Summary
Livmor sammentrekninger er viktige for kvinners velvære. Patologisk økt contractility kan imidlertid føre til dysmenoré, spesielt hos yngre kvinner. Her beskriver vi en enkel ex vivo forberedelse slik at rask vurdering av effekten av glatt muskelavslappende som kan brukes til behandling av dysmenoré.
Abstract
Dysmenoré, eller smertefull kramper, er det vanligste symptomet forbundet med mensen i kvinner og dens alvorlighetsgrad kan hindre kvinners hverdag. Her presenterer vi en enkel og rimelig metode som ville være instrumental for å teste nye legemidler synkende livmor contractility. Denne metoden utnytter den unike evnen til hele musen reproduktive tarmkanalen å vise spontan motilitet når opprettholdt ex vivo i en Petri parabolen inneholder oksygenert Krebs buffer. Denne spontane motilitet ligner bølge-lignende myometrielle aktivitet av den menneskelige livmor, referert til som livmor bølger. For å demonstrere effektiviteten av metoden, har vi ansatt en velkjent livmor avslappende narkotika, adrenalin. Vi viser at den spontane motilitet av hele musen reproduktive tarmkanalen kan raskt og reverserbart hemmet av 1 μM adrenalin i denne Petri parabolen modellen. Dokumentere endringer av livmor motilitet kan enkelt gjøres ved hjelp av en vanlig smarttelefon eller en sofistikert digitalkamera. Vi utviklet en MATLAB-basert algoritme slik at Motion Tracking for å kvantifisere spontane livmor motilitet endringer ved å måle frekvensen av livmor horn bevegelser. En stor fordel med denne ex vivo-tilnærmingen er at reproduksjons kanalen forblir intakt gjennom hele eksperimentet, og bevarer alle iboende intrauterin cellulære interaksjoner. Den store begrensningen av denne tilnærmingen er at opp til 10-20% av uteri kan vise ingen spontan motilitet. Hittil er dette den første kvantitative ex vivo metode for å vurdere spontane livmor motilitet i en Petri parabol modell.
Introduction
Som et stort kvinnelig organ, er livmoren avgjørende for reproduksjon og avgjørende for næring av fosteret1. Livmoren består av tre lag: perimetrium, myometriet og endometrium. Den myometriet er den store kontraktile lag av livmoren og spiller en nøkkelrolle i fosteret levering. Endometrium er det innerste laget som fôr livmorhulen og er essensielt for implantation. I ikke-gravide kvinner i reproduktiv alder, er livmor laget skur månedlig i begynnelsen av menstruasjonssyklusen. Den myometriet hjelpemidler i denne shedding prosessen ved å opprettholde den spontane myometrielle sammentrekninger som trengs for å fjerne den nekrotisk livmor vev fra livmoren1.
Dessverre, økt myometrielle contractility kan føre til negative bivirkninger som dysmenoré, eller smertefulle menstrual kramper. Dette er spesielt sett hos unge kvinner og nulliparous kvinner2. Imidlertid er dysmenoré forskjellig for hver kvinne og avhenger av styrken av deres myometrielle sammentrekninger; sterkere sammentrekninger er ofte forbundet med følelsen av alvorlige kramper3. Myometrielle contractility kan visualisere ved hjelp av livmor ultralyd og er ofte anerkjent som livmor bølger. Forbedret frigjøring av prostaglandiner under menstruasjon4 i en livmor gjennomgår livmor sloughing antas å bidra til økt myometrielle hypercontractility, resulterer i iskemi og hypoksi av livmor muskelen og dermed økt smerte3.
Alvorlig dysmenoré kan hindre den daglige aktiviteten til noen kvinner og 3 til 33% av kvinner har svært sterke smerter, noe som kan føre til en kvinne som skal sengeliggende for 1 til 3 dager hver menstruasjonssyklus5. Dysmenoré er den ledende årsak til gynekologisk sykelighet hos kvinner i reproduktiv alder uavhengig av alder, nasjonalitet og økonomisk status5. Den estimerte utbredelsen av dysmenoré er både høy og variabel, alt fra 45% til 93% hos kvinner i reproduktiv alder5. Dysmenoré-assosiert smerte har en effekt på det daglige livet til kvinner og kan resultere i dårlig faglig ytelse hos ungdom, lavere kvalitet på søvn, begrensning av daglige aktiviteter, og humørsvingninger5.
Mange kvinner som opplever alvorlig dysmenoré ty til over-the-counter medisiner for å lindre deres smerte. Slike over-the-counter medisiner inneholder cyclooxygenase (COX) hemmere som hindrer dannelse av prostaglandiner6. Imidlertid er COX-hemmere forbundet med ugunstige kardiovaskulære hendelser, og om lag 18% av kvinner med dysmenoré er ikke svarer til disse hemmere7. Derfor er det behov for nye medisiner for å redusere menstrual kramper. Siden over contractility av livmoren bidrar til patogenesen av dysmenoré, en mulig strategi kan være bruk av livmor lempelse.
Det er fordelaktig å kvantifisere effekten av potensielle avslappende legemidler i en modell av naturlig forekommende spontane myometrielle sammentrekninger. Men hittil har ingen effektiv ex vivo metode for testing av muskel-avslappende stoffer i intakt livmor blitt beskrevet. For øyeblikket brukes isometrisk spennings målinger for å evaluere avslappende legemiddel effekter. Under slike målinger, en livmor muskel stripe opprettholdes ved en konstant lengde under forhåndsinnlasting i et vev bad mens kraften av livmor muskelsammentrekninger er registrert før og etter oxytocin stimulering i nærvær eller fravær av en avslappende narkotika. Selv om denne tilnærmingen er svært nyttig, krever det dyrt utstyr. Videre isometrisk sammentrekninger ikke ligne den spontane myometrielle bølge-lignende sammentrekninger som naturlig forekommer i intakt livmor. Unikt, livmor myometrielle bølger i gnagere kan bli visualisere som livmor horn motilitet når hele reproduktive tarmkanalen (eggstokkene, oviducts, livmor, og vagina) opprettholdes i en buffer løsning. Her presenterer vi en ex vivo metode for overvåking av spontan motilitet av intakt mus livmoren plassert i en Petri parabolen inneholder oksygenert Krebs buffer. Vi beskriver også en motilitet kvantifisering algoritme utnytte MATLAB bevegelse tracker. Denne romanen tilnærmingen gir en enkel og rimeligere alternativ til å teste avslappende potensialet i naturlig forekommende rettsmidler og syntetiske forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer med dyr har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 måned gamle F2-129S-C57BL/6 seksuelt-modne kvinnelige mus ble brukt i studien.
Forsiktig: Sørg for sikkerhet ved å bære en Laboratoriefrakk, maske og hansker når du arbeider med dyr og biologisk farlige materialer.
1. klargjøring av løsning
- Klargjør Krebs-bufferen, som inneholder: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mm NaH2PO4, 0,56 mm MgCl2, 25 mm NaHCO3og 5 mm glukose, pH 7,4. Kontinuerlig oxygenate Krebs buffer med en blanding av komprimerte gasser som inneholder 5% CO2 og 95% O2 og samtidig opprettholde buffer temperaturen ved 37 ° c ved hjelp av et sirkulerende vannbad.
- Forbered Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann (DPBS), som inneholder: 2,68 mm KCl, 1,47 mm KH2PO4, 136,89 mm NaCl, og 8,1 mm Na2HPO4, pH 7,4.
2. Animal forberedelse
- Bedøve mus ved hjelp av inhalasjon av isoflurane (3%) med avfalls gass rensing. Sikre tilstrekkelig anestesi ved å vurdere abstinens reflekser. Knip den bakre tåen til å bekrefte at ingen bevegelser er elicited, noe som tyder på tap av refleks reaksjoner. Etter dyp bedøvelse er oppnådd, euthanize dyret ved halshogging.
Merk: Isoflurane kan forårsake jevn muskel utvidelse. Derfor bør den reproduktive tarm klargjøringen bli grundig vasket og inkubert i Krebs buffer i minst 15-30 min før du starter ex vivo eksperimenter. Isoflurane kan forårsake irritasjon og ubehag når den er i kontakt med huden, så Fortsett med forsiktighet. - Plasser kroppen på en stor veie båt foret med et papir håndkle.
Merk: Gravide kvinnelige laboratoriepersonell bør ikke være involvert i eksperimenter med isoflurane fordi det kan redusere fosterets vekt, redusere fosterets skjelett forbening, og øke risikoen for spontanabort8, 9. CO2 inhalasjon kan brukes som en erstatning for euthanize mus.
3. fastsettelse av estrous syklus Stage
- Med små tang, løft klitoris for å få tilgang til vaginal ostium og langsomt sette inn en micropipette spiss som inneholder 10 μL av DPBS inn i skjeden.
- Sørg for at micropipette spissen er satt inn gjennom ostium i en vinkel på 10-30 ° for å unngå punktering av vaginal veggen. Væsken skal fortsatt være synlig i spissen etter innsetting. Hvis væsken ikke er synlig, spissen ble satt inn for langt inn i skjeden, og paracervical området av skjeden kan ha blitt perforert.
- Lett trekke ned på vaginal ostium musklene med spissen av micropipette for å tillate luft å gå ut av skjeden.
- Skyll vaginale hulrommet langsomt ved å pipettering opp og ned 2-3 ganger med 10 μL av DPBS og plasser den tegnede celle fjæringen på et glass lysbilde.
- Bruk et invertert fase kontrast mikroskop for å bestemme estrous syklus fasen gjennom Cytologiske analyse. Prosedyren er gjort som beskrevet andre steder10,11. Sørg for at celle fjæringen ikke tørker ut før Cytologiske analyse kan utføres. Suspensjonen kan fortynnes med fersk DPBS, om nødvendig.
4. mus reproduktive skrift Ddissection
- Ordne musen i en liggende posisjon og spre sine ekstremiteter å eksponere abdominopelvic regionen.
- Spray med 70% etanol for å fukte og desinfisere abdominopelvic området.
- Bruke tang, forsiktig løfte huden ligger overlegen til klitoris. Lag små tverrgående snitt på lateral aspekter av nedre abdominal området, opp til øvre ekstremiteter å avdekke peritoneum (figur 1A). Under denne prosessen, en ekstern klaff vil danne. Som små snitt er stadig gjort, vil klaffen øke i størrelse.
- Skjær forsiktig gjennom peritoneum for å avdekke mage-tarmkanalen (figur 1B). Det er viktig å merke seg at livmor hornene kan ofte være plassert rett under peritoneum, så gjør snittene forsiktig og ikke røre hornene som dette kan påvirke livmor motilitet.
- Ved hjelp av tang, fjerne konseptet og fettvev som dekker mage-tarmkanalen. Fjern følgende fordøyelseskanal segmenter fra bukhulen: tolvfingertarmen, jejunum, ileum, cecum, stigende og tverrgående kolon (figur 1C).
- For å finne reproduktive organer, først identifisere urin blæren (figur 1C, "4"), som kan ha en deflatert utseende på grunn av annullering etter døds aktiv. Vagina vil være rett under urin blæren.
- Finn kjønnshår symphesis ved samløpet av kjønnshår bein (caudally til blæren).
- Ved hjelp av saks, fjerne kjønnshår symphesis ved å nøye gjøre snitt på sin laterale sidene gjennom interpubic fibrocartilaginous vev for å få tilgang til og gi en rute for vagina utvinning (figur 1D).
- Skjær gjennom perineum plassert mellom anus og nedre del av den snappe.
- Bruke tang, løfte vagina og langsomt avgiftsdirektoratet i endetarmen.
- Identifiser to livmor horn som bifurcate inn i en gaffel, rostrally til vagina. Finn en convoluted oviduct og eggstokk på slutten av hvert horn, som kan være skjult under de resterende mage-tarmkanalen segmenter. Bruk små dissekere saks for å fjerne eventuelle leddbånd som kobles til og støtte hornene, oviducts, og eggstokkene i bukhulen.
- Fjern reproduktive tarmkanalen, som inkluderer vagina, livmor, oviducts, og eggstokkene, fra bukhulen.
- Overfør den isolerte reproduksjons kanalen (figur 1E) til en 100 mm Petri rett fylt med 10 ml DPBS. Ikke Komprimer livmor hornene for å unngå å skade myometriet.
- Bruk pinsett og kirurgisk saks for å fjerne eventuelle binde og fettvev rundt livmor hornene og vagina, samt noen pels i kjønnshår regionen som kan hindre bildekvaliteten. Fjern det brede leddbånd for å tillate motilitet av livmor hornene.
- Vask den isolerte reproduktive tarmkanalen med friske DPBS to ganger og overfør den til en 35 mm Petri parabol fylt med 3 mL oksygenrikt Krebs løsning.
5. tissue tenkelig
- Plasser Petri parabolen inneholder reproduktive tarmkanalen i oksygenert Krebs buffer på en svart overflate. Oppretthold parabolen ved romtemperatur.
Merk: Det er mulig å bruke en infrarød oppvarming pad for å opprettholde vevet ved 37 ° c. - Tillat 15-30 min for spontane sammentrekninger å begynne. Record spontan livmor motilitet i 10 min fra en aksial fly ved hjelp av alle typer digitalt video utstyr.
- Overfør forberedelsene til en Petri parabolen inneholder oksygenert Krebs buffer supplert med en test sammensatte. Record spontan livmor motilitet i ca 10 min fra en aksial fly ved hjelp av alle typer digitalt video utstyr.
- Vask hele reproduksjons kanalen i 100 mm Petri rett med 10 mL DPBS for å vurdere Reversibilitet av behandlingen.
- Overfør forberedelsene til en Petri parabol med fersk oksygen Krebs buffer. Record spontan livmor motilitet i ca 10 min fra en aksial fly ved hjelp av alle typer digitalt video utstyr.
- Overfør forberedelsene til en annen 35 mm Petri parabolen fylt med oksygenert Krebs buffer supplert med bilen for test sammensatte å sikre at det ikke er mekanisk indusert endringer i spontan livmor motilitet. Dette er en viktig kontroll.
- Overfør videoopptakene til en datamaskinharddisk.
6. data analyse
- Gjør klipp ved hjelp av en programvare for videoredigering fra det opprinnelige videoopptaket som inneholder kontroll-, behandlings-og vaske episoder.
- Bruk MATLAB programvare og den med følgende script (se online supplerende materiale) for å kvantifisere spontan livmor motilitet.
Merk: Computer Vision Toolbox-tillegget for MATLAB må være installert for at skriptet skal fungere fullt ut.- Åpne MATLAB-skriptet, gå til kategorien redigering , og klikk Kjør.
- Velg den første videofilen, og klikk på Åpne.
- Skriv inn en etikett for videofilen i popup-dialogboksen, og klikk OK.
- Angi tidsintervallet (e) som trengs for å beregne frekvensen av horn bevegelse (Δ euklidsk avstand/Δs).
- Bruk musepekeren til å velge to punkter i den første rammen i videoen. Et popup-vindu vil be om å få bekreftet at de valgte punktene skal brukes til sporing. Klikk Start for å starte sann tids sporings prosessen som vises i popup-vinduet. Alternativt kan du klikke på Velg punkter for å markere de to punktene på
- Overvåk nøyaktigheten til sporings prosessen i popup-vinduet.
- Observer en rate vs tid scatter plot og avstand kontra tid scatter plot i et nytt popup-vindu. Lagre de to tallene ved å velge fil | Lagre som i det samme vinduet for å dokumentere dataene.
- Finner en brosjyre benevnt PointTrackerData, automatisk skapt av MATLAB, inne det likt adresseliste der hvor det MATLAB skriften er lokalisert. Identifiser en Excel-fil med navnet label_Data som inneholder data punkter som er samlet inn fra videoen i to separate regnearkfaner.
Merk: eventuelle alternative Motion Tracking-programvare kan brukes til å kvantifisere spontan livmor motilitet.
- Bruk en passende programvare (for eksempel Excel eller SigmaPlot 13) til å utføre den statistiske analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser representative bilder tatt under hele reproduksjons kanalen isolasjons prosedyre som er beskrevet i denne protokollen. For å unngå forurensende buffer med pels, noe som ville redusere video kvalitet, fuktet vi musen kroppen med 70% etanol. Den store standarden for disseksjon delen av protokollen er å finne urin blæren. Livmoren og vagina vil bli plassert dårligere enn urin blæren.
For å teste protokollen, behandlet vi hele reproduktive tarmkanalen med adrenalin. Adrenalin er godt kjent for å forårsake livmor glatt muskel avslapping. Dette hormonet er endogenously produsert i adrenal forlengede og fungerer som en stress hormon i pattedyr. Vi brukte 1 μM adrenalin i eksperimentene våre. Dette er en mette konsentrasjon som er kjent for å forårsake maksimal respons12. En serie på fire eksperimenter ble utført. I alle studier, 1 μM adrenalin reverserbart hemmet spontant livmor motilitet (figur 2).
For å kvantifisere den spontane motilitet av reproduktive tarmkanalen, utviklet vi en algoritme som tillater oss å vurdere den gjennomsnittlige frekvensen av endring i euklidsk avstand mellom to utvalgte punkter på musen reproduktive skrift. Poeng plasseringene spores ved hjelp av bevegelses sporings modulen i MATLAB-programvaren. Den tilsvarende skript for MATLAB, som vi brukte til å beregne euklidsk avstander, er gitt i tilleggs materiale online. Poeng posisjonen er avgjørende for en vellykket bevegelses sporings prosedyre. Nøye vurdering bør tas om kvaliteten på videoene fordi lyset refleksjoner fra Petri parabolen vegg kan distrahere bevegelse Tracker, og det kan slutte å spore horn bevegelsen mens re-tildele punktet til en av lyset Refleksjoner. Vi valgte å plassere et av punktene i midten av et horn for å sikre at det var langt nok fra Petri parabolen veggen refleksjoner. Det andre punktet var vanligvis valgt på vagina siden det ikke viser spontan motilitet. Figur 3 inneholder et eksempel på dataanalyse, og supplerende figur 1 viser representative bilder ervervet under bevegelsessporing.
Figur 1 : Trinn av hele reproduktive tarmkanal isolasjon. (A) et snitt i huden ble gjort og abdominopelvic regionen ble eksponert over peritoneum (1). (B) serøs membranen ble langsomt åpnet for å avdekke mage-tarmkanalen (2). (C) mage-tarmkanalen har blitt flyttet for å avdekke livmor hornene (3). Den urin blæren (4) kan bli visualisere nær sammenheng med hornene. (D) livmor hornene har blitt frigjort og kutt har blitt gjort på lateral sidene av kjønnshår symphesis (5) for å avdekke vagina (6). (E) fjerning av isolert reproduktive skrift og plassering i DPBS løsning. Overflødig pels eller bindevev ble fjernet. (F) en dyp fordypning kan sees på skjeden (høyre) etter fjerning av endetarmen (til venstre, 7). (G) det omgivende bindevevet fjernes. Et digitalt kamera og Application Suite-programvare (versjon 3.7.0) ble brukt til å tilegne seg bilder i sanntid under disseksjon (kamera innstilling: Hue 20/Saturation 80). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Et representativt eksperiment med hele den isolerte reproduksjons kanalen vises. Bildene ble tatt 15 s fra hverandre før (A), under (B), og etter (C) anvendelsen av 1 μM adrenalin. Den reproduktive luftveiene forberedelse utstilt høy motilitet i paneler A og C i fravær av adrenalin, men det er Quiescent i panel B med tilstedeværelsen av 1 μM adrenalin. Den uredigerte videoopptakene er gitt som supplerende videoer 1-3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Data analyse i ex vivo-eksperimentet beskrevet i Figur 2. (A) en gang løpet av euklidsk avstand endre rate vises. Referansepunktene mellom som avstanden ble bestemt under spontan livmor motilitet vises som grønne prikker i innfelt. Punktene ble valgt på proksimale del av skjeden og midten segmentet av en livmor horn som avbildet. Den blå fylte sirkler viser spontan motilitet rate verdier før du legger adrenalin, de røde sirklene viser spontan motilitet priser i nærvær av 1 μM adrenalin, og den grønne fylte sirkler viser spontan motilitet priser etter en bleke. (B) en sammenligning av gjennomsnittlig euklidsk avstand endre priser (piksler/s) før tilsetning av adrenalin (blå bar), i nærvær av 1 μM adrenalin (rød bar), og etter en bleke (grønn bar). MATLAB-programvaren ble brukt til å kvantifisere livmor motilitet. Δt intervallet ble satt til 5 s. "ΔDistance" beregnes som differansen mellom den første ramme distansen og ramme avstanden 5 s senere. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp Kruskal-Wallis en vei analyse av varians på ranks etterfulgt av alle parvis flere sammenlignings prosedyrer i henhold til Dunn ' s Method bruker SigmaPlot 13. Stjernen angir datasettet som var signifikant forskjellig fra de andre eksperimentelle datasettene (P = < 0.001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggs film 1: time-lapse videoklipp som viser spontan livmor motilitet før du legger til 1 μM adrenalin. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende film 2: time-lapse videoklipp som viser spontan livmor motilitet når Krebs buffer ble supplert med 1 μM adrenalin. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende film 3: time-lapse videoklipp som viser spontan livmor motilitet etter bleke. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende figur 1: representative bilder tatt hver 15 s under bevegelsessporing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsmateriale: skriptet for MATLAB-basert sporings algoritme. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en metode for å vurdere spontane contractility av hele gnagere reproduktive tarmkanalen, som inkluderer eggstokkene, oviducts, livmor horn, og vagina. Vi brukte en lignende metode for å demonstrere den avslappende effekten av fenylefrin på spontane livmor motilitet13, men i det siste var vi ikke i stand til å gi kvantitativ analyse av dataene. I dette arbeidet, utviklet vi en algoritme for kvantitativ motilitet dataanalyse ved hjelp av MATLAB Motion Tracking modul. Dette er en nyttig teknikk for å teste nye legemidler som regulerer livmor contractility uavhengig av om stoffene slappe av eller constrict livmor glatte muskler. En stor fordel med denne modellen er at den reproduktive tarmkanalen er intakt, bevare alle iboende intrauterin mobilnettet interaksjoner. Spesielt denne protokollen ikke krever noe spesielt utstyr. Livmoren isolasjon kan gjøres med en enkel forstørrelsesglass og det er ingen krav til noen sofistikerte videoopptaks utstyr. Hvis et digitalt kamera med høy oppløsning ikke er tilgjengelig for bildebehandling, kan et personlig mobiltelefon kamera brukes som et alternativ.
Den mest kritiske trinn i protokollen for vurdering av reproduktive tarmkanalen motilitet er å få levedyktig livmor vev. Myometriet, innenfor livmor hornene, er aktive element i reproduksjons veiene. Derfor, under isolasjon er det viktig å unngå overstrekking eller komprimere hornene. Det er også viktig å sikre at livmor vevet er godt oksygenrikt gjennom eksperimentet for å opprettholde livmor motilitet. Den beste måten å forhindre skade på livmor hornene er å ta kontakt med bare tilstøtende bindevev mens rengjøring av livmoren eller flytte reproduktive tarmkanalen. Siden vagina ikke kontrakt spontant under eksperimentet, er det akseptabelt å komprimere den med tang når du flytter reproduktive tarmkanalen fra en tallerken til en annen. Hele reproduktive luftveiene eksperimenter kan utføres i forbindelse med isometrisk spennings opptak som vurderer Forhåndslasting-og/eller oxytocin-indusert livmor contractility. Imidlertid er en wire myograph en kostbar del av utstyret som ikke alltid er tilgjengelig i et felles laboratoriemiljø.
Den beskrevne metoden har flere begrensninger. Siden myometriet er svært følsom for kompresjon eller trekker, kompliserer dette disseksjon prosessen av reproduktive tarmkanalen. Hvis hornene skades under disseksjon, vil det ikke bli observert spontane contractility. Dette er en stor begrensning av protokollen fordi det er usikkert om kontraktile glatte muskelceller ble uvitende skadet til tross for bruk av forsvarlig omsorg og forsiktighet, eller om de manglet motilitet på grunn av en naturlig årsak. Faktisk observerte vi ingen motilitet i 10-20% av reproduktive tarmkanalen forberedelser i denne studien. Det er viktig å sikre at vaginal segmentet av reproduktive luftveiene forblir intakt fordi fjerning av skjeden markert avtar spontan motilitet av livmor hornene. I kontrast, fravær av eggstokkene og/eller oviducts ikke svekke hele reproduksjons kanalen motilitet. I tillegg bør man merke til at noen forbindelser er følsomme for oksidasjon. For eksempel kan adrenalin lett oksidert. Teste effekten av slike forbindelser ville kreve kortere inkubasjonstid å forebygge overdreven oksidasjon. Men kortere inkubasjons ganger kan hindre muligheten for et medikament for effektivt å trenge inn i tykkelsen på livmor veggen. En ytterligere begrensning av metoden omfatter vurdering av 3-dimensjonale bevegelser av hornene. Hornene har en medfødt natur curling i en 3-dimensjonale flyet, kompliserer analyse. For å overkomme dette problemet, kan man redusere Krebs buffer volumet i Petri parabolen til 2 mL.
Vi fant ut at det optimale alders spekteret for kvinnelige mus er 2-5 måneder. Vi indikerte at anestesi med isoflurane kan føre til redusert motilitet og ekstra vasker kan være nødvendig for å forhindre denne isoflurane-indusert komplikasjon. Alternativt kan man bruke karbondioksid til å euthanize mus. Hvis det oppstår vanskeligheter under disseksjon, kan fokus på landemerker, for eksempel urin blæren, hjelpe. For å kvantifisere den oppnådde motilitet data, vi brukte MATLAB programvare. Hovedproblemet med bevegelse sporing i MATLAB var at tracker ikke var i stand til å riktig finne hornene når de flyttet nær veggen av Petri parabolen. Adobe Premier element ble brukt til å klippe videoopptak og for å redusere størrelsen på videofiler. Selv om det er en fremragende programvarepakke, er den kanskje ikke alltid tilgjengelig i et typisk laboratoriemiljø. Et alternativt alternativ kan være å bruke gratis bevegelsessporing modul av ImageJ programvare eller enkel manuell vurdering av bilder tatt med identiske intervaller og sammenligne plasseringen av livmor hornene på en segmentering rutenett. Figur 2 viser et eksempel på enkel vurdering av spontan livmor motilitet og inkluderer en sammenligning av reproduktive tarm bevegelser innen 15 s intervall.
Ingen enkel metode vurdere livmor motilitet i en Petri parabolen innstillingen har blitt rapportert hittil. Ultralyd og intrauterin trykksensorer kan brukes til å overvåke menneskets livmor contractility14. Det er imidlertid vanskelig å studere underliggende mekanismer i intakt menneskelig livmor. Derfor er bruk av dyremodeller for å undersøke spontan livmor contractility viktig. Den kvinnelige reproduktive tarmkanalen viser spontane myometrielle sammentrekninger som er avgjørende for kvinnens velvære, inkludert hennes fruktbarhet og arbeidskraft15. Disse sammentrekninger kan bli visualisere som livmor bølger under en ultralyd undersøkelse. Men under menstruasjon, over contractility av livmoren kan skape ubehag og føre til dysmenoré, eller menstrual kramper. For å hjelpe lindre noen symptomer på dysmenoré, nye medikamenter rettet mot avslappende livmor glatte muskler er nødvendig. Vår enkle metoden gir en måte for å vurdere virkningene av ulike forbindelser på livmor contractility.
I denne studien, brukte vi vår enkle Petri parabol modell for å bekrefte effektiviteten av adrenalin, en livmor avslappende hormon12, for å hindre spontane livmor motilitet av isolerte musen reproduktive traktater. Vår metode kan også brukes til å teste slike forbindelser som kan øke contractility i livmoren. Viktigere, denne metoden kan ha potensial til å bli oppgradert for gjennomstrømning narkotika screening ved hjelp av en seks-brønn plateformat. Dermed kan metoden vi presenterer her har evnen til å være optimalisert for industriell skala screening prosedyrer. Vi forsøkte ikke å utføre lignende eksperimenter i større gnagere, men vi forventer at lignende spontan motilitet vil være til stede i isolerte rotte uteri. Den større reproduktive tarmkanalen av rotter kan vise mer uttalt livmor motilitet. Vi fant ut at gravide mus uteri kan også vurderes ved hjelp av denne ex vivo livmor motilitet Petri parabolen modell. Som forventet, den spontane motilitet av den gravide livmoren ble redusert fordi det er i en Quiescent tilstand. Men, økt vekt lagt av fosterets vev kan også bidra til motilitet obstruksjon. Det kan fortsatt være fordelaktig å videre utforske egnetheten av hele denne reproduktive tarmkanalen for å vurdere effekten av tokolytisk (avslappende) eller uterotoniske (stimulerende) forbindelser i sammenheng med graviditet og arbeidskraft. Derfor, her har vi presentert en enkel ex vivo modell for å vurdere spontan motilitet av intakt reproduktive tarmkanalen. Denne tilnærmingen kan bli vedtatt for narkotika screening og benyttes for romanen medikament oppdagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av interne IU-midler. SIDEN unnfanget studien. XC og AGO var involvert i utformingen av de beskrevne eksperimentene. FL og AGO analysert og tolket dataene. KLL, arbeid, FL utførte alle ex vivo -eksperimenter. FL skrev MATLAB skriptet. KLL, JOB, og AGO skrev manuskriptet. Alle forfattere leser og godkjente den endelige versjonen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
- Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
- Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
- Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
- Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
- Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
- Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
- Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
- Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
- Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
- Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
- Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
- Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).
