Summary
Het doel van deze methode is het genereren van een in vivo model van tumor angiogenese door xenotransplanterende tumorcellen van zoogdieren tot een embryo van zebravis dat fluorescently gelabelde bloedvaten heeft. Door beeldvorming van de xenotransplantaatmodellen is en geassocieerde vaten kan een kwantitatieve meting van de angiogene respons worden verkregen.
Abstract
Tumor angiogenese is een belangrijk doelwit van anti-kankertherapie en deze methode is ontwikkeld om een nieuw model te bieden om dit proces in vivo te bestuderen. Een zebravis xenotransplantaatmodellen is wordt gecreëerd door het implanteren van zoogdieren tumorcellen in de perivitelline ruimte van twee dagen-post-bemesting zebravis embryo's, gevolgd door het meten van de mate van de angiogene respons waargenomen bij een experimenteel eindpunt tot twee dagen na implantatie. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om de zebravis host angiogene reactie op het transplantaat nauwkeurig te Kwantificeer. Dit maakt gedetailleerd onderzoek van de moleculaire mechanismen en de bijdrage van gastheer versus tumor aan de angiogene respons mogelijk. De xenografted embryo's kunnen worden onderworpen aan een verscheidenheid aan behandelingen, zoals incubatie met potentiële anti-angiogenese medicijnen, om strategieën voor de remming van de tumor angiogenese te onderzoeken. De angiogene respons kan ook live-imaged zijn om meer dynamische cellulaire processen te onderzoeken. De relatief onveeleisende experimentele techniek, goedkope onderhoudskosten van zebravis en korte experimentele tijdlijn maken dit model vooral nuttig voor de ontwikkeling van strategieën om de tumor angiogenese te manipuleren.
Introduction
Angiogenese is een van de klassieke kenmerken van kanker en vertegenwoordigt een doelwit van anti-kankertherapie1,2. Om dit proces te bestuderen, xenotransplantaatmodellen is modellen van kanker zijn gemaakt door het implanteren van zoogdier tumorcellen in dieren zoals muizen3. Een zebravis xenotransplantaatmodellen is model is ook ontwikkeld, waarbij de implantatie van tumorcellen in 2 dagen post fertilisatie (dpi) zebravis die resulteert in een snelle groei van zebravis bloedvaten in de xenotransplantaatmodellen is4.
Dit protocol beschrijft een in vivo zebravis embryo tumor xenotransplantaatmodellen is model waarin de angiogene respons nauwkeurig kan worden gekwantificeerd over de gehele xenotransplantaatmodellen is. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om in vivo de moleculaire mechanismen te onderzoeken die de tumor angiogene respons ondersteunen. De genetische traceerbaarheid van de zebravissen maakt het mogelijk de gastheer bijdrage te ondervragen, terwijl de selectie van verschillende tumor cellijnen toestaat dat de tumor bijdrage aan angiogenese ook wordt onderzocht5,6,7. Bovendien, als zebravis larven zijn permeabel voor kleine moleculen, specifieke pathway remmers kunnen worden gebruikt of drug bibliotheken kunnen worden gescreend om te identificeren van de nieuwe remmers van tumor angiogenese8,9,10, 11.
Het zebravis embryo xenotransplantaatmodellen is model presenteert unieke voordelen ten opzichte van andere zoogdier xenotransplantaatmodellen is modellen. Zebravis xenotransplantaten zijn goedkoper en gemakkelijker uit te voeren, grote aantallen dieren kunnen worden onderzocht en live-celbeeldvorming laat gedetailleerd onderzoek van het Celgedrag toe4. In tegenstelling tot andere in vivo-modellen, die tot enkele weken nodig hebben om significante bloedvat groei te observeren, kan angiogenese in zebravis xenotransplantaten worden waargenomen binnen 24 uur na implantatie3,4. Het ontbreken van een adaptief immuunsysteem in embryonale zebravis, terwijl het gunstig is voor het behoud van de xenograft, betekent echter dat de adaptieve immuunrespons en zijn bijdrage aan de tumor angiogenese niet kunnen worden onderzocht. Bovendien zijn het gebrek aan tumor stromale cellen, het onvermogen om de tumor orthotopisch te implanteren en het verschil in onderhouds temperatuur tussen zebravis en zoogdiercellen potentiële zwakke punten van deze methode. Niettemin, de geschiktheid van dit model voor Live beeldvorming en de mogelijkheid om de angiogene respons nauwkeurig te kwantificen maakt het uniek gunstig voor het bestuderen van de cellulaire processen die de tumor angiogenese in vivo reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van micro injectienaalden
- Zet een micro pipet-trekker aan en stel de volgende parameters in (gekalibreerd voor het in de materiaallijst vermelde micropipet trekker-model): warmte, 680; Pull, 75; Velocity, 40; Tijd, 55; Druk: 530.
- Zet een borosilicaatglas capillair in de pipet-trekker en trek het capillair aan om twee naalden te maken. Herhaal dit voor zo veel naalden als gewenst.
2. celkweek voor implantatie
Opmerking: Bij het gebruik van dit protocol kan elke zoogdier kanker cellijn worden gebruikt voor implantatie in zebravis embryo's als xenografts. Er is echter veel variatie in de angiogene respons geïnduceerd tussen verschillende cellijnen5,11,12. B16-F1 Murine melanoom cellen is aangetoond dat het induceren van een sterke angiogene respons in zebravis embryo's11 en zijn daarom geschikt voor gebruik in dit protocol.
- Kweek B16-F1-cellen bij 37 °C in een kolf van 75 cm2 met mem-α-media, aangevuld met foetaal runderserum (FBS) tot een eindconcentratie van 10% (v/v) en penicillaire/streptomycine, elk in een eindconcentratie van 100 μg/ml.
- Verwijder de media van een 95-100% Confluent health 75 cm2 kolf van B16-F1 cellen en was de cellen in 5 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder de 5 mL PBS, voeg 2 mL kamertemperatuur 0,25% trypsine/ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) toe en incuberen bij 37 °C voor 60 s.
- Tik op de zijkant van de kolf om te bepalen of de cellen hun gehechtheid aan de onderkant van de kolf beginnen te verliezen.
- Voeg toe 8 mL kamertemperatuur MEM-α met 10% FBS in de kolf, Pipetteer tegen de binnenkant van de kolf om cellen die aan de onderkant van de kolf blijven zitten in suspensie te brengen en de celsuspensie in een buis van 15 mL te Pipetteer.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 800 x g, 4-8 °c gedurende 5 minuten, zuig de media op en ga verder met het labelen van de cellen met kleurstof.
3. etikettering B16-F1 cellen met fluorescerende kleurstof
Opmerking: Om onderscheid te maken tussen de geïmplanteerde tumorcellen en andere cellen in het embryo, moeten de tumorcellen vóór de implantatie worden geëtiketteerd met een geschikte fluorescerende kleurstof. Deze stap kan worden overgeslagen als de cellen al fluorescerende reporters uitdrukken.
- Inincuberen 2 mL serum vrije MEM-α-media bij 37 °C.
- Bereid een stamoplossing van de gekozen kleurstof en Verdun deze in voorgeïnde 2 mL van de serum vrije MEM-α-media om een werkbare concentratie te maken (voorbeelden van kleurstoffen en concentraties die geschikt zijn voor B16 F1-cellen zijn beschikbaar in de tabel met materialen).
- Pipetteer 1 mL van de kleurstofoplossing in de celpellet (vanaf stap 2,6), meng grondig door pipetteren en voeg vervolgens de andere 1 mL kleurstof oplossing toe en meng.
- Inincuberen de cellen en het kleurstof mengsel bij 37 °C gedurende 40 min, mengen door zachtjes schudden op 20 min.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 800 x g, 4-8 °c gedurende 5 minuten.
- Zuig de supernatant op en was de gelabelde cellen door pipetteren met 5 mL PBS.
- Centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 800 x g, 4-8 °c gedurende 5 minuten, zuig de supernatant op en plaats de cellen op ijs totdat ze klaar zijn voor implantatie.
Opmerking: De uiteindelijke tumor celpellet moet een volume van 20-40 μL hebben.
4. bereiding van embryo's voor implantatie
Opmerking: Kies een transgene zebravis lijn die fluorescently gelabelde bloedvaten heeft (bijv. kdrl: RFP, fli1a: EGFP, enz.) 13 , 14.
- Twee dagen voorafgaand aan de implantatie, spawn de zebravis zoals eerder beschreven en verzamel de embryo's15.
Opmerking: Omdat we deze vissen niet in een vroeg stadium injecteren, hoeven ze niet binnen 20 minuten na het paaien te worden verzameld, zoals beschreven door Rosen et al.15, maar kunnen worden verzameld na een paar uur van paring. - Plaats de embryo's in 100 mm cultuur gerechten met een dichtheid van ongeveer 100 embryo's/schotel.
- Voeg 50 mL E316 (aangevuld met 5 μL van een 1% w/v waterige oplossing van methyleenblauw om verontreiniging te voorkomen) toe aan elk gerecht, Maak eventuele dode embryo's of vuil schoon en bewaar het gerecht in een donkere incubator bij 28 °c totdat het klaar is voor injectie.
- Bij 1 dag na de bevruchting (DPF), voeg 1-fenyl-2-thiourea (PTU) toe aan elk gerecht om een eindconcentratie van 30 mg/L PTU in E3 te produceren. PTU voorkomt pigmentatie, die kan interfereren met de mogelijkheid om te bekijken van de tumorcellen en bloedvaten.
- Bij 2 DPF, gebruik naalden of pincet om handmatig te dechorionate embryo's die zijn uitgekomen. Selecteer met behulp van een fluorescerende Microscoop zoveel transgene embryo's als nodig is voor xenografting (50-200).
- Voorafgaand aan de implantatie worden de geselecteerde embryo's verdoofde in een oplossing van 300 μg/mL tricaïne in E3 om beweging tijdens de injectieprocedure te voorkomen.
- Vul een 35 mm schaal met een 2% Hydroxypropyl methylcellulose in E3 oplossing tot een kwart van het volume van de schotel.
- Gebruik een pipet om ongeveer 50 embryo's te plaatsen (minimaliseert het volume van de E3-oplossing ook overgebracht) op de methylcellulose.
- Gebruik een pipetpunt met micro loader om de embryo's zo te rangschikken dat ze allemaal verticaal georiënteerd zijn, met de koppen naar boven en met de linker kant naar boven gericht.
Opmerking: Stappen 4.7-4.9 kunnen ook worden uitgevoerd door de embryo's op een agarose blok te rangschikken zoals eerder beschreven17, maar in onze ervaring worden de embryo's gemakkelijker gerangschikt wanneer ze in methylcellulose worden aangebracht.
5. perivitelline injectie van zoogdier kankercellen in 2 DPF-embryo's
Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de cellen bij de implantatie samen een Graft vormen, moeten de cellen worden vermengd met een extracellulair matrix mengsel (ECM). We hebben de stappen beschreven om een dergelijk mengsel van cellen/ECM te maken bij het gebruik van een ECM-mengsel waarnaar wordt verwezen in de tabel met materialen. Als een alternatieve matrix wordt gebruikt, moeten de stappen dienovereenkomstig worden aangepast.
- Verdeel een voorraad ECM in 100 μL aliquots in 500 μL buizen en bewaar deze bij-20 °C tot het nodig is.
- Een hoeveelheid ECM ontdooien en 100 μL PBS toevoegen om het mengsel te verdunnen tot 50% (v/v).
Opmerking: Verdunde 50% ECM kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard. - Meng de 50% ECM goed met de B16-F1-celpellet (uit stap 3,7) door pipetteren en roeren, om een mengsel van cellen/ECM in een 2:1-verhouding te produceren en het mengsel op ijs op te slaan.
- Gebruik een microcapillaire pipet en neem 3-10 μL cellen in.
- Steek de pipetpunt voorzichtig in een naald en werp het B16-F1/matrix mengsel in het uiteinde van de naald.
- Steek de naald in de naald houder en kantel deze in een hoek van 45 ° naar de schaal.
- Breek de punt van de naald met behulp van een pincet om een gat te maken dat groot genoeg is voor de cellen die uit de naald worden uitgeworpen zonder de cellen te knijpen.
- Zet de onder druk staande luchtcilinder aan op het injectie apparaat en draai de injector op de "continue" modus om de cellen naar de punt van de naald te duwen.
- Verwijder de naald uit de schaal en vervang de schaal door een hemocytometer.
- Plaats een druppel olie op de hemocytometer en Injecteer de naald eenmaal op deze druppel.
- Tel het aantal cellen dat met een enkele puls wordt uitgeworpen met behulp van de hemocytometer en Kalibreer de naald om ongeveer 150 cellen per puls uit te werpen door de pulsduur aan te passen.
Opmerking: Het uitwerpen van deze hoeveelheid cellen per puls vereist verschillende pulsen om een succesvolle xenograft te implanteren. Dit zal de onderzoeker meer controle geven over de uiteindelijke grootte van de tumor xenotransplantaatmodellen is door hen in staat te stellen matig het aantal/locatie van pulsen aan te passen om elke xenotransplantaatmodellen is groter of kleiner te maken zoals ze zien. - Plaats de naald in de richting van de dooierzak van een embryo en duw deze door de dooierzak in een ventrale richting totdat de punt van de naald uit de dooierzak is gekomen en de embryonale epidermis op de ventrale zijde van het embryo net posterieur aan het hart duwt.
Opmerking: Plaats de naald zodanig dat deze de embryonale dooierzak binnendringt op de uiteindelijke plaats waar de cellen zullen worden uitgeworpen. Dit zal ervoor zorgen dat de cellen in een richting weg van het hart worden uitgeworpen, waardoor de kans op het injecteren van de cellen in de gemeenschappelijke kardinale ader afneemt. - Duw voorzichtig de punt van de naald een beetje naar voren totdat het een spatie (perivitelline ruimte) tussen de epidermis en het dooierzak membraan heeft gecreëerd en pulseer vervolgens de injector om een deel van het celmengsel in de perivitelline ruimte te werpen.
- Herhaal de pulsen tot 500-800 cellen in de perivitelline ruimte zijn geïnjecteerd, waardoor een zichtbare bult ontstaat die ten minste de helft van de weg langs de bodem van de dooierzak doorloopt, en vervolgens de naald uit het embryo verwijdert.
Opmerking: Als de cellen de naald blokkeren of beschadigd zijn tijdens de injectie, moet u de naald verwijderen door kortstondig over te schakelen naar de "continue" modus en vervolgens terug te gaan naar "Pulse". Dit moet de naald deblokkeren en laat de cellen vrij en onbeschadigd worden uitgeworpen. - Blijf hetzelfde doen voor alle embryo's in het gerecht, het laden van een nieuwe naald met tumorcellen indien nodig.
- Na het injecteren van alle embryo's, verwijder de naald en duw alle embryo's samen met behulp van een microcapillaire pipetpunt zodat ze met zo weinig mogelijk Hydroxypropyl methylcellulose kunnen worden uitgepipetteert.
- Breng de embryo's over in een herstel schotel met E3 (PTU en methyleenblauw) en was ze door het zachtjes pipetteren van de E3 rond de embryo's.
Opmerking: Op dit punt, de xenografted embryo's kunnen worden behandeld met drugs door ze te scheiden in verschillende gerechten en het toevoegen van een drug oplossing aan één gerecht en een controle-oplossing (zoals het medicijn voertuig) aan het andere gerecht. - Inbroed de embryo's bij 34 °C en voer tweemaal daags controles uit om dode of oedemateuze embryo's uit het gerecht te verwijderen.
Opmerking: 34 °c bleek de optimale temperatuur te zijn voor xenotransplantaat vascularisatie en is ook gebruikt door andere studies die de zebravis embryonale xenotransplantaatmodellen is angiogenese model18gebruiken. De xenotransplantaten kunnen op elk moment worden gefotografeerd tot 48 HPI (uren na implantatie).
6. live beeldvorming
- Bij 48 HPI, Identificeer 3-5 gezonde embryo's zonder oedeem. Veranesthetiseer ze in 150 μg/mL tricaïne en monteer ze lateraal in 1% laag smeltpunt (LMP) agarose zoals eerder beschreven19.
Opmerking: Als de agarose stollen is, gebruik dan een microcapillaire pipetpunt om de embryo's zijdelings te positioneren. - Schakel de confocale Microscoop, de Microscoop controller, de lasers en de computer software in om de Microscoop te besturen.
- Plaats het gerecht op een confocale Microscoop. Met behulp van een 20x vergroting, water dippen objectief lens, Positioneer de xenotransplantaatmodellen is in het midden van het veld met behulp van brightfield Imaging.
- Selecteer excitatie lasers die geschikt zijn voor het opsporen van de kleurstof die wordt gebruikt om de tumorcellen te labelen en de de die wordt gebruikt om de zebravis-bloedvaten te labelen.
- Pas de versterking voor elke laser op een niveau dat de detectie van zowel de tumorcellen en de bloedvaten mogelijk maakt.
Opmerking: Zodra confocale instellingen zijn vastgesteld, zorg ervoor dat deze ongewijzigd blijven gedurende het experiment, zodat vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen xenografts. - Gebruik het Laser kanaal dat geschikt is voor de tumorcellen, bepaal een volume dat moet worden afgebeeld met het volledige volume van de xenograft, waardoor ten minste één of twee optische secties aan beide zijden van het transplantaat worden weergegeven. Gebruik sectie-intervallen die ongeveer 5 μm van elkaar zijn om een z-stack te maken.
Opmerking: Het is essentieel dat de z-stack het volledige volume van de xenograft moet bevatten. - Met behulp van twee kanaal Imaging, beeld zowel de tumor xenotransplantaatmodellen is en de bloedvaten. Herhaal stap 6.6-6.7 voor elke larve die moet worden afgebeeld.
7. timelapse-beeldvorming
Opmerking: Dit model is zeer geschikt voor het beeldvormende dynamische cellulaire processen vanwege de transparantie en de beschikbaarheid van zebravis transgenics die fluorescently label verschillende celtypen. Dit maakt time-lapse Imaging een belangrijke toepassing van dit model.
- Zet de milieu kamer aan en stel op 34 °C ten minste 2 uur vóór de beeldvorming. Als de kamer niet wordt bevoficeerd, voeg dan water gerechten toe.
- Verdoving 3-5 embryo's (met 120 μg/mL tricaïne bij 2 DPF en 100 μg/mL tricaïne bij 3 DPF) en monteer ze lateraal in 0,8% LMP agarose voor timelapse-beeldvorming volgens het eerder beschreven protocol19.
Opmerking: Als de agarose stollen is, gebruik dan een microcapillaire pipetpunt om de embryo's zijdelings te positioneren. - De apparatuur en het beeld van de xenotransplantaatmodellen is instellen zoals beschreven in de stappen 6.2-6.7, het verwerven van z-stapels van de xenotransplantaatmodellen is met 10 minuten intervallen.
Opmerking: Het embryo moet op 34 °C worden gehouden omdat het wordt afgebeeld en de E3 bovenop de larven in agar moet worden gecontroleerd en af en toe worden aangevuld om ervoor te zorgen dat het niet uitdroogt.
8. kwantifictatie van de angiogene respons op de zebravis xenograft
Opmerking: de volgende stappen maken gebruik van 3D-beeldanalyse software. Specifieke stappen zullen variëren afhankelijk van de gebruikte software.
- Overdracht van de z-stack confocale beeldbestanden van een tumor xenotransplantaatmodellen is naar een nieuwe map op de 3D-beeldanalyse software.
Opmerking: Om de niveaus van tumor vascularisatie kwantificering, moeten Meetprotocollen worden gemaakt met instellingen gekalibreerd zodat ze kunnen worden gebruikt voor het meten van ofwel tumor volume of vat volume voor alle xenografts. - Om het "tumor volume" protocol voor het meten van het volume van de tumor xenografts te maken, ga naar de "meting" tab in het bovenste menu en sleep vervolgens de protocollen met de naam "Find Objects" uit de lijst van protocollen die aan de linkerzijde van het venster verschijnt om de ruimte dat is getiteld "Sleep taken hier om metingen te maken".
- Zorg ervoor dat dit protocol is ingesteld op het meten van objecten in het tumor kanaal en sleep vervolgens de protocollen met de naam "clip naar ROIs" en "ROI van populatie maken" uit de lijst met protocollen naar de "Sleep taken hier om metingen te maken" ruimte. Zorg ervoor dat deze twee opdrachten van toepassing zijn op de objecten die worden aangeduid met ' objecten zoeken '.
- Voordat u de instellingen van dit protocol Kalibreer, gaat u naar het dropdown menu boven het "mode" label linksboven in het venster en selecteert u de "Extended focus" weergave.
- Deselecteer de niet-tumor kanalen in het deelvenster uiterst rechts door te klikken op de zwarte cirkel onder elke kanaal kop, zodat alleen de tumor kanaal kan worden gezien. Gebruik de "FreeHand"-tool aan de bovenkant van het venster om een "regio van belang" (ROI) rond alle tumor volume te tekenen.
Opmerking: Zorg ervoor dat geen van de tumor uit de ROI wordt gelaten. Dit zal een regio bieden waarop het protocol moet worden uitgevoerd terwijl u de instellingen Kalibreer. - Selecteer het label "samenvatting" in het paneel onder de afbeelding en stel de optie "display" in om "populatie 2" weer te geven. Om te kalibreren, klikt u op het sterretje in de taakobjecten zoeken, die het venster instellingen zal openen. Pas de "Threshold" met behulp van "intensiteit" en het bepalen van de "lagere" drempel totdat alleen de tumorcellen zijn geselecteerd en niet de achtergrond fluorescentie.
Opmerking: Dit is belangrijk, zodat alleen de fluorescentie van de tumorcellen in de geselecteerde ROI (getekend in 8,5) wordt gedetecteerd en geen van de achtergrond fluorescentie wordt gemeten. - Bepaal de "minimale objectgrootte" zodat alleen intacte cellen worden gemeten in tegenstelling tot kleinere items van celpuin (bijvoorbeeld door de "minimale objectgrootte" in te stellen als 100 μm3). Sla dit protocol op als "tumor volume" door op het tabblad metingen in het bovenste menu te klikken en op "Save protocol" te klikken en dezelfde instellingen te gebruiken voor het meten van alle xenografts.
- Om het volume van de xenograft-geassocieerde bloedvaten te meten, moet u een nieuw protocol maken. Ga naar het bovenste menu, klik op het tabblad metingen en klik op "Clear protocol". Sleep de taken ' objecten zoeken ' en ' clip naar ROIs ' naar de ruimte met de titel ' Sleep taken hier om metingen te maken ' voor dit protocol.
- Zorg ervoor dat de eerste opdracht is ingesteld op het meten van objecten in het bloedvat kanaal en dat de volgende opdracht is ingesteld om toe te passen op de objecten die worden geïdentificeerd door de eerste opdracht. Hef vervolgens de selectie van de niet-vaar kanalen in het rechterdeel venster op, zodat alleen de bloedvaten kunnen worden gezien.
- Bepaal de instellingen voor het "vaartuig volume" op een vergelijkbare manier als voor het "tumor volume" protocol en sla dit protocol op als "vat volume" (zie 8.6-8.7).
- Wis het protocol en teken een ROI rond de xenograft, waarbij wordt gezorgd dat geen niet-tumor autofluorescentie wordt opgenomen. Meet de som van het volume van de objecten in het tumor kanaal binnen deze ROI door te klikken op de metingen tab, het selecteren van de "Restore protocol" commando en het kiezen van de "tumor volume" protocol.
- Met behulp van de nieuwe ROI gemaakt door de "tumor volume" protocol, gebruikt u de "vat volume" protocol voor het meten van het totale volume van objecten in het vaartuig kanaal binnen deze ROI door te klikken op de metingen tab, het selecteren van de "Restore protocol" commando en het kiezen van de "vat Volume "protocol.
- Verdeel het volume van het vat door het tumor volume en vermenigvuldig het antwoord met 100 om een procentuele waarde van transplantaat vascularisatie te verkrijgen.
- Herhaal de stappen 8,11 tot en met 8,13 voor alle andere xenografts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door beeldvorming van een individuele xenotransplantaatmodellen is op 6, 24 en 48 HPI, kan de angiogene respons op verschillende tijdstippen worden berekend zoals weergegeven in Figuur 1a-C. De grootste angiogene respons wordt waargenomen tussen 24-48 h post implantatie, met de maximale niveaus van transplantaat vascularisatie gezien rond 2 dpi (Figuur 1a-C). Een time-lapse-film van een typische angiogene respons op een B16-F1 xenotransplantaatmodellen is van 20,75 HPI tot 46 HPI wordt gezien in aanvullende film 1. Deze film werd gegenereerd door Imaging een xenotransplantaatmodellen is geïmplanteerd naar aanleiding van dit protocol in een 2 DPF kdrl: EGFP embryo. De vaten die door de xenotransplantaatmodellen is groeien vormen een kronisch netwerk met vaten van onregelmatige grootte en morfologie, wat typerend is voor het abnormale vasculaire netwerk dat wordt gezien in tumoren van zoogdieren20. De angiogene respons in ons model is het resultaat van bloedvaten die uit de gemeenschappelijke kardinale ader in de xenotransplantaatmodellen is spruiten in tegenstelling tot eerdere studies, die de subintestinale aderen hebben gerapporteerd als de bron van de bloedvaten die uitgroeien tot de xenotransplantaatmodellen is4. Het verschil in de oorsprong van het schip is te wijten aan het feit dat we onze xenotransplantaten hebben geïmplanteerd in een meer ventrale locatie in de perivitelline ruimte, omdat dit het gemakkelijker maakt om de vorm en grootte van de xenotransplantaatmodellen is te visualiseren tijdens het injecteren en beeldvorming20.
Afbeelding 1d -F toont representatieve resultaten van B16-F1 xenotransplantaten en de bijbehorende vasculatuur na behandeling met ofwel DMSO (controle) of 50 nm van een vegfr-remmer (tivozanib)21,22. Onmiddellijk na de implantatie werden xenografted embryo's opgesplitst in twee groepen en ofwel 50 nM Tivozanib of DMSO (0,5% v/v) op elke groep. Ze werden gehandhaafd in deze drugs voorbeeld vorming op 2 dpi. Deze resultaten tonen aan dat de vaartuigen die geassocieerd zijn met xenotransplantaten geïnineerd in de vegfr-remmer (figuur 1e) veel minder talrijk zijn dan de vaartuigen die geassocieerd zijn met xenograften die in DMSO zijn geïnineerd (figuur 1d). In controle embryo's is er een expansief vasculaire netwerk dat zich uitstrekt over de gehele xenotransplantaatmodellen is regio (figuur 1d), wat de typische angiogene respons is die wordt waargenomen na implantatie van B16-F1-cellen. In Figuur 1fis de angiogene respons gekwantificeerd door dit protocol te volgen en het toont een duidelijke afname van de vascularisatie van transplantaat in de met de vegfr-remmer behandelde xenograften in vergelijking met de controles. Ondanks het normaliseren van de niveaus van transplantaat vascularisatie tegen transplantaat volume, blijft er een grote variatie in de niveaus van transplantaat vascularisatie op 48 HPI (variatiecoëfficiënt van 54,2%). Dit is te wijten aan de variatie in het totale volume van de tumor vaten (variatiecoëfficiënt 73,3%); we hebben geconstateerd dat zelfs op gelijke grootte grafts grote variatie in het niveau van vascularisatie hadden. Daarom wordt aanbevolen om ongeveer 20 xenotransplantaten per behandelingsgroep te gebruiken.
De stappen die zijn ondernomen om de vaartuigen te kwantificen die zijn gekoppeld aan de xenotransplantaatmodellen is uit figuur 1d worden weergegeven in Figuur 2. Het tumor kanaal wordt alleen getoond in Fig. 2a, waar een massa van B16-F1-cellen met fluorescentie label (false-gekleurd groen) te zien is onder de dooierzak, die de autofluorcence weergeeft. Een ROI moet zorgvuldig worden getekend rond de xenotransplantaatmodellen is (Figuur 2a'), waarbij wordt gezorgd dat geen van de autofluorescentie uit de dooierzak wordt opgenomen, aangezien het tumor volume protocol deze autofluorescentie kan identificeren als onderdeel van de tumor. Het uitvoeren van het tumor volume protocol identificeert alle B16-F1-cellen in de ROI, meet hun volume en clipt de ROI op hun volume (Figuur 2a' '). Het uitvoeren van het tumor vat volume protocol in deze nieuwe geknipte ROI maakt de identificatie mogelijk van alle schepen die zijn gekoppeld aan de massa van B16-F1-cellen en meet hun volume (Figuur 2a' ''). De waarden van de tumor volume en tumor vat volume protocollen kunnen worden gebruikt om een meting van transplantaat vascularisatie die vervolgens wordt uitgezet in een grafiek zoals te zien in Figuur 1fgeven.
Figuur 1: zebravis tumor xenotransplantaatmodellen is vascularisatie wordt geremd door een vegfr-signalerings remmer. (a-C) Confocale beelden van een levend embryo op 6 HPI (a), 24 HPI (B) en 48 HPI (C), met GFP-gelabelde bloedvaten (magenta). De% Graft vascularisatie werd berekend en opgenomen in het corresponderende paneel. (D-E) Confocale beelden van levende zebravis larven getoond op 48 HPI met fluorescentiengelabelde B16-F1 xenotransplantaten (groen) en GFP-gelabelde bloedvaten (magenta) die onmiddellijk na de implantatie werden behandeld met 0,5% (v/v) DMSO in E3 (D) of 50 nm van een VEGFR-remmer (Tivozanib) in E3 (E). De vaar kanalen voor d en e worden in afzondering weergegeven in respectievelijk d' en e'. F) grafiek waarin de gegevens worden weergegeven van het kwantificeren van de% Graft vascularisatie op 48 HPI in deze xenografts, n = 42 (DMSO), n = 20 (vegfr-remmer). * * p > 0,01 door Mann-Whitney test, foutbalken vertegenwoordigen s.d. schaalbalk = 50 μm. De in Figuur 1f opgenomen gegevens worden11weergegeven.
Figuur 2: Graft vascularisatie kwantificeren. Confocale afbeelding van levende 2-dpi zebravis larven met fluorescentiengelabeld B16-F1 xenotransplantaten (groen) en GFP-gelabelde bloedvaten (magenta). (A) tumor kanaal voorafgaand aan de tekening van een ROI. (A') Een ROI wordt getekend rond de xenotransplantaatmodellen is regio, waardoor de autofluorescentie in de dooier niet inbegrepen is. (A' ') Het "tumor volume" protocol wordt uitgevoerd om het volume van xenotransplantaatmodellen is binnen de ROI te identificeren en creëert ook een nieuwe ROI. (A' '') Het "tumor vat volume" protocol wordt gebruikt om het volume van de schepen binnen de nieuwe ROI te identificeren. Schaalbalk = 50 μm.
Aanvullende film 1: tumor xenotransplantaatmodellen is angiogenese. Confocale time-lapse beeldvorming van een B16-F1 xenotransplantaatmodellen is geïmplanteerd in een 2 DPF zebravis embryo met GFP-gelabelde bloedvaten (kdrl: EGFP). Film genomen van 20,75 HPI naar 46 HPI. Time-lapse-afbeelding z-stacks werden verzameld 10 min uit elkaar; film is gemaakt op 7 frames per seconde. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste kritieke stap in het protocol is de implantatie van tumorcellen. Het is essentieel dat cellen worden geïnjecteerd in een locatie die de xenotransplantaatmodellen is in staat stelt om met succes in het embryo te implanteren zonder het embryo edematous te maken. Een te anterieure injectie kan de cellen in de richting van het hart laten bewegen, de bloedbaan blokkeren en tot oedeem leiden, terwijl een injectie die te posterieure is, een slecht geïmplanteerde xenograft zal veroorzaken. Een voorste injectie wordt het best vermeden door de naald door de dooierzak in een voorste naar achterste richting te plaatsen, zodat deze weg van het hart wijst terwijl het injecteert. Een injectie achteraf wordt het best vermeden door de cellen op een plaats in de voorste helft van het ronde deel van de dooier zak te injecteren. Bovendien, cellen moeten worden geïnjecteerd ventrale aan de dooier SAC en niet laterale aan het, als de laterale locatie is moeilijker te bekijken en vervolgens beeld. Zodra de onderzoeker is redelijk bedreven in dit proces, ongeveer 200-300 embryo's kunnen worden geïmplanteerd met xenotransplantaten elke dag. Beeldvorming van de angiogene respons zal langer duren als gevolg van de tijd die wordt genomen om de xenografts te monteren en te beeld; het duurt ongeveer een uur om het beeld 15-20 xenotransplantaten met behulp van een standaard laser-scanning confocale Microscoop.
De tweede kritieke stap is de meting van transplantaat vascularisatie met behulp van 3D-beeldanalyse software. Kwantatie door tumor volume is vereist omdat het moeilijk is om consistent-sized xenotransplantaten te verkrijgen door middel van micro injectie. Het is noodzakelijk om de instellingen van de softwareprotocollen zorgvuldig te kalibreren en ze consequent te gebruiken om accurate en onpartijdige kwantitatieve metingen voor alle experimenten te verkrijgen. Het instellen van de minimale drempelwaarde voor intensiteit (voor zowel tumor volume en tumor vat volume) is een belangrijk onderdeel van deze stap, omdat het toestaat dat het protocol correct discrimineert tussen fluorescentie die deel uitmaakt van de tumor/vaten en achtergrond fluorescentie. Het is ook belangrijk om de ROI rond de tumor xenotransplantaatmodellen is te tekenen om alleen de tumor xenotransplantaatmodellen is te bevatten en geen heldere, autofluorescerende delen van het embryo (zoals de dooierzak); de onbedoelde opname van niet-tumor autofluorescerende gebieden of niet-tumor bloedvaten in de ROI zal resulteren in deze delen worden gemeten als onderdeel van "tumor volume" of "tumor vat volume", het creëren van significante onnauwkeurigheden in de uiteindelijke berekening. Er is altijd een grote variatie in de angiogene reactie (Zie Figuur 1f), maar in plaats van een beperking van het model, dit kan alleen de natuurlijke variantie in de tumor dichtheid van het vat waargenomen bij zowel menselijke patiënten en Murine xenotransplantaten weerspiegelen 23 , 24. de kwantificering van transplantaat vascularisatie in 60 xenotransplantaten duurt ongeveer 1 uur.
Zorgvuldige selectie van tumor cellijn is ook belangrijk omdat er een grote variatie is in de angiogene respons die wordt veroorzaakt door verschillende zoogdier cellijnen, die kunnen betrekking hebben op de verschillende niveaus van Pro-angiogene moleculen die door deze cellen worden geproduceerd4 , 11. in onze handen geven B16-F1 muis melanoom cellen een robuuste angiogene respons, mogelijk als gevolg van het hoge niveau van vegfa secretie uit deze cellen11. Mogelijke wijzigingen aan dit protocol zijn het gebruik van zebravis melanoom cellen, waardoor de testtemperatuur kan worden verlaagd tot 28 ° en daarom optimaal zijn voor zowel de gastheer als de tumor25 of het gebruik van kankercellen die vertonen Pro-angiogene groeifactoren zoals FGF4,7,20.
Sommige van de voordelen van dit model liggen in de korte tijdspanne, lage kosten, en het relatieve gemak waarmee de xenotransplantatie procedure kan worden uitgevoerd in vergelijking met andere in vivo modellen zoals Murine xenografts, die allemaal het zeer vatbaar maken voor gebruik voor grootschalige studies (d.w.z. chemische schermen voor Anti-angiogene verbindingen26). Het vermogen om het model en de beschikbaarheid van transgene vissen met fluorescently gelabelde bloedvaten en andere celtypen te Live, stelt onderzoekers in staat om de details van het angiogenese proces (zoals het sprouting van het vat) en de celcel te bestuderen interacties (zoals macrophage-endotheliale interacties) die plaatsvinden tijdens angiogenese in dit model11,20,27. Aangezien het vaten normaliseren ook een belangrijke doelstelling van antiangiogene therapie is, betekent een hoge-resolutie Live-beeldvorming van het vasculaire netwerk in de xenotransplantaten dat dit model het potentieel heeft om behandelingen te identificeren die gericht zijn op dit doel. Netwerk tortuositeit kan worden onderzocht door het aantal scheeps vertachten te tellen, terwijl de morfologie van het vaartuig kan worden onderzocht door de variatie in de scheepsbreedte te meten, waardoor Pro-normaliserings behandelingen kunnen worden getest en geëvalueerd in dit model28. Bovendien kan fluorescentie microangio grafie worden gebruikt om de doorgankelijkheid en integriteit van tumor vaten29te bepalen. De genetische traceerbaarheid van de zebravis betekent ook dat het genetisch gemodificeerd kan worden om de rol van verschillende gastheer signalering trajecten in tumor angiogenese6te onderzoeken. Dit model kan daarom worden gebruikt voor het identificeren van nieuwe Anti-angiogene verbindingen die actief zijn in een tumor setting evenals het bestuderen van de cellulaire en moleculaire interacties die de tumor angiogenese reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de heer alhad mahagaonkar voor het beheer van de Universiteit van Auckland zebravis Facility en de biomedische beeldvormings onderzoekseenheid, school voor medische wetenschappen, Universiteit van Auckland, voor hulp bij time-lapse confocale microscopie. Dit werk werd gesteund door een Health Research Council van Nieuw-Zeeland project Grant (14/105), een Royal Society of Nieuw-Zeelandse Marsden Fonds project Grant (UOA1602) en een Auckland Medical Research Foundation project Grant (1116012) toegekend aan J.W.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
