Summary
Uteruskontraktioner är viktiga för välbefinnande hos kvinnor. Emellertid, patologiskt ökad kontraktilitet kan resultera i dysmenorré, särskilt hos yngre kvinnor. Här beskriver vi en enkel ex vivo beredning möjliggör snabb bedömning av effekten av glatt muskelavslappnande medel som kan användas för behandling av dysmenorré.
Abstract
Dysmenorré, eller smärtsam kramper, är det vanligaste symtomet i samband med menstruationer hos kvinnor och dess svårighetsgrad kan hindra kvinnors vardag. Här presenterar vi en enkel och billig metod som skulle vara avgörande för att testa nya läkemedel minskar uterin kontraktilitet. Denna metod utnyttjar den unika förmågan hos hela mus reproduktionsorganen att uppvisa spontan motilitet när den underhålls ex vivo i en petriskål som innehåller syrad Krebs buffert. Denna spontana motilitet liknar den vågliknande kan aktiviteten i den mänskliga livmodern, kallad endometrievågor. För att demonstrera effektiviteten av metoden, vi använde en välkänd livmoder relaxerande läkemedel, epinefrin. Vi visar att den spontana motilitet av hela mus reproduktionsorganen kan snabbt och reversibelt hämmas av 1 μM adrenalin i denna petriskål modell. Dokumentera förändringarna i livmodern motilitet kan lätt göras med hjälp av en vanlig smart telefon eller en sofistikerad digitalkamera. Vi utvecklade en MATLAB-baserad algoritm som möjliggör rörelsespårning för att kvantifiera spontan livmoder motilitetsförändringar genom att mäta graden av livmoder Horns rörelser. En stor fördel med denna ex vivo tillvägagångssätt är att reproduktionsorganen förblir intakt under hela experimentet, bevara alla inneboende intrauterin cellulära interaktioner. Den största begränsningen av detta tillvägagångssätt är att upp till 10-20% av uteri kan uppvisa någon spontan motilitet. Hittills är detta den första kvantitativa ex vivo metoden för att bedöma spontan livmoder motilitet i en petriskål modell.
Introduction
Som ett stort kvinnligt organ, livmodern är avgörande för reproduktion och avgörande för näring av fostret1. Livmodern består av tre skikt: perimetrium, myometrium och endometrium. Den myometrium är den stora kontraktila skikt av livmodern och spelar en nyckelroll i Foster leverans. Livmoderslemhinnan är det innersta skiktet som kantar livmoderhålan och är nödvändig för embryoimplantation. Hos icke-gravida kvinnor i fertil ålder, endometrieskiktet är utgjutet varje månad i början av menstruationscykeln. Den myometrium aids i denna shedding process genom att bibehålla den spontana kan sammandragningar som behövs för att rensa den nekrotiska endometrievävnad från livmodern1.
Tyvärr, ökad kan kontraktilitet kan resultera i negativa biverkningar såsom dysmenorré, eller smärtsamma mensvärk. Detta är särskilt sett i unga honor och avkomma kvinnor2. Emellertid, dysmenorré är olika för varje kvinna och beror på styrkan i deras kan sammandragningar; starkare sammandragningar är ofta förknippade med känslan av svår kramp3. Myometrial kontraktilitet kan visualiseras med hjälp av livmoder ultraljud och är ofta erkänd som endometrievågor. Förbättrad frisättning av prostaglandiner under menstruation4 i en livmoder som genomgår endometriesloustar tros bidra till ökad kan hyperkontraktilitet, vilket resulterar i ischemi och hypoxi av livmoder muskeln och därmed ökad smärta3.
Svår dysmenorré kan hindra den dagliga aktiviteten hos vissa kvinnor och 3 till 33% av kvinnorna har mycket svår smärta, vilket kan orsaka en kvinna att vara sängliggande för 1 till 3 dagar varje menstruationscykel5. Dysmenorré är den vanligaste orsaken till gynekologisk morbiditet hos kvinnor i fertil ålder oavsett ålder, nationalitet, och ekonomisk status5. Den uppskattade prevalensen av dysmenorré är både hög och varierande, allt från 45% till 93% hos kvinnor i fertil ålder5. Dysmenorré-associerad smärta har en effekt på det dagliga livet för kvinnor och kan resultera i dålig akademisk prestation hos ungdomar, lägre sömnkvalitet, begränsning av dagliga aktiviteter, och humörsvängningar5.
Många kvinnor som upplever svår dysmenorré utväg till over-the-counter mediciner för att lindra deras smärta. Sådana over-the-counter mediciner innehåller cyklooxygenas (COX) hämmare som förhindrar bildandet av prostaglandiner6. Emellertid, COX-hämmare är förknippade med ogynnsamma kardiovaskulära händelser, och om 18% av kvinnor med dysmenorré svarar inte på dessa hämmare7. Därför, det finns ett behov av nya mediciner för att minska mensvärk. Eftersom över kontraktilitet av livmodern bidrar till patogenesen av dysmenorré, en möjlig strategi kan vara användningen av uterin relaxantia.
Det är fördelaktigt att kvantifiera effekterna av potentiella relaxerande läkemedel i en modell av naturligt förekommande spontana kan vågliknande sammandragningar. Hittills har dock ingen effektiv ex vivo-metod för att testa muskelavslappnande läkemedel i intakt livmoder beskrivits. För närvarande, isometrisk spänning mätningar används för att utvärdera relaxerande läkemedels effekter. Under sådana mätningar, en livmoder muskel remsor bibehålls vid en konstant längd under förspänning i ett vävnads bad medan kraften i livmodern muskelsammandragningar registreras före och efter oxytocin stimulering i närvaro eller frånvaro av en relaxerande läkemedel. Även om detta tillvägagångssätt är mycket användbart, det kräver dyr utrustning. Dessutom, isometrisk sammandragningar inte liknar den spontana kan vågliknande sammandragningar som naturligt förekommer i intakt livmoder. Unikt, livmoder kan vågor i gnagare kan visualiseras som livmoder horn motilitet när hela reproduktionsorganen (äggstockar, ovikanaler, livmoder, och vagina) upprätthålls i en buffertlösning. Här presenterar vi en ex vivo-metod för att övervaka den spontana motiliteten hos den intakt mus livmodern placerad i en petriskål som innehåller syrad Krebs buffert. Vi beskriver också en motilitetskvantifieringsalgoritm som utnyttjar MATLAB motion tracker. Denna nya metod ger ett enkelt och billigare alternativ för att testa den relaxerande potentialen hos naturligt förekommande rättsmedel och syntetiska föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer med djur har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 månad gamla F2-129S-C57BL/6 sexuellt-mogna kvinnliga möss användes i studien.
Försiktighet: Säkerställ säkerheten genom att bära en labbrock, mask och handskar när du arbetar med djur och biologiskt farliga material.
1. beredning av lösningen
- Förbered Krebs buffert, som innehåller: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mm NaH2Po4, 0,56 mM Mgcl2, 25 mM NaHCO3, och 5 mm glukos, pH 7,4. Kontinuerligt oxygenera Krebs buffert med en blandning av komprimerade gaser som innehåller 5% CO2 och 95% O2 samtidigt som Bufferttemperaturen vid 37 ° c med hjälp av ett cirkulerande vattenbad.
- Förbered Dulbecco s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS), som innehåller: 2,68 mm kcl, 1,47 mm KH2Po4, 136,89 mm NaCl och 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4.
2. djur beredning
- Anesthetize möss med inandning av isofluran (3%) med sopgas rensning. Säkerställ adekvat anestesi genom att bedöma abstinens reflexer. Nypa den bakre tån för att bekräfta inga rörelser framkallas, vilket indikerar förlust av reflex svar. Efter djup anestesi uppnås, euthanize djuret genom halshuggning.
Anmärkning: Isofluran kan orsaka smidig muskel dilatation. Därför bör beredningen av reproduktionsorganen i stor utsträckning tvättas och inkuberas i Krebs-bufferten i minst 15-30 minuter innan ex vivo-experimenten inleds. Isofluran kan orsaka irritation och obehag när det är i kontakt med huden, så fortsätt med försiktighet. - Placera kroppen på en stor väg båt kantad med en pappershandduk.
Anmärkning: Gravida kvinnliga laboratoriepersonal bör inte vara inblandade i experiment med isofluran eftersom det kan minska fostervikt, minska foster skelett benbildning, och öka risken för spontan abort8, 9. CO2 inandning kan användas som ett substitut till euthanize möss.
3. bestämning av estrous Cykelfas
- Med små pinpett, lyft klitoris för att få tillgång till vaginal ostium och sakta in en micropipett spets som innehåller 10 μL av DPBS i slidan.
- Se till att micropipett spetsen är införd genom ostium i en vinkel på 10-30 ° för att undvika punktera vaginala väggen. Vätskan ska fortfarande vara synlig i spetsen efter insättning. Om vätskan inte syns, spetsen sattes in för långt in i slidan, och paracervical området i slidan kan ha varit perforerade.
- Dra lätt ner på vaginal ostium musklerna med spetsen av micropipett för att tillåta luft att lämna slidan.
- Spola långsamt vaginalhålan genom att Pipettera upp och ner 2-3 gånger med 10 μL DPBS och placera den dragna cellsuspensionen på en glas bild.
- Använd en inverterad faskontrastmikroskop för att bestämma brunstcykel skede genom Cytologisk analys. Förfarandet görs enligt beskrivningen på annan plats10,11. Se till att cellsuspensionen inte torkar ut innan Cytologisk analys kan utföras. Suspensionen kan spädas med färska DPBS, om nödvändigt.
4. mus reproduktionsorgan Ddissection
- Ordna musen i liggande läge och sprida sina extremiteter för att exponera den abdominopelvic regionen.
- Spraya med 70% etanol för att fukta och desinficera abdominopelvic området.
- Med hjälp av pinps, lyft försiktigt huden ligger överlägsen klitoris. Gör små tvärgående snitt på de laterala aspekterna av nedre buken, upp till de övre extremiteterna att exponera bukhinnan (figur 1A). Under denna process kommer en extern flik att bildas. Som små snitt görs kontinuerligt, kommer luckan öka i storlek.
- Försiktigt skära genom bukhinnan att exponera mag-tarmkanalen (figur 1B). Det är viktigt att notera att livmoder hornen kan ofta placeras direkt under peritoneum, så gör snitt försiktigt och inte vidrör hornen eftersom detta kan påverka livmoder motilitet.
- Med hjälp av tång, ta bort fascia och fettvävnad som täcker mag-tarmkanalen. Ta bort följande mag-tarmkanalen segment från bukhålan: tolvfingertarmen, jejunum, ileum, blindtarmen, stigande och tvärgående tjocktarmen (figur 1C).
- För att lokalisera fortplantningsorganen, först identifiera urinblåsan (figur 1C, "4"), som kan ha en deflateras utseende på grund av tömning efter dödshjälp. Slidan kommer att vara rätt under urinblåsan.
- Lokalisera blygd bäckenbensfogen vid sammanflödet av blygdbenet (caudally till urinblåsan).
- Använda sax, ta bort blygd bäckenbensfogen genom att noggrant göra snitt på dess laterala sidor genom interpubic fibrocartilaginous vävnad för att få tillgång till och ge en rutt för vagina extraktion (figur 1D).
- Skär genom perineum ligger mellan anus och nedre delen av vulva.
- Med hjälp av pintrops, lyfta slidan och sakta punktskatter ändtarmen.
- Identifiera två livmoder horn som dela i en gaffel, rostrally till slidan. Lokalisera en invecklad oviduct och äggstock på slutet av varje horn, som kan döljas under de återstående mag-tarmkanalen segment. Använd små dissekera sax för att ta bort alla ligament som ansluter till och stödja horn, ovikanaler, och äggstockarna i bukhålan.
- Ta bort reproduktionsorganen, som inkluderar slidan, livmodern, ovikanalerna, och äggstockarna, från bukhålan.
- Överför isolerade reproduktionsorgan (figur 1E) till en 100 mm petriskål fylld med 10 ml dpbs. Komprimera inte livmoder hornen för att undvika att skada myometrium.
- Använd pinpett och kirurgisk sax för att ta bort alla bindväv och fettvävnad som omger livmoder hornen och slidan samt någon päls i blygd regionen som kan hindra bildkvaliteten. Ta bort den breda ligament för att möjliggöra motilitet av livmoder hornen.
- Tvätta isolerade reproduktionsorgan med färska DPBS två gånger och överföra den till en 35 mm petriskål fylld med 3 mL syrad Krebs lösning.
5. vävnads avbildning
- Placera petriskål som innehåller reproduktionsorganen i syrade Krebs buffert på en svart yta. Behåll skålen vid rumstemperatur.
Anmärkning: Det är möjligt att använda en infraröd uppvärmning pad för att bibehålla vävnaden vid 37 ° c. - Låt 15-30 min för spontana sammandragningar påbörjas. Spela in spontan livmoder motilitet i 10 min från ett axiellt plan med någon typ av digital videoutrustning.
- Överför preparatet till en petriskål som innehåller den syrade Krebs-bufferten kompletterad med en testsubstans. Spela in spontan livmoder motilitet i ca 10 min från ett axiellt plan med någon typ av digital videoutrustning.
- Tvätta hela reproduktionsorganen i 100 mm petriskål med 10 mL DPBS för att bedöma reversibiliteten av behandlingen.
- Överför preparatet till en petriskål med den nysyrade Krebs-bufferten. Spela in spontan livmoder motilitet i ca 10 min från ett axiellt plan med någon typ av digital videoutrustning.
- Överför preparatet till en annan 35 mm petriskål fylld med syrade Krebs buffert kompletterad med fordonet för testsubstansen för att säkerställa att det inte finns några mekaniskt inducerade förändringar i spontan livmoder motilitet. Detta är en viktig kontroll.
- Överföra videomaterialet till en datorhårddisk.
6. analys av data
- Gör klipp med hjälp av videoredigeringsprogram från det ursprungliga videomaterialet som innehåller avsnitten kontroll, behandling och tvätta.
- Använd MATLAB-programvaran och det medföljande scriptet (se kompletterande material online) för att kvantifiera spontan uterin motilitet.
Anmärkning: Tillägget Computer Vision Toolbox för MATLAB måste installeras för att scriptet ska fungera fullt ut.- Öppna MATLAB-skriptet, gå till fliken redigerare och klicka på Kör.
- Markera den första videofilen och klicka på Öppna.
- Ange en etikett för videofilen i popup-dialogrutan och klicka på OK.
- Ange tidsintervall (er) som behövs för att beräkna hastigheten för horn rörelse (Δ Euclidean avstånd/ΔS).
- Använd musmarkören för att välja två punkter på den första bildrutan i videon. Ett popup-fönster kommer att be att bekräfta att de valda punkterna ska användas för spårning. Klicka på Start för att initiera realtids spårningsprocessen som kommer att visas i popup-fönstret. Du kan också klicka på Markera om punkter om du vill markera de två punkterna igen.
- Övervaka noggrannheten i uppföljningsprocessen i popup-fönstret.
- Observera en hastighet kontra tid scatter Plot och avstånd kontra tid scatter Plot i ett nytt popup-fönster. Spara de två siffrorna genom att välja Arkiv | Spara som i samma fönster för att dokumentera data.
- Hitta en mapp med namnet Pointtrackerdata, automatiskt skapad av MATLAB, i samma katalog där MATLAB-skriptet finns. Identifiera en Excel-fil med namnet label_Data som innehåller data punkter som samlats in från videon på två separata kalkylbladsflikar.
Obs: alla alternativa rörelse spårningsprogram kan användas för att kvantifiera spontan livmoder motilitet.
- Använd en lämplig programvara (t. ex. Excel eller SigmaPlot 13) för att utföra den statistiska analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1 visar representativa bilder tagna under hela reproduktionsorgan isolerings proceduren som beskrivs i detta protokoll. För att undvika kontaminering av bufferten med päls, vilket skulle minska videokvaliteten, fuktade vi mus kroppen med 70% etanol. Det viktigaste riktmärket för dissekeringsdelen av protokollet är att hitta urinblåsan. Livmodern och slidan kommer att lokaliseras sämre än urinblåsan.
För att testa protokollet, behandlade vi hela reproduktionsorganen med adrenalin. Adrenalin är välkänt för att orsaka uterin smidig muskelavslappning. Detta hormon är endogent produceras i adrenal medulla och fungerar som ett stresshormon hos däggdjur. Vi använde 1 μM adrenalin i våra experiment. Detta är en mättat koncentration känd för att orsaka maximal respons12. En serie av fyra experiment utfördes. I alla prövningar hämmade 1 μM epinefrin reversibelt spontant livmoder motilitet (figur 2).
För att kvantifiera den spontana motilitet i reproduktionsorganen, utformade vi en algoritm som gör det möjligt för oss att bedöma den genomsnittliga förändringstakten i euklidiska avståndet mellan två utvalda punkter på mus reproduktionsorganen. Punkt positionerna spåras med hjälp av motion tracking-modulen i MATLAB-programvaran. Motsvarande skript för MATLAB, som vi använde för att beräkna euklidiska distanserna, finns i tilläggs materialet online. Positionen för punkter är avgörande för en lyckad motion tracking-procedur. Noggrann hänsyn bör tas om kvaliteten på videorna eftersom ljuset reflektioner från petriskonens vägg kan distrahera rörelse tracker, och det kan sluta spåra horn rörelsen medan åter tilldela punkten till en av ljuset Reflektioner. Vi valde att placera en av punkterna i mitten av ett horn för att se till att det var tillräckligt långt från petriskål vägg reflektioner. Den andra punkten var oftast ut på slidan eftersom det inte uppvisar spontan motilitet. Figur 3 ger ett urval av dataanalys, och kompletterande figur 1 visar representativa bilder som erhållits under rörelsespårning.
Figur 1 : Steg i hela reproduktionsorganen isolering. (A) ett snitt i huden gjordes och regionen abdominopelvic exponerades ovanför bukhinnan (1). (B) serös membran öppnades långsamt för att exponera mag-tarmkanalen (2). C) magtarmkanalen har flyttats för att exponera livmoder hornen (3). Urinblåsan (4) kan visualiseras nära konjunktionen av hornen. D) livmoder hornen har befriats och nedskärningar har gjorts på den laterala sidan av blygdbenssammanfogningen (5) för att exponera slidan (6). Eavlägsnande av isolerade reproduktionsorgan och placering i dpbs-lösning. Överskotts päls eller bindväv avlägsnades. (F) en djup indrag kan ses på slidan (höger) efter avlägsnande av ändtarmen (vänster, 7). Gden omgivande bindväven avlägsnas. En digitalkamera och Application Suite-programvara (version 3.7.0) användes för att förvärva realtidsbilder under dissektion (kamera inställning: Hue 20/saturation 80). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Ett representativt experiment med hela isolerade reproduktionsorgan visas. Bilderna togs 15 s isär före (a), under (B), och efter (C) tillämpningen av 1 μm adrenalin. Reproduktionsorganen preparatet uppvisade hög motilitet i paneler A och C i avsaknad av adrenalin, men det är quiescent i panel B med närvaron av 1 μM adrenalin. De oredigerade videofilmerna tillhandahålls som kompletterande videor 1-3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Data analys i det ex vivo-experiment som beskrivs i Figur 2. A) entidsperiod för den euklidiska distans förändrings kursen visas. Referenspunkterna mellan vilka avståndet bestämdes under spontan uterin motilitet visas som gröna prickar i infälld. Poängen valdes i den proximala delen av slidan och mittsegmentet av en livmoder horn som avbildas. Den blå fyllda cirklar visar den spontana motilitetsfrekvens värden innan du lägger adrenalin, de röda cirklarna visar spontan motilitet priser i närvaro av 1 μM adrenalin, och den gröna fyllda cirklar visar spontan motilitet priser efter en Wash-out. (B) en jämförelse av genomsnittliga euklidiska avstånd ändra hastighet (pixlar/s) före tillsats av adrenalin (blå bar), i närvaro av 1 μm adrenalin (röd stapel), och efter en blekt (grön bar). Den MATLAB programvara användes för att kvantifiera livmoder motilitet. Δt-intervallet var inställt på 5 s. "ΔDistance" beräknas som skillnaden mellan det initiala ram avståndet och bild Rute avståndet 5 s senare. Den statistiska analysen utfördes med hjälp av Kruskal-Wallis ett sätt analys av variansen på leden följt av alla Pairwise flera jämförelser förfaranden enligt Dunn metod med hjälp SigmaPlot 13. Asterisken anger datauppsättningen som skiljer sig markant från de andra experimentella datauppsättningarna (P = < 0,001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: time-lapse videoklipp som visar spontan livmoder motilitet innan du lägger till 1 μm adrenalin. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande film 2: time-lapse videoklipp som visar spontan livmoder motilitet när Krebs buffert kompletterades med 1 μm adrenalin. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande film 3: time-lapse videoklipp som visar spontan livmoder motilitet efter washout. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande figur 1: representativa bilder tagna var 15 s under rörelse spårningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande material: MATLAB-baserade spårning algoritm script. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi en metod för att bedöma spontan kontraktilitet av hela gnagare reproduktionsorgan, som omfattar äggstockarna, ovikanaler, livmoder horn, och slidan. Vi använde en liknande metod för att demonstrera den relaxerande effekten av fenylefrin på spontan livmoder motilitet13, men tidigare kunde vi inte ge kvantitativ analys av data. I detta arbete utvecklade vi en algoritm för kvantitativ motilitet dataanalys med hjälp av MATLAB motion tracking module. Detta är en användbar teknik för att testa nya läkemedel som reglerar uterin kontraktilitet oavsett om droger slappna av eller tygla livmodern glatt muskulaturen. En stor fördel med denna modell är att reproduktionsorganen är intakt, bevara alla inneboende intrauterin cellulära interaktioner. Detta protokoll kräver särskilt inte någon särskild utrustning. Livmodern isolering kan göras med ett enkelt förstoringsglas och det finns inga krav på någon sofistikerad videoinspelning utrustning. Om en digitalkamera med hög upplösning inte är tillgänglig för avbildning kan en personlig mobiltelefonkamera användas som ett alternativ.
Det mest kritiska steget i protokollet för bedömning av fortplantningsorganen motilitet är att få livskraftiga livmoder vävnad. Den myometrium, inom livmoder hornen, är motila elementet i reproduktionsorganen. Därför, under isolering är det viktigt att undvika översträckning eller komprimera hornen. Det är också viktigt att se till att livmoder vävnaden är väl oxygenated hela experimentet att upprätthålla livmoder motilitet. Det bästa sättet att förhindra skador på livmoder hornen är att få kontakt med endast angränsande bindväv medan rengöring livmodern eller flytta reproduktionsorganen. Eftersom slidan inte kontraktet spontant under experimentet, är det acceptabelt att komprimera den med pinkoppar när du flyttar reproduktionsorganen från en maträtt till en annan. Hela reproduktionsorganen experiment kan utföras i samband med isometrisk spänning inspelningar som bedömer preload-och/eller oxytocin-inducerad uterin kontraktilitet. Men en tråd myograph är en dyr utrustning som inte alltid finns i en gemensam laboratoriemiljö.
Den beskrivna metoden har flera begränsningar. Eftersom myometrium är mycket känslig för kompressioner eller drar, kompliserar detta dissekeringsprocessen av reproduktionsorganen. Om hornen skadas under dissektion kommer ingen spontan kontraktilitet att observeras. Detta är en stor begränsning av protokollet eftersom det är osäkert om kontraktila glatta muskelceller var omedvetet skadad trots användning av ordentlig vård och försiktighet eller om de saknade motilitet på grund av en naturlig orsak. I själva verket observerade vi ingen motilitet i 10-20% av reproduktionsorganen preparat i denna studie. Det är viktigt att se till att vaginala segmentet av reproduktionsorganen förblir intakt eftersom avlägsnande av slidan markant minskar spontan motilitet av livmoder hornen. Däremot försämrar frånvaron av äggstockar och/eller ovidukter inte hela reproduktionsorganen motilitet. Dessutom bör man notera att vissa föreningar är känsliga för oxidation. Till exempel, epinefrin kan lätt oxideras. Testa effekterna av sådana föreningar skulle kräva kortare inkubationstid förhindra överdriven oxidation. Emellertid, kortare inkubationstider kan hindra förmågan hos ett läkemedel för att effektivt penetrera tjockleken på livmoderväggen. En ytterligare begränsning av metoden innefattar att bedöma Hornens 3-dimensionella rörelser. Hornen har en medfödda karaktär curling i en 3-dimensionell plan, komplierande analys. För att övervinna detta problem kan man minska Krebs buffertvolym i petriskål till 2 mL.
Vi fann att det optimala åldersintervallet för honmöss är 2-5 månader. Vi påpekade att anestesi med isofluran kan resultera i minskad motilitet och ytterligare tvättar kan vara nödvändiga för att förhindra denna isofluran-inducerad komplikation. Alternativt kan man använda koldioxid för att euthanize möss. Om svårigheter uppstår under dissektion, fokusera på landmärken, såsom urinblåsan, kan hjälpa. För att kvantifiera erhållna motilitetsdata använde vi MATLAB-programvara. Det stora problemet med rörelsespårning i MATLAB var att Tracker inte kunde lokalisera hornen när de flyttade nära väggen i petriskål. Adobe Premier element användes för att klippa videofilmer och för att minska storleken på videofiler. Även om det är ett enastående programpaket, det kanske inte alltid vara tillgängliga i en typisk laboratoriemiljö. Ett alternativ kan vara att använda den fria motion tracking modul ImageJ programvara eller ens enkel manuell bedömning av bilder tagna med identiska intervaller och jämföra positionen för livmoder hornen på en segmentering rutnät. Figur 2 visar ett exempel på enkel bedömning av spontan livmoder motilitet och inkluderar en jämförelse av reproduktionsorganen rörelser inom ett 15 s intervall.
Ingen enkel metod som bedömer livmoder motilitet i en petriskål inställning har rapporterats hittills. Ultraljud och intrauterin tryck sensorer kan användas för att övervaka mänsklig livmoder kontraktilitet14. Det är dock svårt att studera bakomliggande mekanismer i intakt Human livmoder. Därför är användningen av djurmodeller för att undersöka spontan uterin kontraktilitet viktigt. Den kvinnliga reproduktionsorgan uppvisar spontana kan sammandragningar som är kritiska för en kvinnas välbefinnande, inklusive hennes fertilitet och Labor15. Dessa sammandragningar kan visualiseras som endometrievågor under en ultraljudsundersökning. Emellertid, under menstruation, över kontraktilitet av livmodern kan skapa obehag och leda till dysmenorré, eller mensvärk. För att lindra vissa symtom på dysmenorré, nya läkemedel riktade mot avslappnande uterin glatta muskler behövs. Vår enkla metod ger ett sätt för att bedöma effekterna av olika föreningar på uterin kontraktilitet.
I denna studie, vi använde vår enkla petriskål modell för att bekräfta effektiviteten av adrenalin, en livmoder muskelavslappnande hormon12, för att förhindra spontan livmoder motilitet av isolerade mus reproduktiv skrifter. Vår metod kan också användas för att testa sådana föreningar som kan öka kontraktilitet av livmodern. Viktigt, denna metod kan ha potential att uppgraderas för genomströmning Drug screening med en sex-well plåtformat. Den metod som vi presenterar här kan alltså ha förmågan att optimeras för screening förfaranden i industriell skala. Vi har inte försökt att utföra liknande experiment i större gnagare, men vi förväntar oss att liknande spontan motilitet kommer att förekomma i isolerade råtta uteri. De större reproduktionsorganen hos råttor kan uppvisa mer uttalad livmoder motilitet. Vi fann att gravida mus uteri kan också bedömas med hjälp av denna ex vivo livmoder motilitet petriskål modell. Som förväntat, den spontana motilitet av den gravida livmodern reducerades eftersom det är i en quiescent tillstånd. Emellertid, ökad vikt tillsätts av foster vävnaden kan också bidra till motilitet obstruktion. Det kan fortfarande vara fördelaktigt att ytterligare utforska lämpligheten av hela denna reproduktionsorgan modell för att bedöma effekten av tokolytisk (relaxerande) eller uterotona (stimulerande) föreningar i samband med graviditet och arbete. Således, här presenterade vi en lätt ex vivo modell för att bedöma spontan motilitet av intakt reproduktionsorgan. Detta tillvägagångssätt kan antas för läkemedels screening och utnyttjas för ny läkemedels upptäckt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av interna IU-fonder. SEDAN tänkte man på studien. XC och sedan var inblandade i utformningen av de beskrivna experimenten. FL och sedan analyserade och tolkade data. KLL, JOB, FL utförde alla ex vivo -experiment. FL skrev MATLAB-skriptet. KLL, JOB och AGO skrev manuskriptet. Alla författare läser och godkänner den slutgiltiga versionen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epinephrine hydrochloride | Sigma-Aldrich | E4642 | |
| Dulbecco's PBS | Fisher Sceintific | 17-512Q | |
| Ethanol 200 PROOF | Decon Laboratories | 2701 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 07-893-2374 | |
| Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps | Fisher Sceintific | 13-812-42 | |
| Curved Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissection High-performance Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system | Leica | DFC425 C | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources | Fisher Sceintific | 12-562-21 | |
| Weigh Boat | Fisher Sceintific | WB30304 | |
| Convertors Astound Standard Surgical Gown | Cardinal Health | 9515 | Small, Medium or Large |
| Gloves | McKesson Corporation | 20-1080 | Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves |
| Petri Dish | Corning Falcon | 351029 | 100 mm |
| Petri Dish | Corning Falcon | 353001 | 35 mm |
| 95% O2- 5% CO2 gas mixture | Praxair | MM OXCD5-K | |
| Ear-loop Masks | Valumax International | 5430E-PP | |
| DSLR 24.2 MP Camera | Canon | EOS Rebel T6i | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | version 2019 or later |
References
- Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
- Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
- Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
- Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
- Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
- Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
- Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
- Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
- Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).
- Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
- Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
- Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
- Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).
