Summary
Lo scopo di questo metodo è quello di generare un modello in vivo di angiogenesi tumorale xenotrapianto di cellule tumorali dei mammiferi in un embrione di pesce zebra che ha vasi sanguigni etichettati fluorescentmente. Esaminando lo xenotrapianto e i vasi associati, è possibile ottenere una misurazione quantitativa della risposta angiogenica.
Abstract
L'angiogenesi tumorale è un obiettivo chiave della terapia anti-cancro e questo metodo è stato sviluppato per fornire un nuovo modello per studiare questo processo in vivo. Uno xenotrapianto di pesce zebra viene creato impiantando cellule tumorali dei mammiferi nello spazio perivitelline di due giorni dopo la fecondazione degli embrioni di pesce zebra, seguito misurando l'entità della risposta angiogenica osservata in un endpoint sperimentale fino a due giorni post-impianto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di quantizzare con precisione la risposta angiogenica dell'ospite del pesce zebra all'innesto. Ciò consente un esame dettagliato dei meccanismi molecolari e del contributo ospite vs tumorale alla risposta angiogenica. Gli embrioni xenointrapsi a possono essere sottoposti a una varietà di trattamenti, come l'incubazione con potenziali farmaci anti-angiogenesi, al fine di studiare strategie per inibire l'angiogenesi tumorale. La risposta angiogenica può anche essere live-immagine al fine di esaminare processi cellulari più dinamici. La tecnica sperimentale relativamente poco impegnativa, i costi di manutenzione a basso costo del pesce zebra e la breve linea temporale sperimentale rendono questo modello particolarmente utile per lo sviluppo di strategie per manipolare l'angiogenesi tumorale.
Introduction
L'angiogenesi è uno dei segni distintivi classici del cancro e rappresenta un obiettivo della terapia anti-cancro1,2. Per studiare questo processo, sono stati creati modelli di xenotrapianto di cancro impiantando cellule tumorali di mammiferi in animali come i topi3. È stato inoltre sviluppato un modello di xenotrapianto di pesce zebra, che prevede l'impianto di cellule tumorali in 2 giorni dopo la fecondazione (dpi) pesce zebra che si traduce in una rapida crescita dei vasi sanguigni del pesce zebra nello xenotrapianto4.
Questo protocollo descrive un modello di xenotrapianto dell'embrione di pesce zebra in vivo in cui la risposta angiogenica può essere quantificata con precisione nell'intero xenotrapianto. Questo metodo consente allo sperimentatore di esaminare, in vivo, i meccanismi molecolari alla base della risposta angiogenica tumorale. La trattatibilità genetica del pesce zebra permette di interrogare il contributo dell'ospite, mentre la selezione didiverse linee cellulari tumorali permette di esaminare anche il contributo del tumore all'angiogenesi 5,6,7. Inoltre, poiché le larve di pesce zebra sono permeabili a piccole molecole, è possibile utilizzare inibitori specifici della via o vagliare le librerie di farmaci per identificare nuovi inibitori dell'angiogenesi tumorale8,9,10, 11.
Il modello xenotrapianto embrionale di zebra presenta vantaggi unici rispetto ad altri modelli di xenotrapianto mammifero. Gli xenografi di pesce zebra sono più economici e più facili da eseguire, è possibile esaminare un gran numero di animali e l'imaging delle cellule vive consente un esame dettagliato del comportamento cellulare4. A differenza di altri modelli in vivo, che richiedono fino a diverse settimane per osservare una crescita significativa del vaso, l'angiogenesi negli xenografi del pesce zebra può essere osservata entro 24 h dopo l'impianto3,4. Tuttavia, la mancanza di un sistema immunitario adattivo nel pesce zebra embrionale, pur conile nel mantenimento dello xenotrapianto, significa che la risposta immunitaria adattativa e il suo contributo all'angiogenesi tumorale non possono essere esaminati. Inoltre, la mancanza di cellule stromali tumorali, l'incapacità di impiantare ortotopicamente il tumore e la differenza di temperatura di mantenimento tra il pesce zebra e le cellule dei mammiferi sono potenziali punti deboli di questo metodo. Ciò nonostante, l'amenabilità di questo modello per l'imaging dal vivo e la capacità di quantificare con precisione la risposta angiogenica lo rende particolarmente vantaggioso per lo studio dei processi cellulari che regolano l'angiogenesi tumorale in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione degli aghi di microiniezione
- Accendere un tiratore di micropipette e impostare i seguenti parametri (calibrato per il modello di espellere micropipette elencato nella Tabella dei materiali): Calore, 680; Tirare, 75; Velocità, 40; Tempo, 55; Pressione: 530.
- Fissare un capillare di vetro borosilicato nell'eschetto micropipette e tirare il capillare per fare due aghi. Ripetere l'operazione per tutti gli aghi desiderati.
2. Coltura cellulare per l'impianto
NOT: Quando si utilizza questo protocollo, qualsiasi linea cellulare del cancro dei mammiferi può essere utilizzata per l'impianto in embrioni di pesce zebra come xenografi. Tuttavia, c'è molta variazione nella risposta angiogenica indotta tra diverse linee cellulari5,11,12. È stato dimostrato che le cellule di melanoma murine B16-F1 inducono una forte risposta angiogenica negli embrioni di pesce zebra11 e sono quindi appropriate per l'uso in questo protocollo.
- Coltivare le cellule B16-F1 a 37 cm in una fiaschetta di 75 cme 2 utilizzando un supporto MEM-z, integrata con siero fetale bovino (FBS) a una concentrazione finale del 10% (v/v) e Penicillin /Streptomycin, ciascuna ad una concentrazione finale di 100 g/mL.
- Rimuovere il supporto da un flacone 95-100% confluente 75 cm2 di cellule B16-F1 e lavare le cellule in 5 mL di salina con buffer fosfato a temperatura ambiente (PBS).
- Rimuovere il PBS da 5 mL, aggiungere 2 mL di temperatura ambiente 0,25% Trypsin/ acido etilenediaminetracetico (EDTA) e incubare a 37 gradi centigradi per 60 s.
- Toccare il lato del pallone per determinare se le cellule stanno cominciando a perdere il loro attaccamento alla parte inferiore del pallone.
- Aggiungere 8 mL di temperatura ambiente MEM-z con 10% FBS nel pallone, pipetta contro l'interno del pallone per portare tutte le cellule che rimangono aderenti al fondo del pallone in sospensione e pipetta la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g, 4-8 s C per 5 min, aspirare il supporto e procedere all'etichettatura delle cellule con colorante.
3. Etichettatura delle celle B16-F1 con colorante fluorescente
NOT: Per distinguere tra le cellule tumorali impiantate e le altre cellule dell'embrione, le cellule tumorali devono essere etichettate con un colore fluorescente appropriato prima dell'impianto. Questo passaggio può essere saltato se le cellule esprimono già giornalisti fluorescenti.
- Incubare 2 mL di MEM-smaciola senza siero a 37 gradi centigradi.
- Preparare una soluzione di riserva del colorante scelto e diluirla in mezzi MEM-z senza sciometto pre-incubati per realizzare una concentrazione praticabile (esempi di coloranti e concentrazioni appropriati per le cellule B16 F1 sono forniti nella Tabella dei Materiali).
- Pipetta 1 mL della soluzione di tintura nel pellet cellulare (dal passaggio 2.6), mescolare accuratamente pipettando, quindi aggiungere l'altro 1 mL di soluzione di tintura e mescolare.
- Incubare le cellule e la miscela di tintura a 37 gradi centigradi per 40 min, mescolando dolcemente a 20 min.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g, 4-8 s C per 5 min.
- Aspirare il supernatante e lavare le cellule etichettate pipettando con 5 mL di PBS.
- Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 800 x g, 4-8 gradi centigradi per 5 min, aspirare il supernatante e posizionare le cellule sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per l'impianto.
NOT: Il pellet finale della cellula tumorale dovrebbe avere un volume di 20-40.L.
4. Preparazione di embrioni per l'impianto
NOT: Scegliere una linea di pesci zebra transgenici con vasi sanguigni etichettati fluorescentmente (ad esempio kdrl:RFP, fli1a:EGFP, ecc.) 13 del sistema , 14.
- Due giorni prima dell'impianto, deporre le uova del pesce zebra come descritto in precedenza e raccogliere gli embrioni15.
NOT: Poiché non stiamo iniettando questi pesci in una fase precoce, non hanno bisogno di essere raccolti entro 20 min di deposizione delle uova come descritto da Rosen et al.15, ma possono essere raccolti dopo poche ore di accoppiamento. - Mettere gli embrioni in piatti di coltura da 100 mm ad una densità di circa 100 embrioni/piatto.
- Aggiungere 50 mL di E316 (completati con 5 oluna di una soluzione di riserva di 1% w/v di blu di metilene per evitare la contaminazione) ad ogni piatto, pulire eventuali embrioni o detriti morti e tenere il piatto in un'incubatrice scura a 28 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'iniezione.
- A 1 giorno dopo la fecondazione (dpf), aggiungere 1-fenil-2-thiourea (PTU) ad ogni piatto per produrre una concentrazione finale di 30 mg/L PTU in E3. PTU previene la pigmentazione, che può interferire con la capacità di visualizzare le cellule tumorali e vasi sanguigni.
- A 2 dpf, utilizzare aghi o pinzette per dechorionate manualmente tutti gli embrioni che non sono schiusi. Utilizzando un microscopio fluorescente, selezionare tutti gli embrioni transgenici necessari per lo xenotrapianto (50-200).
- Prima dell'impianto, anatetizzare gli embrioni selezionati in una soluzione di 300 g/mL di Tricaine in E3 al fine di prevenire il movimento durante la procedura di iniezione.
- Riempire un piatto da 35 mm con un 2% di metilcellulosa in soluzione E3 per un quarto del volume del piatto.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare circa 50 embrioni (riducendo al minimo il volume della soluzione E3 anche trasferiti) sulla metilcellulosa.
- Utilizzare una punta pipetta Microloader per disporre gli embrioni in modo che siano tutti orientati verticalmente, con le teste verso l'alto e con il lato sinistro rivolto verso l'alto.
NOT: I passi 4.7-4.9 possono essere effettuati anche disponendo gli embrioni su un blocco di agarose come descritto in precedenza17, ma secondo la nostra esperienza, gli embrioni sono più facilmente disposti quando disposti in metilcellulosa.
5. Iniezione perivitelina delle cellule tumorali dei mammiferi in 2 embrioni dpf
NOT: Per garantire che le cellule si aggregano come un innesto quando impiantate, le cellule devono essere mescolate insieme a una miscela di matrice extracellulare (ECM). Abbiamo descritto i passaggi per fare una tale miscela di cellule / ECM quando si utilizza una miscela ECM a cui si fa riferimento nella Tabella dei Materiali. Se si utilizza una matrice alternativa, i passaggi devono essere regolati di conseguenza.
- Dividere uno stock di ECM in 100 aliquote in 500 tubi l e conservare a -20 gradi centigradi fino a quando necessario.
- Scongelare un'aliquota di ECM e aggiungere 100 L di PBS per diluire la miscela al 50% (v/v).
NOT: Il 50% di diluito ECM può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese. - Mescolare bene il 50% ECM con il pellet a cellule B16-F1 (dal punto 3.7) pipettando e mescolando, per produrre una miscela di cellule/ECM in un rapporto 2:1 e conservare la miscela sul ghiaccio.
- Utilizzando una pipetta microcapillare, occupano 3-10 l. di cellule.
- Inserire con attenzione la punta della pipetta in un ago ed espellere la miscela B16-F1/matrice all'estremità dell'ago.
- Inserire l'ago nel portaaago e inclinarlo con un angolo di 45 gradi rispetto al piatto.
- Rompere la punta dell'ago utilizzando una pinzetta per fare un buco abbastanza grande per le cellule da espellere dall'ago senza spremere le cellule.
- Accendere il cilindro d'aria pressurizzato collegato all'apparato di iniezione e attivare momentaneamente l'iniettore in modalità "continua" per spingere le cellule sulla punta dell'ago.
- Togliere l'ago dal piatto e sostituire il piatto con un emocitometro.
- Mettere una goccia di olio sull'emocitometro e iniettare l'ago una volta su questa goccia.
- Contare il numero di cellule espulse con un singolo impulso utilizzando l'emocitometro e calibrare l'ago per espellere circa 150 cellule per impulso regolando la durata dell'impulso.
NOT: L'espulsione di questa quantità di cellule per impulso richiederà diversi impulsi per impiantare con successo uno xenotrapianto. Questo darà al ricercatore un maggiore controllo sulla dimensione finale dello xenotrapianto tumorale permettendo loro di regolare moderatamente il numero / posizione degli impulsi per rendere ogni xenotrapianto più grande o più piccolo come meglio credono. - Puntare l'ago verso il sacco del tuorlo di un embrione e spingerlo attraverso il sacco del tuorlo in una direzione ventrale fino a quando la punta dell'ago è emersa dal sacco del tuorlo e sta spingendo l'epidermide embrionale sul lato ventrale dell'embrione appena posteriore al cuore.
NOT: Posizionare l'ago in modo che entri nel sacco del tuorlo embrionale anteriore alla posizione finale in cui le cellule verranno espulse. Questo farà in modo che le cellule saranno espulse in una direzione lontano dal cuore, diminuendo la probabilità di iniettare le cellule nella vena cardinale comune. - Spingere con attenzione la punta dell'ago in avanti un po 'fino a creare uno spazio (spazio perivitelina) tra l'epidermide e la membrana sac del tuorlo e poi pulsare l'iniettore per espellere parte della miscela cellulare nello spazio perivitelina.
- Ripetere gli impulsi fino a quando 500-800 cellule sono state iniettate nello spazio perivitelina, creando un rigonfiamento visibile che si estende almeno la metà del percorso lungo il fondo del sacco del tuorlo, quindi rimuovere l'ago dall'embrione.
NOT: Se le cellule bloccano l'ago o sono danneggiate durante l'iniezione, svuotare l'ago passando momentaneamente alla modalità "continua" e quindi di nuovo a "impulso". Questo dovrebbe sbloccare l'ago e consentire alle cellule di essere espulse liberamente e intatte. - Continuare a fare lo stesso per tutti gli embrioni nel piatto, caricando un nuovo ago con cellule tumorali quando necessario.
- Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, rimuovere l'ago e spingere tutti gli embrioni insieme utilizzando una punta di pipetta microcapillare in modo che possano essere pipettati con il minor numero possibile di metilcellulososa.
- Trasferire gli embrioni in un piatto di recupero contenente E3 (con PTU e blu di metilene) e lavarli con il pipificamento dolcemente E3 intorno agli embrioni.
NOT: A questo punto, gli embrioni xenoinneto possono essere trattati con farmaci separandoli in piatti diversi e aggiungendo una soluzione farmacologica a un piatto e una soluzione di controllo (come il veicolo antidroga) all'altro piatto. - Incubare gli embrioni a 34 gradi centigradi ed eseguire due volte i controlli giornalieri per rimuovere gli embrioni morti o adedematosi dal piatto.
NOTA: è stata ritenuta la temperatura ottimale per la vascolarizzazione dello xenotrapianto ed è stato utilizzato anche da altri studi che utilizzano l'angiogenesi xenotrapianto embrionale del pesce zebra18. Gli xenogratto possono essere immagine in qualsiasi momento fino a 48 hpi (ore dopo l'impianto).
6. Immagini dal vivo
- A 48 hpi, identificare 3-5 embrioni sani senza edema. Anasthetizzare in 150 g/mL Tricaine e montarli lateralmente in 1% Low Melting Point (LMP) agarose come precedentemente descritto19.
NOT: Mentre l'agarose si sta solidificando, utilizzare una punta di pipetta microcapillare per mantenere gli embrioni posizionati lateralmente. - Accendere il microscopio confocale, il controllore del microscopio, i laser e il software informatico per il controllo del microscopio.
- Posizionare il piatto al microscopio confocale. Utilizzando un ingrandimento 20x, l'obiettivo di immersione dell'acqua, posizionare lo xenotrapianto al centro del campo utilizzando l'imaging del campo luminoso.
- Selezionare i laser di eccitazione appropriati per rilevare il tinrito utilizzato per etichettare le cellule tumorali e il fluoroforo utilizzato per etichettare i vasi sanguigni del pesce zebra.
- Regolare il guadagno per ogni laser ad un livello che consente il rilevamento di entrambe le cellule tumorali e i vasi sanguigni.
NOT: Una volta stabilite le impostazioni confocali, assicurarsi che siano mantenute invariate durante l'esperimento in modo da poter fare confronti tra gli xenogrini. - Utilizzando il canale laser appropriato per le cellule tumorali, determinare un volume da immaginare che include l'intero volume dello xenotrapianto, consentendo almeno una o due sezioni ottiche su entrambi i lati dell'innesto. Utilizzare intervalli di sezione che si trovano a circa 5 m di distanza per creare uno z-stack.
NOT: È essenziale che lo z-stack contenga l'intero volume dello xenotrapianto. - Utilizzando l'imaging a due canali, immagini sia lo xenotrapianto tumorale che i vasi sanguigni. Ripetere i passaggi da 6.6 a 6.7 per ogni larva da immaginare.
7. Immagine time Lapse
NOT: Questo modello è molto adatto per l'imaging di processi cellulari dinamici grazie alla sua trasparenza e alla disponibilità di transgenici di pesci zebra che etichettano fluorescentmente diversi tipi di cellule. Questo rende l'imaging time-lapse un'applicazione chiave di questo modello.
- Accendere la camera ambientale e impostare a 34 gradi centigradi almeno 2 h prima dell'imaging. Se la camera non è umidificata, aggiungere piatti d'acqua.
- Anestesizza 3-5 embrioni (utilizzando 120 Tricaine a 2 dpf e 100 Tricaine a 3 dpf) e montali lateralmente in 0,8% di Agarose per l'imaging time-lapse secondo il protocollo precedentemente descritto19.
NOT: Mentre l'agarose si sta solidificando, utilizzare una punta di pipetta microcapillare per mantenere gli embrioni posizionati lateralmente. - Impostare l'attrezzatura e l'immagine dello xenotrapianto come descritto nei passaggi 6.2-6.7, acquisendo z-stack s dello xenotrapianto a intervalli di 10 min.
NOT: L'embrione deve essere mantenuto a 34 gradi centigradi mentre viene immaginato e l'E3 sopra le larve in agar deve essere controllato e integrato occasionalmente per garantire che non si asciughi.
8. Quantitazione della risposta angiogenica al pesce zebra Xenograft
NOTA: i passaggi seguenti utilizzano il software di analisi delle immagini 3D. I passaggi specifici variano a seconda del software utilizzato.
- Trasferire i file di immagine confocale z-stack di uno xenotrapianto tumorale in una nuova cartella sul software 3D Image Analysis.
NOT: Per quantificare i livelli di vascolarizzazione del tumore, i Protocolli di misurazione devono essere creati con impostazioni calibrate in modo che possano essere utilizzati per misurare il volume del tumore o il volume del vaso per tutti gli xenotraptanti. - Per creare il protocollo "Volume tumorale" per misurare il volume degli xenopifti tumorali, vai alla scheda "Misurazione" nel menu in alto e trascina i protocolli denominati "Trova oggetti" dall'elenco dei protocolli che appare sul lato sinistro della finestra verso lo spazio che si intitola "Trascinare le attività qui per effettuare le misurazioni".
- Assicurarsi che questo protocollo sia impostato per misurare gli oggetti nel canale del tumore, quindi trascinare i protocolli denominati "Clip to ROIs" e "Make ROI from Population" dall'elenco dei protocolli allo spazio "Drag tasks here to make measurements". Assicurarsi che questi due comandi si applichino agli oggetti identificati da "Trova oggetti".
- Prima di calibrare le impostazioni di questo protocollo, vai al menu a discesa sopra l'etichetta "Mode" in alto a sinistra della finestra e seleziona la vista "Extended Focus".
- Deselezionare i canali non tumorali nel riquadro all'estrema destra facendo clic sul cerchio nero sotto ogni intestazione del canale, in modo che solo il canale tumorale può essere visto. Utilizzare lo strumento "Mano libera" nella parte superiore della finestra per disegnare una "regione di interesse" (ROI) intorno a tutto il volume del tumore.
NOT: Fare attenzione a garantire che nessuno del tumore è lasciato fuori dal ROI. Questo fornirà un'area su cui eseguire il protocollo durante la calibrazione delle impostazioni. - Selezionare l'etichetta "Riepilogo" nel pannello sotto l'immagine e impostare l'opzione "Visualizza" per visualizzare "Popolazione 2". Per calibrare, fare clic sull'asterisco nell'attività Trova oggetti, che si aprirà la finestra delle impostazioni. Regolare la "Soglia" utilizzando "Intensità" e determinando la soglia "Inferiore" fino a quando non vengono selezionate solo le cellule tumorali e non la fluorescenza di fondo.
NOT: Questo è importante in modo che venga rilevata solo la fluorescenza delle cellule tumorali nel ROI selezionato (estratto in 8.5) e non viene misurata alcuna fluorescenza di fondo. - Determinare la "Dimensione minima dell'oggetto" in modo che solo le celle intatte vengano misurate rispetto agli elementipiù piccoli di detriti cellulari (ad esempio impostando "Dimensione minima dell'oggetto" su 100 m 3). Salvare questo protocollo come "Volume del tumore" facendo clic sulla scheda Misure nel menu in alto e facendo clic su "Salva protocollo" e utilizzare le stesse impostazioni per misurare tutti gli xenotrapianto.
- Per misurare il volume dei vasi sanguigni associati allo xenotrapianto, è necessario creare un nuovo protocollo. Vai al menu in alto, fai clic sulla scheda Misure e fai clic su "Cancella protocollo". Trascinare le attività "Trova oggetti" e "Ritaglia in ROI" nello spazio intitolato "Trascina le attività qui per effettuare misurazioni" per questo protocollo.
- Assicurarsi che il primo comando sia impostato per misurare gli oggetti nel canale del vaso sanguigno e che il seguente comando sia impostato per applicare agli oggetti identificati dal primo comando. Quindi deselezionare i canali non-nave nel riquadro di estrema destra in modo che solo i vasi sanguigni possono essere visti.
- Determinare le impostazioni per il "Volume del vaso" in modo simile al protocollo "Volume del tumore" e salvare questo protocollo come "Volume del vaso" (vedere 8.6-8.7).
- Cancellare il protocollo e disegnare un ROI intorno allo xenotrapianto, avendo cura di non includere alcuna autofluorescenza non-tumorale. Misurare la somma del volume degli oggetti nel canale tumorale all'interno di questo ROI facendo clic sulla scheda Misure, selezionando il comando "Ripristina protocollo" e scegliendo il protocollo "Volume tumorale".
- Utilizzando il nuovo ROI realizzato dal protocollo "Volume del tumore", utilizzare il protocollo "Volume del vaso" per misurare il volume totale degli oggetti nel canale del vaso all'interno di questo ROI facendo clic sulla scheda Misure, selezionando il comando "Ripristina protocollo" e scegliendo il pulsante "Vessel Volume" protocollo.
- Dividere il volume del vaso per il volume del tumore e moltiplicare la risposta per 100 per ottenere un valore percentuale di vascolarizzazione dell'innesto.
- Ripetere i passaggi da 8.11 a 8.13 per tutti gli altri xenogri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esaminando un singolo xenotrapianto a 6, 24 e 48 hpi, la risposta angiogenica a diversi orari può essere calcolata come mostrato nella Figura 1A-C. La più grande risposta angiogenica si osserva tra 24-48 h dopo l'impianto, con i livelli massimi di vascolarizzazione del trapianto osservati intorno ai 2 dpi (Figura 1A-C). Un filmato time-lapse di una tipica risposta angiogenica a un B16-F1 xenotrapianto da 20.75 hpi fino 46 hpi è visto in Supplementary Movie 1. Questo film è stato generato mediante imaging a uno xenotrapianto impiantato seguendo questo protocollo in un embrione 2 dpf kdrl:EGFP. I vasi che crescono attraverso lo xenotrapianto formano una rete tortuosa con vasi di dimensioni irregolari e morfologia, che è tipica della rete vascolare anormale vista nei tumori dei mammiferi20. La risposta angiogenica nel nostro modello è il risultato di vasi che spuntano dalla vena cardinale comune nello xenotrapianto rispetto agli studi precedenti, che hanno segnalato le vene sub-intestinali come fonte dei vasi che crescono nello xenotrapianto4. La differenza nell'origine del vaso è dovuta al fatto che abbiamo impiantato i nostri xenoinnesti in una posizione più ventrale nello spazio perivitelline, in quanto questo rende più facile visualizzare la forma e le dimensioni dello xenotrapianto durante l'iniezione e l'imaging20.
Figura 1D -F mostra risultati rappresentativi degli xenografi B16-F1 e della relativa vascolatura dopo il trattamento con DMSO (controllo) o 50 nM di un inibitore VEGFR (Tivozanib)21,22. Subito dopo l'impianto, gli embrioni xenoinneto sono stati divisi in due gruppi e a ciascun gruppo è stato applicato 50 nM Tivozanib o DMSO (0,5% v/v). Sono stati mantenuti in questi farmaci prima dell'imaging a 2 dpi. Questi risultati mostrano che i vasi associati agli xenografi incubati nell'inibitore VEGFR (Figura 1E) sono molto meno numerosi dei vasi associati agli xenoinnesti incubati nella DMSO (Figura 1D). Negli embrioni di controllo, c'è un'ampia rete vascolare che si estende in tutta la regione dello xenotrapianto (Figura 1D), che è la tipica risposta angiogenica osservata dopo l'impianto di cellule B16-F1. Nella figura 1F,la risposta angiogenica è stata quantificata seguendo questo protocollo e mostra una chiara riduzione della vascolarizzazione dell'innesto negli xenografi trattati con inibitori VEGFR rispetto ai controlli. Nonostante la normalizzazione dei livelli di vascolarizzazione dell'innesto rispetto al volume dell'innesto, rimane una grande variazione nei livelli di vascolarizzazione del trapianto a 48 hpi (coefficiente di variazione del 54,2%). Ciò è dovuto alla variazione del volume totale dei vasi tumorali (coefficiente di variazione 73,3%); abbiamo osservato che anche gli innesti di dimensioni simili avevano grandi variazioni nel livello di vascolarizzazione. Per questo motivo, si raccomanda di utilizzare circa 20 xenotrapfti per gruppo di trattamento.
Le misure adottate per quantificare i vasi associati allo xenotrapianto da Figura 1D sono illustrati nella Figura 2. Il canale tumorale è mostrato da solo nella Figura 2A, dove una massa di cellule B16-F1 fluorescently etichettate (verde falso colore) può essere visto sotto il sacco del tuorlo, che visualizza l'autofluorescenza. Un ROI deve essere disegnato con attenzione intorno allo xenograft (Figura 2A'), facendo attenzione a non includere alcuna autofluorescenza dal sacco del tuorlo, poiché il protocollo Volume tumorale può quindi identificare questa autofluorescenza come parte del tumore. L'esecuzione del protocollo Tumor Volume identifica tutte le cellule B16-F1 nel ROI, ne misura il volume e ritaglia il ROI al loro volume (Figura 2A''). L'esecuzione del protocollo Del volume del vaso di tumore in questo nuovo ROI ritagliato consente l'identificazione di tutti i vasi associati alla massa delle cellule B16-F1 e ne misura il volume (Figura 2A'''). I valori dei protocolli Volume tumore e Volume del vaso di tumore possono essere utilizzati per dare una misura della vascolarizzazione dell'innesto che viene poi tracciata in un grafico come si vede nella Figura 1F.
Figura 1: La vascolarizzazione dello xenotrapianto del tumore zebra è inibita da un inibitore di segnalazione VEGFR. (A-C) Immagini confocali di un embrione vivo a 6 hpi (A), 24 hpi (B) e 48 hpi (C), con vasi sanguigni etichettati GFP (magenta). La prevascolizzazione % innesto è stata calcolata e inclusa nel pannello corrispondente. (D-E) Immagini confocali di larve di pesce zebra dal vivo mostrate a 48 hpi con xenografi B16-F1 con etichettaflue fluorescente in E3 ( D) o 50 nmdi un Inibitore VEGFR (Tivozanib) in E3 (E). I canali della nave per D ed E sono mostrati in isolamento in D' ed E', rispettivamente. (F) Grafico che mostra i dati della quantificazione della varianza dell'innesto a 48 hpi in questi xenogrini, n - 42 (DMSO), n 20 (inibitore VEGFR). Il test Mann-Whitney, le barre di errore sono di tipo s.d. I dati contenuti nella figura 1F sono riprodotti11.
Figura 2: Quantificare la vascolarizzazione dell'innesto. Immagine confocale di larve di pesce zebra dal vivo da 2 dpi con xenoftB B16-F1 (verde) e vasi sanguigni con etichettatura GFP (magenta). (A) Canale tumorale prima del disegno di un ROI. (A') Un ROI viene disegnato intorno alla regione dello xenotrapianto, assicurando che l'autofluorescenza nel tuorlo non sia inclusa. (A'') Il protocollo "Volume tumorale" viene eseguito per identificare il volume di xenotrapianto all'interno del ROI e crea anche un nuovo ROI. (A''') Il protocollo "Volume dei vasi tumorali" viene utilizzato per identificare il volume dei vasi all'interno del nuovo ROI. Barra della scala: 50 m.
Film supplementare 1: Angiogenesi dello xenotrapianto tumorale. Immagini confocali time-lapse di uno xenotrapianto B16-F1 impiantato in un embrione di pesce zebra a 2 dpf con vasi sanguigni etichettati tramite GFP (kdrl:EGFP). Film dal 20.75 hpi a 46 hpi. Time-lapse immagine z-stacks sono stati raccolti 10 min di distanza; film è stato realizzato a 7 fotogrammi al secondo. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il primo passo critico nel protocollo è l'impianto delle cellule tumorali. È essenziale che le cellule vengano iniettate in un luogo che consenta allo xenotrapianto di impiantare con successo nell'embrione senza rendere l'embrione edematoso. Un'iniezione troppo anteriore può permettere alle cellule di muoversi verso il cuore, bloccando il flusso sanguigno e portando all'edema, mentre un'iniezione troppo posteriore si tradurrà in uno xenotrapianto impiantato male. Un'iniezione anteriore è meglio evitare inserendo l'ago attraverso il sacco del tuorlo in una direzione anteriore a posteriore in modo che sia rivolto lontano dal cuore mentre si inietta. Un'iniezione posteriore è meglio evitare iniettando le cellule in una posizione nella metà anteriore della parte rotonda del sacco del tuorlo. Inoltre, le cellule devono essere iniettate ventrale al sacco del tuorlo e non laterali ad esso, come la posizione laterale è più difficile da visualizzare e successivamente immagine. Una volta che il ricercatore è ragionevolmente abile in questo processo, circa 200-300 embrioni possono essere impiantati con xenografti ogni giorno. L'imaging della risposta angiogenica richiederà più tempo a causa del tempo impiegato per montare e immaginare gli xenografi; ci vuole circa un'ora per immagini 15-20 xenogranti utilizzando un microscopio confocale a scansione laser standard.
Il secondo passo critico è la misurazione della vascolarizzazione dell'innesto utilizzando un software di analisi delle immagini 3D. La quantificazione per volume del tumore è necessaria in quanto è difficile ottenere xenotrapianto di dimensioni costante attraverso la microiniezione. È necessario calibrare attentamente le impostazioni dei protocolli software e utilizzarle in modo coerente per ottenere misurazioni quantitative accurate e imparziali per tutti gli esperimenti. L'impostazione della soglia minima per l'intensità (sia per il volume del tumore che per il volume del vaso di tumore) è una parte importante di questo passaggio in quanto consente al protocollo di discriminare correttamente tra la fluorescenza che fa parte del tumore/vasi e la fluorescenza di fondo. È importante anche disegnare il ROI intorno al xenotrapianto tumorale per includere solo lo xenotrapianto tumorale e non parti luminose dell'embrione (come il sacco del tuorlo); l'inclusione accidentale di eventuali regioni autofluorescing non tumorali o vasi sanguigni non tumorali nel ROI comporterà che queste parti vengano misurate come parte di "volume di tumore" o "volume del vaso di tumore", creando significative imprecisioni nel calcolo finale. C'è sempre una grande variazione nella risposta angiogenica (vedi Figura 1F),tuttavia, piuttosto che essere una limitazione del modello, questo può semplicemente riflettere la varianza naturale nella densità dei vasi tumorali osservata sia nei pazienti umani che nei xenointrapini murini 23 del 23 o , 24. La quantificazione della vascolarizzazione dell'innesto in 60 xenogrini richiederà circa 1 h.
Un'attenta selezione della linea cellulare tumorale è importante anche perché c'è un'ampia variazione nella risposta angiogenica indotta tra diverse linee cellulari dei mammiferi, che possono essere correlate ai diversi livelli di molecole pro-angiogeniche prodotte da queste cellule4 , 11.Nelle nostre mani, le cellule del melanoma del topo B16-F1 danno una robusta risposta angiogenica, probabilmente a causa dell'alto livello di secrezione VEGFA da queste cellule11. Eventuali modifiche a questo protocollo sarebbero l'uso di cellule di melanoma del pesce zebra, che consentirebbe di abbassare la temperatura del saggio a 28 gradi e quindi di essere ottimale sia per l'ospite che per il tumore25 o per l'uso di cellule tumorali che sovraesprimano fattori di crescita pro-angiogenici come FGF4,7,20.
Alcuni dei vantaggi di questo modello si trovano nel suo breve lasso di tempo, basso costo, e la relativa facilità con cui la procedura di xenotrapianto può essere condotta rispetto ad altri modelli in vivo come murine xenografts, che lo rendono altamente suscettibile di essere utilizzato per studi su larga scala (cioè schermi chimici per composti anti-angiogenici26). La capacità di vivere il modello e la disponibilità di pesci transgenici con vasi sanguigni etichettati fluorescentmente e altri tipi di cellule consente ai ricercatori di studiare i dettagli del processo di angiogenesi (come la germogliazione dei vasi) e le cellule cellulari interazioni (come le interazioni macrofalo-endotelia-endoteliali) che avvengono durante l'angiogenesi in questo modello11,20,27. Poiché la normalizzazione dei vasi è anche un obiettivo chiave della terapia antiangiogenica, l'imaging live ad alta risoluzione della rete vascolare negli xenografi significa che questo modello ha il potenziale per identificare i trattamenti che sono diretti a questo obiettivo. La tortuosità della rete potrebbe essere esaminata contando il numero di rami di imbarcazioni, mentre la morfologia dei vasi potrebbe essere esaminata misurando la variazione della larghezza del vaso, consentendo di testare e valutare i trattamenti a favore della normalizzazione nel modello28. Inoltre, la microangiografia a fluorescenza può essere utilizzata per determinare la patenza e l'integrità dei vasi tumorali29. La trattabilità genetica del pesce zebra significa anche che può essere geneticamente modificato per esaminare il ruolo di varie vie di segnalazione dell'ospite nell'angiogenesi tumorale6. Questo modello può quindi essere utilizzato per identificare nuovi composti anti-angiogenici che sono attivi in un ambiente tumorale, nonché studiare le interazioni cellulari e molecolari che regolano l'angiogenesi tumorale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Alhad Mahagaonkar per aver gestito la struttura di pesce zebra dell'Università di Auckland e l'Unità di Ricerca Biomedica Imaging, Scuola di Scienze Mediche, Università di Auckland, per assistenza nella microscopia confocale time-lapse. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di progetto del Consiglio per la ricerca sanitaria della Nuova èelanda (14/105), una sovvenzione per il progetto Marsden Fund (UOA1602) della Royal Society of Neozelandese e una sovvenzione per il progetto Auckland Medical Research Foundation (1116012) assegnato a J.W.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
