die Diekdrinenkontraktilität regulieren, unabhängig davon, ob die Medikamente entspannen oder verengen Gebärmutter glatte Muskeln. Ein großer Vorteil dieses Modells ist, dass der Fortpflanzungstrakt intakt ist, wobei alle intrauterinen zellulären Wechselwirkungen erhalten bleiben. Insbesondere erfordert dieses Protokoll keine spezielle Ausrüstung. Die Gebärmutterisolierung kann mit einer einfachen Lupe durchgeführt werden und es gibt keine Notwendigkeit für anspruchsvolle Videoaufzeichnungsgeräte. Wenn eine hochauflösende Digitalkamera nicht für die Bildgebung verfügbar ist, kann alternativ eine persönliche Mobiltelefonkamera verwendet werden.
Der kritischste Schritt des Protokolls zur Beurteilung der Beweglichkeit des Fortpflanzungstraktes ist die Gewinnung von lebensfähigem Gebärmuttergewebe. Das Myometrium, innerhalb der Gebärmutterhörner, ist das motile Element des Fortpflanzungstraktes. Daher ist es während der Isolation wichtig, eine Überdehnung oder Verdichtung der Hörner zu vermeiden. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass das Gebärmuttergewebe während des gesamten Experiments gut mit Sauerstoff versorgt wird, um die Gebärmuttermotilität aufrechtzuerhalten. Der beste Weg, um Schäden an den Gebärmutterhörnern zu verhindern, ist, Kontakt mit nur dem angrenzenden Bindegewebe zu machen, während die Gebärmutter gereinigt oder der Fortpflanzungstrakt bewegt wird. Da sich die Vagina während des Experiments nicht spontan zusammenzieht, ist es akzeptabel, sie mit der Zange zu komprimieren, wenn der Fortpflanzungstrakt von einer Schale zur anderen bewegt wird. Die gesamten Fortpflanzungstraktexperimente können in Verbindung mit isometrischen Spannungsaufzeichnungen durchgeführt werden, die die vorbelastete und/oder oxytocininduzierte Gebärmutterkontraktilität bewerten. Ein Drahtmyograph ist jedoch ein teures Gerät, das nicht immer in einer gemeinsamen Laborumgebung verfügbar ist.
Die beschriebene Methode weist mehrere Einschränkungen auf. Da das Myometrium sehr empfindlich auf Kompressionen oder Zugarbeiten reagiert, erschwert dies den Sezieren des Fortpflanzungstraktes. Wenn die Hörner während der Zerlegung beschädigt werden, wird keine spontane Kontraktilität beobachtet. Dies ist eine wesentliche Einschränkung des Protokolls, weil es unsicher ist, ob die kontraktilen glatten Muskelzellen unwissentlich trotz der Verwendung der richtigen Sorgfalt und Vorsicht beschädigt wurden oder ob sie aufgrund einer natürlichen Ursache keine Beweglichkeit hatten. Tatsächlich haben wir in dieser Studie keine Beweglichkeit bei 10-20% der Präparate des Fortpflanzungstraktes beobachtet. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das vaginale Segment des Fortpflanzungstraktes intakt bleibt, da die Entfernung der Vagina die spontane Beweglichkeit der Gebärmutterhörner deutlich verringert. Im Gegensatz dazu beeinträchtigt das Fehlen von Eierstöcken und/oder Eileitern nicht die gesamte Beweglichkeit des Fortpflanzungstraktes. Darüber hinaus sollte man beachten, dass einige Verbindungen empfindlich auf Oxidation sind. Zum Beispiel, Epinephrin kann leicht oxidiert werden. Das Testen der Auswirkungen solcher Verbindungen würde eine kürzere Inkubationszeit erfordern, um eine übermäßige Oxidation zu verhindern. Jedoch, kürzere Inkubationszeiten können die Fähigkeit eines Medikaments behindern, effizient die Dicke der Gebärmutterwand zu durchdringen. Eine weitere Einschränkung der Methode beinhaltet die Bewertung der dreidimensionalen Bewegungen der Hörner. Die Hörner haben eine angeborene Natur des Lockens in eine dreidimensionale Ebene, was die Analyse erschwert. Um dieses Problem zu lösen, kann man das Krebs-Puffervolumen in der Petrischale auf 2 ml verringern.
Wir fanden heraus, dass der optimale Altersbereich für weibliche Mäuse 2-5 Monate beträgt. Wir wiesen darauf hin, dass anästhesie mit Isofluran eisäne kann zu einer verminderten Beweglichkeit führen und zusätzliche Wassen können notwendig sein, um diese Isofluran-induzierte Komplikation zu verhindern. Alternativ kann man Kohlendioxid verwenden, um Mäuse einzuschläfern. Wenn Schwierigkeiten während der Zerlegung auftreten, konzentrieren Sie sich auf Sehenswürdigkeiten, wie die Harnblase, kann helfen. Um die erhaltenen Motilitätsdaten zu quantifizieren, haben wir die MATLAB-Software verwendet. Das Hauptproblem bei der Bewegungsverfolgung in MATLAB war, dass der Tracker nicht in der Lage war, die Hörner richtig zu lokalisieren, wenn sie sich in der Nähe der Wand der Petrischale bewegten. Adobe Premier Element wurde verwendet, um das Videomaterial zu beschneiden und die Größe von Videodateien zu reduzieren. Obwohl es sich um ein hervorragendes Softwarepaket handelt, ist es möglicherweise nicht immer in einer typischen Laborumgebung verfügbar. Eine alternative Option kann darin bestehen, das kostenlose Motion-Tracking-Modul der ImageJ-Software oder auch eine einfache manuelle Auswertung von Bildern mit identischen Intervallen zu verwenden und die Position der Gebärmutterhörner auf einem Segmentierungsraster zu vergleichen. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für eine einfache Beurteilung der spontanen Gebärmuttermotilität und beinhaltet einen Vergleich der Bewegungen des Fortpflanzungstraktes innerhalb eines Intervalls von 15 s.
Bisher wurde keine einfache Methode zur Beurteilung der Gebärmuttermotilität in einer Petrischale berichtet. Ultraschall- und intrauterine Drucksensoren können verwendet werden, um die Kontraktilität der menschlichen Gebärmutter zu überwachen14. Es ist jedoch schwierig, die zugrunde liegenden Mechanismen in der intakten menschlichen Gebärmutter zu untersuchen. Daher ist die Verwendung von Tiermodellen zur Untersuchung der spontanen Gebärmutterkontraktilität wichtig. Der weibliche Fortpflanzungstrakt weist spontane myometriale Kontraktionen auf, die für das Wohlbefinden einer Frau entscheidend sind, einschließlich ihrer Fruchtbarkeit und Arbeit15. Diese Kontraktionen können während einer Ultraschalluntersuchung als Endometriumwellen visualisiert werden. Jedoch, während der Menstruation, über Kontraktilität der Gebärmutter kann Beschwerden verursachen und zu Dysmenorrhoe führen, oder Menstruationskrämpfe. Um einige Symptome der Dysmenorrhoe zu lindern, neue Medikamente zur Entspannung der Gebärmutter glatten Muskeln sind erforderlich. Unsere einfache Methode bietet eine Möglichkeit, die Auswirkungen verschiedener Verbindungen auf die Kontraktilität der Gebärmutter zu bewerten.
In dieser Studie verwendeten wir unser einfaches Petrischalenmodell, um die Wirksamkeit von Adrenalin, einem Uterusrelaxanthormon12, zu bestätigen, um spontane Gebärmuttermotilität isolierter Mausfortpflanzungstrakte zu verhindern. Unsere Methode kann auch für die Prüfung solcher Verbindungen verwendet werden, die die Kontraktilität der Gebärmutter erhöhen können. Wichtig ist, dass diese Methode das Potenzial hat, für das Durchsatz-Arzneimittel-Screening mit einem Sechs-Well-Plattenformat aufgerüstet zu werden. Somit kann die Methode, die wir hier vorstellen, für industrielle Screening-Verfahren optimiert werden. Wir haben nicht versucht, ähnliche Experimente an größeren Nagetieren durchzuführen, aber wir erwarten, dass eine ähnliche spontane Beweglichkeit in isolierten Ratten uteri vorhanden sein wird. Der größere Fortpflanzungstrakt von Ratten kann eine ausgeprägtere Gebärmuttermotilität aufweisen. Wir fanden heraus, dass schwangere Maus uteri kann auch mit diesem ex vivo uterine Motilität Petri Schale Modell bewertet werden. Wie erwartet, wurde die spontane Beweglichkeit der schwangeren Gebärmutter reduziert, weil sie sich in einem stillen Zustand befindet. Jedoch, erhöhtes Gewicht durch das fetale Gewebe hinzugefügt kann auch zur Motilität Obstruktion beitragen. Es kann immer noch von Vorteil sein, die Eignung dieses gesamten Fortpflanzungstraktmodells weiter zu untersuchen, um die Wirkung von tokolytischen (relaxanten) oder uterotischen (stimulierenden) Verbindungen im Kontext von Schwangerschaft und Arbeit zu bewerten. So präsentierten wir hier ein einfaches Ex-vivo-Modell zur Beurteilung der spontanen Beweglichkeit des intakten Fortpflanzungstraktes. Dieser Ansatz kann für das Drogenscreening gewählt und für die Entdeckung neuartiger Arzneimittel verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch interne IU-Mittel unterstützt. AGO konzipierte die Studie. XC und AGO waren an der Gestaltung der beschriebenen Experimente beteiligt. FL und AGO analysierten und interpretierten die Daten. KLL, JOB, FL führten alle Ex-vivo-Experimente durch. FL schrieb das MATLAB-Skript. KLL, JOB und AGO schrieben das Manuskript. Alle Autoren lasen und genehmigten die endgültige Fassung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
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