Summary
Uterine sammentrækninger er vigtige for trivsel af kvinder. Men, patologisk øget kontraktilitet kan resultere i dysmenorré, især hos yngre kvinder. Her beskriver vi et simpelt ex vivo præparat, der giver mulighed for hurtig vurdering af effekten af glatte muskelafslappende midler, som kan anvendes til behandling af dysmenorré.
Abstract
Dysmenorré, eller smertefulde kramper, er det mest almindelige symptom forbundet med menstruation hos kvinder og dens sværhedsgrad kan hæmme kvinders hverdag. Her præsenterer vi en nem og billig metode, der ville være medvirkende til at teste nye lægemidler faldende uterin kontraktilitet. Denne metode udnytter den unikke evne til hele musens reproduktive kanal til at udvise spontan motilitet, når den vedligeholdes ex vivo i en Petri skål indeholdende oxygeneret Krebs buffer. Denne spontane motilitet ligner den bølge-lignende myometriale aktivitet af den menneskelige uterus, omtales som endometriale bølger. For at demonstrere effektiviteten af metoden, vi ansat en velkendt uterin afslappende lægemiddel, epinephrin. Vi viser, at den spontane motilitet af hele musens reproduktive kanal kan hurtigt og reversibelt hæmmes af 1 μM adrenalin i denne Petri skål model. Dokumentere ændringer af uterin motilitet kan nemt gøres ved hjælp af en almindelig smart telefon eller et sofistikeret digitalt kamera. Vi udviklede en MATLAB-baseret algoritme, der tillod motion tracking at kvantificere spontane uterin motilitet ændringer ved at måle hastigheden af livmoder horn bevægelser. En stor fordel ved denne ex vivo tilgang er, at den reproduktive tarmkanalen forbliver intakt i hele forsøget, bevare alle iboende intrauterin cellulære interaktioner. Den væsentligste begrænsning af denne fremgangsmåde er, at op til 10-20% af uteri ikke kan udvise spontan motilitet. Hidtil er dette den første kvantitative ex vivo -metode til vurdering af spontan uterin motilitet i en Petri skål model.
Introduction
Som et stort kvindeligt organ, livmoderen er afgørende for reproduktion og afgørende for næring af fosteret1. Livmoderen består af tre lag: perimetrium, myometrium og endometrium. Den myometrium er den største kontraktile lag af livmoderen og spiller en central rolle i fosteret levering. Endometriet er det inderste lag foring af livmoderhulen og er afgørende for embryo implantation. Hos ikke-gravide kvinder i den fødedygtige alder, den endometriale lag er kastet månedligt i begyndelsen af menstruationscyklus. Myometrium aids i denne udgydelse proces ved at opretholde de spontane myometriale sammentrækninger er nødvendige for at rydde det nekrotiske endometriale væv fra livmoderen1.
Desværre, øget myometrial kontraktilitet kan resultere i negative bivirkninger såsom dysmenorré, eller smertefulde menstruations kramper. Dette ses især hos unge kvinder og født Women2. Men, dysmenorré er forskellig for hver kvinde og afhænger af styrken af deres myometriale sammentrækninger; stærkere sammentrækninger er ofte forbundet med følelsen af svære kramper3. Myometrial kontraktilitet kan visualiseres ved hjælp af uterin ultralyd og er ofte anerkendt som endometriale bølger. Øget frigivelse af prostaglandiner under menstruation4 i en livmoder, der gennemgår endometriale sløjning menes at bidrage til øget myometrial hyperkontraktilitet, hvilket resulterer i iskæmi og hypoksi af uterin musklen og dermed øget smerte3.
Svær dysmenorré kan hæmme den daglige aktivitet af nogle kvinder og 3 til 33% af kvinderne har meget svære smerter, som kan forårsage en kvinde at være sengeliggende for 1 til 3 dage hver menstruationscyklus5. Dysmenorré er den førende årsag til gynækologisk sygelighed i kvinder i den reproduktive alder uanset alder, nationalitet og økonomisk status5. Den anslåede prævalens af dysmenorré er både høj og variabel, lige fra 45% til 93% i kvinder i den reproduktive alder5. Dysmenorré-associerede smerter har en effekt på det daglige liv af kvinder og kan resultere i dårlig akademisk præstation hos unge, lavere søvnkvalitet, begrænsning af daglige aktiviteter, og humørsvingninger5.
Mange kvinder, der oplever svær dysmenorré udvej til over-the-counter medicin til at lindre deres smerte. Sådanne over-the-counter medicin indeholder cyclooxygenase (COX) hæmmere, som forhindrer dannelsen af prostaglandiner6. Men, COX-hæmmere er forbundet med negative kardiovaskulære hændelser, og omkring 18% af kvinder med dysmenorré reagerer ikke på disse hæmmere7. Derfor er der behov for nye medikamenter til at reducere menstruations kramper. Da over kontraktilitet af livmoderen bidrager til patogenesen af dysmenorré, en mulig strategi kan være brugen af uterin relaxants.
Det er fordelagtigt at kvantificere virkningerne af potentielle afslappende stoffer i en model af naturligt forekommende spontane myometriale bølge-lignende sammentrækninger. Men hidtil, ingen effektiv ex vivo metode til testning af muskel-afslappende lægemidler i intakt uterus er blevet beskrevet. I øjeblikket, isometrisk spænding målinger anvendes til at evaluere afslappende narkotika effekter. Under sådanne målinger, en uterin muskel strimmel opretholdes på en konstant længde under preload i et vævs bad, mens kraften af uterin muskelsammentrækninger registreres før og efter oxytocin stimulation i nærværelse af eller fravær af en afslappende stof. Selv om denne fremgangsmåde er meget nyttig, det kræver dyrt udstyr. Endvidere ligner isometriske sammentrækninger ikke de spontane myometriale bølgelignende sammentrækninger, der naturligt forekommer i den intakte uterus. Entydigt kan uterin myometriale bølger i gnavere visualiseres som uterin horn motilitet, når hele reproduktions kanalen (æggestokke, ovikanaler, uterus, og vagina) opretholdes i en bufferopløsning. Her præsenterer vi en ex vivo-metode til overvågning af den spontane motilitet af den intakte muse livmoder placeret i en Petri skål indeholdende oxygeneret Krebs buffer. Vi beskriver også en algoritme til kvantificering af motilitet ved hjælp af MATLAB motion tracker. Denne nye tilgang giver et nemt og billigere alternativ til at teste det afslappende potentiale af naturligt forekommende retsmidler og syntetiske forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer med dyr er blevet godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg på Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 måned-gamle F2-129S-C57BL/6 seksuelt-modne hunmus blev brugt i studiet.
Forsigtig: Sørg for sikkerhed ved at bære en laboratorie frakke, maske og handsker, når du arbejder med dyr og biologisk farlige materialer.
1. klargøring af opløsningen
- Forbered Krebs buffer, som indeholder: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mm Nah2po4, 0,56 mM Mgcl2, 25 mM NaHCO3, og 5 mm glucose, pH 7,4. Krebs-bufferen med en blanding af komprimerede gasser, der indeholder 5% CO2 og 95% O2 , samtidig med at buffer temperaturen holdes ved 37 °c ved hjælp af et cirkulerende vandbad.
- Der forberedes Dulbecco's fosfat-bufferet saltvand (DPBS), som indeholder: 2,68 mm kcl, 1,47 mmKH 2po4, 136,89 mm NaCl og 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4.
2. tilberedning af dyr
- Anæstetize mus ved indånding af isofluran (3%) med spild gas scavenging. Sørg for tilstrækkelig anæstesi ved at vurdere abstinens reflekser. Knib den bageste tå til at bekræfte ingen bevægelser er fremkaldt, hvilket indikerer tab af refleks svar. Efter den dybe anæstesi er opnået, aflive dyret ved decapitation.
Bemærk: Isoflurane kan forårsage glat muskel dilatation. Derfor bør den reproduktive tarm-præparat grundigt vaskes og inkuberet i Krebs buffer i mindst 15-30 min før påbegyndelse af ex vivo eksperimenter. Isofluran kan forårsage irritation og ubehag, når det er i kontakt med huden, så Fortsæt forsigtigt. - Placer kroppen på en stor veje båd foret med et papirhåndklæde.
Bemærk: Gravide kvindelige laboratoriepersonale bør ikke være involveret i forsøg med isofluran, fordi det kan nedsætte fostervægt, nedsætte føtal knogle ossifikation, og øge risikoen for spontan abort8, 9. Co2 indånding kan bruges som en erstatning for aflive mus.
3. bestemmelse af estrous Cycle Stadium
- Med små pincet, løft klitoris for at få adgang til vaginal ostium og langsomt indsætte en mikropipette spids indeholdende 10 μL af DPBS i vagina.
- Sørg for, at mikropipette spidsen er indsat gennem ostium i en vinkel på 10-30 ° for at undgå punktering af vaginal væggen. Væsken skal stadig være synlig i spidsen efter indsættelse. Hvis væsken ikke er synlig, spidsen blev indsat for langt ind i vagina, og paracervical område af vagina kunne have været perforeret.
- Træk let ned på de vaginale ostium muskler med spidsen af mikropipetten for at tillade luft at forlade vagina.
- Skyl forsigtigt vaginal hulen ved pipettering op og ned 2-3 gange med 10 μL DPBS, og Placer den trukne cellesuspension på et glas skred.
- Brug en inverteret fasekontrast mikroskop til at bestemme estrous cyklus fase gennem cytologiske analyse. Proceduren udføres som beskrevet andetsteds10,11. Sørg for, at cellesuspensionen ikke tørrer ud, før der kan foretages cytologiske analyser. Suspensionen kan om nødvendigt fortyndes med friske DPB'ER.
4. mus reproduktions kanal Ddissection
- Arranger musen i en liggende position og sprede dens ekstremiteter at udsætte maveregionen.
- Spray med 70% ethanol til at fugte og desinficere mave-området.
- Ved hjælp af tang, forsigtigt løfte huden placeret overlegen i klitoris. Lav små tværgående snit på de laterale aspekter af det nedre abdominalområde, op til de øvre ekstremiteter for at udsætte bughinden (figur 1A). Under denne proces, en ekstern flap vil danne. Som små snit er konstant lavet, vil klappen stige i størrelse.
- Forsigtigt gennem bughinden for at udsætte mave-tarmkanalen (figur 1B). Det er vigtigt at bemærke, at uterin horn kan ofte være placeret direkte under bughinde, så gør indsnit forsigtigt og ikke røre hornene, da dette kan påvirke uterin motilitet.
- Ved hjælp af pincet, fjerne fascia og fedtvæv, der dækker mave-tarmkanalen. Fjern følgende mavetarmkanalen segmenter fra bughulen: duodenum, jejunum, ileum, cecum, stigende og tværgående kolon (figur 1C).
- For at finde de reproduktive organer, først identificere urinblæren (figur 1C, "4"), som kan have en deformeret udseende på grund af tømning efter eutanasi. Skeden vil være lige under urinblæren.
- Find den kønsbehåring låsen ved sammenløbet af de pubiske knogler (caudally til blæren).
- Ved hjælp af en saks, fjerne den kønsbehåring låsen ved omhyggeligt at gøre indsnit på sine laterale sider gennem interpubic fibrocartilaginerende væv for at få adgang til og give en rute for vagina ekstraktion (figur 1D).
- Skær gennem mellem kødet placeret mellem anus og nedre del af vulva.
- Ved hjælp af pincet, løft vagina og langsomt punktafgiftspligtige endetarmen.
- Identificere to uterin horn, der bifurcate i en gaffel, rostrally til vagina. Find en indviklet æggelederen og æggestok i slutningen af hvert horn, som kan være skjult under de resterende mavetarmkanalen segmenter. Brug små dissekere saks til at fjerne eventuelle ledbånd, der forbinder til og støtte horn, ovikanalerne, og æggestokke i bughulen.
- Fjern den reproduktive tarmkanalen, som omfatter vagina, livmoderen, ovikanalerne, og æggestokkene, fra bughulen.
- Den isolerede reproduktions kanal (figur 1E) overføres til en 100 mm Petri skål fyldt med 10 ml dpbs. Du må ikke komprimere livmoder hornene for at undgå at beskadige myometrium.
- Brug pincet og kirurgisk saks til at fjerne enhver bindevæv og fedtvæv omkring livmoder horn og vagina samt enhver pels i den kønsbehåring region, der kunne hæmme billedkvaliteten. Fjern den brede ligament for at tillade motilitet af livmoder hornene.
- Vask den isolerede reproduktive kanal med friske DPBS to gange og overfør den til en 35 mm Petri skål fyldt med 3 mL oxygeneret Krebs opløsning.
5. vævs billeder
- Placer Petri skålen, der indeholder den reproduktive kanal i oxygenholdig Krebs buffer på en sort overflade. Opretholde skålen ved stuetemperatur.
Bemærk: Det er muligt at bruge en infrarød opvarmning pad til at vedligeholde vævet ved 37 °C. - Tillad 15-30 min for spontane sammentrækninger til at begynde. Optag spontan uterin motilitet i 10 min fra et aksialt plan ved hjælp af enhver form for digitalt videoudstyr.
- Overføre præparatet til en Petri skål, der indeholder oxygenholdig Krebs-bufferen suppleret med en test forbindelse. Optag spontan uterin motilitet i ca. 10 min fra et aksialt plan ved hjælp af enhver form for digitalt videoudstyr.
- Hele reproduktions kanalen vaskes i 100 mm Petri skål med 10 mL DPBS for at vurdere reversibiliteten af behandlingen.
- Overfør præparatet til en Petri skål med frisk oxygeneret Krebs buffer. Optag spontan uterin motilitet i ca. 10 min fra et aksialt plan ved hjælp af enhver form for digitalt videoudstyr.
- Overfør præparatet til en anden 35 mm Petri skål fyldt med iltet Krebs buffer suppleret med køretøjet til teststoffet for at sikre, at der ikke er mekanisk inducerede ændringer i spontan uterin motilitet. Dette er en vigtig kontrol.
- Overfør videooptagelserne til en computers harddisk.
6. data analyse
- Foretag klip ved hjælp af videoredigeringssoftware fra den originale videooptagelse, der indeholder kontrol-, behandlings-og vaske episoder.
- Brug MATLAB-softwaren og det medfølgende script (se online supplerende materiale) til at kvantificere spontan uterin motilitet.
Bemærk: Tilføjelsesprogrammet computer vision Toolbox til MATLAB skal være installeret, for at scriptet kan fungere fuldt ud.- Åbn MATLAB-scriptet, gå til fanen Editor , og klik på Kør.
- Vælg den første videofil, og klik på Åbn.
- Skriv en etiket til videofilen i pop op-dialogboksen, og klik på OK.
- Angiv det eller de tidsintervaller, der er nødvendige for at beregne frekvensen for horn bevægelsen (Δ euclidean distance/ΔS).
- Brug musemarkøren til at vælge to punkter på den første ramme i videoen. Et pop op-vindue vil bede om at bekræfte, at de valgte punkter skal bruges til sporing. Klik på Start for at starte den realtids sporingsproces, der vises i pop op-vinduet. Alternativt kan du klikke på Genvælg punkter for at vælge de to punkter igen.
- Overvåg nøjagtigheden af sporingsprocessen i pop op-vinduet.
- Overhold en sats vs. tid scatter plot og distance vs. tid scatter plot i et nyt pop-up vindue. Gem de to tal ved at vælge fil | Gem som i det samme vindue for at dokumentere dataene.
- Find en mappe med navnet Pointtrackerdata, der automatisk er oprettet af MATLAB, i samme mappe, som MATLAB-scriptet er placeret i. Identificer en Excel-fil med navnet label_Data indeholdende data punkter indsamlet fra videoen i to separate regnearksfaner.
Bemærk: enhver alternativ motion tracking software kan bruges til at kvantificere spontan uterus motilitet.
- Brug en passende software (f. eks. Excel eller SigmaPlot 13) til at udføre den statistiske analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser repræsentative billeder, der er taget under hele isolations proceduren for reproduktions kanalen, som er beskrevet i denne protokol. For at undgå at forurenes bufferen med pels, hvilket ville formindske videokvaliteten, fugtet vi muse legemet med 70% ethanol. Den vigtigste benchmark for dissektion afsnit af protokollen er at finde urinblæren. Livmoderen og vagina vil blive placeret ringere end urinblæren.
For at teste den protokol, vi behandlede hele reproduktive tarmkanalen med epinephrin. Epinephrin er velkendt for at forårsage uterin glat muskel afslapning. Dette hormon er endogent produceret i binyre medulla og fungerer som et stress hormon i pattedyr. Vi brugte 1 μM epinephrin i vores eksperimenter. Dette er en mækelses koncentration, der vides at forårsage maksimal respons12. Der blev udført en serie på fire eksperimenter. I alle forsøg, 1 μM epinephrin reversibelt inhiberet spontant uterin motilitet (figur 2).
For at kvantificere den spontane motilitet af den reproduktive kanal, designede vi en algoritme, der giver os mulighed for at vurdere den gennemsnitlige ændring i den euklidiske afstand mellem to udvalgte punkter på musens reproduktive kanal. Punkt positionerne spores ved hjælp af bevægelses sporings modulet i MATLAB-softwaren. Det tilsvarende script for MATLAB, som vi brugte til at beregne de euklidiske afstande, findes i det supplerende materiale online. Placeringen af punkter er afgørende for en vellykket motion tracking procedure. Der bør tages nøje hensyn til kvaliteten af de videoer, fordi de lette refleksioner fra Petri Rens væg kan distrahere bevægelses trackeren, og det kan stoppe sporing af horn bevægelsen, mens re-tildele punktet til en af lyset Refleksioner. Vi valgte at placere et af punkterne i midten af et horn for at sikre, at det var langt nok fra Petri skålen vægrefleksioner. Det andet punkt blev normalt valgt på vagina, da det ikke udviser spontan motilitet. Figur 3 indeholder en stikprøve af dataanalyse, og supplerende figur 1 viser de repræsentative billeder, der er erhvervet under bevægelsessporing.
Figur 1 : Trin i hele reproduktive kanal isolation. A) der blev foretaget et snit i huden, og maveregionen blev eksponeret over bughinden (1). (B) den serøse membran blev langsomt åbnet for at udsætte mave-tarmkanalen (2). C) mave-tarmkanalen er blevet flyttet for at eksponere livmoder hornene (3). Urinblæren (4) kan visualiseres nær sammenløbet af hornene. D) livmoder hornene er blevet befriet, og der er foretaget nedskæringer på side siderne af den pubiske låsen (5) for at udsætte skeden (6). E) fjernelse af den isolerede reproduktions kanal og placering i dpbs-opløsning. Eventuel overskydende pels eller bindevæv blev fjernet. (F) en dyb fordybning kan ses på skeden (højre) efter fjernelse af endetarmen (venstre, 7). G) det omgivende bindevæv fjernes. En digital kamera og program Suite software (version 3.7.0) blev brugt til at erhverve real-time billeder under dissektion (kameraindstilling: Hue 20/mætning 80). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Der vises et repræsentativt eksperiment med hele den isolerede reproduktions kanal. Billederne blev taget 15 s fra hinanden før (A), under (B), og efter (C) anvendelse af 1 μM epinephrin. Den reproduktive kanal forberedelse udstillet høj motilitet i paneler A og C i fravær af adrenalin, men det er latent i panel B med tilstedeværelsen af 1 μM epinephrin. De uredigerede videooptagelser leveres som supplerende videoer 1-3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Data analyse i det ex vivo-eksperiment, der er Figur 2. (A) der vises et tidsforløb for den euklidiske distance ændringsrate. De referencepunkter, mellem hvilke afstanden blev bestemt under spontan uterin motilitet, vises som grønne prikker i indsættet. Pointene blev udvalgt på den proksimale del af vagina og det midterste segment af et uterin horn som afbildet. De blå fyldte cirkler viser den spontane motilitet sats værdier før tilsætning adrenalin, de røde cirkler viser den spontane motilitet satser i nærværelse af 1 μM adrenalin, og de grønne fyldte cirkler viser den spontane motilitet satser efter en udskylningen. (B) en sammenligning af gennemsnitlige euklidiske afstand ændre satser (pixels/s) før tilsætning af adrenalin (blå bar), i nærværelse af 1 μM epinephrin (rød bar), og efter en udvasknings (grøn bar). MATLAB-softwaren blev brugt til at kvantificere uterin motilitet. Δt-intervallet blev sat til 5 s. "ΔDistance" beregnes som forskellen mellem den oprindelige ramme afstand og ramme afstanden 5 s senere. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af Kruskal-Wallis envejs analyse af variansen på ranglisterne efterfulgt af alle parvise multiple sammenlignings procedurer i henhold til Dunns metode ved hjælp af SigmaPlot 13. Stjernen angiver det datasæt, der var signifikant forskelligt fra de andre eksperimentelle datasæt (P = < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende film 1: time-lapse videoklip, der viser spontan uterin motilitet, før du tilføjer 1 μM epinephrin. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Supplerende film 2: time-lapse videoklip, der viser spontan uterin motilitet, når Krebs buffer blev suppleret med 1 μM epinephrin. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Supplerende film 3: time-lapse videoklip, der viser spontan uterin motilitet efter udskylningen. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Supplerende figur 1: repræsentative billeder taget hver 15 s under motion tracking. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materiale: det MATLAB-baserede sporings algoritme script. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en metode til vurdering af spontan kontraktilitet af hele gnaver reproduktions kanalen, som omfatter æggestokkene, ovikanalerne, livmoder horn og vagina. Vi brugte en lignende metode til at demonstrere den afslappende effekt af phenylephrin på spontan uterin motilitet13, men i fortiden var vi ude af stand til at levere kvantitative analyse af dataene. I dette arbejde, vi udviklet en algoritme til kvantitativ motilitet dataanalyse ved hjælp af MATLAB motion tracking modul. Dette er en nyttig teknik til afprøvning af nye lægemidler, der regulerer uterin kontraktilitet uanset om narkotika slappe eller snøre uterin glatte muskler. En stor fordel ved denne model er, at den reproduktive tarmkanalen er intakt, bevare alle iboende intrauterin cellulære interaktioner. Denne protokol kræver navnlig ikke noget særligt udstyr. Livmoderen isolation kan gøres med en simpel forstørrelsesglas og der er ingen krav til nogen sofistikeret Video Recording udstyr. Hvis et digitalt kamera med høj opløsning ikke er tilgængeligt til billedbehandling, kan et personligt mobiltelefon kamera bruges som et alternativ.
Det mest kritiske skridt i protokollen til vurdering af reproduktionsevnen motilitet er at opnå levedygtige uterin væv. Myometrium, inden for livmoder horn, er det motile sædceller element i reproduktions kanalen. Derfor, under isolation er det vigtigt at undgå at overstrække eller komprimere hornene. Det er også vigtigt at sikre, at livmoder vævet er godt iltet i hele eksperimentet for at opretholde uterin motilitet. Den bedste måde at forhindre skader på uterin horn er at komme i kontakt med kun det tilstødende bindevæv, mens du rengør livmoderen eller flytter reproduktions kanalen. Da skeden ikke kontrakt spontant under forsøget, er det acceptabelt at komprimere det med pincet, når du flytter den reproduktive tarmkanalen fra en skål til en anden. Hele reproduktions kanalen eksperimenter kan udføres i forbindelse med isometrisk spænding optagelser, der vurderer preload-og/eller oxytocin-induceret uterin kontraktilitet. Men en wire myograph er et dyrt stykke udstyr, der ikke altid er tilgængelig i et fælles laboratorium miljø.
Den beskrevne metode har flere begrænsninger. Da myometrium er meget følsom over for kompressioner eller trækker, dette komplicerer dissektions processen af reproduktions kanalen. Hvis hornene beskadiges under dissektion, vil der ikke blive observeret spontan kontraktilitet. Dette er en væsentlig begrænsning af protokollen, fordi det er usikkert, om de kontraktile glatte muskelceller var ubevidst beskadiget på trods af brugen af ordentlig pleje og forsigtighed, eller om de manglede motilitet på grund af en naturlig årsag. Faktisk observerede vi ingen motilitet i 10-20% af de reproduktive tarm-præparater i denne undersøgelse. Det er vigtigt at sikre, at det vaginal segment af reproduktions kanalen forbliver intakt, fordi fjernelse af vagina markant nedsætter spontan motilitet af livmoder horn. I modsætning hertil hæmmer fraværet af æggestokke og/eller ovikanalerne ikke hele reproduktions kanalen motilitet. Desuden bør man bemærke, at nogle forbindelser er følsomme over for oxidation. For eksempel, epinephrin kan let oxideret. Afprøvning af virkningerne af sådanne forbindelser ville kræve kortere inkubationstid forhindre overdreven oxidation. Men kortere inkubationstider kan hæmme et lægemiddel evne til effektivt at trænge ind i tykkelsen af livmodervæggen. En yderligere begrænsning af metoden omfatter vurdering af de 3-dimensionelle bevægelser af hornene. Hornene har en medfødte natur af curling i en 3-dimensionel plan, komplicerende analyse. For at overvinde dette problem, kan man nedsætte Krebs buffer volumen i Petri skålen til 2 mL.
Vi fandt, at den optimale aldersklasse for kvindelige mus er 2-5 måneder. Vi oplyste, at anæstesi med isofluran kan resultere i nedsat motilitet og yderligere skylning kan være nødvendigt for at forhindre denne isofluran-induceret komplikation. Alternativt kan man bruge kuldioxid til at aflive mus. Hvis der opstår problemer under dissektion, fokus på landemærker, såsom urinblæren, kan hjælpe. For at kvantificere de opnåede motilitet data, brugte vi MATLAB software. Det store problem med motion tracking i MATLAB var, at trackeren ikke var i stand til korrekt at lokalisere hornene, når de flyttede nær væggen af Petri skålen. Adobe Premier-element blev brugt til at klippe videooptagelserne og reducere størrelsen på videofiler. Selv om det er en fremragende softwarepakke, det kan ikke altid være tilgængelig i en typisk laboratorie indstilling. En alternativ mulighed kan være at bruge gratis motion tracking modul ImageJ software eller endda simpel manuel vurdering af billeder taget med identiske intervaller og sammenligne placeringen af livmoder horn på en segmentering gitter. Figur 2 viser et eksempel på simpel vurdering af den spontane uterin motilitet og omfatter en sammenligning af reproduktive tarm bevægelser inden for 15 s interval.
Ingen enkel metode, der vurderer uterin motilitet i en Petri skål indstilling er blevet rapporteret hidtil. Ultralyd og intrauterin tryk sensorer kan bruges til at overvåge Human uterus kontraktilitet14. Det er dog vanskeligt at studere underliggende mekanismer i den intakte humane livmoder. Derfor er brugen af dyremodeller til undersøgelse af spontan uterin kontraktilitet vigtig. Den kvindelige reproduktive kanal udstiller spontane myometriale sammentrækninger, der er afgørende for en kvindes trivsel, herunder hendes frugtbarhed og arbejdskraft15. Disse sammentrækninger kan visualiseres som endometriale bølger under en ultralydsundersøgelse. Men under menstruation, over kontraktilitet af livmoderen kan skabe ubehag og føre til dysmenorré, eller menstruations kramper. For at hjælpe med at lindre nogle symptomer på dysmenorré, nye lægemidler rettet mod afslappende uterin glatte muskler er nødvendige. Vores enkle metode giver en måde til at vurdere virkningerne af forskellige forbindelser på uterin kontraktilitet.
I denne undersøgelse, vi brugte vores Easy Petri skål model til at bekræfte effektiviteten af epinephrin, en uterin afslappende hormon12, at forhindre spontan uterin motilitet af isolerede mus reproduktive skrifter. Vores metode kan også anvendes til afprøvning af sådanne forbindelser, der kan øge kontraktilitet af livmoderen. Vigtigere, denne metode kan have potentialet til at blive opgraderet til gennemløb Drug screening ved hjælp af en seks-brønd plade format. Således kan den metode, vi præsenterer her, have evnen til at blive optimeret til industriel skala screeningprocedurer. Vi har ikke forsøgt at udføre lignende eksperimenter i større gnavere, men vi forventer, at lignende spontan motilitet vil være til stede i isolerede rotte uteri. De større reproduktive tarmkanalen af rotter kan udvise mere udtalt uterin motilitet. Vi fandt, at gravide mus uteri kan også vurderes ved hjælp af denne ex vivo uterin motilitet Petri skål model. Som forventet, den spontane motilitet af den gravide livmoderen blev reduceret, fordi det er i en stille tilstand. Men, øget vægt tilsættes af føtal væv kan også bidrage til motilitet obstruktion. Det kan stadig være gavnligt at yderligere udforske egnetheden af hele denne reproduktive kanal model til at vurdere effekten af tocolytic (relaxant) eller uterotoniske (stimulerende) forbindelser i forbindelse med graviditet og arbejdskraft. Således præsenterede vi her en let ex vivo-model til vurdering af den spontane motilitet i den intakte reproduktions kanal. Denne fremgangsmåde kan vedtages for narkotika screening og udnyttes til nye lægemidler opdagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af interne IE-midler. SIDEN udtænkt studiet. XC og AGO var involveret i udformningen af de beskrevne eksperimenter. FL og siden analyserede og fortolkede dataene. KLL, JOB, FL udførte alle ex vivo -eksperimenter. FL skrev MATLAB-scriptet. KLL, JOB, og siden skrev manuskriptet. Alle forfattere læste og godkendte den endelige version af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
- Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
- Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
- Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
- Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
- Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
- Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
- Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
- Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
- Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
- Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
- Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
- Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).
