Summary
우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
γδ T 세포 수용체 (γδ IEL)를 발현하는 상피 내 림프구는 장 상피의 면역 감시에 중요한 역할을한다. γδ T 세포 수용체에 대한 확실한 리간드의 부족으로 인해, γδ IEL 활성화및 생체 내의 이들의 기능의 조절에 대한 우리의 이해는 제한적이다. 이것은 γδ IEL 기능 및 국부적인 미세 환경에 대한 이 세포의 반응성에 관여하는 신호 통로를 심문하는 대체 전략의 개발을 필요로 합니다. γδ IELs는 병원체 전좌를 제한하기 위하여 넓게 이해되더라도, intravital 화상 진찰의 사용은 안정상태에서 및 침략적인 병원체에 응하여 IEL/상피 상호 작용의 좌측 시간 역학을 이해하는 것이 중요했습니다. 본 명세서에서, 우리는 역회전 디스크 공초점 레이저 현미경을 사용하여 GFP γδ T 세포 리포터 마우스의 소장 점막에서 IEL 철새 거동을 시공하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 접근법의 최대 이미징 깊이는 2광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법의 사용에 비해 제한적이지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경 은 광표백을 감소시키고 고속 이미지 수집의 이점을 제공합니다. 사진 손상. 4D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 T 세포 감시 동작과 이웃 세포와의 상호 작용을 실험 조작 후 분석하여 장 점막 내IEL 활성화 및 기능에 대한 추가 적인 통찰력을 제공합니다.
Introduction
상피 내 림프구(IEL)는 장 상피 내에 위치하며, 지하막을 따라 그리고 세포간 공간 내의 인접 한 상피 세포 사이에모두 발견된다 1. 5-10개의 상피 세포마다 약 1개의 IEL이 있습니다. 이러한 ILS는 장 상피 장벽2의 큰 창공의 면역 감시를 제공하는 센티넬역할을 한다. γδ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 ILs는 뮤린 소장에서 총 IEL 집단의 최대 60%를 포함한다. γδ T 세포 결핍 마우스에 대한 연구는 장 손상, 염증 및 감염에 대한 응답으로이들 세포의 크게 보호 역할을 입증 3,4,5. Tcrd 녹아웃 마우스 6의생성에도 불구하고, γδ IEL 생물학에 대한 우리의 이해는 γδ TCR에 의해 인식된 리간드가 아직 확인되지 않았다는 사실로 인해 부분적으로 제한적으로 남아 있다7. 그 결과, 이러한 세포 집단을 연구하는 도구의 부족으로 인해 생리적 및 병리학적 조건 하에서 γδ TCR 활성화 및 기능의 역할을 조사하기가 어려워졌다. 이러한 격차를 해소하기 위해, 우리는 γδ IEL 기능및 생체 내 외부 자극에 대한 반응성에 대한 추가적인 통찰력을 제공하는 수단으로 γδ IEL 철새 행동과 이웃 장세포와의 상호 작용을 시각화하는 라이브 이미징 기술을 개발했습니다.
지난 10 년 동안, intravital 화상 진찰은 상피 세포 흘리기 8, 상피 장벽 기능 의조절을 포함하여 장 생물학의 다중 양상에 관련되었던 분자 사건의 우리의 이해를 현저하게 확장했습니다9 ,10,발광 내용의 골수성 세포 샘플링11,12,및 숙주 미생물 상호 작용11,13,14,15,16 . IEL 생물학의 맥락에서, 내활력 현미경 검사법의 사용은 IEL 운동성의 시공간역학 및 감시 행동을 중재하는 요인에 빛을 비추었습니다13,14,15, 16. 핵 GFP 발현17에의해 γδ IeLs를 표시하는 TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) 기자 마우스의 개발은 γδ ILs가 상피 내 의 높은 운동성이며 미생물에 반응하는 독특한 감시 행동을 나타낸다는 것을 밝혔습니다. 감염17,13,14. 최근에는, 또 다른 γδ T 세포 리포터 마우스가 전체 세포(18)의 시각화를 허용하도록 세포질에서GFP를 발현하는 (Tcrd-GDL)이 개발되었다. 유사한 방법론은 IEL 운동성19,20의역학에 G 단백질 결합 수용체(GPCR)-18 및 -55와 같은 특정 케모카인 수용체의 요구사항을 조사하기 위해 사용되어 왔다. 세포 특이적 리포터가 없는 경우, CD8α에 대한 형광 공액 항체를 생체내IEL 운동성을 시각화하고 추적하는 데 사용되었으며,20. 2광자 레이저 스캐닝 현미경은 일반적으로 intravital 화상 진찰을 위해 사용되지만, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경의 사용은 최소한의 배경 잡음으로 고속 및 고해상도 멀티 채널 이미지를 캡처하는 독특한 장점을 제공합니다. 이 기술은 장 점막의 복잡한 미세 환경 내에서 면역 / 상피 상호 작용의 시공간 역학을 해명하는 데 이상적입니다. 더욱이, 다양한 형질전환 및/또는 녹아웃 마우스 모델의 사용을 통해, 이러한 연구는 장 내 면역 및/또는 상피 세포 기능의 분자 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Protocol
모든 연구는 Rutgers 뉴저지 의과 대학 비교 의학 자원에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 실험실 동물 관리 (AALAC)-공인 시설의 평가 및 인증의 협회에서 수행되었다.
1. 마우스 준비
참고: 동물 제제 및 수술을 포함한 다음 절차는 수술 전에 30-40 분이 소요되며 현미경을 켜고 동봉 된 인큐베이터를 현미경으로 37 °C로 따뜻하게합니다.
- 버나드 말리센 (INSERM, 파리, 프랑스)에서 얻은 C57BL/6 배경에 8-10주 된 TcrdEGFP 마우스에 대한 실험을 수행하였다. IACUC 승인 절차에 따르면, 동물의 무게에 따라 케타민 (120 mg/kg)과 자일라진 (10 mg / kg)을 i.p. 주입하여 마우스를 마취시다. 호흡 속도 (분당 55-65 호흡)21,발가락 핀치 및 팔피브랄 반사로 마취 수준을 평가하십시오.
- 수술용 평면 마취에 도달하면 테이프를 사용하여 마우스의 뒷다리를 가열 패드에 고정하여 직장 온도계로 모니터링할 수 있는 체온을 유지합니다. 마취가 벗겨지고 있다는 징후가 있는 경우(예: 호흡 속도 증가, 깜박임 및/또는 팔피브랄 반사에 대한 눈 근육 경련 반응), 마우스가 완전히 진정될 때까지 한 번에 50 μL의 케타민/자일라진을 다시 관리하십시오.
- 0.9% 식염수의 315 μL로 Hoechst 33342 (10 mg/mL)의 50 μL을 희석시킴으로써 핵 염료를 준비; 최종 농도는 마우스의 무게에 따라 37.5 mg/kg입니다(대략 적인 부피 200 μl). 일단 마우스가 마취되면, 천천히 레트로 궤도 정맥 부비동을 통해 결핵 주사기를 사용하여 Hoechst를 주입.
참고: 마우스가 레트로 궤도 주입 후 순환 볼륨의 변화에 적응할 수 있도록 다음 단계로 진행하기 전에 1-2 분 기다립니다. - 소량의 윤활제를 눈 위에 두어 건조하지 않도록 하십시오.
2. 마우스 수술 : 장 점막을 노출하는 개복술
- 피부와 복막을 통해 2cm 수직 절개를 하고 하복부의 중간선을 따라 심상화할 장의 영역을 외부화합니다.
- 각진 집게를 사용하여 복강에서 소굴을 조심스럽게 꺼내서 이미지화 할 소장 영역을 식별하십시오. 이 과정에서 반열성 혈관이 찢어지지 않도록주의하십시오. 잠재적인 손상이나 출혈을 최소화하려면 내장을 집게로 잡거나 꼬집지 마십시오.
- 최소한의 배설물을 포함하는 화상 진찰을 위한 소장 (2-3 cm)의 적당한 지구를 찾아내세요. 조심스럽게 소양과 남아있는 소장을 복막 강으로 돌려 보내면서 관심 세그먼트를 외부화하십시오.
참고: 이 단계에서 부양에 구멍을 뚫거나 간부성 혈관을 방해하지 마십시오. - 혈관 사이의 기본 장간막의 양쪽에 두 쌍의 집게를 놓고, 집게의 끝을 부드럽게 문질러 막에 구멍을만듭니다 (도 1)22. 이것은 바늘이 장 아래 복강을 닫을 때 장간막을 통과할 수 있게 합니다.
- 외부화 장의 루프를 유지하면서 절개를 닫습니다. 각진 집게와 곡선, 5cm 봉합사에 부착 된 테이퍼 포인트 바늘을 사용하여, 복막의 한쪽을 관통, 이전 단계에서 만든 구멍을 통해 이동, 복막 안감의 다른 측면을 통해 위로. 봉합사 하나를 위쪽에 놓고 다른 봉합사 아래쪽에 놓습니다.
참고: 이 단계에서 혈관을 손상시키지 마십시오. - 이 과정을 반복하여 장 루프 아래의 피부를 닫고 절개 중간에 하나의 봉합사를 기본 복막의 이전 봉합사 사이에 놓습니다.
참고: 이미지화할 영역만 외부화하는 것이 중요합니다. 이것은 화상 진찰 도중 불필요한 운동을 감소시킬 것입니다. 장담동맥을 묶지 않도록 하십시오. - 전기 소작을 사용하여 반 장간막 테두리를 따라 천공 선을 만듭니다. 소작 직후, 추가 열 유발 조직 손상을 방지하기 위해 장 표면에 몇 방울의 물을 바르십시오. 잔류 물을 제거하기 위해 킴 와이프와 얼룩.
- Vannas 가위를 사용하여 소작 조직의 말단 가장자리에 작은 수평 슬릿을 자르고 외부 조직 세그먼트의 근위 쪽 (길이 약 1.5 cm)을 향해 소작 된 라인의 길이를 따라 절단하여 점막을 노출시다. 표면.
참고: 필요한 경우 집게를 사용하여 노출된 점막 표면에 남은 과도한 배설물을 부드럽게 제거합니다. - 조직이 탈수되는 것을 방지하기 위해 촉촉한 김스 와이프로 마우스의 복부를 덮으하십시오. 덮인 용기에 있는 현미경에 마우스를 수송하십시오.
3. 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의한 이미지 수집
- HBSS에서 1 μM AlexaFluor 633의 피펫 150 μL을 35mm 접시의 유리 커버미드 바닥에. 열린 점막 표면이 커버슬립에 직접 닿을 수 있도록 마우스를 배치합니다.
- 현미경의 머리를 뒤로 기울이고 미리 데운 인큐베이터에서 이미징 단계에 뚜껑을 덮은 접시에 마우스를 놓습니다. 또는, 체온을 유지하기 위해 가열 담요로 마우스를 덮는다.
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 각 레이저의 여기 강도와 노출 시간은 광표백을 방지하고 시간 지점 사이의 간격을 최소화하기 위해 각각 10-15 mW 또는 120-150 ms를 초과해서는 안됩니다. 프레임 평균을 "2"로 조정하고 EM 게인 기능을 켜서 배경 노이즈를 줄입니다. 픽셀 크기를 올바르게 측정하려면 63x 대물 보정을 선택합니다.
참고: 위에서 자세히 설명한 설정은 초기 참조를 제공하기 위한 것이지만 개별 현미경 구성에 따라 달라집니다. - 405 nm 레이저와 20x 공기 목표를 사용하여, 눈에 띄는 움직임이나 눈에 띄는 표류가 없는 융모의 필드를 찾기 위해 핵을 시각화합니다. 호흡, 연동 또는 심장 박동으로 인한 실제 운동 영역을 피하십시오.
- XY 스캔을 사용하여 관심 분야의 XY 좌표를 기록하고 글리세롤 침지 63배 대물렌즈로 전환합니다.
- 405 nm 채널에서 최대 1분 동안 라이브 이미지를 획득하여 선택한 필드의 융모가 안정적인지 확인합니다.
- 405 nm 채널에서 라이브 이미지를 획득하는 동안 초점을 조정하여 우루 끝 바로 아래에 있는 직교 평면을 찾습니다. 1.5 μm 단계를 사용하여 약 15-20 μm의 핵을 해결하기 어려울 때까지 융모 끝 상피 바로 아래에서 시작하여 Z 스택을 획득합니다.
참고: 전술한 노출 시간을 이용하여 3개의 채널(405, 488, 640 nm)으로 이미징할 때, 약 20s 간격으로 3개의 채널을 순차적으로 획득할 수 있다. - 수집 시작 후 3-5분 후에 분석 모드에서 소프트웨어를 열어 이미지 안정성 및 γδ IEL 운동성을 확인합니다. 각 분야별로 30~60분 동안 이미지를 계속 획득합니다. 각 마우스에 대해 2-3개의 필드를 기록합니다. 이미징을 하는 동안 5분마다 마우스를 모니터링합니다.
참고: 마취가 마모되기 시작하면 포셉을 사용하여 마우스의 목을 부드럽게 스크러프하여 케타민/자일라진 50 μL을 한 번에 투여합니다. 마취 수준을 계속 모니터링하고 필요한 경우 다시 관리하십시오. - 4시간 이상 마우스를 이미지화하는 것은 권장되지 않습니다. 이미지 수집이 완료되면, 양측 기흉 에 이어 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 희생.
4. 이미지의 4D 분석
- 이미징 파일을 4D 렌더링 소프트웨어로 직접 가져옵니다.
- IeLs 및 루멘에 대한 개별 표면을 만든 다음 표 1에 설명된 매개 변수를 초기 참조로 사용하여 시간이 지남에 따라 표면을 추적합니다. IELs의 경우 표시된 시드 점 지름을 사용하여 분할 터치 오브젝트를 사용하도록 설정합니다.
- 자동 회귀 추적 알고리즘을 사용하여 IEL 운동성을 결정합니다. 추적 알고리즘은 비교적 정확하지만 각 IEL의 트랙을 시각적으로 검사하는 것이 필수적입니다. 트랙이 올바르지 않으면 트랙 편집 탭에서 연결 해제 및 연결 기능을 사용하여 수정합니다.
- 각 IEL에서 루멘까지의 거리를 확인하려면 루멘 표면을 선택하고 도구 메뉴에서 거리 변환 기능을 수행합니다. 메시지가 표시되면 외부 서피스를선택합니다. 거리 변환이 계산되면 4번째 채널로 표시됩니다.
- 4채널의 강도 분음을 필터링하여 측면 세포간 공간(LIS) 내에 있는 γδ ILs를 선택합니다. 이 값은 열 상피 세포의 높이에 따라 15 μm에 가까워야합니다. 이 범위 내의 총 γδ IeLs의 백분율은 LIS에서 γδ IeLs의 주파수로서 보고된다.
- 추가 분석을 위해 IEL 트랙 속도, 트랙 변위, 트랙 직진 및 트랙 길이를 포함한 통계 데이터를 내보냅니다. 또는 Vantage 모듈을 사용하여 데이터를 분석합니다. 실험에 따라 LIS 또는 IEL/상피 상호 작용 내의 거주 시간을 포함하여 수집된 데이터에서 추가 메트릭을 가져옵니다.
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Representative Results
TcrdEGFP 리포터 마우스의 intravital 화상 진찰을 사용하여, 우리는 이전에 γδ IELs가 지하 막을 따라 그리고 측면 세포 간 공간 (LIS)로 이동하여 상피를 순찰하는 동적 감시 행동을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 상태(그림2,동영상 1)를 참조하십시오.
이 접근법은 또한 특정 세포 신호화 경로 및/또는 수용체의 억제가 γδ IEL 철새 거동에 미치는 영향을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인터류킨(IL)-15는 γδ IEL 항상성23,24에필수적인 흉막사이토카인이다. IL-2Rβ 수용체를 통한 IL-15 신호가 안정상태에서 γδ IEL 운동성의 역학에 기여하는지 여부를 확인하기 위해, TcrdEGFP 리포터 마우스는 항-IL-2Rβ 항체(TM-β1) 또는 이소형 IgG2b 대조군을 투여한 후 2시간 후 영상을 화하였다. 유색 트랙은 30분 동안 개별 γδ IELs의 철새경로를 나타냅니다(그림 3A). LIS에서 γδ IELs의 빈도는 TM-β1로 처리된 마우스에서 증가되었지만(도3A,B),이들 γδ Iels의 30% 이상이 공회전 거동을 나타내었다(도3A,C). 유휴 γδ IeLs는 트랙 직진도 및 트랙 변위 길이에 상한을 부과하여 정의되었다. 이러한 공회전 표현형은 제어에 상대적인 IL-2Rβ 봉쇄에 따른 γδ IeLs의 순간 속도 및 감금 비 둘 다에서 유의한 감소에 의해 확인되었다(도3D,E). 또한, 유휴 γδ IeLs는 더 긴 거주 시간을 가지며, 운동성 γδ IeLs에 비해 LIS 내에서 더 자주 국소화되었다(도3F).
그림 1: 집게를 사용하여 장간막에 구멍을 만듭니다. 멤브레인의 양쪽에 집게를 배치하여 봉합사에 구멍을 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제주에서 γδ IELs의 대표적인 3D 이미지. TcrdEGFP 리포터 마우스의 제주점막을 정상 상태에서 촬영한 타임랩스 비디오에서 단일 타임포인트를 선택하였습니다. γδ IeLs는 녹색, 흰색의 핵 및 빨간색 의 루멘으로 표시됩니다. 배율 막대 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: IL-2Rβ의 억제는 측세포 간 공간에서 γδ IEL 공회전을 유도한다. 이 수치는 "상피 IL-15는 장 내 림프구 운동성의 중요한 조절기입니다." 후, M. D. 외. 2018, J Immunol, 201 (2), p. 747-756. 15 저작권 2018 면역학자 협회에 의해,Inc. (A) GFP γδ IELs 를 이동하는 것을 보여주는 시간 경과 이미지는 IgG2b 또는 TM-β1의 0.45 mg으로 2 시간 처리 후 제주 융모 상피 내의 ILS. 30분 동안 의 개별 γδ IELs(녹색)의 운동성은 색깔된 트랙으로 도시됩니다. 핵은 흰색으로 표시되고, 루멘은 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 20μm. (B) LIS 내의 γδ IELs의 빈도(n= 치료당 3마우스, n=6-7 동영상). (C) IgG2b- 또는 TM-β1 처리 마우스에서 유휴 상태인 γδ IELs의 백분율. (D) 순간 속도 (n = 13,299 및 9,600 시간 포인트). (E) 트랙 구속비율(n = 350 및 278트랙)이 표시됩니다. (F) 루멘으로부터의 유휴 및 운동성 γδ IELs의 거리. 평균 + SEM이 표시됩니다 (+). * p < 0.05, **p < 0.01, #p & 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이엘 (것) | 루멘 | |
| 표면 상세(μm) | 1.2 | 1.5 |
| 배경 빼기(μm) | 1.67 | 2개 |
| 시드 포인트 직경(μm) | 7.5 | 해당/A |
| 필터 : 복셀의 수 | 250개 | 6,500명 |
| 추적: 최대 거리(μm) | 10개 | 10개 |
| 추적: 최대 간격 | 2개 | 2개 |
표 1: 생성을 위한 대표 설정 이마리스의 γδ IEL 및 발광 "표면". 이러한 설정은 488 nm 채널(IEL) 및 640 nm 채널(루멘)의 표면을 생성하고 추적할 때 시작점으로 사용될 수 있다. 실험 조건에 따라 이러한 설정을 수정해야 할 수 있습니다.
영화 1: GFP의 인트라바이탈 이미징 γδ IEL [마우스 제주]에서 의거 동작. GCrdEGFP 마우스로부터 제주에서 의 γδ IEL 운동성의 시간 경과 내 활력 현미경 검사법은 IgG2b의 0.45 mg으로 처리하였다. γδ IeLs는 녹색, 청색의 핵, 및 적색의 루멘으로 표시됩니다. 스케일 바, 20 μm. 프레임은 약 30분 동안 30초마다 수집되었다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
사내 현미경 기술의 발달은 세포 내 구조의 재구성을 관찰 할수있는 전례없는 기회를 제공했다 8,9,22,세포 - 세포 상호 작용12, 25 및 세포 이동 거동13,14,15,16,26 그렇지 않으면 접근할 수 없는 조직에서. 생체 내 18,27에서γδ IELs의 조절 및 기능을 연구하는 도구의 일반적인 부족이 있었고, 그 결과, 생체 내 이미징의 사용은 분자 조절에 관한 조사의 새로운 길을 열었습니다. IEL 인구의 기능적 특성13,14,15,16,20. γδ IeLs는 이전에 장 점막(28) 내에 고정된것으로 추정되었다. 그러나, 추가 분석은 이들 세포가 매우 동적이며, 상피 구획(13)의 단단한 경계 때문에 이차 림프기관에서 림프구보다 더 느리게 이동한다는 것을 보여주었다. 더욱이, 생체 내 이미징의 사용은 γδ IEL 운동성 및 기능(13)을 구동하는 ILS와 상피 세포 사이의 누화를 포함하여 γδIEL 감시 동작의 시공간역학에 대한 추가적인 통찰력을제공했다. 14세 , 15세 , 16. 이 철새 동작의 분석은 생체 외 또는 생체 외 내 실험을 사용하여 정확하게 정량화되지 않았을 IEL 세포 반응에 대한 새로운 메트릭을 정의했습니다.
전체 절차에 걸쳐, 지속적으로 마우스의 감속 수준을 모니터링하는 것이 필수적이다. 가스 마취 (이소플루란)의 지속적인 투여는 케타민 / 자일라진의 대안으로 사용될 수 있습니다. 개복술을 수행 할 때, 생물학의 정확한 평가를 제공하기 위해 그대로 신경 혈관 공급을 유지하는 것이 중요합니다. 장만혈관을 묶는 것은 조직의 저산소증과 점진적인 괴사로 이어질 수 있습니다. 대조적으로, 혈관을 끊는 것은 화상 진찰 도중 몇몇 채널의 형광 강렬을 감소시킬 수 있는 노출된 점막으로 출혈 귀착될 것입니다. IELs가 둥근 형태를 개발하고 이미지 수집 중에 이동을 중지하는 경우 마우스의 체온이 약간 감소하기 때문일 수 있습니다. 현미경 단계에 가까운 온도 센서를 배치하면 노출된 점막 부위의 온도가 37°C에서 유지되도록 합니다. 인큐베이션 챔버의 온도 안정성에 따라 온도를 38-39°C로 상승시키는 것이 필요할 수 있습니다.
일단 마우스가 현미경 단계에 위치되면, 인접한 혈관의 연동 또는 수축 때문에 과도한 운동이 결여된 융모의 필드를 확인하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 경우 커버슬립에 융모를 단단히 포장하기 위해 접시 내에서 마우스를 재배치하거나 마우스 측면을 외부로 조작합니다. 대안적으로, 이미징 필드는 무대에 마우스를 배치 한 후 몇 분 더 안정될 수 있습니다. 수집 중에 점진적인 XY 드리프트가 있는 경우, 4D 렌더링 소프트웨어에서 드리프트 보정을 사용하여 시간 과정 전반에 걸쳐 이미지의 다른 위치에 존재하는 4-5개의 핵을 선택하고 각 위치에 대한 스팟을 추적하여 수정할 수 있습니다. 핵. 스팟이 생성되면 트랙 편집 메뉴에서 드리프트 수정을 선택하여 번역 드리프트를 수정합니다. 드리프트 보정은 이미지의 다른 오브젝트를 추적하는 데 사용되는 좌표를 변경하므로 다른 해석보다 앞서 수행해야 합니다.
2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사법은 조직29깊숙이침투하는 데 유용한 광범위한 이미징 깊이를 허용하지만, 회전 디스크 레이저 공초점 현미경은 내부 이미징 응용 분야에 고유한 장점을 가지고 있습니다. 2광자 레이저 스캐닝 현미경 은 40-50 %의 양자 효율로 한 번에 하나의 픽셀만 감지 할 수있는 광증법튜브 (PMT)에 의존합니다. 대조적으로, 회전 디스크 공초점 레이저 현미경은 전자 곱셈 (EM) CCD 카메라를 사용하여 동시에 백만 픽셀까지 직접 감지하여 양자 효율을 95 %로 증가시킵니다. 그 결과, 광표백 및 광손상의 잠재력이 현저히 감소되고, 증가된 획득 속도는 더 많은 피상적 조직에서 세포 이동을 이미징할 때 시간적 해상도를 최대화합니다. 화상 진찰 양식에 관계없이, 이 외과 적 절차는 반전된 현미경에 화상 진찰을 위한 장 점막을 드러내기 위해 이상적입니다.
형광 리포터, 형광 표지 프로브 또는 다양한 파장에서 생성된 미생물의 형광 균주를 발현하는 마우스 균주의 가용성이 증가함에 따라 생체 내 장에서 평가하는 조합 실시간 응답은 무한합니다. intravital 화상 진찰은 세포 세포와 호스트 세균 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공할 수 있을 뿐 아니라, 또한 동종 또는 병리학 조건의 밑에 상피 와 면역 세포 둘 다에 있는 동적 분자 및 세포 프로세스를 강조할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R21 AI143892, 뉴저지 건강 재단 보조금, 부시 생물 의학 보조금 (KLE)에 의해 지원됩니다. 우리는 원고를 편집하고 대표 결과에 표시된 데이터를 제공하는 그녀의 도움 마들렌 후 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
References
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