Summary
이 방법의 목적은 형광표지된 혈관이 있는 제브라피시 배아로 포유류 종양 세포를 이종이식에 이식함으로써 종양 혈관신생의 생체 내 모델을 생성하는 것이다. 이종이식 및 관련 혈관을 이미징함으로써, 혈관신생 반응의 정량적 측정을 얻을 수 있다.
Abstract
종양 혈관신생은 항암 치료의 주요 표적이며 이 방법은 생체 내에서 이 과정을 연구하는 새로운 모델을 제공하기 위해 개발되었다. 제브라피시 이종이식은 포유류 종양 세포를 2일 후 수정 후 제지피시 배아의 연막 공간에 이식한 다음, 최대 2일까지 실험 종점에서 관찰된 혈관신생 반응의 정도를 측정하여 생성됩니다. 이식 후. 이 방법의 주요 장점은 접목에 대한 제브라피쉬 숙주 혈관신생 반응을 정확하게 정량화하는 능력이다. 이것은 혈관 신생 반응에 호스트 대 종양 기여뿐만 아니라 분자 메커니즘의 상세한 검사를 가능하게합니다. 이종이식 된 배아는 종양 혈관 신생을 억제하는 전략을 조사하기 위해 잠재적 인 항 혈관 신생 약물을 사용하여 배양하는 것과 같은 다양한 치료를 받을 수 있습니다. 혈관 신생 반응은 또한 더 역동적 인 세포 과정을 검사하기 위해 라이브 이미지 화 될 수있다. 상대적으로 까다로운 실험 기술, 제브라피시의 저렴한 유지 보수 비용 및 짧은 실험 타임 라인은 종양 혈관 신생을 조작하는 전략의 개발에 특히 유용합니다.
Introduction
혈관신생은 암의 고전적인 특징 중 하나이며 항암 치료1,2의표적을 나타낸다. 이 과정을 연구하기 위해, 암의 이종이식 모델은 마우스3과같은 동물에 포유류 종양 세포를 이식함으로써 생성되었다. 제브라피시 이종이식 모델도 개발되어 종양 세포를 2일 후 수정(dpi) 제브라피쉬로 이식하여 제브라피시 혈관이 이종이식으로급속히 성장하게 된다4.
이 프로토콜은 혈관신생 반응이 전체 이종이식에 걸쳐 정확하게 정량화될 수 있는 생체 내 제브라피쉬 배아 종양 이종이식 모델을 기술한다. 이 방법은 조사자가 종양 혈관신생 반응을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 생체 내에서 검사할 수 있게 한다. 제브라피시의 유전성성은 숙주 기여도를 심문할 수 있게 하고, 다른 종양 세포주를 선택하면 혈관신생에대한 종양 기여도도 5,6,7을검사할 수 있다. 또한, 제브라피쉬 유충이 소분자에 투과성됨에 따라, 특정 경로 억제제가 사용될 수 있거나 약물 라이브러리를 스크리브하여종양 혈관신생의 신규 억제제를 식별할 수 있다 8,9,10, 11.
제브라피쉬 배아 이종이식 모델은 다른 포유류 이종이식 모델과 비교하여 고유한 이점을 제공합니다. Zebrafish 이종이식은 저렴하고 수행하기 쉬우며, 많은 수의 동물을 검사할 수 있으며 살아있는 세포 이미징을 통해 세포 행동을 자세히 검사 할 수있습니다4. 유의한 혈관 성장을 관찰하기 위해 최대 몇 주가 필요한 생체 내 모델과 달리, 제브라피시 이종이식에서혈관신생은 이식 후 24시간 이내에 관찰될 수 있다3,4. 그러나, 배아 제브라피시에 적응성 면역 계통의 부족은, 이종이식을 유지하는 데 유익하면서, 적응성 면역 반응 및 종양 혈관신생을 향한 그것의 기여가 검토될 수 없다는 것을 의미한다. 또한, 종양 기질 세포의 부족, 종양을 직교적으로 이식할 수 없는 무능력 및 제브라피시와 포유류 세포 사이의 유지 보수 온도의 차이는 이 방법의 잠재적 약점이다. 그럼에도 불구하고, 살아있는 화상 진찰을 위한 이 모형의 어메니티 및 정확하게 혈관신생 반응을 양량하는 기능은 생체내에서 종양 혈관신생을 조절하는 세포 과정을 연구하는 것을 유일하게 유익하게 만듭니다.
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Protocol
1. 미세 주사 바늘의 준비
- 마이크로파이펫 풀러를 켜고 다음 파라미터(재료 표에 나열된 마이크로파이펫 풀러 모델에 대해 보정됨): 열, 680; 당기기, 75; 속도, 40; 시간, 55; 압력: 530.
- 보로실리케이트 유리 모세관을 마이크로파이펫 풀러에 고정하고 모세관을 당겨 두 개의 바늘을 만듭니다. 원하는 만큼 바늘을 반복하십시오.
2. 이식용 세포 배양
참고: 이 프로토콜을 사용하는 경우, 모든 포유류 암 세포주가 제브라피시 배아에 이식하는 데 이종이식으로 사용될 수 있다. 그러나, 상이한 세포주5,11,12사이에서 유도된 혈관신생 반응에 많은 변이가 있다. B16-F1 뮤린 흑색종 세포는 제브라피쉬 배아(11)에서 강한 혈관신생 반응을 유도하는 것으로 나타났으며 따라서 이 프로토콜에서 사용하기에 적합하다.
- B16-F1 세포를 75 cm 2 플라스크에서 75 cm2 플라스크에서 페탈 소 세럼(FBS)으로 보충하여 최종 농도10%(v/v)와 페니실린/스트렙토마이신을 각각 100 μg/mL의 최종 농도로 성장시다.
- B16-F1 세포의 95-100% 공류 75 cm2 플라스크에서 매체를 제거하고 실온인산완충식염수(PBS)의 5 mL로 세포를 세척하였다.
- 5 mL PBS를 제거하고 실온 0.25 % 트립신 / 에틸렌디아민 테 아세트산 (EDTA)의 2 mL을 추가하고 60 s에 대해 37 °C에서 배양하십시오.
- 플라스크의 측면을 탭하여 세포가 플라스크 바닥에 부착된 것을 잃기 시작했는지 확인합니다.
- 플라스크에 10% FBS를 사용하여 8 mL의 MEM-α를 추가하고 플라스크 내부에 파이펫을 추가하여 플라스크 바닥에 부착된 모든 셀을 현탁액으로 가져와 셀 현탁액을 15 mL 튜브로 피펫합니다.
- 세포 현탁액을 800 x g, 4-8°C에서 5분 동안 원심분리하고, 매체를 흡인하고, 염료로 세포에 라벨을 붙이도록 진행한다.
3. 형광 염료로 B16-F1 세포 라벨링
참고: 이식된 종양 세포와 배아의 다른 세포를 분화하기 위해서는 종양 세포에 이식 하기 전에 적절한 형광 염료로 라벨을 부착해야 합니다. 세포가 이미 형광 기자를 발현하는 경우이 단계를 건너 뛸 수 있습니다.
- 37°C에서 무혈청 MEM-α 매질의 2 mL을 배양합니다.
- 선택된 염료의 스톡 용액을 준비하고 이를 미리 배양된 2 mL의 무혈청 MEM-α 매체로 희석하여 가능한 농도를 만듭니다(B16 F1 세포에 적합한 염료 및 농도의 예는 재료표에 제공됨).
- 염료 용액의 파이펫 1 mL(단계 2.6에서)에, 파이펫팅으로 철저히 혼합한 다음, 다른 1 mL의 염료 용액을 첨가하고 혼합한다.
- 세포를 37°C에서 40분 동안 배양하고, 20분에서 부드럽게 흔들어 혼합한다.
- 세포 현탁액을 800 x g, 4-8 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- 상월체를 흡인하고 PBS의 5 mL로 파이펫팅하여 라벨이 부착된 세포를 세척한다.
- 세포 현탁액을 다시 800 x g, 4-8 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 상월체를 흡인하고 이식 준비가 될 때까지 얼음위에 세포를 놓습니다.
참고: 최종 종양 세포 펠릿은 20-40 μL의 부피를 가져야한다.
4. 이식용 배아 준비
참고: 형광으로 표시된 혈관(예: kdrl:RFP, fli1a:EGFP 등)이 있는 형질전환 제브라피시 라인을 선택하십시오. 13세 , 14.
- 이식 2일 전에, 앞서 설명한 바와 같이 제브라피시를 산란시키고 배아(15)를 수집한다.
참고: 우리는 초기 단계에서이 물고기를 주입하지 않기 때문에, 그들은 로젠 등15에의해 설명 된 대로 산란의 20 분 이내에 수집 할 필요가 없습니다, 하지만 짝짓기의 몇 시간 후 수집 될 수있다. - 약 100 배아 / 접시의 밀도에 100mm 배양 접시에 배아를 배치합니다.
- 각 접시에 50 mL의 E316 (오염을 방지하기 위해 메틸렌 블루의 1 % w / v 수성 스톡 용액5 μL로 보충)을 추가하고 죽은 배아 또는 이물질을 청소하고 주사 준비가 될 때까지 어두운 인큐베이터에 접시를 보관하십시오.
- 1 일 후 수정 (dpf),에 추가 1-페닐-2-티오레아 (PTU) E3에서 30 mg/L PTU의 최종 농도를 생산 하기 위해 각 접시에. PTU는 색소 침착을 방지, 종양 세포와 혈관을 볼 수있는 능력을 방해 할 수있는.
- 2 dpf에서 바늘이나 핀셋을 사용하여 해치되지 않은 배아를 수동으로 데코리오네이트합니다. 형광 현미경을 사용하여 이종이식(50-200)에 필요한 만큼형형형 배아를 선택합니다.
- 이식 전에, 주사 절차 도중 운동을 방지하기 위하여 E3에 있는 300 μg/mL 트리카인의 해결책에 있는 선택된 태아를 마취하십시오.
- E3 용액에 2% 메틸셀룰로오스를 35mm 접시에 채웁니다.
- 전사 파이펫을 사용하여 약 50개의 배아(E3 용액의 부피 최소화)를 메틸셀룰로오스에 놓습니다.
- Microloader 파이펫 팁을 사용하여 배아가 모두 수직으로 향하도록 배치하고 머리를 위쪽으로 향하고 왼쪽이 위를 향하도록 합니다.
참고: 단계 4.7-4.9는 또한 앞에서설명한바와 같이 아가로즈 블록에 배아를 배열함으로써 수행될 수 있지만, 우리의 경험에서, 배아는 메틸셀룰로오스에 배열될 때 더 쉽게 배열된다.
5. 포유류 암세포의 Perivitelline 주입 2 dpf 배아
참고: 이식 시 세포가 이식편으로 함께 뭉치도록 하려면 세포가 세포외 매트릭스 혼합물(ECM)과 함께 혼합되어야 합니다. 우리는 재료의 표에서 참조 된 ECM 혼합물을 사용할 때 이러한 세포 / ECM 혼합물을 만드는 단계를 설명했다. 대체 행렬을 사용하는 경우 그에 따라 단계를 조정해야 합니다.
- ECM 의 스톡을 500 μL 튜브에 100 μL aliquots로 나누고 필요할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
- ECM의 별표를 해동하고 혼합물을 50 % (v / v)로 희석하기 위해 PBS 100 μL을 추가합니다.
참고: 희석된 50% ECM은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있다. - 50% ECM을 B16-F1 세포 펠릿(3.7단계로부터)과 잘 섞어 파이펫팅및 교반하여 세포/ECM의 혼합물을 2:1 비율로 생성하고 혼합물을 얼음 위에 저장합니다.
- 미세 모세관 파이펫을 사용하여 세포의 3-10 μL을 차지합니다.
- 조심스럽게 바늘에 피펫 팁을 삽입하고 바늘의 끝에 B16-F1 / 매트릭스 혼합물을 배출.
- 바늘을 바늘 홀더에 넣고 접시에 45° 각도로 기울입니다.
- 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 부러뜨려 세포를 압박하지 않고 바늘에서 세포가 배출 될 만큼 큰 구멍을 만듭니다.
- 사출 장치에 부착된 가압 공기 실린더를 켜고 인젝터를 "연속" 모드로 전환하여 세포를 바늘 끝으로 밀어 넣습니다.
- 접시에서 바늘을 제거하고 혈세포계로 접시를 교체하십시오.
- 혈세포계에 오일 한 방울을 놓고 이 방울에 바늘을 한 번 주입하십시오.
- 혈세포계를 사용하여 단일 펄스로 배출된 세포 수를 계산하고 펄스 지속 시간을 조정하여 펄스당 약 150개의 세포를 배출하도록 바늘을 보정합니다.
참고: 펄스 당 세포의이 양을 배출하는 것은 성공적인 이종이식을 이식하기 위해 여러 펄스가 필요합니다. 이것은 연구원에게 종양 이종이목의 최종 크기에 대한 더 많은 통제권을 줄 것입니다 그(것)들이 적당히 각 이종이식을 더 크거나 더 작게 만들기 위하여 펄스의 수/위치를 조정하는 것을 허용하 여 적합하게 보입니다. - 배아의 노른자 낭쪽으로 바늘을 가리키고 바늘의 끝이 노른자 낭에서 나오고 배아의 복부 측에 배아 표피를 심장으로 밀어 낼 때까지 노른자 낭을 통해 서를 밀어 넣습니다.
참고: 바늘을 위치하여 배아 노른자 낭 앞쪽으로 들어가 세포가 배출될 최종 위치로 이동합니다. 이것은 세포가 일반적인 추기경 정맥으로 세포를 주입의 가능성을 감소, 심장에서 멀리 방향으로 배출 될 것을 보장합니다. - 조심스럽게 앞으로 바늘의 끝을 밀어 조금 앞으로 그것은 표피와 노른자 낭 막 사이의 공간 (perivitelline 공간)를 만든 다음 연막 공간으로 세포 혼합물의 일부를 배출하는 인젝터를 펄스.
- 500-800 세포가 연막 공간에 주입 될 때까지 펄스를 반복하여 노른자 낭의 바닥을 따라 적어도 절반의 길이를 연장한 눈에 보이는 벌지를 만든 다음 배아에서 바늘을 제거합니다.
참고: 세포가 바늘을 막거나 주사 중에 손상된 경우, 순간적으로 "연속" 모드로 전환하여 바늘을 제거한 다음 다시 "펄스"로 전환합니다. 이것은 바늘을 차단해제하고 세포가 자유롭고 손상되지 않게 배출될 수 있도록 해야 합니다. - 필요한 경우 종양 세포로 새로운 바늘을적재하여 접시에있는 모든 배아에 대해 동일한 작업을 계속하십시오.
- 모든 배아를 주입 한 후, 바늘을 제거하고 가능한 한 적은 메틸 셀룰로오스로 배펫 을 피펫 할 수 있도록 미세 모세관 파이펫 팁을 사용하여 모든 배아를 함께 밀어 넣습니다.
- 배아를 E3(PTU 및 메틸렌 블루 포함)을 함유한 회복 접시로 옮기고 배아 주변에 E3를 부드럽게 피펫팅하여 세척합니다.
참고: 이 시점에서, 이종이식 된 배아는 다른 접시로 분리하고 한 접시에 약물 용액을 추가하고 다른 접시에 약물 용액 (예 : 약물 비히클)을 추가하여 약물로 치료 할 수 있습니다. - 34 °C에서 배아를 배양하고 접시에서 죽은 또는 부종 배아를 제거하기 위해 매일 두 번 검사를 수행합니다.
참고: 34°C는 이종이식 혈관화를 위한 최적의 온도인 것으로 밝혀졌으며, 또한 제브라피쉬 배아 이종이이식 혈관신생모델(18)을채택한 다른 연구에서도 사용되고 있다. 이종이식은 최대 48hpi(이식 후 시간)까지 언제든지 이미지화할 수 있습니다.
6. 라이브 이미징
- 48 hpi에서 부종없이 3-5 건강한 배아를 확인하십시오. 150 μg/mL 트리카인으로 마취시키고 앞에서 설명한19.
참고: 아가로스가 굳어지면 미세 모세관 파이펫 팁을 사용하여 배아를 측면으로 유지합니다. - 공초점 현미경, 현미경 컨트롤러, 레이저 및 현미경을 제어하기 위한 컴퓨터 소프트웨어를 켭니다.
- 공초점 현미경에 접시를 놓습니다. 20배 배율, 물 담그는 대물 렌즈를 사용하여 밝은 필드 이미징을 사용하여 이종이식을 필드 중앙에 배치합니다.
- 제브라피시 혈관에 라벨을 붙이는 데 사용되는 종양 세포 및 형광포에 사용되는 염료를 검출하는 데 적합한 여기 레이저를 선택합니다.
- 각 레이저의 게인을 종양 세포와 혈관 을 모두 검출할 수 있는 수준으로 조정합니다.
참고: 공초점 설정이 설정되면, 이것들이 실험 전반에 걸쳐 변하지 않도록 하여 이종이식을 비교할 수 있도록 한다. - 종양 세포에 적합한 레이저 채널을 사용하여, 이식의 어느 한 쪽에서 적어도 하나 또는 두 개의 광학 섹션을 허용, 이종이식의 전체 볼륨을 포함하는 이미지화 될 볼륨을 결정한다. z 스택을 만들려면 약 5 μm 간격의 단면 간격을 사용합니다.
참고: z-스택은 이종이식의 전체 부피를 포함해야 하는 것이 필수적이다. - 2개의 채널 화상 진찰을 사용하여, 종양 이종이식 및 혈관 둘 다를 심상합니다. 각 유충에 대해 6.6-6.7단계를 반복하여 이미지화합니다.
7. 타임랩스 이미징
참고: 이 모델은 다양한 세포 유형을 형광적으로 표시하는 제브라피시 형질전환의 투명성과 가용성으로 인해 동적 세포 과정을 이미징하는 데 매우 적합합니다. 따라서 타임랩스 이미징이 이 모델의 주요 응용 분야가 됩니다.
- 환경 챔버를 켜고 이미징 전에 적어도 2 시간 동안 34 °C로 설정하십시오. 챔버가 가습되지 않은 경우, 물 접시를 추가합니다.
- 3-5개의 배아를 마취시키고(2 dpf에서 120 μg/mL 트리카인을 3dpf에서 100 μg/mL 트리카인 사용) 및 앞에서 설명한 프로토콜19에따른 시간 경과 이미징을 위한 0.8% LMP 아가로에 측면으로 장착한다.
참고: 아가로스가 굳어지면 미세 모세관 파이펫 팁을 사용하여 배아를 측면으로 유지합니다. - 6.2-6.7 단계에 설명된 대로 장비를 설정하고 이종이식을 이미지화하고 10분 간격으로 이종이식의 z 스택을 획득합니다.
참고: 배아는 이미지화되고 있으므로 34 °C에서 유지되어야하며 한천의 유충 위에있는 E3을 검사하고 때때로 보충하여 건조하지 않도록해야합니다.
8. 제브라피시 제노이식에 대한 혈관조형성 반응의 정량화
참고: 다음 단계에서는 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 특정 단계는 사용되는 소프트웨어에 따라 다릅니다.
- 종양 이종이식의 z-stack 공초점 이미지 파일을 3D 이미지 분석 소프트웨어의 새 폴더로 전송합니다.
참고: 종양 혈관화 수준을 정량화하기 위해 측정 프로토콜은 모든 이종이식에 대한 종양 부피 또는 혈관 볼륨을 측정하는 데 사용할 수 있도록 보정된 설정으로 작성되어야 합니다. - 종양 이종이식의 부피를 측정하기 위한 "종양 볼륨" 프로토콜을 만들려면 상단 메뉴의 "측정" 탭으로 이동한 다음 창 왼쪽에 나타나는 프로토콜 목록에서 "개체 찾기"라는 프로토콜을 드래그하여 공간으로 이동합니다. "측정을 위해 여기에 작업을 드래그"라는 제목이 붙습니다.
- 이 프로토콜이 종양 채널의 개체를 측정하도록 설정된 다음 프로토콜 목록에서 "채우기로 클립"과 "채우기에서 ROI 만들기"라는 프로토콜을 "측정을 위해 여기 드래그 작업" 공간으로 드래그합니다. 이러한 두 명령이 "개체 찾기"로 식별된 개체에 적용되도록 합니다.
- 이 프로토콜의 설정을 보정하기 전에 창 왼쪽 상단의 "모드" 레이블 위의 드롭다운 메뉴로 이동하여 "확장 초점" 보기를 선택합니다.
- 각 채널 제목 아래에 있는 검은 원을 클릭하여 맨 오른쪽에 있는 창에서 비종양 채널을 선택 해제하여 종양 채널만 볼 수 있도록 합니다. 창 상단의 "Freehand" 도구를 사용하여 모든 종양 볼륨 주위에 "관심 영역"(ROI)을 그립니다.
참고: 종양중 어느 것도 ROI에서 제외되지 않도록 주의하십시오. 이렇게 하면 설정을 보정할 때 프로토콜을 수행할 영역이 제공됩니다. - 이미지 아래의 패널에서 "요약" 레이블을 선택하고 "채우기 2"를 표시하도록 "표시" 옵션을 설정합니다. 보정하려면 설정 창을 여는 개체 찾기 작업의 별표를 클릭합니다. "강도"를 사용하여 "임계값"을 조정하고 배경 형광이 아닌 종양 세포만 선택될 때까지 "더 낮은" 임계값을 결정합니다.
참고: 이는 선택된 ROI(8.5에 그려진)에서 종양 세포로부터의 형광만 검출되고 배경 형광이 측정되지 않도록 하는 것이 중요하다. - "최소 개체 크기"를 결정하여 작은 셀 파편 항목과 반대로 손상되지 않은 셀만 측정되도록 합니다(예: "최소개체 크기"를 100 μm 3로 설정). 상단 메뉴의 측정 탭을 클릭하고 "프로토콜 저장"을 클릭하여 이 프로토콜을 "종양 볼륨"으로 저장하고 모든 이종이식을 측정할 때 동일한 설정을 사용합니다.
- 이종이식 과 관련된 혈관의 부피를 측정하려면 새로운 프로토콜을 만들어야합니다. 상단 메뉴로 이동하여 측정 탭을 클릭하고 "프로토콜 지우기"를 클릭합니다. 이 프로토콜에 대해 "개체 찾기" 및 "ROI로 클립" 작업을 "여기로 드래그 작업"이라는 제목의 공간으로 드래그합니다.
- 첫 번째 명령이 혈관 채널의 개체를 측정하도록 설정되어 있는지 확인하고 다음 명령이 첫 번째 명령으로 식별된 개체에 적용되도록 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 혈관만 볼 수 있도록 극우 창에서 비 혈관 채널을 선택 해제합니다.
- "종양 볼륨" 프로토콜과 유사한 방식으로 "용기 볼륨"에 대한 설정을 결정하고 이 프로토콜을 "용기 볼륨"으로 저장합니다(8.6-8.7 참조).
- 프로토콜을 지우고 이종이식 주위에 ROI를 그리고, 어떤 비종양 자가형광을 포함하지 않도록 주의한다. 측정 탭을 클릭하고 "프로토콜 복원" 명령을 선택하고 "종양 볼륨" 프로토콜을 선택하여 이 ROI 내부의 종양 채널에 있는 개체의 부피 합을 측정합니다.
- "종양 볼륨" 프로토콜에 의해 만들어진 새로운 ROI를 사용하여 "혈관 볼륨" 프로토콜을 사용하여 측정 탭을 클릭하고 "프로토콜 복원" 명령을 선택하고 "Vessel" 명령을 선택하여 이 ROI 내부의 선박 채널내 개체의 총 볼륨을 측정합니다. 볼륨" 프로토콜입니다.
- 혈관 부피를 종양 부피를 나누고 답을 100으로 곱하여 이식편 혈관화의 백분율 값을 얻습니다.
- 다른 모든 이종이식에 대해 8.11에서 8.13 단계를 반복합니다.
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Representative Results
6, 24 및 48 hpi에서 개별 이종이식을 이미징함으로써, 상이한 시점에서의 혈관신생 반응은 도 1A-C에 도시된 바와 같이 계산될 수 있다. 가장 큰 혈관 신생 반응은 이식 후 24-48 시간 사이에서 관찰되며, 접목 혈관의 최대 수준은 2 dpi (그림1A-C)에서볼 수 있습니다. B16-F1 이종이식에 대한 전형적인 혈관신생 반응의 타임랩스 영화는 20.75hpi에서 46hpi까지의 보조 영상1에서 볼 수 있다. 이 영화는 이 프로토콜에 따라 이식된 이종이식을 2 dpf kdrl:EGFP 배아로 이미징함으로써 생성되었다. 이종이식을 통해 성장하는 혈관은 불규칙한 크기와 형태학의 혈관을 가진 고난의 네트워크를 형성하며, 이는 포유류종양(20)에서볼 수 있는 비정상적인 혈관 네트워크의 전형이다. 우리의 모형에 있는 혈관 신생 반응은 xenograft로 성장하는 배의 근원으로 아장 정맥을 보고한 이전 연구 결과와 반대로 일반적인 추기경 정맥에서 이종이식으로 싹트는 혈관의결과입니다 4. 혈관 기원의 차이는 우리가 주입하고 화상 진찰(20)동안 이종이식의 모양과 크기를 쉽게 시각화 할 수 있기 때문에 우리가 더 복부 공간에 우리의 xenografts를 이식한 사실에 기인한다.
그림 1D -F는 VEGFR 억제제(Tivozanib)21,22의DMSO(제어) 또는 50 nM으로 처리한 후 B16-F1 이종이식및 이들의 관련 혈관이식의 대표적인 결과를 나타낸다. 이식 직후, 이식된 배아는 두 그룹으로 분할되었고 50 nM 티보자닙 또는 DMSO(0.5% v/v)를 각 그룹에 적용하였다. 그(것)들은 2 dpi에 화상 진찰의 앞에 이 약에서 유지되었습니다. 이러한 결과는 VEGFR 억제제에서 배양된 이종이식과 관련된 혈관(그림 1E)이DMSO에서 배양된 이종이식과 관련된 혈관보다 훨씬 적다는 것을 보여준다(도 1D). 대조군 배아에서, 전체 이종이식 부위를 가로지르는 광대한 혈관 네트워크가 있다(그림1D),이는 B16-F1 세포의 이식 후 관찰되는 전형적인 혈관신생 반응이다. 도1F에서, 혈관신생 반응은 이 프로토콜에 따라 정량화되었고, 대조군과 비교할 때 VEGFR 억제제 처리된 이종이식에서 이식편 혈관의 명확한 감소를 나타낸다. 이식편 부피에 대한 이식편 혈관화 수준을 정상화했음에도 불구하고 48hpi(54.2%의 변이 계수)에서 이식편 혈관화 수준에 큰 변화가 남아 있습니다. 이것은 종양 혈관의 총 부피의 변화 (변이 계수 73.3 %)에 기인합니다. 우리는 유사한 크기의 이식편조차도 혈관 화 수준에서 큰 변화를 보였다는 것을 관찰했습니다. 이 때문에 치료 그룹당 약 20 개의 이종이식을 사용하는 것이 좋습니다.
그림 1D에서 이종이식과 관련된 혈관을 정량화하기 위해 취한 단계는 그림2에 나타내고 있습니다. 종양 채널은 도 2A에서단독으로 나타내는데, 여기서 B16-F1 세포의 질량은 형광으로 표지 (거짓 색 녹색)가 자가형광을 표시하는 노른자 낭 아래에 보일 수 있습니다. ROI는 종양 볼륨 프로토콜이 종양의 일부로 이 자기 형광을 식별할 수 있기 때문에 노른자 낭에서 자가 형광을 포함하지 않도록 주의하면서 이종이식(그림2A')주위에 신중하게 그려져야 합니다. 종양 볼륨 프로토콜을 수행하면 ROI의 모든 B16-F1 셀을 식별하고 볼륨을 측정하고 ROI를 볼륨으로 클립합니다(그림2A'). 이 새로운 클리핑된 ROI에서 종양 혈관 부피 프로토콜을 수행하면 B16-F1 세포의 질량과 관련된 모든 혈관을 식별하고 부피를 측정할 수 있습니다(그림2A''). 종양 부피 및 종양 혈관 부피 프로토콜로부터의 값은 도 1F에서볼 수 있는 바와 같이 그래프로 플롯되는 이식편 혈관화의 측정을 제공하는데 사용될 수 있다.
도 1: 제브라피시 종양 이종이식 혈관화는 VEGFR 신호 전달 억제제에 의해 억제된다. (A-C) 6 hpi (A), 24hpi (B)및 48 hpi(C)에서 살아있는 배아의 공초점 이미지, GFP 라벨이 부착 된 혈관 (마젠타). %의 이식편 혈관화를 계산하고 해당 패널에 포함시켰다. (D-E) 형광성 라벨이 부착된 B16-F1 이종이목(녹색) 및 GFP 라벨이 부착된 혈관(마젠타)을 E3(D)에서 0.5%(v/v) DMSO로 즉시 처리한 48hpi에서 나타난살아있는 제브라피시 유충의 공초점 이미지 VEGFR 억제제 (티보자니브)E3 (E). D 및 E의 용기 채널은 각각 D'와 E'로 격리되어 표시됩니다. (f) 그래프는 이들 이종이식에서 48hpi에서 48hpi에서 % 이식혈관을 정량화한 데이터를 표시하고, n=42(DMSO), n=20(VEGFR 억제제)을 표시한다. **p>0.01 by Mann-Whitney 테스트, 오차 막대는 s.d. 스케일 막대 = 50 μm을 나타냅니다. 도 1F에 포함된 데이터는11을재현한다.
그림 2: 접목 혈관을 정량화. 형광라벨이 부착된 B16-F1 이종이식(녹색) 및 GFP 라벨이 부착된 혈관(자홍색)을 가진 살아있는 2dpi 제브라피시 유충의 공초점 이미지. (A) ROI를 그리기 전에 종양 채널. (A)) 이종이식 영역 주위에 ROI가 그려져 노른자의 자가 형광이 포함되지 않도록합니다. (A'') "종양 볼륨" 프로토콜은 ROI 내부의 이종이식 의부적을 식별하고 새로운 ROI를 생성하기 위해 수행됩니다. (A''') "종양 혈관 볼륨" 프로토콜은 새로운 ROI 내부의 혈관 부피를 식별하는 데 사용됩니다. 배율 막대 = 50 μm.
보충 영화 1: 종양 이종이식 혈관 신생. GFP 표지된 혈관을 가진 2dpf 제브라피시 배아에 이식된 B16-F1 xenograft의 공초점 시간 경과 영상(kdrl:EGFP). 20.75hpi에서 46hpi로 촬영한 영화. 타임랩스 이미지 z-스택은 10분 간격으로 수집되었다; 영화는 초당 7 프레임으로 만들어졌습니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 종양 세포의 이식입니다. 세포가 배아 부종을 만들지 않고 배아에 성공적으로 이식 할 수있는 위치에 세포를 주입하는 것이 필수적입니다. 너무 앞쪽인 주사는 세포가 심장쪽으로 움직이도록 허용하여 혈류를 차단하고 부종으로 이어질 수 있으며, 너무 후방인 주사는 이식이 제대로 되지 않습니다. 전방 주사는 주입으로 심혼에서 멀리 가리키도록 후방 방향으로 전방에 있는 노른자 낭을 통해서 바늘을 삽입해서 피하는 것이 가장 좋습니다. 후부 주사는 노른자 낭의 둥근 부분의 앞쪽 절반에 있는 위치에 세포를 주입하 여 가장 잘 피할 수 있습니다. 또한, 세포는 노른자 낭에 복부를 주입해야하며 횡측이 아닌 측면 위치가 더 어렵고 이후에 이미지가 야합니다. 일단 연구원이 이 프로세스에 합리적으로 숙달되면, 대략 200-300의 태아는 매일 이종이식으로 이식될 수 있습니다. 혈관 신생 반응의 이미징은 이종이식을 장착하고 이미지화하는 데 걸리는 시간 으로 인해 더 오래 걸릴 것입니다. 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 15-20 개의 이종이식을 이미지화하는 데 약 1 시간이 걸립니다.
두 번째 중요한 단계는 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이식편 혈관을 측정하는 것입니다. 미세 주입을 통해 일관되게 크기의 이종이식을 얻기 어렵기 때문에 종양 부피에 의한 정량이 필요합니다. 모든 실험에서 정확하고 편견 없는 정량적 측정을 얻기 위해 소프트웨어 프로토콜의 설정을 신중하게 보정하고 일관되게 사용해야 합니다. 강도에 대한 최소 임계값설정(종양 체적 및 종양 혈관 부피 모두)은 프로토콜이 종양/혈관및 배경 형광의 일부인 형광을 올바르게 구별할 수 있도록 하기 때문에 이 단계의 중요한 부분입니다. 종양 이종이판 주위의 ROI를 이종이식에 그려서 배아의 밝은 자가형광 부분(예: 노른자 낭)만을 포함하는 것도 중요하다; ROI에 비종양 자가 형광 영역 또는 비 종양 혈관을 우발적으로 포함하면 이러한 부분이 "종양 볼륨" 또는 "종양 혈관 볼륨"의 일부로 측정되어 최종 계산에서 상당한 부정확성을 초래합니다. 혈관 신생 반응에 항상 큰 변화가 있습니다 (그림 1F참조), 그러나, 모델의 제한이 아니라, 이것은 단지 인간 환자와 뮤린 이종이식 모두에서 관찰 된 종양 혈관 밀도의 자연적인 차이를 반영 할 수있다 23세 , 24. 60 이종이식에서 이식편 혈관의 양은 약 1 시간이 소요됩니다.
종양 세포주의 신중한 선택은 또한 이 세포에 의해 생성된 프로 혈관신생 분자의 상이한 수준과 관련될 수 있는 다른 포유류 세포주 사이에서 유도된 혈관신생 반응에 있는 넓은 변이가 있기 때문에 또한 중요합니다4 , 11. 우리의 손에서, B16-F1 마우스 흑색종 세포는 이들 세포로부터VEGFA 분비의 높은 수준(11)으로 인해 강력한 혈관신생 반응을 제공합니다. 이 프로토콜에 대한 가능한 수정은 제브라피시 흑색종 세포의 사용일 것이고, 이는 분석 온도를 28°로 낮출 수 있게 하고, 따라서 숙주 및 종양25 또는 과발현하는 암세포의 사용 모두에 최적일 것이다. FGF4,7,20과같은 프로 혈관 신생 성장 인자.
이 모델의 장점 중 일부는 짧은 시간 범위, 저렴한 비용 및 이종이식 절차가 뮤린 이종이식과 같은 다른 생체 내 모델과 비교하여 수행 될 수있는 상대적 용이성에 있으며, 모두 매우 적합합니다. 대규모 연구 (즉, 항 혈관 신생 화합물에 대한 화학스크린 26). 형광으로 표지된 혈관 및 그밖 세포 모형을 가진 형질전환 물고기의 모형 그리고 가용성을 상시 하는 기능을 사는 기능은 연구원이 혈관 신생 프로세스의 세부사항을 연구하는 것을 허용합니다 (혈관 발아와 같은) 세포 세포 뿐만 아니라 이 모델11,20,27에서혈관신생 중에 일어나는 상호작용(대식세포-내피-내피 상호작용 등). 혈관 정상화는 또한 항혈관신생 치료의 주요 목표이기 때문에, 이 모델에서 혈관 네트워크의 고해상도 라이브 이미징은 이 모델이 이 목표에 지시되는 치료법을 식별할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 의미한다. 네트워크 비틀거린도는 혈관 분기점의 수를 계수함으로써 검사될 수 있고, 선박 형태는 혈관 폭의 변동을 측정하여 검사될 수 있으며, 이 모델28에서프로 정규화 처리를 테스트하고 평가할 수 있습니다. 또한, 형광 미세 혈관 조영술은 종양 혈관(29)의개통 성 및 무결성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 제브라피시의 유전성은 또한 종양 혈관신생에서 다양한 숙주 신호화 경로의 역할을 검사하기 위해유전적으로 변형될 수 있음을 의미한다 6. 이 모형은 그러므로 종양 조정에서 활성화되는 새로운 항 혈관신생 화합물을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다 뿐만 아니라 종양 혈관신생을 통제하는 세포와 분자 상호 작용을 공부하.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 오클랜드 제브라피시 대학과 오클랜드 대학 의학 과학 대학, 의학 대학, 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 뉴질랜드 프로젝트 보조금의 건강 연구 위원회 (14/105), 뉴질랜드 마스덴 기금 프로젝트 보조금의 왕립 학회 (UOA1602) 및 오클랜드 의학 연구 재단 프로젝트 보조금 (1116012) J.W.A에 수여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
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