Summary
אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.
Abstract
לימפוציטים תוך-אפיתל המבטאת קולטן תא T γδ (γδ אל) לשחק תפקיד מפתח במעקב החיסונית של אפיתל המעי. בשל היעדר ליגולי מוחלט עבור קולטן התא γδ T, ההבנה שלנו של התקנה של γδ הפעלה של אל-על ותפקידם בvivo נשאר מוגבל. זה מחייבת את ההתפתחות של אסטרטגיות חלופיות לחקור משעולים איתות המעורבים בוויסות הפונקציה של γδ, ואת התגובה של תאים אלה למיקרו הסביבה המקומית. למרות γδ IELs מובנים באופן נרחב כדי להגביל טרנסלוקציה הפתוגן, השימוש הדמיה in, היה קריטי כדי להבין את הדינמיקה הרקתית של האינטראקציות של אל-האו אפיתל במצב יציב בתגובה פתוגנים פולשנית. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש התנהגות הנדידה של אל-אל ברירית המעי הקטן של העכבר הכתבת gfp γδ T באמצעות דיסק מסתובב הפוך מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית. למרות שעומק ההדמיה המקסימלי של גישה זו מוגבל ביחס לשימוש במיקרוסקופיה לייזר בשני הפוטונים, מיקרוסקופ לייזר מסתובב בדיסק מספק את היתרון של רכישת תמונה במהירות גבוהה עם הלבנת שיפור ו נזקי. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה 4D, התנהגות מעקב התא T ואת האינטראקציות שלהם עם התאים השכנים ניתן לנתח בעקבות מניפולציה ניסיוני כדי לספק תובנה נוספת לתוך הפעלה ותפקוד של אל-על בתוך רירית המעי.
Introduction
לימפוציטים התוך-אפיתל (אל-על) נמצאים מתחת לאפיתל המעי, ומצויים הן לאורך קרום המרתף ובין תאי האפיתל הסמוכים בחלל הבין-תאי הרוחבי1. יש כ-א. א. אחד עבור כל 5-10 תאים אפיתל; אלה IELs לשמש זקיפים כדי לספק מעקב החיסונית של המרחב הגדול של מכשול האפיתל המעי2. IELs ביטוי קולטן התא γδ T (TCR) מהווים עד 60% של אוכלוסיית הכולל של אל. אל במעי הדק קטן. מחקרים ב γδ T-cell לקוי עכברים להפגין תפקיד המגן במידה רבה של תאים אלה בתגובה לפציעה במעיים, דלקת וזיהום3,4,5. למרות הדור של העכבר הנוקאאוט Tcrd 6, ההבנה שלנו של ביולוגיה γδ, שנותרה מוגבלת בשל העובדה שליטרים המוכרים על-ידי הγδ tcr טרם זוהו7. כתוצאה מכך, חוסר כלים ללמוד את האוכלוסיה הסלולרית התקשה לחקור את התפקיד של γδ TCR הפעלה ותפקוד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. כדי למלא פער זה, פיתחנו טכניקות הדמיה בשידור חי כדי להמחיש את התנהגות הנדידה הγδ של אל-על עם הסביבה השכנה כאמצעי כדי לספק תובנה נוספת לפונקציה γδ והיענות לגירויים חיצוניים בvivo.
במהלך העשור האחרון, הדמיה מעמיקה הרחיבה באופן משמעותי את הבנתנו את האירועים המולקולריים המעורבים בהיבטים מרובים של ביולוגיה של המעי, כולל תאים אפיתל הקזת8, ויסות פונקציית ההפרדה האפיתל9 ,10, לדגימת תא מיאלואידית של תוכן של לומיאל11,12, ואינטראקציות של חיידק מארח11,13,14,15,16 . במסגרת השימוש בביולוגיה של אל-על, שימוש במיקרוסקופיה באמצעות מיקרוטרטל מזיל אור על הדינמיקה הטמפורלית של אל-מדינת אל-עואו, והגורמים המאובטים את התנהגות המעקב שלהם13,14,15, . שישה עשרה הפיתוח של TcrdH2BeGFP (tcrdegfp) כתבת עכברים, אשר תוויות γδ iels על ידי גרעיני הביטוי gfp17, גילה כי iels γδ הם מאוד נעים בתוך האפיתל והתערוכה התנהגות ייחודית מעקב היענות חיידקים . זיהום17,13,14 לאחרונה, עוד γδ T העיתונאי הנייד פותחה (Tcrd-gdl) אשר מבטא gdl בציטופלסמה כדי לאפשר ויזואליזציה של התא כולו18. מתודולוגיה דומה שימש כדי לחקור את הדרישה של קולטני כימוקין ספציפיים, כגון G חלבון בשילוב קולטן (gpcr)-18 ו-55, על הדינמיקהשל אל. בהעדר כתב מיוחד לתאים, השתמשו בנוגדנים בעלי מראות פלורסנט כנגד CD8α שימשו להמחיש ולעקוב אחר "אל-לvivo" ב-19,20. למרות מיקרוסקופ שני פוטון לייזר סריקה משמש בדרך כלל עבור הדמיה intravital, השימוש של הדיסק ספינינג מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד מספק יתרונות ייחודיים כדי ללכוד מהירות גבוהה ברזולוציה גבוהה multi-channel תמונות עם רעש רקע מינימלי. טכנולוגיה זו היא אידיאלית כדי להבהיר את הדינמיקה הטמפורלית של אינטראקציות החיסון/אפיתל בתוך המיקרו-סביבה המורכבת של רירית המעי. יתר על כן, באמצעות שימוש במודלים שונים ו/או העכבר מודלים, מחקרים אלה יכולים לספק תובנה לתוך הוויסות המולקולרי של המעי החיסונית ו/או תא אפיתל התפקוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים נערכו באגודה של הערכה והסמכה של מעבדה בעלי חיים טיפול (AALAC)-מתקן מוכר על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הספר הרפואי של רטגרס ניו ג'רזי רפואה השוואתית משאבים.
1. הכנת העכבר
הערה: ההליך הבא, כולל הכנה לבעלי חיים וניתוחים, ייקח 30 – 40 דקות לפני הניתוח, הפעל את המיקרוסקופ וחמם את החממה המצורפת במיקרוסקופ עד 37 ° c.
- בצע ניסויים ב-8 – 10 שבועות עכברים מבית הספר על רקע C57BL/6, אשר התקבלו מ ברנרד Malissen (INSERM, פריז, צרפת). על פי ההליך המאושר IACUC, מורדם העכבר על ידי הזרקת כיתה של קטמין (120 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) מבוסס על משקל החיה. הערכת רמת ההרדמה בקצב נשימה (55 – 65 נשימות לדקה)21, צביטה בבוהן וpalpebral רפלקס.
- לאחר הרדמה המטוס הכירורגי הוא הגיע, לאבטח את הרגליים האחוריות של העכבר באמצעות קלטת למשטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, אשר ניתן לפקח על ידי מד חום פי הטבעת. אם יש סימנים כי ההרדמה היא לובש (למשל, קצב נשימה מוגבר, מהבהב ו/או שריר העין תגובה מרעידה palpebral רפלקס), מחדש לניהול 50 μL של קטמין/xylazine בכל פעם עד העכבר הוא הרגעה לחלוטין.
- להכין את הצבע הגרעיני על ידי דילול 50 μL של Hoechst 33342 (10 מ"ג/mL) עם 315 μL של 0.9% תמיסת מלח; הריכוז הסופי הוא 37.5 מ"ג/ק"ג מבוסס על משקל העכבר (200 כמות משוער μL). ברגע העכבר מורדם, לאט להזריק הופסט באמצעות מזרק טוברקולין דרך סינוס ורידי רטרו מסלולית.
הערה: המתן 1 – 2 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא כדי לאפשר לעכבר להפוך את השינוי במחזור הנפח הבאים רטרו מסלולית הזרקה. - מניחים כמות קטנה של חומר סיכה על העיניים כדי למנוע מהם להתייבש.
2. כירורגיה של העכבר: לפרוטומיה לחשוף רירית המעיים
- לעשות חתך 2 ס מ אנכי דרך העור ואת צפק לאורך קו האמצע של הבטן התחתונה כדי להחצין את האזור של המעי להיות בתמונה.
- באמצעות מלקחיים זוויתי, בזהירות למשוך את מעי מתוך חלל הצפק ולזהות את האזור של המעי הדק כדי להיות בתמונה. היזהרו לא לקרוע כלי דם מצע במהלך תהליך זה. כדי למזער נזק פוטנציאלי או דימום, להימנע לתפוס או צובט את המעי עם מלקחיים.
- אתר אזור מתאים של המעי הדק (2 – 3 ס מ) עבור דימות המכיל תוכן מינימלי צואה. החזר בזהירות את המעי הגס ואת המעיים הקטנים הנותרים לחלל הצפק, תוך השארת קטע הריבית מוחלק.
הערה: הימנע מלדרוך על המעי הסטום או לשבש את היום במהלך שלב זה. - מניחים שני זוגות של מלקחיים משני צדדיו של המצע המעי הבסיסית בין כלי הדם, ולשפשף בעדינות את קצות המלקחיים יחד כדי ליצור חור בקרום (איור 1)22. זה יאפשר המחט לעבור את המצע המעי כאשר סוגרים את החלל הצפק מתחת למעיים.
- לסגור את החתך תוך שמירה על לולאה של המעי השפעה. באמצעות מלקחיים זוויתי מעוקל, המחט נקודת להתחדד מוצמד 5 ס מ תפר, לחדור צד אחד של צפק, לעבור דרך החור עשה בשלב הקודם, ומעלה דרך הצד השני של רירית הצפק. מניחים תפר אחד למעלה, ועוד. קרוב לתחתית החתך
הערה: הימנע מפגיעה בכלי האורך במהלך שלב זה. - חזרו על תהליך זה כדי לסגור את העור מתחת לולאת המעי, על ידי הצבת תפר אחד באמצע החתך, בין התפרים הקודמים בצפק הבסיסית.
הערה: חשוב רק להחצין את האזור שהוא ליצירת תמונה; פעולה זו תפחית את התנועה החיצוני במהלך ההדמיה. אל תדאג להמנע מקשירת. העורקים המסטרמיים - השתמשו בחשמלית כדי ליצור קו ניקוב לאורך הגבול האנטי-מסטראלי. מיד לאחר הצרוב, להחיל כמה טיפות מים על פני השטח של המעי כדי למנוע נזק נוסף רקמות המושרה. אבן חשופה בעלת מגבונים להסרת מים שיורית.
- חותכים חתך אופקי קטן בקצה המרוחק של הרקמה הכאוגית באמצעות מספריים vannas ולהמשיך לחתוך לאורך הקו הצרוב לקראת הקצה הקרוב ביותר של פלח הרקמה המועבר (כ 1.5 ס מ אורך) כדי לחשוף את הרירית שטח.
הערה: במקרה הצורך, השתמש מלקחיים כדי להסיר בעדינות את כל התוכן העודף בצואה שנותר על פני השטח החשוף של רירית. - לכסות את הבטן של העכבר עם קינגב לחות כדי למנוע את רקמת להיות מיובש. להעביר את העכבר למיקרוסקופ בתוך כלי מכוסה.
3. רכישת תמונה על ידי ספינינג מיקרוסקופיה דיסק מוקד
- פיפטה 150 μL של 1 μM AlexaFluor 633 ב HBSS על שמיכות זכוכית התחתון של צלחת 35 mm. הצב את העכבר כך שפני השטח הפתוחים של רירית מגעים ישירות עם שובר הכיסויים.
- להטות את הראש של המיקרוסקופ לאחור ולמקם את העכבר על הצלחת שמיכות על הבמה הדמיה בחממה טרום מחומם. לחלופין, לכסות את העכבר על ידי שמיכה חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
- הפעל תוכנה לדימות. את עוצמת עירור ואת זמן החשיפה עבור כל לייזר לא יעלה על 10-15 mW או 120 – 150 ms, בהתאמה, כדי למנוע הלבנת ולמזער את המרווח בין נקודות זמן. כוונן את ממוצע המסגרת ל-"2" והפעל את פונקציית הרווח האלקטרו-ממדי כדי להפחית את רעשי הרקע. בחר בכיול האובייקטיבי 63 x כדי להבטיח את המדידה הנכונה של גודל הפיקסל.
הערה: ההגדרות המפורטות לעיל אמורות לספק הפניה ראשונית, אך ישתנו בהתאם לתצורות המיקרוסקופ הבודדות. - שימוש 405 ננומטר לייזר ומטרת האוויר 20x, להמחיש את הגרעינים כדי לאתר שדה של villi כי חוסר תנועה מורגש או להיסחף בעין. הימנע מאזורים של התנועה העובדתית עקב נשימה, פריסטלזיס או פעימות לב.
- באמצעות הסריקה XY, להקליט את קואורדינטת XY של שדה העניין ולעבור את טבילה הגליצרול 63 x המטרה.
- ודא כי villi בשדה שנבחר הם יציבים על ידי רכישת תמונה חיה על ערוץ 405 ננומטר עד 1 דקות.
- בזמן הרכישה של תמונה חיה על הערוץ 405 ננומטר, להתאים את המוקד כדי למצוא את המטוס האורתוגונלי ממש מתחת לקצה הווילי. לרכוש Z-ערימות החל מתחת בדיוק מתחת האפיתל עצה villous למטה villous עד קשה לפתור את גרעיני, כ 15 – 20 יקרומטר, באמצעות צעד 1.5 יקרומטר.
הערה: כאשר הדמיה עם שלושה ערוצים (405, 488, 640 nm) באמצעות זמני חשיפה שתוארו לעיל, ניתן לרכוש את כל שלושת הערוצים ברציפות בסביבות 20 s מרווחי. - פתח את התוכנה במצב ניתוח, 3 – 5 דקות לאחר תחילת הרכישה, כדי לאשר את יציבות התמונה וγδ לתנועתיות אל-על. המשך לרכוש תמונות עבור 30 – 60 דקות עבור כל שדה של villi. שיא 2 – 3 שדות עבור כל עכבר. בזמן הדמיה, לפקח על העכבר כל 5 דקות.
הערה: אם ההרדמה מתחיל להתפוגג, להשתמש מלקחיים כדי להדוף בעדינות את הצוואר של העכבר כדי לנהל 50 μL של קטמין/xylazine בכל פעם. המשיכו לנטר רמות הרדמה וניהול מחדש בעת הצורך. - לא מומלץ לצלם עכבר יחיד למשך יותר מ 4 h. לאחר רכישת תמונה הושלמה, להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם ואחריו החזה הדו.
4.4D ניתוח תמונות
- ישירות לייבא קבצי הדמיה לתוכנת עיבוד 4D.
- צור משטחים בודדים עבור iels ולומן, ולאחר מכן עקוב אחר המשטחים לאורך זמן תוך שימוש בפרמטרים המתוארים בטבלה 1 כהפניה ראשונית. עבור IELs, אפשר מפוצל לגעת באובייקטים באמצעות קוטר נקודת הזרע המצוין.
- השתמש באלגוריתם המעקב האוטומטי כדי לקבוע את התנועתיות של אל. למרות שאלגוריתם המעקב מדויק יחסית, הכרחי לבדוק באופן חזותי מסלולים לכל אחד מאלה. אם מעקב אינו נכון, תקן אותו באמצעות הפקודה התנתק והתחבר תחת הכרטיסיה ערוך רצועות .
- כדי לקבוע את המרחק מכל אל-אל לומן, בחר את משטח לומן ובצע פונקציית שינוי מרחק בתפריט כלי . כשתתבקש, בחר מחוץ למשטח. לאחר החישוב, השינוי במרחק יוצג כערוץ ה -4.
- לסנן את העוצמה מינימום של הערוץ הרביעי כדי לבחור γδ iels כי הם בתוך המרחב התרבות לרוחב (LIS). ערך זה צריך להיות קרוב ל 15 μm, מבוסס על גובה של תא אפיתל טורי. האחוזים של סך γδ IELs בתוך טווח זה מדווחים כתדירות של IELs γδ ב-LIS.
- לניתוח נוסף, לייצא נתונים סטטיסטיים כולל: מהירות המסלול של אל-על, מסלול הזחה, מעקב אחר יושר ואורך המסלול. לחלופין, ניתוח נתונים באמצעות מודול התצפית. בהתאם לניסוי, השג מדדים נוספים מהנתונים הנרכשים, כולל זמן לשכון באינטראקציות LIS או אל-האפיתל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות דימות הדמיה של עכברים העיתונאי TcrdEGFP, יש לנו בעבר הראו כי IELs γδ התערוכה מעקב דינמי התנהגות, שבה הם מסיירים האפיתל על ידי מעבר לאורך קרום המרתף לתוך החלל הבינתאי לרוחב (LIS) באופן קבוע מדינה (איור 2, סרט 1).
גישה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך כיצד עיכוב של מסלולים ספציפיים התא איתות ו/או קולטנים השפעות γδ התנהגות נדידה של אל. לדוגמה, אינטרלויקין (IL)-15 הוא מתקן הכרחי עבור γδ אל הומאוסטזיס23,24. כדי לקבוע אם IL-15 איתות דרך הקולטן IL-2Rβ תורמת הקינטיקה של תנועתיות γδ אל המצב יציב, העכברים העיתונאי TcrdEGFP התמונה 2 h לאחר הממשל של אנטי-IL-2Rβ נוגדן (TM-β1) או בקרת IgG2b isotype. מסלולים צבעוניים מציינים את נתיבי הנדידה של γδ IELs בודדים במהלך 30 דקות (איור 3A). למרות תדירות γδ IELs ב-LIS הוגדלה עכברים שטופלו עם TM-β1 (איור 3A,B), יותר מ 30% של אלה γδ iels הציגו התנהגות הפונקציה (איור 3a,C). Γδ IELs סרק הוגדרו על ידי הטלת מגבלות עליונות על מיישר המסלול ולעקוב אחר אורך העקירה. זה הפנוטיפ היתה אושרה על ידי ירידה משמעותית הן מהירות מיידית ויחס הכליאה של γδ IELs בעקבות IL-2Rβ המצור ביחס לשלוט (איור 3D,E). יתר על כן, γδ IELs סרק יש זמן ארוך לשכון והיו לעתים קרובות יותר מקומי בתוך LIS לעומת מγδ IELs (איור 3F).
איור 1: באמצעות מלקחיים כדי ליצור חור במצע המעי. הניחו מלקחיים משני צדי הקרום כדי ליצור חור לתפרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמות המייצגת 3D של Γδ IELs ב jejunum. נקודת זמן בודדת נבחרה מסרטון שצולם בזמן הצילום של הרירית הג של העכבר כתבת במצב יציב. γδ IELs מוצגים ירוק, גרעינים בלבן לומן באדום. סרגל בקנה מידה = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עיכוב של IL-2Rβ מעורר γδ את התושב בחלל הבין-תאי הצדדי. נתון זה הותאם מתוך "אפיתל IL-15 הוא ווסת קריטי של γδ האפיתל לימפוציטים בתוך רירית המעי." על ידי Hu, M. D. et al. 2018, J אימונוol, 201 (2), עמ' 747-756. 15 זכויות יוצרים 2018 על ידי האגודה האמריקנית של אימונוולוגים, Inc. (A) זמן-תמונות מראה הצגת הגירה Gfp γδ iels בתוך האפיתל villous המעי הבאה 2 h טיפול עם 0.45 MG של IgG2b או TM-β1. תנועתיות של γδ IELs בודדים (ירוק) במהלך 30 דקות מוצגים עם פסים צבעוניים. גרעינים מוצגים בלבן, ואת לומן מוצג באדום. סולם ברים = 20 μm. (ב) תדירות Γδ iels ב-LIS (n = 3 עכברים לכל טיפול, n = 6-7 קטעי וידאו). (ג) אחוזי Γδ iels שהיו בלתי מטוהרים בעכברים IgG2b-או TM-β1 שטופלו. (ד) מהירות מיידית (n = 13,299 ו 9,600 נקודות זמן). (ה) מעקב אחר יחסי הכליאה (n = 350 ו-278 מסלולים) מוצגים. (ו) מרחק של חוסר פעילות ו נעים γδ iels מתוך לומן. ממוצע + SEM מוצג (+). * p < 0.05, * * p < 0.01,p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| אל-אל | לומן | |
| פרטי שטח (μm) | 1.2 | 1.5 |
| מחסור ברקע (μm) | 1.67 | 2 |
| קוטר נקודות זרעים (μm) | 7.5 | N/A |
| מסנן: מספר הvoxels | 250 | 6,500 |
| מעקב: מרחק מירבי (μm) | 10 | 10 |
| מעקב: הפער המירבי | 2 | 2 |
טבלה 1: הגדרות מייצגים ליצירת γδ לאלה ולומיאל "משטחים" באייריס. ניתן להשתמש בהגדרות אלה כנקודת התחלה בעת יצירת משטחים ומעקב אחר משטחי הערוץ 488 ננומטר (אל-אס) וערוץ 640 ננומטר (לומן). בהתאם לתנאים הניסיוניים, ייתכן שיהיה צורך לשנות הגדרות אלה.
סרט 1: הדמיה של GFP γδ אל-על התנהגות נדידה בעכבר jejunum. מיקרוסקופ מγδ של אל-הזמן לתנועה בג מתוך עכבר Tcr Fp המטופל עם 0.45 מ ג של IgG2b. γδ IELs מוצגים ירוק, גרעינים בכחול, ואת לומן באדום. . שורת קנה מידה, 20 μm מסגרות נאספו כל 30 s עבור כ 30 דקות. הסרט מותאם מ Hu, מ. ד . ואח ' 201815. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתוח טכניקות המיקרוסקופיה של הארגון סיפק הזדמנות חסרת תקדים לבחון את התארגנות משנה של מבנים תת-תאיים8,9,22, אינטראקציות תא תאים12, 25 והתנהגות הנדידה של תאים13,14,15,16,26 ברקמות אחרות שאינן נגישות. יש כבר מחסור כללי של כלים ללמוד את הרגולציה והתפקוד של γδ iels ב vivo18,27, וכתוצאה מכך, השימוש הדמיה inital פתחה שדרות חדשות של חקירה בנוגע לרגולציה המולקולרית מאפיינים פונקציונליים של אוכלוסיות אל-אל13,14,15,16,20. γδ IELs נחשבים בעבר נייח בתוך רירית המעי28. עם זאת, ניתוח נוסף הראה כי תאים אלה הם דינמיים מאוד, אבל להעביר לאט יותר לימפוציטים באברי הלימפה המשני בשל המגבלות הצמודות של תא אפיתל13. יתרה מזאת, השימוש בהדמיה vivo סיפק תובנה נוספת לדינמיקה הטמפורלית של התנהגות מעקב γδ אל-על, כולל הוצלב בין IELs לתאי האפיתל הכוננים γδ לתנועתיות ותפקוד13, מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , 16. ניתוח התנהגות נדידה זו הגדירה מדדים חדשים לתגובות הסלולר של אל.
במהלך כל ההליך, זה חיוני לפקח ברציפות את רמת ההרדמה של העכבר. מינהל מתמשך של הרדמה גז (isofלוריאן) יכול לשמש חלופה לקטמין/xylazine. כאשר מבצעים את הניתוח, זה קריטי לשמור על אספקת הנוירוכלי הדם ללא פגע כדי לספק הערכה מדויקת של הביולוגיה. קשירת כלי דם מצע יכול להוביל היפוקסיה ונמק הדרגתי של הרקמה. לעומת זאת, ניתוק כלי הדם יגרום לדימום ברירית החשופה, דבר שיכול להפחית את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של כמה ערוצים במהלך ההדמיה. אם IELs לפתח מורפולוגיה מעוגל ולהפסיק לנוע במהלך רכישת תמונה, זה יכול להיות בגלל ירידה קלה בטמפרטורת הגוף של העכבר. הצבת חיישן הטמפרטורה קרוב לשלב המיקרוסקופ מבטיח כי הטמפרטורה באתר של רירית חשוף נשמרת ב 37 ° c. העלאת הטמפרטורה ל-38-39 ° צ' עשויה להיות נחוצה בהתאם ליציבות הטמפרטורה של תא הדגירה.
לאחר העכבר כבר ממוקם על הבמה המיקרוסקופ, זה יכול להיות קשה כדי לזהות שדות של villi כי חוסר תנועה מוגזמת עקב פריסטלטיקה או התכווצות של כלי דם סמוכים. אם זה קורה, למקם מחדש את העכבר בתוך המנה או לתמרן את האגפים של העכבר באופן חיצוני במאמץ לארוז ווילבי בחוזקה נגד שמיכות. לחילופין, שדה ההדמיה עשוי להיות יציב יותר כמה דקות לאחר הצבת העכבר על הבמה. אם יש הדרגתית הסחף XY במהלך הרכישה, זה יכול להיות מתוקן באמצעות תיקון הסחף בתוכנת עיבוד 4D על ידי בחירת 4-5 גרעיני הנמצאים במיקומים שונים של התמונה לאורך כל קורס הזמן ומעקב אחר נקודה עבור כל גרעין. לאחר שנוצרו נקודות , בחר באפשרות ' הסחף הנכון ' בתפריט ' עריכת מעקב ' כדי לתקן את הסחף. חשוב כי תיקון הסחף ייעשה לפני כל ניתוח אחר, שכן זה ישנה את הקואורדינטות המשמשות למעקב אחר אובייקטים אחרים בתמונה.
למרות מיקרוסקופ שני פוטון לייזר סריקה מאפשר עומק רחב של הדמיה כי הוא שימושי לחדור עמוק לתוך רקמות29, מיקרוסקופ מסתובב לייזר בדיסק מיקרוסקופיה יש יתרונות ייחודיים משלו עבור יישומים הדמיה intravital. המיקרוסקופיה לייזר דו-פוטון מסתמכת על צינורות פוטוטיפוטיים (PMT) שיכולים לזהות פיקסל אחד בלבד בכל פעם עם יעילות קוונטית של 40%-50%. לעומת זאת, מיקרוסקופית דיסק מסתובב מיקרוסקופיה לייזר משתמשת מצלמה מצלמות CCD (EM) המצלמה כדי לזהות ישירות עד מיליון פיקסלים בו, ובכך להגדיל את היעילות הקוונטית ל 95%. כתוצאה מכך, הפוטנציאל של פוטוהילבנת ו-photobleaching מופחת באופן משמעותי, בעוד מהירות הרכישה גדל למקסם את הרזולוציה הטמפורלית כאשר הגירה תא הדמיה ברקמות שטחיות יותר. ללא קשר למודאליות של ההדמיה, הליך כירורגי זה הוא אידיאלי לחשיפת רירית המעי להדמיה במיקרוסקופ הפוך.
עם הזמינות הגוברת של זנים העכבר המבטא כתבים פלורסנט, fluorescently התווית בדיקה או זנים פלורסנט של מיקרואורגניזמים שנוצרו בשפע של אורכי גל, שילובים להעריך במעי vivo תגובות בזמן אמת הן אינסופיות. לא רק יכול הדמיה בלתי מספקת לספק תובנה הרומן לתוך תא תא ו-מארח האינטראקציות חיידק, אבל זה יכול גם להדגיש תהליכים מולקולריים דינאמיים וסלולריים הן בתאי האפיתל והן החיסון תחת תנאים הומטיים או פתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIH R21 AI143892, ניו ג'רזי קרן הבריאות גרנט, בוש ביורפואי מענק (קל). אנו מודים למדלן הו על עזרתה בעריכת כתב היד והענקת הנתונים המוצגים בתוצאות הנציגים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
- Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
- Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
- Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
- Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
- Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
- Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
- Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
- Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
- Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
- Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
- Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
- Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
- Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
- Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
- Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
- Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
