Summary
As contrações uterinas são importantes para o bem-estar das fêmeas. No entanto, a contratilidade patologicamente aumentada pode resultar em dismenorreia, especialmente em fêmeas mais jovens. Aqui, nós descrevemos uma preparação ex vivo simples permitindo a avaliação rápida da eficácia de afrouxamento do músculo liso que podem ser usados tratando o dysmenorrhea.
Abstract
A dismenorreia, ou cãibras dolorosas, é o sintoma mais comum associado à menstruação em fêmeas e sua gravidade pode dificultar a vida cotidiana das mulheres. Aqui, apresentamos um método fácil e barato que seria instrumental para testar novas drogas diminuindo a contratilidade uterina. Este método utiliza a habilidade original do intervalo reprodutivo do rato inteiro para expor a motilidade espontânea quando mantido ex vivo em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Esta motilidade espontânea assemelha-se à atividade myometrial onda-como do útero humano, referido como ondas endometrial. Para demonstrar a eficácia do método, empregamos um bem conhecido medicamento relaxante uterino, epinefrina. Nós demonstramos que a motilidade espontânea do intervalo reprodutivo do rato inteiro pode ser rapidamente e reversivelmente inibida pela epinefrina de 1 μM neste modelo do prato de Petri. Documentar as mudanças da motilidade uterina pode ser facilmente feito usando um telefone inteligente comum ou uma câmera digital sofisticada. Nós desenvolvemos um algoritmo MATLAB-baseado permitindo o seguimento do movimento para quantificar mudanças uterine espontâneas da motilidade medindo a taxa de movimentos uterine do chifre. Uma grande vantagem dessa abordagem ex vivo é que o trato reprodutivo permanece intacto durante todo o experimento, preservando todas as interações celulares intrauterinas intrínsecas. A principal limitação dessa abordagem é que até 10-20% dos úteros podem não apresentar motilidade espontânea. Até o momento, este é o primeiro método quantitativo ex vivo para avaliar a motilidade uterina espontânea em um modelo de prato de Petri.
Introduction
Como um órgão fêmea principal, o útero é crucial para a reprodução e essencial para a nutrição do feto1. O útero consiste em três camadas: o perimetrium, o miométrio e o endométrio. O miométrio é a camada contrátil principal do útero e joga um papel chave na entrega do feto. O endométrio é a camada mais interna que reveste a cavidade uterina e é essencial para a implantação do embrião. Em fêmeas não gestantes em idade reprodutiva, a camada endometrial é vertida mensalmente no início do ciclo menstrual. O miométrio auxilia neste processo de derramamento, mantendo as contrações miometrial espontâneas necessárias para limpar o tecido endometrial necrótico do útero1.
Infelizmente, aumento da contratilidade miometrial pode resultar em efeitos colaterais negativos, tais como dismenorreia, ou cãibras menstruais dolorosas. Isto é especialmente observado em fêmeas jovens e mulheres nulíparas2. No entanto, a dismenorreia é diferente para cada mulher e depende da força de suas contrações miometrial; as contrações mais fortes são frequentemente associadas com a sensação de cãibras severas3. A contratilidade miometrial pode ser visualizada usando ultrassonografia uterina e muitas vezes é reconhecida como ondas endometriais. A liberação aumentada das prostaglandinas durante a menstruação4 em um útero que submete-se a descamação endometrial é acreditada para contribuir ao hypercontractility myometrial aumentado, tendo por resultado a isquemia e o hipóxia do músculo uterine e aumentado assim dor3.
Dismenorreia severa pode dificultar a atividade do dia-a-dia de algumas mulheres e 3 a 33% das mulheres têm dor muito severa, o que poderia causar uma mulher a ser acamados por 1 a 3 dias cada ciclo menstrual5. A dismenorreia é a principal causa de morbidade ginecológica em mulheres em idade reprodutiva, independentemente da idade, nacionalidade e status econômico5. A prevalência estimada de dismenorreia é alta e variável, variando de 45% a 93% em mulheres em idade reprodutiva5. A dor associada à dismenorreia tem efeito no cotidiano das mulheres e pode resultar em mau desempenho acadêmico em adolescentes, menor qualidade de sono, restrição de atividades diárias e alterações de humor5.
Muitas mulheres que experimentam dismenorreia grave recorrer a medicamentos over-the-counter para aliviar a sua dor. Tais medicamentos de balcão contêm inibidores da ciclooxigenase (COX) que impedem a formação de prostaglandinas6. No entanto, os inibidores da COX estão associados a eventos cardiovasculares adversos, e cerca de 18% das mulheres com dismenorreia não respondem a esses inibidores7. Portanto, há uma necessidade de novos medicamentos para reduzir as cólicas menstruais. Desde que sobre o contratilidade do útero contribui à patogénese do dysmenorrhea, uma estratégia possível pode ser o uso de relaxants uterine.
É benéfico quantificar os efeitos de drogas relaxantes potenciais em um modelo de ocorrência natural myometrial espontâneo-como contrações de onda. Entretanto, assim distante, nenhum método ex vivo eficiente para testar drogas músculo-relaxando no útero intacto foi descrito. Atualmente, medições de tensão isométrica são usadas para avaliar os efeitos de drogas relaxantes. Durante tais medidas, uma tira do músculo uterine é mantida em um comprimento constante a pré-carga em um banho do tecido quando a força de contrações do músculo uterine for gravada antes e depois da estimulação do ocitocina na presença ou na ausência de uma droga relaxante. Embora esta aproximação seja muito útil, exige o equipamento caro. Além disso, as contrações isométricas não se assemelham às contrações myometrial espontâneas da onda-como que ocorrem naturalmente no útero intacto. Excepcionalmente, as ondas myometrial uterine nos roedores podem ser visualizadas como a motilidade uterine do chifre quando o intervalo reprodutivo inteiro (ovários, oviducts, útero, e vagina) é mantido em uma solução do amortecedor. Aqui, nós apresentamos um método ex vivo para monitorar a motilidade espontânea do útero intacto do rato coloc em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Também descrevemos um algoritmo de quantificação da motilidade utilizando o rastreador de movimento MATLAB. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos dispendiosa para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente e compostos sintéticos.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade de Indiana (Indianapolis, IN). 2-5 mês-velho F2-129S-C57BL/6 ratos fêmeas sexualmente maduros foram utilizados no estudo.
Atenção: Assegure a segurança desgastando um revestimento, uma máscara, e umas luvas do laboratório ao trabalhar com animais e materiais bioperigosos.
1. preparação da solução
- Prepare o tampão Krebs, que contém: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mm NaH2po4, 0,56 mM MgCl2, 25 mm NaHCO3e 5 mm glicose, pH 7,4. Oxigenar continuamente o tampão Krebs com uma mistura de gases compridos contendo 5% CO2 e 95% o2 , mantendo a temperatura tampão a 37 ° c usando um banho de água circulante.
- Prepare a solução salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS), que contém: 2,68 mm kcl, 1,47 mm KH2po4, 136,89 mm NaCl e 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4.
2. preparação animal
- Anestesiando camundongos usando inalação de isoflurano (3%) com a eliminação de gases residuais. Assegure a anestesia adequada avaliando reflexos da retirada. Aperte o dedo traseiro para afirmar que não há movimentos são eliciados, indicando a perda de respostas reflexas. Após a anestesia profunda é alcançada, eutanizar o animal por decapitação.
Nota: Isoflurano pode causar dilatação do músculo liso. Portanto, a preparação do trato reprodutivo deve ser extensivamente lavada e incubada no tampão Krebs por pelo menos 15-30 min antes de iniciar os experimentos ex vivo. O isoflurano pode causar irritação e desconforto quando está em contacto com a pele, por isso proceda com precaução. - Coloc o corpo em um grande barco do pesar alinhado com uma toalha de papel.
Nota: O pessoal de laboratório feminino grávida não deve estar envolvido em experimentos com isoflurano, pois pode diminuir o peso fetal, diminuir a ossificação esquelética fetal e aumentar o risco de aborto espontâneo8,9. A inalação de CO2 pode ser usada como um substituto para eutanizar camundongos.
3. determinação da fase de ciclo estral
- Com fórceps pequeno, levante o clitóris para ganhar o acesso ao óstio vaginal e insira lentamente uma ponta da micropipeta que contem 10 μL de dpbs no vagina.
- Assegure-se de que a ponta da micropipeta seja inserida através do óstio em um ângulo de 10-30 ° para evitar perfurar a parede vaginal. O líquido ainda deve ser visível na ponta após a inserção. Se o líquido não é visível, a ponta foi inserida demasiado distante no vagina, e a área paracervicais do vagina pôde ter sido perfurada.
- Puxe levemente para baixo nos músculos do óstio vaginal com a ponta da micropipeta para permitir que o ar saia da vagina.
- Lave lentamente a cavidade vaginal pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes com 10 μL de DPBS e coloque a suspensão de células desenhadas numa lâmina de vidro.
- Use um microscópio de contraste de fase invertida para determinar o estágio de ciclo estral através da análise citológica. O procedimento é feito conforme descrito em outros10,11. Assegure-se de que a suspensão celular não seque antes que a análise citológica possa ser realizada. A suspensão pode ser diluída com DPBS fresco, se necessário.
4. Ddissecção do trato reprodutivo do rato
- Arranje o rato em uma posição supina e espalhe suas extremidades para expor a região abdominopelvic.
- Spray com 70% de etanol para umedecer e desinfectar a área abdominopélvica.
- Usando fórceps, levante cuidadosamente a pele localizada superior ao clitóris. Fazer pequenas incisões transversais nos aspectos laterais da área abdominal inferior, até as extremidades superiores para expor o peritônio (Figura 1a). Durante este processo, uma aleta externa formarão. Porque as incisões pequenas são feitas continuamente, a aleta aumentará no tamanho.
- Corte cuidadosamente o peritônio para expor o trato gastrointestinal (Figura 1B). É importante notar que os chifres uterinos podem muitas vezes ser localizado diretamente o peritônio, para fazer incisões cautelosamente e não tocar os chifres, pois isso pode afetar a motilidade uterina.
- Usando fórceps, retire a fáscia e tecido adiposo cobrindo o trato gastrointestinal. Remover os seguintes segmentos do trato gastrointestinal da cavidade abdominal: o duodeno, jejuno, íleo, cálio, cólon ascendente e transverso (Figura 1C).
- Para localizar os órgãos reprodutivos, primeiro identifique a bexiga urinária (Figura 1C, "4"), que pode ter uma aparência deflacionada devido à micção após a eutanásia. A vagina estará bem embaixo da bexiga urinária.
- Localize a sínfise púbica na confluência dos ossos púbica (caudally à bexiga).
- Usando tesouras, retire a sínfise púbica, fazendo incisões cuidadosamente em seus lados laterais através do tecido fibrocartilaginoso interpúbica para obter acesso e fornecer uma rota para a extração da vagina (Figura 1D).
- Corte através do períneo localizado entre o ânus e a parte inferior da vulva.
- Usando fórceps, levante a vagina e retire lentamente o reto.
- Identifique dois chifres uterinos que se bifurcam em um garfo, rostralmente para a vagina. Localize um oviduto e um ovário complicado no fim de cada chifre, que pode ser escondido os segmentos restantes do aparelho gastrointestinal. Use tesouras de dissecação pequenas para remover todos os ligamentos que conectam e suportam os chifres, os oviducts, e os ovários dentro da cavidade abdominal.
- Retire o trato reprodutivo, que inclui a vagina, útero, ovidutos e ovários, a partir da cavidade abdominal.
- Transferir o trato reprodutivo isolado (Figura 1E) para um prato de Petri de 100 mm preenchido com 10 ml de dpbs. Não comprima os chifres uterinos para evitar danificar o miometrium.
- Use fórceps e tesoura cirúrgica para remover qualquer tecido conjuntivo e adiposo em torno dos chifres uterinos e vagina, bem como qualquer pele na região Púnica que poderia dificultar a qualidade da imagem. Retire o ligamento largo para permitir a motilidade dos chifres uterinos.
- Lave o trato reprodutivo isolado com o DPBS fresco duas vezes e transfira-o para um prato de Petri de 35 mm preenchido com 3 mL de solução de Krebs oxigenada.
5. imagem latente do tecido
- Coloque a placa de Petri contendo o trato reprodutivo no tampão de Krebs oxigenado em uma superfície preta. Mantenha o prato à temperatura ambiente.
Nota: É possível usar uma almofada de aquecimento infravermelha para manter o tecido em 37 ° c. - Aguarde 15-30 min para que as contrações espontâneas comecem. Grave a motilidade uterina espontânea por 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
- Transfira a preparação para uma placa de Petri contendo o tampão de Krebs oxigenado suplementado com um composto de teste. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
- Lave todo o trato reprodutivo em 100 mm prato de Petri com 10 mL de DPBS para avaliar a reversibilidade do tratamento.
- Transfira a preparação para uma placa de Petri com o tampão Krebs recém-oxigenado. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
- Transfira a preparação para outro prato de Petri de 35 mm preenchido com tampão de Krebs oxigenado suplementado com o veículo para o composto de teste para garantir que não haja alterações induzidas mecanicamente na motilidade uterina espontânea. Este é um controle importante.
- Transfira a gravação de vídeo para um disco rígido do computador.
6. análise de dados
- Faça clipes usando qualquer software de edição de vídeo da filmagem original contendo o controle, tratamento e episódios de lavagem.
- Use o software MATLAB e o script fornecido (consulte o material complementar on-line) para quantificar a motilidade uterina espontânea.
Nota: O complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB deve ser instalado para que o script seja totalmente funcional.- Abra o script MATLAB, vá para a guia Editor e clique em executar.
- Selecione o primeiro arquivo de vídeo e clique em abrir.
- Insira um rótulo para o arquivo de vídeo na caixa de diálogo pop-up e clique em OK.
- Insira o (s) intervalo (es) de tempo necessário para calcular a taxa de movimento do chifre (distância Δ euclidiana/ΔS).
- Use o cursor do mouse para selecionar dois pontos no primeiro quadro do vídeo. Uma janela pop-up pedirá para confirmar que os pontos selecionados devem ser usados para o rastreamento. Clique em Iniciar para iniciar o processo de rastreamento em tempo real que será exibido na janela pop-up. Como alternativa, clique em selecionar pontos para selecionar novamente os dois pontos.
- Monitore a precisão do processo de rastreamento na janela pop-up.
- Observe um gráfico de dispersão de taxa versus tempo e distância versus gráfico de dispersão de tempo em uma nova janela pop-up. Salve as duas figuras selecionando arquivo | Salvar como na mesma janela para documentar os dados.
- Localize uma pasta denominada Pointtrackerdata, criada automaticamente pelo MATLAB, no mesmo diretório onde o script MATLAB está localizado. Identifique um arquivo do Excel denominado label_Data contendo pontos de dados coletados do vídeo em duas guias de planilha separadas.
Nota: qualquer software de rastreamento de movimento alternativo pode ser usado para quantificar a motilidade espontânea do útero.
- Use um software apropriado (por exemplo, Excel ou SigmaPlot 13) para realizar a análise estatística.
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Representative Results
A Figura 1 mostra imagens representativas tiradas durante todo o procedimento de isolamento do trato reprodutivo descrito neste protocolo. Para evitar contaminar o tampão com pêlo, o que diminuiria a qualidade do vídeo, umedecido o corpo do mouse com 70% de etanol. A principal referência para a seção de dissecção do protocolo é encontrar a bexiga urinária. O útero ea vagina será localizado inferior à bexiga urinária.
Para testar o protocolo, tratamos todo o trato reprodutivo com epinefrina. A epinefrina é bem conhecida por causar relaxamento do músculo liso uterino. Este hormônio é produzido endogenamente na medula adrenal e serve como um hormônio do estresse em mamíferos. Nós usamos epinefrina de 1 μM em nossos experimentos. Esta é uma concentração saturando conhecida para causar a resposta máxima12. Uma série de quatro experimentos foi realizada. Em todos os ensaios, 1 μM de epinefrina reversivelmente inibiu a motilidade uterina espontânea (Figura 2).
Para quantificar a motilidade espontânea do trato reprodutivo, projetamos um algoritmo que nos permite avaliar a taxa média de mudança na distância euclidiana entre dois pontos selecionados no trato reprodutivo do camundongo. As posições de ponto são rastreadas usando o módulo de rastreamento de movimento do software MATLAB. O roteiro correspondente para o MATLAB, que usamos para calcular as distâncias euclidianas, é fornecido no material suplementar online. A posição dos pontos é fundamental para um procedimento de rastreamento de movimento bem-sucedido. A consideração cuidadosa deve ser tomada a respeito da qualidade dos vídeos porque as reflexões claras da parede da placa de Petri podem distrair o perseguidor de movimento, e pode parar de seguir o movimento do chifre ao re-atribuindo o ponto a um da luz Reflexões. Optou-se por colocar um dos pontos no meio de um chifre para garantir que era longe o suficiente das reflexões parede prato de Petri. O segundo ponto foi selecionado geralmente no vagina desde que não exibiam a motilidade espontânea. A Figura 3 fornece uma amostra de análise de dados e a Figura complementar 1 mostra as imagens representativas adquiridas durante o acompanhamento de movimento.
Figura 1 : Etapas de isolação inteira do intervalo reprodutivo. (A) uma incisão na pele foi feita e a região abdominopélvica foi exposta acima do peritônio (1). (B) a membrana serosa foi lentamente aberta para expor o trato gastrointestinal (2). (C) o trato gastrointestinal foi movido para expor os chifres uterinos (3). A bexiga urinária (4) pode ser visualizada perto da conjunção dos chifres. (D) os chifres uterinos foram liberados e os cortes foram feitos nos lados laterais da sínfise púbica (5) para expor a vagina (6). (E) remoção do trato reprodutivo isolado e colocação em solução de dpbs. Qualquer excesso de pele ou tecido conjuntivo foi removido. (F) um recuo profundo pode ser visto na vagina (direita) após a remoção do reto (esquerda, 7). (G) o tecido conjuntivo circundante é removido. Uma câmera digital e software Application Suite (versão 3.7.0) foi usado para adquirir imagens em tempo real durante a dissecção (configuração da câmera: Hue 20/Saturation 80). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Um experimento representativo com todo o trato reprodutivo isolado é mostrado. As imagens foram realizadas 15 s separadas antes (a), durante (B), e após (C) a aplicação de epinefrina 1 μm. A preparação do trato reprodutivo exibiu alta motilidade nos painéis A e C na ausência de epinefrina, mas é quiescente no painel B com a presença de epinefrina a 1 μM. A gravação de vídeo não editada é fornecida como vídeos complementares 1-3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de dados no experimento ex vivo descrito em Figura 2. (A) um curso do tempo da taxa euclidiana da mudança da distância é mostrado. Os pontos de referência entre os quais a distância foi determinada durante a motilidade uterina espontânea são mostrados como pontos verdes no Inset. Os pontos foram selecionados na parte proximal do vagina e no segmento médio de um chifre uterine como representado. Os círculos cheios azuis mostram os valores espontâneos da taxa da motilidade antes de adicionar a epinefrina, os círculos vermelhos mostram as taxas espontâneas da motilidade na presença da epinefrina de 1 μM, e os círculos cheios verdes mostram as taxas espontâneas da motilidade após um washout. (B) uma comparação das taxas médias de mudança de distância euclidiana (pixels/s) antes da adição de epinefrina (barra azul), na presença de 1 μm de epinefrina (barra vermelha), e após um washout (barra verde). O software MATLAB foi utilizado para quantificar a motilidade uterina. O intervalo Δt foi fixado em 5 s. "ΔDistance" é calculado como a diferença entre a distância do quadro inicial e a distância do quadro 5 s mais tarde. A análise estatística foi realizada utilizando-se a análise de variância One Way de Kruskal-Wallis em fileiras seguidas de todos os procedimentos de comparação múltipla emparelhando de acordo com o método de Dunn usando SigmaPlot 13. O asterisco indica o conjunto de dados que foi significativamente diferente dos outros conjuntos de dados experimentais (P = < 0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme suplementar 1: clipe de vídeo Time-Lapse mostrando motilidade uterina espontânea antes de adicionar 1 μm de epinefrina. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Filme suplementar 2: clipe de vídeo Time-Lapse mostrando motilidade uterina espontânea quando o tampão de Krebs foi suplementado com epinefrina a 1 μm. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Suplementar filme 3: Time-Lapse clipe de vídeo mostrando motilidade uterina espontânea após washout. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Complementar Figura 1: imagens representativas tiradas a cada 15 s durante o rastreamento de movimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Material suplementar: o script de algoritmo de rastreamento baseado em MATLAB. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, descrevemos um método para avaliar a contratilidade espontânea de todo o trato reprodutivo de roedores, que inclui os ovários, ovidutos, chifres uterinos e a vagina. Utilizou-se um método semelhante para demonstrar o efeito relaxante da fenilefrina na motilidade uterina espontânea13, porém, no passado não pudemos fornecer análise quantitativa dos dados. Neste trabalho, desenvolvemos um algoritmo para análise quantitativa de dados de motilidade utilizando o módulo de rastreamento de movimento MATLAB. Esta é uma técnica útil para testar novas drogas que regulam a contratilidade uterina, independentemente de se as drogas relaxam ou contraem músculos lisos uterinos. Uma grande vantagem deste modelo é que o trato reprodutivo está intacto, preservando todas as interações celulares intrauterinas intrínsecas. Notavelmente, este protocolo não requer nenhum equipamento especial. O isolamento do útero pode ser feito com uma lupa simples e não há nenhuma exigência para qualquer equipamento de gravação de vídeo sofisticado. Se uma câmera digital de alta resolução não estiver disponível para imagens, uma câmera de telefone móvel pessoal pode ser usada como uma alternativa.
A etapa mais crítica do protocolo de avaliação da motilidade do trato reprodutivo é a obtenção de tecido uterino viável. O myometrium, dentro dos chifres uterine, é o elemento motile do intervalo reprodutivo. Portanto, durante o isolamento é importante evitar o estiramento excessivo ou comprimir os chifres. Também é importante garantir que o tecido uterino seja bem oxigenado durante todo o experimento para manter a motilidade uterina. A melhor maneira de evitar qualquer dano aos chifres uterinos é fazer contato com apenas o tecido conjuntivo adjacente ao limpar o útero ou mover o trato reprodutivo. Uma vez que a vagina não contrair espontaneamente durante o experimento, é aceitável para comprimi-lo com o fórceps ao mover o trato reprodutivo de um prato para outro. As experiências inteiras do intervalo reprodutivo podem ser executadas conjuntamente com as gravações isométricas da tensão que avaliam a contratilidade uterine Preload-e/ou oxytocin-induzida. Entretanto, um miógrafo do fio é uma parte de equipamento cara que não esteja sempre disponível em um ambiente comum do laboratório.
O método descrito tem várias limitações. Desde que o miométrio é muito sensível às compressões ou às trações, este complica o processo da dissecção do intervalo reprodutivo. Se os chifres forem danificados durante a dissecção, nenhuma contratilidade espontânea será observada. Esta é uma limitação principal do protocolo porque é incerto se as pilhas de músculo liso contrátil foram danificadas inconscientemente apesar do uso do cuidado apropriado e do cuidado ou se faltou a motilidade devido a uma causa natural. Na verdade, não observamos motilidade em 10-20% das preparações do trato reprodutivo neste estudo. É importante garantir que o segmento vaginal do trato reprodutivo permaneça intacto porque a remoção da vagina diminui acentuadamente a motilidade espontânea dos chifres uterinos. Em contrapartida, a ausência de ovários e/ou ovidutos não prejudica toda a motilidade do trato reprodutivo. Além disso, deve-se notar que alguns compostos são sensíveis à oxidação. Por exemplo, a epinefrina pode ser facilmente oxidado. Testar os efeitos de tais compostos exigiria um tempo de incubação mais curto impedindo a oxidação excessiva. No entanto, tempos de incubação mais curtos podem dificultar a capacidade de uma droga para penetrar eficientemente a espessura da parede uterina. Uma outra limitação do método inclui a avaliação dos movimentos 3-dimensional dos chifres. Os chifres têm uma natureza inata de ondulação em um plano tridimensional, complicando a análise. Para superar esse problema, pode-se diminuir o volume do tampão Krebs na placa de Petri para 2 mL.
Nós encontramos que a escala de idade óptima para ratos fêmeas é 2-5 meses. Nós indicamos que a anestesia com isoflurano pode conduzir à motilidade reduzida e as lavas adicionais podem ser necessárias para impedir esta complicação isoflurano-induzida. Alternativamente, pode-se usar dióxido de carbono para eutanizar camundongos. Se as dificuldades surgem durante a dissecção, o foco em pontos de referência, como a bexiga urinária, pode ajudar. Para quantificar os dados de motilidade obtidos, utilizamos o software MATLAB. O principal problema com o rastreamento de movimento no MATLAB foi que o rastreador foi incapaz de localizar corretamente os chifres quando se mudaram perto da parede da placa de Petri. O Adobe Premier Element foi usado para recortar as imagens de vídeo e reduzir o tamanho dos arquivos de vídeo. Embora seja um pacote de software proeminente, pode não estar sempre disponível em um ambiente de laboratório típico. Uma opção alternativa pode ser usar o módulo de rastreamento de movimento livre do software ImageJ ou mesmo a simples avaliação manual de imagens tiradas com intervalos idênticos e comparando a posição dos chifres uterinos em uma grade de segmentação. A Figura 2 mostra um exemplo de avaliação simples da motilidade uterina espontânea e inclui uma comparação dos movimentos do trato reprodutivo dentro de um intervalo de 15 s.
Nenhum método simples que avalia a motilidade uterine em um ajuste do prato de Petri foi relatado assim distante. Os sensores de ultra-som e pressão intrauterina podem ser usados para monitorar a contratilidade do útero humano14. No entanto, é difícil estudar os mecanismos subjacentes no útero humano intacto. Portanto, o uso de modelos animais para a investigação da contratilidade uterina espontânea é importante. O trato reprodutivo feminino apresenta contrações miometrial espontâneas que são críticas para o bem-estar de uma mulher, incluindo sua fertilidade e trabalho15. Estas contrações podem ser visualizadas como ondas endometrial durante uma examinação do ultra-som. No entanto, durante a menstruação, sobre a contratilidade do útero pode criar desconforto e levar a dismenorreia, ou cólicas menstruais. Para ajudar a aliviar alguns sintomas de dismenorreia, novas drogas destinadas a relaxar os músculos lisos uterinos são necessários. Nosso método simples fornece uma maneira de avaliar os efeitos de vários compostos na contratilidade uterina.
Neste estudo, nós usamos nosso modelo fácil do prato de Petri para confirmar a eficácia da epinefrina, uma hormona de relaxante uterine12, para impedir a motilidade uterine espontânea de intervalos reprodutivos isolados do rato. Nosso método também pode ser usado para testar tais compostos que podem aumentar a contratilidade do útero. Importante, este método pôde ter o potencial ser promovido para a seleção da droga da taxa de transferência usando um formato da placa de seis poços. Assim, o método que apresentamos aqui pode ter a capacidade de ser otimizado para procedimentos de triagem de escala industrial. Nós não tentamos executar experiências similares em roedores maiores, mas nós esperamos que a motilidade espontânea similar estará atual em uteri isolado do rato. O trato reprodutivo maior de ratos pode apresentar motilidade uterina mais pronunciada. Nós encontramos que o úteros grávido do rato pode igualmente ser avaliado usando este modelo ex vivo do prato de Petri da motilidade uterine. Como esperado, a motilidade espontânea do útero grávido foi reduzida porque está em um estado quiescente. No entanto, o aumento do peso adicionado pelo tecido fetal também pode contribuir para a obstrução da motilidade. Pode ainda ser benéfico explorar mais a adequação de todo este modelo de trato reprodutivo para avaliar o efeito de compostos tocolíticos (relaxant) ou uterotônicos (estimulantes) no contexto da gravidez e do trabalho. Assim, apresentamos aqui um modelo ex vivo fácil para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo intacto. Esta aproximação pode ser adotada para a seleção da droga e ser utilizada para a descoberta nova da droga.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos de IU internos. A AGO concebeu o estudo. XC e AGO estiveram envolvidos no projeto dos experimentos descritos. FL e AGO analisaram e interpretaram os dados. KLL, JOB, FL realizou todos os experimentos ex vivo . FL escreveu o script MATLAB. KLL, Jó e AGO escreveram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram a versão final do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
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